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1 / 2 SIS 051 Fiche technique Numération cellulaire sur l’hématimètre de Neubauer De la bonne utilisation des cellules de comptage dépend la qualité des résultats des numérations cellulaires en hématologie A la fin de la lecture de ce document vous devez être capable de : choisir la bonne technique selon le type de cellules à compter rendre un résultat en tenant compte du facteur de multiplication identifier et corriger les principales sources d’erreur entretenir l’hématimètre ATTENTION : pour des raisons de sécurité, des pipettes en verres ne devraient plus être utilisées dans le laboratoire. Si malgré tout vous utilisez encore des pipettes Thoma, des étapes complémentaires sont décrites en bleu et en italique. 1. Quel hématimètre choisir? Il existe différents types d'hématimètres. Ils diffèrent par leur quadrillage, mais tous permettent de compter, dans un volume précis et connu, les globules blancs, les globules rouges et les thrombocytes à l’objectif 40x ou 50x (grossissement idéal : 400x). Dans ce document, on ne parlera que de l’hématimètre de NEUBAUER. 2. Materiel - Le sang peut être dilué directement : Pipette réglable / Récipient pour dilution - Hématimètre de Neubauer (ou modèle récent Neubauer improved) / lamelle en verre épais pour hématimètre - Solution pour dilution : Türk ou Plaxan pour Leucocytes et Thrombocytes / réactif selon Dacie et Lewis pour Erythrocytes (ne plus utiliser le réactif Hayem en raison de sa toxicité) - Mélangeur pour les échantillons de sang (+ agitateur à pipettes pour pipette à dilution Thoma) - Microscope avec oculaire 10x et objectif 40x ou 50x sans immersion. 3. Dilution de l'échantillon, préparation de la chambre de comptage a) Mélanger le sang EDTA sur un mélangeur pendant 5-10 minutes au minimum et de préférence 10 minutes pour le CQ. b) Diluer le sang complet ou le sang capillaire bien mélangé de la manière suivante. (Aspirer du sang jusqu'à environ 1 mm au-dessus de la marque 0,5 de la pipette de Thoma. Essuyer le bout de la pipette à l'aide d'un coton humidifié. Ajuster le sang exactement jusqu'à la marque 0,5.) Leucocytes Thrombocytes (utiliser la première goutte de sang capillaire!) Erythrocytes Récipient pour dilution approprié __________________ pipette de Thoma Dilution 1:20 950 μL Türk ou Plaxan + 50 μL sang EDTA ou capillaire ______________________ avec boule blanche Türk- ou Plaxan, aspirer exactement la solution jusqu‘à la marque 11, sans réajuster Dilution 1:20 950 μL Türk ou Plaxan + 50 μL sang EDTA ou capillaire ______________________ avec boule blanche Türk- ou Plaxan, aspirer exactement la solution jusqu‘à la marque 11, sans réajuster Dilution 1:200 1990 μL réactif selon Dacie / Lewis + 10 μL sang EDTA ou capillaire _______________________ avec boule rouge réactif selon Dacie / Lewis, aspirer exactement la solution jusqu‘à la marque 101, sans réajuster Prendre la pipette de Thoma entre deux doigts, en fermant les deux côtés et agiter vivement cinq à dix fois, puis la poser encore pendant 5 minutes sur l’agitateur à pipettes. c) Coller la lamelle sur l’hématimètre, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon légèrement humide. Puis faire glisser la lamelle sur la largeur de l’hématimètre et vérifier la bonne adhésion. Il doit apparaître un anneau de Newton (couleur arc-en-ciel). d) Vérifier la propreté de la cellule sous le microscope. e) Laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l'échantillon dilué entre l’hématimètre et la lamelle. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de l'hématimètre et elle doit recouvrir complètement et d'un seul coup toute la surface quadrillée de l'hématimètre. (Rejeter les 2-3 premières gouttes de la pipette de Thoma, puis remplir l’hématimètre). Ne jamais aspirer le surplus, éviter les bulles d’air. f) Laisser reposer l'hématimètre à plat, en "chambre" humide (une boîte de Pétri avec un chiffon humide). pendant 10 minutes (20 minutes pour les thrombocytes) afin de laisser les éléments sédimenter. Ne jamais compter les éléments dans une chambre de comptage desséchée. g) Compter dans le quadrillage, selon une procédure bien établie, les éléments désirés (voir point 4). h) Rendre le résultat en multipliant le nombre de cellules comptées par le facteur de multiplication adéquat (voir point 5).

Fiche technique Numération cellulaire - CSCQ · Fiche technique Numération cellulaire sur l’hématimètre de Neubauer De la bonne utilisation des cellules de ... Dilution de l'échantillon,

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SIS 051

Fiche techniqueNumération cellulairesur l’hématimètre de Neubauer

De la bonne utilisation des cellules decomptage dépend la qualité des résultatsdes numérations cellulaires en hématologie

A la fin de la lecture de ce document vous devez êtrecapable de :

choisir la bonne technique selon le type de cellules à compter rendre un résultat en tenant compte du facteur de

multiplication identifier et corriger les principales sources d’erreur entretenir l’hématimètre

ATTENTION : pour des raisons de sécurité, des pipettes enverres ne devraient plus être utilisées dans le laboratoire.Si malgré tout vous utilisez encore des pipettes Thoma, des étapescomplémentaires sont décrites en bleu et en italique.

1. Quel hématimètre choisir?Il existe différents types d'hématimètres. Ils diffèrent par leur quadrillage, mais tous permettent de compter, dansun volume précis et connu, les globules blancs, les globules rouges et les thrombocytes à l’objectif 40x ou 50x(grossissement idéal : 400x). Dans ce document, on ne parlera que de l’hématimètre de NEUBAUER.

2. Materiel- Le sang peut être dilué directement : Pipette réglable / Récipient pour dilution- Hématimètre de Neubauer (ou modèle récent Neubauer improved) / lamelle en verre épais pour hématimètre- Solution pour dilution : Türk ou Plaxan pour Leucocytes et Thrombocytes / réactif selon Dacie et Lewis pour

Erythrocytes (ne plus utiliser le réactif Hayem en raison de sa toxicité)- Mélangeur pour les échantillons de sang (+ agitateur à pipettes pour pipette à dilution Thoma)- Microscope avec oculaire 10x et objectif 40x ou 50x sans immersion.

3. Dilution de l'échantillon, préparation de la chambre de comptagea) Mélanger le sang EDTA sur un mélangeur pendant 5-10 minutes au minimum et de préférence 10 minutes pour

le CQ.b) Diluer le sang complet ou le sang capillaire bien mélangé de la manière suivante.

(Aspirer du sang jusqu'à environ 1 mm au-dessus de la marque 0,5 de la pipette de Thoma. Essuyer le bout de la pipette à l'aide d'un cotonhumidifié. Ajuster le sang exactement jusqu'à la marque 0,5.)

Leucocytes Thrombocytes(utiliser la première goutte desang capillaire!)

Erythrocytes

Récipient pour dilutionapproprié

__________________pipette de Thoma

Dilution 1:20950 µL Türk ou Plaxan +50 µL sang EDTA oucapillaire______________________avec boule blancheTürk- ou Plaxan, aspirer exactementla solution jusqu‘à la marque 11,sans réajuster

Dilution 1:20950 µL Türk ou Plaxan +50 µL sang EDTA oucapillaire______________________avec boule blancheTürk- ou Plaxan, aspirer exactementla solution jusqu‘à la marque 11,sans réajuster

Dilution 1:2001990 µL réactif selonDacie / Lewis + 10 µL sangEDTA ou capillaire_______________________avec boule rougeréactif selon Dacie / Lewis, aspirerexactement la solution jusqu‘à lamarque 101, sans réajuster

Prendre la pipette de Thoma entre deux doigts, en fermant les deux côtés et agiter vivement cinq à dix fois, puis la poser encore pendant 5minutes sur l’agitateur à pipettes.

c) Coller la lamelle sur l’hématimètre, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon légèrementhumide. Puis faire glisser la lamelle sur la largeur de l’hématimètre et vérifier la bonne adhésion. Il doitapparaître un anneau de Newton (couleur arc-en-ciel).

d) Vérifier la propreté de la cellule sous le microscope.e) Laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l'échantillon dilué entre l’hématimètre et la lamelle. La goutte ne

doit pas déborder dans les rigoles de l'hématimètre et elle doit recouvrir complètement et d'un seul coup toute lasurface quadrillée de l'hématimètre. (Rejeter les 2-3 premières gouttes de la pipette de Thoma, puis remplir l’hématimètre). Nejamais aspirer le surplus, éviter les bulles d’air.

f) Laisser reposer l'hématimètre à plat, en "chambre" humide (une boîte de Pétri avec un chiffon humide). pendant10 minutes (20 minutes pour les thrombocytes) afin de laisser les éléments sédimenter. Ne jamais compter leséléments dans une chambre de comptage desséchée.

g) Compter dans le quadrillage, selon une procédure bien établie, les éléments désirés (voir point 4).h) Rendre le résultat en multipliant le nombre de cellules comptées par le facteur de multiplication adéquat (voir

point 5).

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4. Comptage des cellules

Quel que soit l'hématimètre et la surface à compter, on compte tous les éléments situés à l'intérieur des lignesdélimitant cette surface. Pour les éléments situés sur les lignes, on applique la règle de la limite des lignes :compter les cellules touchant la ligne du haut et celle de droite. Ne pas compter les cellules touchant la ligne dubas, ni celle de gauche.

comptertoutes les cellules internes au carré

+toutes les cellules touchant la ligne du haut etla ligne de droite.

Dans cet exemple, les cellules à compter sont :13 + 8 = 21 cellules.

5. Exemple de calcul des cellules

Formule du calcul : nombre de cellules x facteur de dilution x facteur de conversion------------------------------------------------------------------------------------nombre de carrés x volume d‘un carré

LEUCOCYTES - Comptage THROMBOCYTES - Comptage ERYTHROCYTES - Comptage

Leucocytes (Lc) comptés par carré :28 ; 25 ; 27 ; 26 = 106 leucocytes

Thrombocytes (Tc) comptés par carré:35 ; 45 ; 50 ; 50 = 180 thrombocytes

Erythrocytes (Ec) comptés par carré:85 ; 95 ; 80 ; 100 = 360 érythrocytes

Nombre de leucocytes comptés: 106Nombre de carrés comptés : 4 grandsVolume d‘un carré bleu : 0,1 µLFacteur de dilution : 1/20Facteur de conversion µL en L:

1L =1 x106 µL

106 Lc x 20 x 106

4 x 0,1 µL

106 Lc x 50 x 106 / L= 5 300 x 106 Lc / L = 5,3 x 109 Lc / Lou 5,3 Lc G / L (Giga / L)

Nombre de thrombocytes comptés : 180Nombre de carrés comptés : 80 très petitsVolume d‘un carré rouge : 0,00025 µLFacteur de dilution : 1/20Facteur de conversion µL en L:

1L =1 x106 µL

180 Tc. x 20 x 106

80 x 0,00025 µL

180 Tc x 1000 x 106 / L= 180 000 x 106 Tc / L = 180 x 109 Tc / Lou 180 Tc G / L (Giga / L)

Nombre de érythrocytes comptés : 380Nombre de carrés comptés : 80 très petitsVolume d‘un carré rouge : 0,00025 µLFacteur de dilution : 1/200Facteur de conversion µL en L:

1L =1 x106 µL

360 Ec x 200 x 106

80 x 0,00025 µL

360 Ec x 10 000 x 106 / L= 3 600 000 Ec / L = 3,60 Ec x 1012 / Lou 3,60 Ec T / L (Tera / L)

Lors du comptage des érythrocytes dans un hématimètre, le technicien doit être conscient que le coefficient devariation peut être très élevé avec cette détermination.

6. Entretien d‘un hématimètrea) Rincer la cellule et la lamelle à l’eau courante puis à l’alcool à 70 % (v/v).b) Sécher la cellule et la lamelle avec un torchon sec, doux et non pelucheux (éviter de la rayer).Entretien de la pipette de Thomaa) Vider la pipette immédiatement après usage, pour éviter un dessèchement ou, entreposer la pipette dans un récipient contenant de l‘eau.b) Rincer la pipette à l‘eau courante, puis à l‘eau distillée, et enfin à l‘alcool à 70 % (v/v).c) Sécher à l’acétone ou dans un four à air chaud.

Précautions : la bille doit être libre avant de réutiliser la pipette, la pipette ne doit pas être ébréchée.

7. Principales sources d’erreurs Cellule à numération non nettoyée et/ou non dégraissée / empreinte de doigt sur la lamelle / mauvaisehomogénéisation / erreur de pipetage, temps non respectés / comptage dans une chambre de comptagedesséchée / présence de bulles d’air dans la cellule / absorption du liquide en cas de débordement / mauvaisréglage du microscope / erreurs de dilutions / erreurs de calculs / erreurs d’unités / Pipette de Thoma sale / faussepipette.

Fiche revue Septembre 2010 Dagmar Kesseler, Ada Rieder, avec remerciements à Barbara Jost CSCQ 2010. AUCUNE COPIE DE CE DOCUMENT N'EST AUTORISEE SANS L’ACCORD DU CSCQ.

CSCQ, 2 CHEMIN DU PETIT-BEL-AIR, CH - 1225 CHENE-BOURG

Les leucocytes (A) sont comptés dans les quatre grands carrés bleus composés de 16 petits carrés (= 64).

Les érythrocytes et les thrombocytes (B) sont comptés dans les 4 lignes rouges dans le quadrillage centralcomposé de 20 très petits carrés (= 80).

La hauteur entre la chambre et la lamelle est de 0,1mm.Le volume est de :- grand carré 1mm x 1mm x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 0,1 µL- très petit carré 0,05mm x 0,05mm x 0,1 mm = 0,00025 mm3 = 0,00025 µL