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101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015 Département de biologie Collège Lionel-Groulx TABLE DES MATIÈRES Page 1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE 1 2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon 2 3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une gélose 3 4. COLORATION DE GRAM 4 5. LE MICROSCOPE A) Figure 5 B) Liste des parties 6 C) Utilisation 7 6. ENSEMENCEMENT D’UNE GÉLOSE PAR STRIATION (4 stries) 8 7. MILIEUX DE CULTURE A) Gélose nutritive 9 B) Gélose au sang 9 C) Gélose MacConkey 10 D) Gélose Mannitol-sel 11 E) Gélose Bacillus 12 F) Tubes TSI 13-14 8. TESTS ENZYMATIQUES A) Catalase 15 B) Oxydase 15 C) Coagulase 15 9. CULTURE ANAÉROBIE 16 10.ANTIBIOGRAMME 17-18 FICHES TECHNIQUES de bactériologie

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    Département de biologie Collège Lionel-Groulx

    TABLE DES MATIÈRES

    Page

    1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE 1

    2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon 2

    3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une gélose 3

    4. COLORATION DE GRAM 4

    5. LE MICROSCOPE

    A) Figure 5

    B) Liste des parties 6

    C) Utilisation 7

    6. ENSEMENCEMENT D’UNE GÉLOSE PAR STRIATION (4 stries) 8

    7. MILIEUX DE CULTURE

    A) Gélose nutritive 9

    B) Gélose au sang 9

    C) Gélose MacConkey 10

    D) Gélose Mannitol-sel 11

    E) Gélose Bacillus 12

    F) Tubes TSI 13-14

    8. TESTS ENZYMATIQUES

    A) Catalase 15

    B) Oxydase 15

    C) Coagulase 15

    9. CULTURE ANAÉROBIE 16

    10. ANTIBIOGRAMME 17-18

    FICHES TECHNIQUES de bactériologie

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    1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE

    COULEUR

    COULEUR

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    2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon

    1. Flamber l’anse bactériologique dans la flamme du brûleur.

    2. Laisser refroidir quelques secondes (10) près de la flamme.

    3. Bien mélanger la culture par rotation (et non par inversion)

    4. Flamber l’entrée du tube à chaque ouverture et fermeture.

    5. Prélever une bouclée de bouillon.

    6. Étaler le prélèvement à la surface de la lame à la grandeur d’un 10¢

    Attention : flamber l’anse avant de la redéposer!

    7. Laisser sécher (complètement) à l’air

    8. Fixer les bactéries sur la lame en passant celle-ci rapidement

    dans la flamme, 3 fois. Laisser tiédir quelques secondes après

    chaque passage.

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    3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une colonie sur gélose

    1. Déposer une petite goutte d’eau sur une lame

    2. Flamber l’anse bactériologique dans la

    flamme du brûleur

    3. Laisser refroidir quelques secondes (10), en

    restant près de la flamme

    4. Prélever un minuscule fragment d’une

    colonie (effleurer à peine une colonie

    suffira!). Attention, surveiller l’asepsie :

    couvercle entrouvert et rester à proximité

    de la flamme.

    5. Étaler le prélèvement à la surface de la

    lame en le dispersant dans la goutte d’eau.

    Étaler à la grandeur d’un 10¢

    Attention : flamber l’anse avant de la redéposer!

    6. Laisser sécher (complètement) à l’air

    7. Fixer les bactéries sur la lame en passant

    celle-ci rapidement dans la flamme, 3 fois.

    Laisser tiédir quelques secondes après

    chaque passage.

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    4. COLORATION DE GRAM

    1. Couvrir le frottis bactérien de

    cristal violet (colorant

    primaire); attendre 1 minute.

    2. Rincer avec un mince filet

    d’eau ; faire «tomber» l’eau

    un peu au-dessus du frottis et

    non directement dessus.

    3. Mettre l’eau iodée (lugol) ;

    attendre 1 minutes.

    4. Rincer avec un mince filet

    d’eau.

    5. Décolorer en couvrant

    d’alcool ; attendre 30 sec.

    6. Rincer avec un mince filet

    d’eau.

    7. Couvrir de safranine

    (colorant secondaire) ;

    attendre 1 minute.

    8. Rincer avec un mince filet

    d’eau.

    9. Assécher doucement la lame :

    égoutter et essuyer le dessous

    de la lame à l’aide d’un papier

    à lentille.

    10. Observer la lame à l’huile à immersion (G : 1000 X)

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    5. LE MICROSCOPE -- A) Figure

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    5. LE MICROSCOPE -- B) Liste des parties

    PARTIES MÉCANIQUES :

    1. Base supporte tout l’appareil.

    2. Potence bras recourbé par lequel on saisit l’appareil pour le transporter ; supporte le tube optique et la

    platine.

    3. Platine plateau sur lequel on dépose la préparation à observer ; elle est percée en son centre pour laisser

    passer la lumière.

    4. Valets dispositif servant à retenir la lame en place.

    5. Chariot pièce métallique située sur la platine ; sert à déplacer la préparation (contrôlé par les vis de

    déplacement du chariot).

    6. Vis de déplacement permettent de déplacer le chariot (et donc la lame) ; l’une permet les déplacements

    du chariot avant-arrière (haut-bas pour l’image) et l’autre les déplacements LATÉRAUX (gauche-droite).

    7. Tube optique porte à ses deux extrémités les deux composantes du système optique : l’oculaire et les

    objectifs.

    8. Revolver pièce circulaire rotative reliée au tube optique et qui porte les objectifs ; permet de placer dans

    l’axe optique du microscope l’objectif approprié.

    9. Vis macrométrique commande le déplacement en hauteur rapide et visible de la platine ; permet une première mise

    au point de l’objet à observer ; ne doit être utilisée qu’avec l’objectif à faible grossissement.

    10. Vis micrométrique commande un déplacement en hauteur de la platine de très faible amplitude (mouvement

    produit peu visible) ; sert à faire la mise au point fine.

    11. Vis du condensateur permet d’ajuster la hauteur du condensateur, pour obtenir l’éclairage optimal ; attention, il s’agit

    d’une grosse vis, pas d’une petite (ne touchez pas aux petites vis : le condensateur pourrait

    tomber)!

    PARTIES OPTIQUES :

    12. Source lumineuse fixée sur la base, sous le condensateur ; vous pouvez régler son intensité

    (lampe) (attention de ne pas envoyer TROP de lumière : c’est plus fatiguant pour les yeux et on perd des

    détails!).

    13. Condensateur système de lentilles situé sous la platine ; concentre les rayons lumineux pour augmenter la

    clarté de l’image. Sa hauteur est réglable par une vis.

    14. Diaphragme intégré dans le condensateur ; dose la quantité de lumière qui traverse l’objet ; contrôlé par un

    petit levier qui se déplace latéralement (pas une petite vis : un levier!).

    15. Objectif fixés sur le revolver, ils sont au nombre de quatre ; chacun est un système de lentilles pointé

    vers l’objet à observer ; produisent des images agrandies de l’objet (4X, 10X, 40X, 100X).

    16. Oculaire système de lentilles pointé vers l’œil de l’observateur ; il agrandit une nouvelle fois (10X)

    l’image déjà agrandie par l’objectif et la transmet à l’œil.

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    5. LE MICROSCOPE – C) Utilisation

    10 AVANT D'OBSERVER

    1. Allumer la lampe et régler à une intensité moyenne.

    2. Centrer la lame au-dessus du rayon lumineux (vis de la platine).

    3. Élever la platine au maximum (vis macrométrique).

    (Condenseur remonté et diaphragme-iris ouvert)

    20 MISE AU POINT AVEC LE PLUS PETIT OBJECTIF (4X ou 5X)

    1. Sélectionner l'objectif.

    2. Abaisser lentement la platine (vis macrométrique) jusqu'à l'obtention d'une image dans l'oculaire.

    3. Ajuster la mise au point (vis micrométrique).

    4. Choisir un point de l'image à grossir et l'amener au centre du champ visuel (vis de la platine).

    30 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 10X

    Répéter les 4 étapes précédentes.

    40 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 40X

    Répéter en n'utilisant que la vis micrométrique.

    50 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF A IMMERSION (100X)

    1. Déplacer l'objectif 40X sans amener complètement l'objectif 100X.

    2. Déposer une goutte d'huile au centre de la lame (l’indice de réfraction de l’huile étant proche de celui du verre,

    cette goutte minimise la réfraction et la perte de lumière lors de son passage entre la lame et la lentille de l’objectif).

    3. Amener complètement l'objectif 100X.

    4. Faire la mise au point avec la vis micrométrique.

    TRUCS POUR AMELIORER LA CLARTE DE L'IMAGE?

    1. Ajuster le réglage de l'intensité lumineuse (bouton de réglage de la lampe)

    2. Ajuster la hauteur du condenseur. (vis du condenseur)

    3. Ajuster le diaphragme-iris.

    POUR RETROUVER UNE IMAGE PERDUE?

    Recommencer avec le plus petit objectif! (sûr et rapide)

    ESSENTIEL APRES UTILISATION DE L'IMMERSION:

    Essuyer les objectifs 40X et 100X avec du papier à lentilles

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    Strie 1 Série 1

    Strie 2

    Strie 3

    Strie 4

    Série 2

    Série 3

    Série 4

    6. Ensemencement d’une gélose par striation (4 stries)

    ISOLATION DE COLONIES

    Après avoir prélevé aseptiquement un échantillon (près d’un brûleur, avec une anse bactériologique stérile)

    1. Effectuer une striation continue (gauche) ou une série

    de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au

    même endroit. Refermer.

    Flamber l’anse bactériologique.

    2. Effectuer une 2e striation continue (gauche) en ne

    passant que 2 fois dans la 1ère

    strie; ou une 2e série de 4

    stries (droite) en évitant de passer deux fois au même

    endroit. Refermer.

    Flamber l’anse bactériologique.

    3. Effectuer une 3e striation continue (gauche) en ne

    passant que 2 fois dans la 2e strie; ou une 3

    e série de 4

    stries (droite) en évitant de passer deux fois au même

    endroit. Refermer.

    Flamber l’anse bactériologique.

    4. Effectuer une 4e striation continue (gauche) en ne

    passant que 2 fois dans la 3e strie; ou une 4

    e série de 4

    stries (droite) en évitant de passer deux fois au même

    endroit. Incuber.

    Colonies isolées après incubation

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    7. Milieux de culture A) GÉLOSE NUTRITIVE Description Milieu de base utilisé pour cultiver et isoler les bactéries non exigeantes.

    Utilisation Usages multiples, examen de l’eau, du lait, des aliments. Isolation de colonies en vue d’effectuer leur

    description, des colorations ou divers tests.

    Composition Formule par litre d’eau Digestion pancréatique de gélatine (peptone)…… 5g

    Extrait de bœuf…………………………………... 3g

    Agar……………………………………………...15g Note : contrairement à la gélatine, l’agar est toujours solide quand on incube une gélose à 37oC (point de fusion = 45oC)

    pH = 6,8 ± 0,2

    Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1369a.html

    7. Milieux de culture B) GÉLOSE AU SANG – 5% mouton

    Description Milieu de base légèrement enrichi (avec du sang de mouton) pour cultiver et isoler un large éventail de

    bactéries non exigeantes.

    Utilisation Utilisé de routine en santé humaine et animale pour isoler des bactéries et les différencier selon le type

    d’hémolyse (α, β ou γ)

    Composition Formule par litre d’eau Extrait de tissu cardiaque ...……………………10,0g

    Extrait de bœuf ………………………….8,5g

    NaCl ……………………………………5,0g

    Agar …………………………………………15,0g

    Sang de mouton défibrinisé …………………………..50ml pH = 6,8 ± 0,2

    Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1601a.html

    Interprétation Plusieurs bactéries sécrètent des hémolysines, des substances qui lysent les globules rouges.

    Hémolyse β ou complète : les colonies sont entourées d’une zone claire et incolore; les globules rouges sont lysés et l’hémoglobine dégradée en un composé incolore.

    Hémolyse α ou partielle : l’hémoglobine est réduite en méthémoglobine et il y a alors une zone verdâtre ou brunâtre autour des colonies.

    Hémolyse γ : absence d’hémolyse.

    http://www.quelab.com/htmleng/1369a.htmlhttp://www.quelab.com/htmleng/1601a.html

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    7. Milieux de culture C) GÉLOSE Mac Conkey

    Description Milieu sélectif pour isoler les entérobactéries à gram - et milieu différentiel pour distinguer si elles

    fermentent ou non le lactose.

    Milieu sélectif : la présence de Crystal violet inhibe la croissance de la plupart des bactéries gram +, et

    l’ajout de sels biliaires est toxique pour beaucoup de bactéries non adaptées au milieu intestinal.

    Milieu différentiel : la présence de lactose et d’un indicateur de pH permet de distinguer les

    entérobactéries capables de fermenter le lactose (ex : E. coli) de celles qui ne le peuvent pas (ex :

    salmonelles).

    Utilisation Utilisé de routine en santé humaine et animale car plusieurs infections sont causées par les

    entérobactéries (incluant les coliformes); de plus, ce milieu permet de confirmer la coloration de gram.

    Très utilisé pour les analyses d’eau.

    Composition Formule par litre d’eau Peptone de gélatine ...……………………17,0g

    Peptone de caséine ……………………………1,5g

    Peptone de viande ………………………………1,5g

    Sels biliaires …………………………………1,5g

    Lactose …………………………………..10,0g

    NaCl ………………………………………….5,0g

    Rouge neutre ………………………………0,03g

    Crystal violet ……………………………..0,001g

    Agar ………………………………13,5g pH = 7,1 ± 0,2

    Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1517a.html

    Interprétation Deux résultats peuvent être interprétés :

    Croissance + ou - : o Confirmation du gram : la croissance de la plupart des gram + est inhibée par le Crystal violet; la

    présence de colonies peut donc confirmer un gram – (mais attention, quelques gram + peuvent

    aussi croître sur ce milieu).

    o La croissance de bactéries résistantes aux sels biliaires est une indication de la présence d’entérobactérie (encore là, il y a des exceptions).

    Lactose + ou - : o Lactose + : les bactéries capables de fermenter le lactose rendent le pH acide, et les colonies sont

    alors teintées d’un rose foncé par le colorant Rouge neutre. Parfois, le pH acide fait aussi

    précipiter les sels biliaires autour des colonies et le milieu devient opaque et rosé.

    o Lactose - : Les bactéries qui ne fermentent pas le lactose ne sont pas colorées.

    E. coli

    Lactose + Proteus sp.

    Lactose -

    http://www.quelab.com/htmleng/1517a.html

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    7. Milieux de culture D) GÉLOSE MANNITOL-SEL

    Description Milieu sélectif pour isoler les staphylocoques et milieu différentiel pour distinguer s’ils fermentent ou

    non le mannitol.

    Milieu sélectif : la présence d’une forte concentration en sel inhibe la croissance de la plupart des

    bactéries pour favoriser la croissance des bactéries dites «halophiles» (qui aiment le sel) tels les

    staphylocoques (adaptés au milieu salé de la peau).

    Milieu différentiel : la présence de mannitol et d’un indicateur de pH permet de distinguer les bactéries

    capables de fermenter le mannitol : le milieu passe alors du rose au jaune.

    Utilisation Utilisé en santé humaine et animale pour différencier les espèces de staphylocoques.

    Composition Formule par litre d’eau Peptone de caséine ……………………………5,0g

    Peptone de viande ………………………………5,0g

    Extrait de bœuf …………………………………1,0g

    D-Mannitol …………………………………..10,0g

    NaCl ………………………………………….75,0g

    Rouge phénol ………………………………0,025g

    Agar ………………………………15,0g pH = 7,4 ± 0,2

    Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1858a.html

    Interprétation Deux résultats peuvent être interprétés :

    Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence de staphylocoques. D’autres espèces peuvent croître (ex : Enterococcus sp.) mais leurs colonies sont souvent très petites.

    Mannitol + ou - : les bactéries capables de fermenter le mannitol rendent le pH acide et le Rouge phénol fait passer le milieu du rose au jaune autour des colonies.

    Serratia marcescens

    Croissance -

    Staph. aureus

    Croissance +

    Mannitol +

    Staph. epidermidis

    Croissance +

    Mannitol -

    Strep. agalactiae

    Croissance -

    http://www.quelab.com/htmleng/1858a.html

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    7. Milieux de culture F) Gélose Bacillus cereus (PEMBA)

    Croissance de B. cereus sur milieu PEMBA.

    Description Milieu sélectif et différentiel développé pour détecter spécifiquement la présence de Bacillus cereus

    comme contaminant alimentaire.

    Milieu sélectif : l’antibiotique polymyxine B est l’agent sélectif pour le genre Bacillus.

    Milieu différentiel : la présence de mannitol et du colorant Bleu bromothymol permettent de détecter la

    fermentation du mannitol et l’ajout de jaune d’œuf indique l’activité d’une lécithinase.

    Utilisation Utilisé pour détecter la présence de Bacillus cereus dans l’industrie alimentaire.

    Composition Formule par litre d’eau Peptone de caséine ……………………………1,0g

    Mannitol …………………………………10,0g

    NaCl ………………………………………….2,0g

    MgSO4 ………………………………………….0,1g

    Phosphate de Na, dibasique ……………………………….2,5g

    Phosphate de K, monobasique ………………………….0,25g

    Pyruvate de Na ………………………………….10,0g

    Bleu bromothymol ……………………………………..0,1g

    Agar ………………..……………………………15,0g

    Solution de jaune d’œuf ………………………………50ml

    Antibiotique : Polymyxine B …………………100 000 unités pH = 7,6 ± 0,2

    Réf. http://www.oxoid.com/CA/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0617&c=CA&lang=EN&org=&sec

    =

    Interprétatio

    n

    Trois résultats peuvent être interprétés :

    Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence du genre Bacillus.

    Mannitol + ou - : Le colorant Bleu bromothymol est jaune en milieu acide et bleu-vert en milieu alcalin. Des colonies bleues-vertes indiqueront une absence de fermentation du mannitol, typique de

    Bacillus cereus.

    Lécithinase + ou - : L’apparition d’une opacité du milieu autour des colonies est due à la précipitation du jaune d’œuf, indiquant l’activité d’une lécithinase, typique de B. cereus.

    http://www.oxoid.com/CA/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0617&c=CA&lang=EN&org=&sechttp://www.oxoid.com/CA/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0617&c=CA&lang=EN&org=&sec

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    7. Milieux de culture G) Tubes TSI (triple sugar iron)

    TEST TSI

    1. Prélever une colonie bactérienne à l’aide du fil droit stérile. 2. En piquant avec le fil droit, inoculer le culot d’une gélose inclinée TSI; en sortant le fil de la gélose,

    effectuer une strie sinueuse sur la pente.

    3. Ne pas visser le bouchon complètement. Incuber à 37oC pendant 24 hres et noter vos observations.

    Voir exemples page suivante.

    Description Milieu différentiel utilisé surtout pour distinguer les divers types de bactéries pathogènes entériques,

    bacilles gram -. Il permet de détecter :

    La fermentation d’un des 3 sucres présents et ce, en surface et en profondeur dans le tube

    La production de gaz (au cours de la fermentation)

    La production de H2S

    Composition Formule par litre d’eau Peptone de gélatineine ……………………………5,0g

    Peptone de caséine ………………………………5,0g

    Extrait de levure …………………………………3,0g

    Extrait de bœuf ………………………………………3,0g

    Peptone de viande …………………………………..10,0g

    NaCl ………………………………………….5,0g

    Lactose ……………………………………10,0g

    Saccharose ………………………………10,0g

    Glucose …………………………………………1,0g

    Citrate d’amonium ferrique ……………………..0,2g

    Thiosulfate de Na ………………………..0,2g

    Rouge phénol ……………………………………..0,025g

    Agar ………………..……………………………12,0g pH = 7,3 ± 0,2

    Réf. http://www.quelab.com/htmleng/2354a.html

    Interprétation Quatre résultats doivent être observés :

    Fermentation des sucres : la fermentation d’un des 3 sucres produit des composés acides qui font virer le milieu du rouge au jaune grâce au colorant Rouge phénol. Cette fermentation peut avoir lieu en

    surface (sur la pente de la gélose) et/ou en profondeur (dans le culot). Par convention, on notera un

    milieu jaune «acide» (ou A) et un milieu rouge «alcalin» (ou K, de l’anglais, alkaline); souvent, le

    résultat est noté sous forme de rapport :

    Ex : pente/culot = alcalin/acide ou K/A

    Note : si un dépôt noir (voir production de H2S) empêche de voir la couleur jaune ou rouge, on assume

    que le milieu est jaune (acide, A)

    Production de gaz : la fermentation peut être accompagnée de production de gaz qui se manifeste par des craques dans la gélose ou par le soulèvement de celle-ci. On note le résultat «avec» ou «sans», ou

    encore simplement par + ou -.

    Production de H2S : La production de H2S se manifeste par l’apparition d’un dépôt noir dans la gélose.

    http://www.quelab.com/htmleng/2354a.html

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    7. Milieux de culture G) Tubes TSI (triple sugar iron) EXEMPLES

    # Tube 1 (témoin) 2 3 4 5

    Pente/culot K/K A/A A/A K/A K/A

    Gaz - - + - -

    H2S - - - + +

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    8. TESTS ENZYMATIQUES

    CATALASE

    1. Placer une goutte de H2O2 sur une lame de verre (à godet). 2. Avec une anse de Koch, prélever des bactéries et les disperser dans le H2O2. 3. Observer immédiatement le dégagement de bulles d’O2 pour une réaction positive. 4. NE PAS JETER LA LAME À GODETS : mettre à tremper (solution de javel)

    OXYDASE

    1. Placer un papier absorbant sur une lame et l’imbiber avec le réactif d’oxydase. 2. Avec une anse de Koch, y déposer un prélèvement bactérien pris sur une gélose. 3. Observer l’apparition d’une coloration rosée à pourpre pour une réaction positive.

    COAGULASE

    1. Ensemencer généreusement (2 bouclées si on utilise une culture en bouillon) un tube contenant du plasma de lapin avec EDTA (500 μl)

    2. Incuber à 35 ± 1°C et examiner les tubes après un minimum de 4 heures. Les tubes négatifs sont incubés jusqu’à 24 heures.

    3. La formation d’un caillot ferme et distinct est considérée comme une réaction de coagulase positive. À ce moment, aucune confirmation n’est nécessaire. Cette réaction peut être visible après 3 à 4

    heures d’incubation mais ne peut être considérée négative avant 18 heures à 35 ± 1°C.

    TEST PRINCIPE ET INTERPRÉTATION

    1. Catalase Les bactéries possédant l’enzyme catalase peuvent transformer le peroxyde d’hydrogène, H2O2 (toxique), en H2O et O2, lequel est dégagé sous forme de gaz et entraîne la formation de bulles. On les dit « catalase + »

    Test utilisé en présence de coques gram+ pour différencier les staphylocoques (catalase+) des

    streptocoques (catalase -).

    Test aussi utilisé en présence de petits bacilles gram+ pour différencier divers genres bactériens.

    2. Oxydase Les bactéries possédant l’enzyme cytochrome oxydase peuvent oxyder plusieurs réactifs. Le réactif utilisé dans ce test donne une coloration pourpre foncée lors de son oxydation. On les dit « oxydase + »

    Test utilisé pour distinguer divers groupes de bacilles gram-. Une réaction «oxydase -» est typique des

    bactéries de la famille des Enterobacteriacées.

    3. Coagulase Les bactéries possédant l’enzyme coagulase peuvent provoquer la coagulation du plasma. On les dit «coagulase +».

    Test utilisé pour distinguer Staphylococcus aureus (coagulase +) de la plupart des autres espèces de

    Staphylococcus (coagulase -)

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    16

    9. CULTURE ANAÉROBIE

    BESOINS EN OXYGÈNE

    Types de

    bactéries Milieu

    Métabolisme

    énergétique Équation générale

    Rendement

    énergétique

    Aérobies

    Facultatives

    Anaérobies

    Aérobie

    +O2

    Respiration

    cellulaire C6H12O6 + O2 CO2 + H2O

    38

    ATP/glucose

    Anaérobie

    -O2 Fermentation

    C6H12O6 (CO2) + Composé organique

    (éthanol, ac. lactique, méthane, etc.)

    2

    ATP/glucose

    Gélose droite. On peut ensemencer des bactéries dans des tubes de gélose nutritive («géloses droites»). L’oxygène

    diffuse très peu à travers la gélose de telle sorte qu’il y a un gradient de concentration décroissant qui

    s’établit à partir de la surface vers le fond du tube; le fond constitue un milieu quasi anaérobie. Après

    incubation, on pourra observer la croissance à divers endroits dans la gélose selon les besoins en O2 des

    bactéries :

    1. Les aérobies obligatoires croissent à la surface. 2. Les anaérobies obligatoires croissent au fond de la gélose. 3. Les facultatives s’observent sur toute la profondeur; elles se

    rassemblent le plus souvent au bout supérieur de l'éprouvette,

    là où la respiration aérobie est possible et fournit plus

    d’énergie que la fermentation effectuée plus en profondeur.

    On distingue aussi 2 autres cas, peu fréquents dans le domaine

    de la santé :

    4. Les microaérophiles se regroupent près de la partie supérieure car elles n'ont besoin que d'une concentration minime en oxygène pour vivre.

    5. Les bactéries anaérobies aérotolérantes se disposent de manière homogène dans l'éprouvette puisque l'oxygène n'a aucun effet sur eux.

    Chambre anaérobie. On peut incuber des géloses en boîtes de Pétri à

    l’intérieur de contenants hermétiques dans lesquels

    on enlève l’O2 à l’aide de systèmes réactionnels tels

    que celui qui est illustré ici.

    1. Les aérobies obligatoires ne peuvent y croître. 2. Les anaérobies obligatoires pourront y croître

    alors qu’elles ne pourront croître en présence

    dO2.

    3. Les facultatives pourront croître mais plus lentement qu’en présence d’O2, puisque la

    respiration cellulaire fournit plus d’énergie que

    le processus de fermentation.

    Bouillon thioglycollate. Enfin, on peut cultiver des bactéries anaérobies dans un bouillon nutritif contenant du thioglycollate; ce

    composé fixe l’O2 et rend le milieu anaérobie.

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    17

    10. ANTIBIOGRAMME

    1. INTRODUCTION

    L’antibiogramme est une méthode servant à déterminer la sensibilité

    d’une bactérie à divers antibiotiques. Il est particulièrement utile

    lorsqu’on se rend compte qu’un antibiotique n’est plus efficace pour

    guérir une infection ou encore lorsqu’on veut choisir un antibiotique

    approprié dès le début du traitement et que l’on n’est pas certain de

    l’identité de la bactérie responsable de l’infection.

    Le principe est simple : des papiers-buvards imbibés de quantités

    connues de divers antibiotiques sont déposés à la surface d’une

    culture fraîchement ensemencée. Si la bactérie est sensible, une zone

    d’inhibition de croissance sera observée autour du papier-buvard

    (voir figure ci-contre). Des normes internationales standardisées nous

    permettent de déterminer, selon la grandeur du diamètre de la zone

    d’inhibition, si la bactérie est résistante, moyennement sensible ou très sensible à l’antibiotique (voir page

    suivante).

    2. MANIPULATIONS

    1) À l’aide d’un écouvillon, prélever un échantillon de la bactérie inconnue et ensemencer une gélose de façon à former un tapis bactérien.

    2) À l’aide de pinces stérilisées (flambées à l’alcool) et/ou d’un distributeur automatique, disposer les papiers buvards sur la gélose : ils doivent être placés en périphérie (1,0 cm du bord) et à au moins 2,0

    cm les uns des autres.

    3) À l’aide de pinces stérilisées, appuyer légèrement sur les disques de papier pour qu’ils adhèrent bien à la surface de la gélose (sans pour autant qu’ils s’y enfoncent).

    4) Incuber selon les conditions appropriées pendant 24 heures.

    3. RÉSULTATS

    Mesurer le diamètre (mm) de chacune des zones d’inhibition de croissance.

    À l’aide d’une chartre de valeurs standardisées (voir page suivante), déterminer le degré de sensibilité de la bactérie aux antibiotiques testés (sensible, moyennement sensible ou résistante).

    ZONE D’INHIBITION

    ANTIBIOTIQUES

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    18

    4. CHARTRE D’INTERPRÉTATION DES ANTIBIOGRAMMES

    PELCZAR M.J. et CHAN E.C.S. Eléments de microbiologie, HRW, Montréal, 1982.

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