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FML 13-12-04
PCR Quantitative
F Martin-Laurent et D Bru
UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email
Démonstration de PCR quantitative
1. Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)
2. Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)
3. Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent)
4. Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru
Principe de la PCR conventionnelle
Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces
Elongation
Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol
72°C
55°C
95°C
72°C
x 35 cycles
Séparation électrophorétique
FML 13-12-04
PCR conventionnelle versus PCR quantitative
Analyse en point final sur gel d’agarose
Phase exponentielle
Phase linéaire
Phase plateau
Analyse dynamique de la PCR quantitative
-haute précision pendant la phase exponentielle
-variabilité importante à la phase plateau
FML 13-12-04
PCR quantitative avec une sonde TaqMan®
Cette méthode repose sur deux principes :-la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)-l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA
-Spécificité l’amorce pour la PCR-Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
FML 13-12-04
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
-FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Fluorescence
Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
FML 13-12-04
Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
RQ
-lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML 13-12-04
nm
Abs
orbt
ion Fluorescence
475 550
FAM
nm550 600
Abs
orbt
ion Fluorescence
TAMRA
-Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher
-FRET
Mécanisme de quenching
Excitation
Émission
FR
ET
FML 13-12-04
TaqMan® MGB probes
NFQ non fluorescent quencherNouvelle innovation
MGB minor groove binderstabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’)sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)
NFQR
MGB
FML 13-12-04
PCR quantitative SYBR ®Green
Mesure de fluorescence en fin d’élongation
FML 13-12-04
TaqMan ® versus SYBR ® Green
TaqMan ® SYBR ® Green
Spécificité -fixation des amorces,-hybridation de la sonde,-conditions PCR
-fixation des amorces,--conditions PCR
Flexibilité -multiplexe,-détection de SNP,-
---utilisation d’amorces dégénérées
Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé-vérifier la formation de dimère d’amorces
FML 13-12-04
ROX™ comme référence passive
Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…)
ROX
Echantillon 2
FAM
ROX
Echantillon 1
FAM
Flu
ores
cenc
e
Flu
ores
cenc
eRn
Rn
Rn= Reporter / Passive référence
FML 13-12-04
Détermination du Ct (cycle seuil)
Bruit de fond
cycle
Rn
10 2O 3O 4O 5O
1
2
3
4
Ligne de base
Ct
La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence
FML 13-12-04
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents
Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
Nombre de cycles
Flu
ores
cen
ce é
mis
e (U
A)
101106 105 104 103 102
Nom
bre
de
cop
ies
(log
)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38
Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998
Ct
FML 13-12-04
Quantification absolue
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
Nom
bre
de
cop
ies
(log
)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38
Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998
Nombre de cycles
Flu
ores
cen
ce é
mis
e (U
A)
101106 105 104 103 102Ct
Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible
FML 13-12-04
Efficacité de la PCR quantitative
Nom
bre
de
cop
ies
(log
)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38
Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26Ct + 10,85R2= 0,998
Efficacité = 10(-pente) -1
Exemplepente = -0.26E = 10(0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 %
atzA
Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 %
FML 13-12-04
PCR efficace à 100%
y = x (1 + E)n
cas spécifique E = 1 alorsy = x 2n
y=nombre de copie du gène cible
x=nombre de copie initiale
E=efficacité
n=nombre de cycle PCR
Quand E = 1 alors :
Ct = + 1 augmentation x2
Ct= + 3.32 augmentation x10
FML 13-12-04
Quantification relative
o pas besoin de courbe de standardo calcul des résultats pas comparaisons des Cto nécessité de définir :
- un gène cible servant de contrôle endogène,- un gène cible servant de standard.
le contrôle endogène :
- donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc),
- est présent en quantité constante dans tous les échantillons,
- normalise :
- les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)
- les variations d’éfficacité de transcription inverse
FML 13-12-04
Standard
t=0 t=2 t=4 t=7 t=14 t=21
-t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,-t0 sera utilisé comme valeur standard
FML 13-12-04
Contrôle endogène
Gène cible
Ct = 22 – 16 = 6
Ct=16 Ct=22 Cycle
Rn
Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène
Ct=16 Ct=22 Cycle
Rn
Ct=21Ct=15
Contrôle endogène
Gène cible
Ct = 21 – 15 = 6
Si 2 x plus de matrice ?
FML 13-12-04
Comparaison de Ct
Ct=16 Ct=26 Cycle
Rnt2
Ct=12 Ct=22 Cycle
Rnt4
Ct=15 Ct=31 Cycle
Rnt7
Ct=16 Ct=32 Cycle
Rnt0
Contrôle endogène Gène cible FML 13-12-04
Comparaison de Ct
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène
Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct
Etape 2: normalisation par rapport au standard
Ct échantillon - Ct standard = Ct
Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible
2-Ct
FML 13-12-04
Quantification relative des résultats
64 64
1 1
standard
Au
gmen
tati
on p
ar x
t0
t2
t4
t7
FML 13-12-04
Exercice (1/4)
Contrôle
16S rRNA Ct 14
atzA Ct 32
Atrazine
16S rRNA Ct 16
atzA Ct29
Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ?
16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène….
FML 13-12-04
Contrôle
16S rRNA Ct 14
atzA Ct 32
Atrazine
16S rRNA Ct 16
atzA Ct29
Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2
2Ct 16SrRNA = 22 = 4
La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine.
Exercice (2/4)
FML 13-12-04
Exercice (3/4)
Contrôle
16S rRNA Ct 14
atzA Ct 32
Atrazine
16S rRNA Ct 16
atzA Ct29
Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de
la séquence atzA ?
FML 13-12-04
Exercice (4/4)
Contrôle
16S rRNA Ct 14
atzA Ct 32
Atrazine
16S rRNA Ct 16
atzA Ct29
Ct contrôle= 32 – 14 = 18
Ct atrazine= 29 – 16 = 13
Ct = 18 – 13 = 5
2Ct = 25 = 32
Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle
FML 13-12-04
Analyse de la structure des communautés microbiennes
RISA :
Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
Amplification PCR
Amorces universelles : 38f et 72r
IGS
3’
5’
A 16 S 23 S
5’
3’
IGS
B 16 S 23 S
12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50
0.404
1.114
MM
MM
MM
MM
0.900
0.124
0.147
0.190
0.242
kpb
• Profils de bandes complexes
• numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes)
FML 13-12-04
LP FP HPU LDSS LDCSS
LDCSS-HAP
SS100SS10FMU
IA
900
692
501484
404
320
L
La BouzulePierrelayeCouhins
Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
U : contrôleFM : fumier 10t/h/anSS10 : boue 10t/h/anSS100 : boue 100t/h/an
LP : pollution faibleFP : pollution moyenneHP : pollution élevée
U : contrôleLDSS : boue deshydratéeLDCSS : boue deshydratée compostéeLDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP
FML 13-12-04
-0.15
0.25-0.25 0.15
HP
FP
LP
PC1 30%
PC2
21%
Pierrelaye
-0.2
0.16-0.16 0.35
FM
U
SS10
SS100
PC2
15.2
%
PC1 45.3%
Couhins
Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
La Bouzule
-0.15
0.16-0.16 0.16
U
LDSS
LDCSS
LDCSS-HAP
PC1 30%
PC2
20%
U : contrôleFM : fumier 10t/h/anSS10 : boue 10t/h/anSS100 : boue 100t/h/an
LP : pollution faibleFP : pollution moyenneHP : pollution élevée
U : contrôleLDSS : boue deshydratéeLDCSS : boue deshydratée compostéeLDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP
FML 13-12-04
Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
0
20
40
60
80
0 20 40 60 80
Time (day)
%cu
mu
lati
ve
14C
O2
HP
FP
LP
0
20
40
60
80
0 20 40 60 80
Time (day)
% c
um
ula
tive
14
CO
2
U
SS10
SS100
FM
0
20
40
60
80
0 20 40 60 80
Time (day)
% c
um
ula
tive
14C
O2
U
LDSS
LDCSS
LDCSS+HAP
La Bouzule
PierrelayeCouhins
FML 13-12-04
Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
0,0E+00
2,0E+04
4,0E+04
6,0E+04
8,0E+04
1,0E+05
atzA atzB atzC
Gene target
atz
(co
py
nu
mb
er.
g-1
of
soil
)
U
FM
SS10
SS100
a aa a
a
babab
ab ba
ab
0,0E+00
2,0E+04
4,0E+04
6,0E+04
8,0E+04
1,0E+05
atzA atzB atzC
Gene target
atz
(co
py
nu
mb
er.
g-1
of
soil
)
LP
FP
HP
a
b
b
bb
bb
a
a
0,0E+00
2,0E+04
4,0E+04
6,0E+04
8,0E+04
1,0E+05
atzA atzB atzC
Gene target
atz
(co
py
nu
mb
er.
g-1
of
soil
)
U
LDSS
LDCSS
LDCSS-Hap
a a aa
abab
bb
b baa
FML 13-12-04
1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents
2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
Nombre de cycles
Flu
ores
cen
ce é
mis
e (U
A)
101106 105 104 103 102
Nom
bre
de
cop
ies
(log
)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38
Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998
PRINCIPE DE LA RT-qPCR
1 ARNm = 1 ADNc
Ct
FML 13-12-04
NN
N NHCH2CH3(CH3)2CH2HN
Cl
atrazine
OH
NN
N NHCH2CH3(CH3)2CH2HN
Hydroxyatrazine
atzA
Acide cyanurique
N-isopropylammélide
NN
N OH(CH3)2CH2HN
OH
atzB
HO
NN
N OH
OH
atzC
CO2 + NH4+
atzF
NH
OO
Biuret
NH2
atzD
atzE
O
NH
OO
H2N
Allophanate
-
VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE
H2N
FML 13-12-04
P .ADP
0
2 000 000
4 000 000
6 000 000
8 000 000
0 100 200 300
C. heintzi i
0
200 000
400 000
600 000
800 000
0 100 200 300
Niveau d’expression de l’ADNr 16S
la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience
L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps
Temps (min) Temps (min)
ARNr 16S / ng d’ARN extrait
FML 13-12-04
Niveau d’expression des gènes atzA, B et C
L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE
P.ADP• - ATRAZINE :Expression basale des gènes atz• + ATRAZINE : Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz
0
200
400
600
800
1 000
0 100 200 300 400
0
50
100 150
200
250
300
0 200 400
0
200
400
600
800
0 200 400
Temps (min)
Temps (min)
Temps (min)
AR
Nm
/106 A
RN
r 16
SA
RN
m /1
06 AR
Nr
16S
AR
Nm
/106 A
RN
r 16
S atzA
atzB
atzC
P.ADP
C. heintzii• - ATRAZINE :seul atzA s’exprime • + ATRAZINE :Augmentation de l’expression des gènes atzA et BPas d’expression d’atzC
0
10 000
20 000
30 000
40 000
0 200 400
0
2 000
4 000
6 000
8 000
10 000
12 000
0 200 400
0
1
0 200 400Temps (min)
Temps (min)
Temps (min)
AR
Nm
/106 A
RN
r 16
SA
RN
m /1
06 AR
Nr
16S
AR
Nm
/106 A
RN
r 16
S atzA
atzB
atzC
C. heintzii
FML 13-12-04
atzD
0
500
1 000
1 500
2 000
0 100 200 300 400
Time (min)
Rel
ativ
e n
um
ber
of
mR
NA
b bb
b b
ab
ab
a
a
aa
a
atzF
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 100 200 300 400
Time (min)
Rel
ativ
e n
um
ber
of
mR
NA
atzE
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 100 200 300 400
Time (min)
Rel
ativ
e n
um
ber
of
mR
NA
a a
a
a
abab b
bbb
Temps (min)
Niveau d’expression des gènes atzD, E et F
En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale
L’expression d’atzD et atzE augmentent 300 min après l’ajout d’atrazine
x 20
x 150
L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine
Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient
FML 13-12-04