Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila

Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ;Science 287, 1837 (2000)

INTRODUCTIONVisée de l’article

Introduction

• Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC

• Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie

• Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype

• Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain

DESCRIPTION DE LA MÉTHODEDescription et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln

Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln

• Lignées comportant des polyCAG– 20 répétitions : lignée 20Q (normales)– 127 répétitions : lignée 127Q (augmentées)

• Après traduction des ARNm, obtention de polyglutamines de ces 2 types

• Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux

Rappel : Mutagénèse par élément PPied P

w+

Site de clonage

Pied P

Origine de réplication

AmpiR

Plasmide avec Elément P

Transposase

Source de Transposase

A Pw-

Embryon de drosophile

Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques

Lignée UAS-polyCAG

5’ 3’

Poly CAG Promoteur UAS HA

Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

• Insertion d’un élément P contenant :– Promoteur UAS– Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions)– Séquence codant pour un épitope de

l’hémagglutinine (HA)

Lignée GMR-Gal4

• Insertion d’un élément P contenant : – Promoteur GMR (expression au niveau des yeux)– Séquence GAL4 codant pour la protéine GAL4

5’ 3’

GAL 4 Promoteur GMR

Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

Croisement des 2 lignées

• Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique)

• Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil.

• Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4

5’ 3’

Poly CAGPoly CAGUASUAS HAHA

5’ 3’

GAL 4GAL 4GMRGMR

Facteur de transcription spécifique de l’œil

Transcription de GAL4

Protéine Gal4

ARNm Gal4ARNm Gal4

Traduction de l’ARNm Gal4

Induction de la transcription

Induction de la transcription

Poly CAGPoly CAG HAHAARNm

Transcription

Traduction

Polyglutamine avec épitope HA

RÉSULTATSElaboration des lignées transgéniques poly-Gln

Phénotypes obtenus après croisement

• Lignées 20Q : [sauvage]• Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines]

Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODECriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs

Création des lignées transgéniques à testée

• 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes)

• Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes.

• Croisement avec les lignées 127 Q

RÉSULTATSCriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs

Lignées intéressantes

Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve :• 29 lignées « Enhancer »• 30 lignées « Suppresseur »

• On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220

TECHNIQUES D’OBSERVATION

Mise en évidence des différents phénotypes

• Aspect extérieur : microscopie optique, et MEB

• Immunohistologie et observation microscopique : DAPI et FITC

Microscopie photonique

Microscopie électronique à balayages

FITC (Fluorescein isothiocyanate)

DAPI (Di aminido phényl indol)

Résultats

Lignée EU3500

• Code pour HDJ1 (en 3’ de EU3500) : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain

• Domaine J en NH2 terminal (jonction)

Lignée EU3220

• Code pour DTPR2 (en 3’ de EU3220) : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2)

• Domaine J en COOH terminal

DISCUSSION

Implication du domaine J

• Responsable la suppression• Domaine présent sur les HSP• Etudes complémentaires in vitro : domaine J

supprime les agrégations par fixation des protéines agrégées

• Ici dHdj1 ou dtpr2 se lieraient donc aux polyglutamines pour les empêcher de former des agrégats

CONCLUSION

Gènes suppresseurs déterminés

• Croisement de mouches présentant un phénotype à supprimer, par des mouches possédant chacune un élément P différent

• Détermination des descendants présentant un phénotype supprimé

• On peut déterminer quel gène est impliqué dans la suppression du phénotype mutant

Vers un traitement?

• Agrégats de polyglutamine = gain de fonction• On ne peut pas insérer un gène pour le

traiter : thérapie génique impossible• On pourrait tenter de surexprimer un gène

pour supprimer le phénotype. Problème : pléiotropie

• Difficile

THE END