Giovana Krempel Fonseca Merighe - USP · 2007. 12. 11. · no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear. / Giovana Krempel Fonseca Merighe

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Giovana Krempel Fonseca Merighe

Passagem celular, sexo e transcrição X-específica interferem no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear

Pirassununga

2007

Giovana Krempel Fonseca Merighe

Passagem celular, sexo e transcrição X-específica interferem no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear

Tese de Doutorado apresentada à Comissão de Pós Graduação da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor em Zootecnia, na área de concentração: Qualidade e Produtividade Animal.

Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles Orientador

Pirassununga

2007

ii

FICHA CATALOGRÁFICA preparada pela

Biblioteca da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo

Merighe, Giovana Krempel Fonseca M561p Passagem celular, sexo e transcrição X-específica interferem

no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear. / Giovana Krempel Fonseca Merighe - Pirassununga, 2007.

111 f. Tese (Doutorado) -- Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - Universidade de São Paulo. Departamento de Ciências Básicas. Área de Concentração: Qualidade e Produtividade Animal. Orientador: Flávio Vieira Meirelles. Unitermos: 1. Transferência nuclear 2. Bovino 3. Passagem celular 4. Sexo 5. Cromossomo X 6. Expressão gênica. I. Título.

iii

AGRADEÇO A DEUS,

Criador Universal que por sua infinita

bondade permitiu esta vitória pela qual me doei.

iv

DEDICO

Ao meu marido MAURICIO MERIGHE,

Por ser a melhor pessoa do mundo; por me fazer abundantemente feliz estando ao meu lado;

pelos momentos que compartilhamos, sendo alegres ou tristes; pelos sonhos adiados,

pelo amor que dá o real sentido a vida.

v

DEDICO

Aos meus pais ANTONIO e DORA,

À minha irmã CRISTIANE

Fortaleza presente em toda minha vida... Na segurança de um lar bem estruturado,

moldaram meu caráter e minha personalidade. Todas as minhas realizações eu devo ao amor,

carinho e apoio que sempre me dedicaram.

vi

AGRADECIMENTO ESPECIAL

AO PROF. DR. FLÁVIO VIEIRA MEIRELLES

Agradeço a credibilidade em mim depositada; mais que

um orientador, despertou em mim o espírito do poder de realização e me fez acreditar em novos horizontes para meus conhecimentos.

Agradecimentos

vii

Prof. Dr. José Bento Sterman Ferraz, por quem tenho grande respeito e

admiração, conselheiro ímpar nas decisões importantes, não poupando esforços

para que o ideal se concretizasse.

Dra. Yeda F. Watanabe, motivadora fundamental, agradeço pelos

ensinamentos, pela confiança e amizade que foram alicerces deste trabalho.

Profa. Dra. Claudia Lima Verde Leal e Prof. Dr. Luis Felipe Prada e Silva pela

preciosa contribuição durante a qualificação.

Prof. Dr. Júlio César de C. Balieiro, pela orientação nas análises estatísticas, e

pelas palavras sábias e amigas.

Prof. Dr. Antonio Augusto Mendes Maia, incentivador constante dos meus

objetivos.

Profa. Dra. Elyara Maria Pereira da Silva, por me apresentar o caminho para

pesquisa.

Fernando Henrique Biase e Weruska Karina Freitas Santos Biase, pelo

compartilhamento de seus conhecimentos, sendo imprescindíveis para a

concretização deste trabalho. Agradeço a amizade sincera e incondicional.

Moyses dos Santos Miranda e Tiago Henrique Câmara de Bem, colaboradores

fundamentais para a realização deste trabalho.

Felipe Perecin e Simone Cristina Méo Niciura, pelas discussões e

compartilhamento das experiências adquiridas.

Amigos do ZAB, Aldo, Andréa, China, Elisangela, Márcia, Mirele, Nathália, Nilton,

Rafael, Ricardo, Sandra, Silvana e Rosângela, pelo apoio, incentivo e

companheirismo de sempre.

Soraya Brites Loureiro Raspantini, por quem tenho grande respeito e admiração,

agradeço a confiança, o apoio e a disposição incansável.

viii

Adriana Roberta, pela amizade e por tornar a convivência do dia-a-dia

extremamente agradável e bem-humorada.

Colegas do LMMD, que de uma maneira ou de outra me mostraram as

dificuldades das relações inter-pessoais e me ensinaram a enxergar o que

realmente tem valor.

Conceição e Layla, pela paciência e atenção dispensadas.

Colegas da Biblioteca, pela atenção e auxílios prestados.

Colegas da FZEA, pelo apoio e incentivo.

Nucleogen, pela preciosa parceria sem a qual este trabalho não seria realizado.

Comissão de Pós-Graduação da FZEA, colaboradores significativos na aquisição

de materiais utilizados.

FAPESP, financiadora de parte do projeto.

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São

Paulo, Campus de Pirassununga, em especial, ao Departamento de Ciências

Básicas por ser a casa onde recebo oportunidades inigualáveis de crescer

profissionalmente.

ix

Sumário

Lista de Figuras ...........................................................................................................................xii

Lista de Tabelas........................................................................................................................xvii

Introdução Geral ....................................................................................................................xviii

CAPÍTULO 1

Efeito do número da passagem e do sexo de fibroblastos no desenvolvimento de

embriões bovinos produzidos por transferência nuclear..................................................01

Resumo.......................................................................................................................................02

Abstract ......................................................................................................................................04

1. Introdução.............................................................................................................................05

2. Revisão de Literatura ...........................................................................................................06

3.Objetivos .................................................................................................................................12

3.1 Objetivo Geral................................................................................................................12

3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................12

4. Hipóteses................................................................................................................................13

5. Material e Métodos..............................................................................................................14

5.1 Produção dos embriões ...............................................................................................14

5.1.1 Maturação in vitro...............................................................................................14

5.1.2 Transferência nuclear .........................................................................................14

5.1.3 Eletrofusão e Ativação Química ......................................................................15

5.1.4 Células doadoras ................................................................................................15

5.2 Sincronização do cio e transferência dos embriões...............................................17

5.3 Análise Estatística...........................................................................................................18

6. Resultados..............................................................................................................................19

6.1 Efeito do número da passagem dos fibroblastos....................................................19

6.2 Efeito do sexo dos fibroblastos ....................................................................................23

7. Discussão................................................................................................................................27

7.1 Efeito do número da passagem dos fibroblastos....................................................27

7.2 Efeito do sexo dos fibroblastos ....................................................................................29

8. Conclusões ............................................................................................................................34

9. Perspectivas...........................................................................................................................34

10. Referências Bibliográficas.................................................................................................35

x

CAPÍTULO 2

Efeito da reprogramação nuclear na expressão de genes relacionados ao

cromossomo X em embriões bovinos produzidos in vitro ................................................46

Resumo.......................................................................................................................................47

Abstract ......................................................................................................................................49

1. Introdução..........................................................................................................................50

2. Revisão de Literatura ........................................................................................................52

2.1 Transcrito Específico da Inativação (XIST)...........................................................55

2.2 Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD) e Hipoxantina

Fosforribosiltransferase (HPRT) ................................................................................58

2.3 Interferon-tau (IFN-τ)................................................................................................62

3. Objetivos .............................................................................................................................67

3.1 Objetivo Geral .............................................................................................................67

3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................67

4. Hipótese ..............................................................................................................................68

5. Material e Métodos...........................................................................................................69

5.1 Produção dos embriões por fecundação in vitro .............................................69

5.1.1 Maturação in vitro..........................................................................................69

5.1.2 Fecundação in vitro.......................................................................................69

5.1.3 Cultivo in vitro..................................................................................................70

5.2 Produção dos embriões por transferência nuclear ..........................................71

5.2.1 Maturação in vitro..........................................................................................71

5.2.2 Transferência nuclear ....................................................................................71

5.2.3 Eletrofusão e ativação química ..................................................................72

5.2.4 Células doadoras ...........................................................................................72

5.3 Armazenamento e sexagem dos embriões .......................................................74

5.3.1 Armazenamento dos embriões ...................................................................74

5.3.2 Sexagem dos embriões produzidos por fecundação in vitro ................74

5.4 Análise da expressão gênica ................................................................................75

5.4.1 Amplificação do RNA....................................................................................75

5.4.2 Transcrição reversa ........................................................................................77

5.4.3 Amplificação do cDNA dos genes de interesse ......................................77

5.5 Análise estatística........................................................................................................79

6. Resultados...........................................................................................................................82

xi

6.1 Sexagem dos embriões produzidos por fecundação in vitro ...................82

6.2 Amplificação do cDNA dos genes de interesse .........................................83

7. Discussão.............................................................................................................................87

8. Modelos Hipotéticos .........................................................................................................94

9. Conclusões .........................................................................................................................96

10. Perspectivas .......................................................................................................................96

11. Referências Bibliográficas................................................................................................97

xii

Lista de Figuras

Figura 1. Ilustração das diferentes etapas do processo de transferência nuclear. (a)

Oócito no estádio de metáfase II antes da enucleação. (b) Aspiração do

corpúsculo polar e citoplasma adjacente. (c) Oócito enucleado. (d) Controle

fluorescente da presença dos cromossomos em metáfase dentro da pipeta de

micromanipulação após coloração do DNA. (e) Cultivo de fibroblastos bovinos a

partir de biópsia da prega da cauda. (f) Células doadoras isoladas da cultura de

fibroblastos. (g) Inserção da célula doadora no espaço perivitelino do oócito

enucleado. (h) Fusão da célula doadora com o citoplasma receptor. (i) Primeira

clivagem do embrião reconstituído. (j) Blastocisto produzido por transferência

nuclear desenvolvido in vitro. (k) Bezerros produzidos por transferência nuclear

(modificado de HEYMAN, 2005) ............................................................................................16

Figura 2. Esquema resumido do cronograma de sincronização do cio dos animais

utilizados como receptoras dos embriões produzidos por transferência nuclear .......18

Figura 3. Taxas clivagem, 8 células e formação de blastocisto de embriões

submetidos à transferência nuclear com células somáticas em diferentes passagens.

Estas porcentagens foram calculadas sobre zigotos efetivamente reconstituídos

(fundidos; iniciais = 3ª a 5ª passagens; intermediárias = 6ª a 8ª passagens e tardias =

9ª a 12ª passagens) ..................................................................................................................20

Figura 4. Taxas de prenhez aos 30 dias, gestação a termo e sobrevivência pós

nascimento de embriões submetidos a transferência nuclear com células somáticas

em diferentes passagens (iniciais = 3ª a 5ª passagens; intermediárias = 6ª a 8ª

passagens e tardias = 9ª a 12ª passagens)..........................................................................21

Figura 5. Evolução da gestação de receptoras após a transferência de embriões

bovinos produzidos a partir de transferência nuclear de células somáticas

submetidas a diferentes períodos de cultivo in vitro. A seta indica o intervalo de

maior perda gestacional ........................................................................................................22

xiii

Figura 6. Taxas de clivagem, 8 células e formação de blastocisto de embriões

submetidos à transferência nuclear a partir de células doadoras de núcleos

femininas e masculinas............................................................................................................24

Figura 7. Taxas de prenhez, gestação a termo e sobrevivência após o nascimento

de embriões submetidos à transferência nuclear a partir de células doadoras de

núcleos femininas e masculinas.............................................................................................25


bovinos machos e fêmeas produzidos a partir de transferência nuclear de células

somáticas ...................................................................................................................................26

Figura 9. Principais pontos de perda gestacional influenciados pelo sexo de

embriões bovinos machos e fêmeas submetidos à transferência nuclear. A perda

gestacional no período entre 30 e 90 dias foi considerada independente do sexo. As

setas indicam o valor de p para as taxas de aborto de fêmeas em comparação

com machos. O período de 90 a 150 dias foi considerado um ponto crítico para a

perda gestacional em fêmeas por apresentar p < 0,01 ...................................................32

Figura 10. Organogênese do desenvolvimento embrionário e fetal pós-implantação,

evidenciando os períodos críticos durante a gestação...................................................33

Figura 11. Escolha do Xa (cromossomo X ativo) pelo fator de bloqueio. (A) Fator de

bloqueio (BF), codificado autossomicamente, é produzido em quantidades

suficientes para escolher um Xa. (B) Durante o processo de escolha do Xa, ambos os

cromossomos X competem pelo fator de bloqueio na região cis-atuante

descriminada como elemento de contagem (EC). A interação do fator de bloqueio

com o elemento de contagem define a escolha do Xa. Neste momento, moléculas

de RNA estão sendo produzidas, porém estão restritas ao local de transcrição. (C)

No próximo passo, a atividade do RNA é reprimida no Xa eleito mediante sua

modificação pelo fator de bloqueio, e a expressão de XIST é, então, cessada. O

RNA do Xi (X inativo) reveste o cromossomo, levando à inativação de seus genes

(modificado de PLATH et al., 2002) .......................................................................................56

xiv

Figura 12. Participação da G6PD no ciclo das pentoses. GSH = Glutationa reduzida

(atividade anti-oxidante); GSSH = Glutationa oxidada; H2O2 = peróxido de

hidrogênio; NADP+ = nicotinamida adenina difosfato; NADPH = nicotinamida

adenina difosfato reduzida (modificado de VOGEL e MOTULSKY, 1997)......................58

Figura 13. Participação da HPRT da via de recuperação das purinas. A enzima

produzida por este gene converte bases purinas livres nas células aos seus 5’-

mononucleotídeos correspondentes (modificado de VOGEL e MOTULSKY, 1997)....61

Figura 14. Representação esquemática do cromossomo X e a localização dos

genes estudados XIST, G6PD e HPRT .....................................................................................62

Figura 15. Ilustração das diferentes etapas do processo de produção de embriões a

partir de fecundação in vitro. (a) Aspiração dos folículos ovarianos. (b) Fluído

folicular contendo oócitos. (c) Oócito selecionado no estádio imaturo. (d) Oócito no

estádio de metáfase II antes da fecundação. (e) Confirmação fluorescente da

presença dos cromossomos em metáfase II e da extrusão do 1º corpúsculo polar. (f)

Preparação do gradiente de percoll. (g) Seleção dos espermatozóides viáveis por

centrifugação do gradiente de Percoll. (h) Blastocistos produzidos por fecundação

in vitro. (i) Armazenamento individual de blastocistos eclodidos no 9º dia de cultivo

in vitro para posterior análise de expressão gênica ..........................................................70



corpúsculo polar e citoplasma adjacente. (c) Oócito enucleado. (d) Controle

fluorescente da presença dos cromossomos em metáfase dentro da pipeta de






nuclear desenvolvido in vitro. (k) Armazenamento individual de blastocistos

eclodidos no 9º dia de cultivo in vitro para posterior análise de expressão gênica

(modificado de HEYMAN, 2005) ............................................................................................73

xv

Figura 17. Esquema do protocolo utilizado para amplificação do RNA obtido a partir

de um único embrião no estádio de blastocisto eclodido no nono dia de cultivo....76

Figura 18. Protocolo utilizado no sistema de PCR em tempo real para amplificação

do cDNA obtido a partir do RNA amplificado de um único embrião no estádio de

blastocisto eclodido no nono dia de cultivo ......................................................................78

Figura 19. Curva de regressão linear utilizando o programa LinRegPCR. Os limites

superior e inferior da janela de linearidade foram utilizados para os cálculos da

eficiência da reação de PCR e índice de correlação da curva ...................................80

Figura 20. Curva de amplificação obtida a partir de uma reação em cadeia da

polimerase apresentada em tempo real. O limiar de fluorescência corresponde ao

ponto médio da janela de linearidade (região de amplificação exponencial), onde

a eficiência da PCR é maior. O ciclo em que cada curva de amplificação atravessa

o limiar de fluorescência serve como base para comparação entre as amostras ....81

Figura 21. Eletroforese dos fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de

oligonucleotídeos iniciadores específicos para identificarem machos e fêmeas da

espécie bovina. (♀) Fragmento de DNA de fêmea amplificado apenas pelo

oligonucleotídeo específico para bovinos (♂) Fragmentos de DNA de machos

amplificados tanto pelo oligonucleotídeo específico de bovinos quanto específico

para machos.............................................................................................................................82

Figura 22. Eletroforese dos fragmentos de cDNA amplificados por PCR em tempo

real a partir de oligonucleotídeos iniciadores específicos dos genes XIST, IFN-τ, G6PD

e HPRT em bovinos ...................................................................................................................83

Figura 23. Expressão relativa do transcrito do gene XIST em blastocistos bovinos

produzidos por transferência nuclear e por fecundação in vitro. Letras distintas

indicam diferença significativa entre os grupos (p < 0,05)...............................................84

xvi

Figura 24. Expressão relativa do transcrito do gene G6PD em blastocistos bovinos



Figura 25. Expressão relativa do transcrito do gene HPRT em blastocistos bovinos



Figura 26. Expressão relativa do transcrito do gene IFN-τ em blastocistos bovinos



Figura 27. Modelo hipotético proposto da velocidade da progressão do evento de

inativação do cromossomo X em embriões fêmeas produzidos por transferência

nuclear (TN) e por fecundação in vitro (FIV).......................................................................94

Figura 28. Modelo hipotético da expressão de G6PD durante o desenvolvimento

embrionário frente à disponibilidade de glicose no meio de cultivo ............................95

xvii

Lista de Tabelas

Tabela 1. Número de oócitos manipulados e de embriões produzidos por

transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em relação ao tempo de cultivo

da célula doadora de núcleo ...............................................................................................19

Tabela 2. Número de embriões transferidos e dados das gestações obtidas a partir

de embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em

relação ao tempo de cultivo da célula doadora de núcleo .........................................21


transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em relação ao sexo da célula

doadora de núcleo .................................................................................................................23


de embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em

relação ao sexo da célula doadora de núcleo.................................................................25

Tabela 5. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores para o estudo do sexo de

embriões bovinos......................................................................................................................75

Tabela 6. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores e tamanho dos fragmentos

dos genes escolhidos para estudo da expressão em embriões bovinos (GAPDH, XIST,

IFN-τ, G6PD e HPRT) ..................................................................................................................79


fecundação in vitro utilizando protocolo padrão do laboratório (M = embriões

machos e F = embriões fêmeas) ...........................................................................................83

xviii

Introdução Geral

A clonagem animal por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) está

sendo aplicada em várias espécies de mamíferos. A partir da Dolly, um clone de

ovelha (CAMPBELL et al., 1996b), várias outras espécies têm sido clonadas, por

exemplo, camundongos (WAKAYAMA et al., 1998), bovinos (KATO et al., 1998; WELLS et

al., 1999), caprinos (BAGUISI et al., 1999), suínos (ONISHI et al., 2000; POLEJAEVA et al.,

2000), coelhos (CHESNE et al., 2002), gatos (SHIN et al., 2002), mulas (WOODS et al.,

2003), cavalos (GALLI et al., 2003; VANDERWALL et al., 2004; HINRICHS et al., 2005) e

mais recentemente, um cachorro (LEE et al., 2005).

Contudo, existem dois fatores diretamente relacionados às falhas da

biotecnologia da clonagem que limitam sua aplicação na área comercial. O primeiro

deles é a baixa eficiência, na qual, em bovinos, aproximadamente 6% dos embriões

sobrevivem a termo (WELLS et al., 1999). O segundo, é denominado síndrome da

clonagem, caracterizado por uma série de anormalidades que resultam em morte

embrionária no início do desenvolvimento, altas taxas de aborto, gestação

prolongada, síndrome do bezerro grande, malformações placentárias e fetais e

complicações do sistema imunológico (SMITH et al., 2000; WELLS et al., 2004).

Fatores que podem estar envolvidos com as falhas da TNCS, como a

manipulação in vitro de embriões reconstruídos, implicam em conseqüências adversas

que podem ser imediatas ou em longo prazo (SMITH e MURPHY, 2004). Alterações

epigenéticas e maturidade do citoplasma receptor (SMITH e MURPHY, 2004), tanto

quanto, alterações na cromatina derivadas da célula doadora afetam a

competência do desenvolvimento embrionário e acarretam em anormalidades

cromossômicas (YOUNG e FAIRBURN, 2000; KANG et al., 2001; BUREAU et al., 2003).

Evidências destas alterações em decorrência da TNCS são manifestadas pela

inapropriada expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário

(HUMPHERYS et al., 2001; RIDEOUT et al., 2001; WRENZYCKI et al., 2001) e modificações

na cromatina (SANTOS et al., 2003), como a inativação do cromossomo X (XUE et al.,

2002) e metilação do DNA (KANG et al., 2001; BOURC’HIS et al, 2001; DEAN et al., 2001).

Somadas às observações mencionadas anteriormente, foi observado aumento de

células cromossomicamente anormais em clones nascidos vivos (HANADA et al., 2005).

Embora células doadoras possam ser obtidas diretamente de um animal adulto,

estas normalmente são cultivadas e propagadas in vitro antes da transferência, para

xix

facilitar a manipulação e estocagem. Fibroblastos são geralmente utilizados por

apresentarem divisões estáveis e linhagens homogêneas, além de poderem ser

congelados e descongelados sem grandes perdas de viabilidade. (SMITH et al., 2000).

Além da memória epigenética do núcleo doador, outros fatores como a fase

do ciclo celular, o número da passagem e o sexo das células doadoras de núcleo,

influenciam a viabilidade dos embriões reconstruídos. Estas variações têm sido

estudadas em relação à eficiência da clonagem, porém ainda permanecem não

esclarecidas (ORTEGON et al., 2007).

A reprogramação do núcleo somático também pode afetar o cromossomo X,

resultando, por exemplo, em uma reativação do cromossomo X inativo do núcleo

doador através de alterações do padrão de metilação. Em conseqüência, genes que

estavam silenciados na célula somática retornam à sua atividade durante o

desenvolvimento embrionário, podendo ou não ser novamente inativados (XUE et al.,

2002).

O entendimento dos mecanismos celulares e moleculares que envolvem estas

alterações pode levar ao aprimoramento do desenvolvimento embrionário e ao

aumento das taxas de nascimento. Este trabalho teve como objetivo estudar a

influência do tempo de cultivo in vitro e do sexo das células doadoras de núcleo no

desenvolvimento embrionário de indivíduos produzidos por transferência nuclear,

como também comparar a expressão de alguns genes reconhecidamente silenciados

durante a inativação do cromossomo X em fêmeas, no início do desenvolvimento de

embriões machos e fêmeas produzidos por fecundação in vitro e transferência

nuclear.

1

CAPÍTULO 1

Efeito do número da passagem e do sexo

de fibroblastos no desenvolvimento de

bovinos produzidos por transferência

nuclear

2

Resumo

MERIGHE, G.K.F. Efeito do número da passagem e do sexo de fibroblastos no

desenvolvimento de bovinos produzidos por transferência nuclear. Tese de Doutorado –

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo,

Pirassununga, 2007.

Células cultivadas por longos períodos acumulam alterações genéticas e

epigenéticas que resultam frequentemente em uma inapropriada reprogramação nuclear

de embriões submetidos à transferência nuclear a partir de células somáticas (TNCS). Além

disso, a variável sexo é um fator limitante na produção de blastocistos e na competência de

desenvolvimento pós-implantação de embriões produzidos in vitro. Desta maneira, o

objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do número da passagem nos experimentos de

transferência nuclear, bem como, avaliar o efeito do sexo no desenvolvimento in vitro e no

potencial pós-implantação destes embriões. Para tanto, oócitos derivados de matadouro

foram enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto a partir de 18

horas pós-maturação. Após a fusão (dois pulsos de 2,25 kv/cm durante 65 µseg) e ativação

química (ionomicina - 5,0 µM durante 5 minutos e 6-DMAP - 2,0 mM durante 3 horas), os

zigotos reconstituídos com núcleo de célula somática foram cultivados em CR2 com

monocamada de células da granulosa a 38,8ºC, em atmosfera umidificada e 5% de CO2 em

ar durante 7 dias. Os resultados foram analisados utilizando o teste Qui-quadrado (χ2). No

cultivo in vitro, embriões reconstruídos com células em passagens tardias apresentaram

menores taxas de clivagem, 8 células e desenvolvimento a blastocisto (p < 0,05). Embriões

reconstruídos com células em passagens iniciais apresentaram maior competência em

formar um blastocisto (16% versus 14% - intermediárias e 7% - tardias; p < 0,05). Apesar dos

embriões reconstruídos com células em passagens tardias apresentarem resultados

semelhantes de prenhez aos 30 dias (35% versus 27% - iniciais e 26% - intermediárias), não

foram competentes para o desenvolvimento de uma gestação a termo (0% versus 34% -

iniciais e 25% - intermediárias). Além de não apresentarem diferenças nas taxas de

desenvolvimento a termo, neonatos produzidos com células em passagens iniciais e

intermediárias apresentaram taxas equivalentes de sobrevivência (50% vs 57%,

respectivamente). Em relação ao sexo, embora maior taxa de clivagem tenha sido

observada para fêmeas (78% vs 74%; p < 0,05), embriões machos foram mais competentes

no desenvolvimento a blastocisto (16% vs 14,5%; p < 0,05). As taxas de prenhez,

desenvolvimento a termo e sobrevivência foram semelhantes entre os gêneros. Entretanto,

fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação (p < 0,05). Em

conclusão, estes resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por um

3

longo período dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas

durante a gestação. Também foi possível concluir que embriões clonados do gênero

masculino apresentam maior competência para desenvolver a blastocisto e suportar uma

gestação a temo.

Palavras-chaves: transferência nuclear, fibroblastos, passagem celular, sexo, bovino.

4

Abstract

MERIGHE, G.K.F. Effect of fibroblasts passage number and sex on bovine development after

nucleus transfer. Tese de Doutorado – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,

Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2007.

Cells cultured for long-term periods accumulate genetic and epigenetic

modifications that result in improper nuclear reprogramming of somatic cell nuclear transfer

(SCNT) embryos. Furthermore, the sex may be a limiting factor in blastocysts production and

in post-implantation developmental competence. Therefore, the objective of this study was

to determine the effect of the passage number for SCNT, and to evaluate the effect of sex

on in vitro development and on post-implantational competence of these embryos. Oocytes

obtained from slaughtered cows were enucleated and reconstructed by TNCS from an adult

animal at 18 hours of in vitro maturation. After fusion (two 2.25 kv/cm DC pulses for 65 µsec)

and chemical activation (5.0 µM ionomycin for 5 min followed by 2.0 mM 6-DMAP for 3 hours),

the reconstructed zygotes were cultured in CR2 on a granulosa cell monolayer at 38.8ºC in a

humidified atmosphere of 5% CO2 in air for 7 days. Data were analyzed using Chi Square

analysis. Reconstructed embryos with cells on late passages showed lower rates for

cleavage, 8 cells embryos and blastocyst formation (p < 0.05). Reconstructed embryos with

cells on early passages showed higher competence to blastocyst formation (16% versus 14% -

intermediate and 7% - late; p < 0.05). Although reconstructed embryos with cells on late

passages showed similar results for pregnancy on day 30 (35% versus 27% - early and 26% -

intermediate), they were not competent to develop to term. Calving rates and perinatal

survival (PNS) were similar when comparing early and intermediate passages (34% vs 25% and

50% vs 57%, respectively). Regarding sex, although cleavage rates were higher for female

embryos (78% vs 74%; p < 0.05), male embryos were more competent for blastocyst formation

(16% vs 14.5%; p < 0.05). The pregnancy rate, development to term and PNS were similar

between gender, however, female embryos showed higher rates of abortion between day

90 and 120. In conclusion, these results indicate that long-term culture of donor cells

decrease blastocyst formation and increase the chances of failure during pregnancy.

Futhermore, cloned male embryos were more competent to form a blastocyst and had lower

rates of abortion.

Key-words: nuclear transfer, fibroblast, cell passage, sex, bovine.

5

1) Introdução

Existe interesse científico e comercial em embriões produzidos por

transferência nuclear de células somáticas (TNCS), visando, principalmente, a

preservação de espécies em extinção e a produção de indivíduos transgênicos

com aplicação na agropecuária e ciências biomédicas. A realização destas

aplicações envolve o desenvolvimento de um embrião produzido por técnicas de

manipulação celular que capacitam o potencial totipotente e a expressão do

núcleo reprogramado.

O sucesso na produção de indivíduos derivados de transferência nuclear

depende de alguns fatores. Entre outros, o número da passagem durante o cultivo

da célula doadora de núcleo tornou-se um fator limitante na transferência nuclear,

pois células cultivadas por um longo período entram em senescência celular e

apresentam mutações que se acumulam durante as várias passagens celulares,

prejudicando o desenvolvimento dos embriões.

Além disso, o sexo dos embriões produzidos por sistemas de cultivo in vitro

influencia a competência de desenvolvimento pré-implantação além de ser fator

limitante na gestação a termo. Pesquisadores observaram que o desenvolvimento

de embriões fêmeas frequentemente é afetado por sistemas de cultivo in vitro,

desequilibrando a proporção em relação ao sexo, o que justifica o maior número

de bezerros machos nascidos de embriões produzidos in vitro.

A maior compreensão dos fatores que condicionam este desvio entre os

sexos no nascimento, deve colaborar no esclarecimento das variáveis que

influenciam o desenvolvimento pré e pós-implantação de embriões machos e

fêmeas.

Desta maneira, esta etapa do trabalho objetivou determinar a competência

das células doadoras de núcleo após cultivo por período curto (3ª a 5ª passagens),

intermediário (6ª a 8ª passagens) e prolongado (9ª a 12ª passagens), bem como

avaliar o efeito do sexo no desenvolvimento in vitro e no potencial pós-implantação

de embriões submetidos à transferência nuclear.

6

2) Revisão de Literatura

A partir dos primeiros relatos de nascimentos de bovinos produzidos por

transferência nuclear de um núcleo embrionário para um oócito enucleado

(PRATHER et al., 1987), vários estudos tem sido realizados para aprimorar a eficiência

da clonagem nesta espécie. Esta metodologia, não somente, permite avaliar o

potencial de desenvolvimento de um núcleo, mas também possibilita analisar as

interações entre o núcleo doador e o citoplasma receptor (KATO et al., 1998).

Esta biotecnologia levou ao crescente investimento de diversos grupos e

empresas de pesquisa. Estima-se que, até o ano de 2004, cerca de 1.500 bezerros

foram obtidos a partir de transferência nuclear somática no mundo, principalmente

na América do Norte, Japão, Nova Zelândia e Europa, como também em países da

América do Sul e Ásia (HEYMAN, 2005).

Este número, porém, parece insignificante comparado ao impacto de outras

biotecnologias reprodutivas. Por exemplo, aproximadamente 500.000 transferências

de embriões são realizadas a cada ano em bovinos a partir de embriões produzidos

in vivo e in vitro (HEYMAN, 2005). Tal fato deve-se à baixa eficiência, pois esta

metodologia ainda permanece em fase de aprimoramento, para futuramente ser

uma ferramenta intensamente integrada à biotecnologia reprodutiva (HEYMAN,

2005).

A clonagem somática pode também contribuir em vários aspectos como a

conservação da biodiversidade. Por exemplo, na Nova Zelândia a transferência

nuclear foi utilizada para clonar a única fêmea da raça bovina extinta “Enderby

Island”, obtendo-se 20 cópias. Estas fêmeas poderão reproduzir através de

inseminação com sêmen de diferentes touros que foram congelados e estocados

(WELLS et al., 1998).

Outra finalidade para a transferência nuclear é utilizar oócitos bovinos como

receptores de núcleos somáticos de outras espécies comprometidas. Usando esta

técnica de transferência nuclear inter-específica, fibroblastos de Bos gaurus foram

fundidos com oócitos enucleados de Bos taurus, resultando em um indivíduo com

genótipo nuclear de B. gaurus e mitocondrial de B. taurus obtendo-se um modelo

inter-espécies (DINDOT et al., 2004).

Do ponto de vista de aplicação da clonagem na produção pecuária, cópias

genéticas podem ter alto valor para a inseminação artificial. Estas cópias podem ser

7

obtidas por transferência nuclear no caso de morte acidental ou doença severa

deste reprodutor ou, ainda, para favorecer a logística de venda de sêmen. Esta

possibilidade foi demonstrada primeiramente no Canadá com o nascimento do

clone Starbuck II usando células doadoras do touro Starbuck, que teve uma grande

contribuição para o rebanho holandês (SMITH, 2002).

Finalmente, no caso da clonagem em larga escala, grupos de animais

geneticamente idênticos são rotineiramente produzidos como animais que servem

como modelo para pesquisa (BIGGERS, 1986) e, na espécie bovina, poderia ser

potencialmente usada em programas de criação (MEIRELLES et al., 2006; 2007).

Na área científica, a transferência nuclear é considerada um modelo para a

pesquisa básica visando à investigação em biologia celular e molecular.

Finalmente, o modelo bovino oferece vantagens como ativação do genoma e

implantação tardios comparado ao camundongo (WELLS et al., 1999).

Apesar de todo este potencial para aplicação da biotecnologia de

transferência nuclear de células somáticas, numerosos parâmetros permanecem

limitantes para o aumento da eficiência desta técnica na produção de animais

saudáveis, porém um importante pré-requisito é a disponibilidade de células

capazes de sofrer reprogramação para suportar o desenvolvimento embrionário e

fetal após a transferência nuclear (MASTROMONACO et al., 2006).

Em se tratando do tempo de cultivo celular, a eficiência da clonagem a

partir de células somáticas adultas tem sido amplamente limitada ao uso de células

doadoras recém colhidas, ou após o cultivo in vitro por períodos curtos (abaixo da

10ª passagem; KUBOTA et al., 2000).

A maior parte das células somáticas cultivadas in vitro alcança um limite de

proliferação. Neste momento, estas células cessam o crescimento, fenômeno

denominado senescência replicativa. Este estado irreversível difere da quiescência

celular, onde a inibição do crescimento é conseguida com a privação de soro ou

com a densidade celular, característica necessária para sincronizar células

doadoras na fase G0 para a transferência nuclear (PIGNOLO et al., 1993).

Quando as células são cultivadas in vitro por um longo período resultam na

acumulação de numerosas modificações, favorecendo a perda da função de

genes. Características como instabilidade cromossômica e encurtamento do

telômero têm sido correlacionados com o aumento do tempo de cultivo (HAMILTON

et al., 2001; ALLSOPP, et al., 1992; BENN, 1976). Tais modificações acumulam-se

8

durante muitos ciclos de divisões celulares e conseqüentemente dificultam ou

inviabilizam o desenvolvimento (CIBELLI, et al., 1998; WALKER et al., 1996).

Um considerável aumento de células cromossomicamente anormais oriundas

de passagens tardias foi demonstrado (BENN, 1976; STRELCHENKO, 1996; GIRALDO et

al., 2004). Benn (1976) observou que o conteúdo cromossômico contido nas células

progrediu de 30% para 60% de anormalidade durante o cultivo celular até

passagens tardias.

Ao mesmo tempo, Strelchenko (1996) e Giraldo et al. (2004) relataram 81% e

98% de células anormais derivadas de cultivos em passagens tardias,

respectivamente. Entre as anormalidades estruturais e numéricas que foram

observadas estão incluídas as fusões terminais, translocações, aneuploidia e

poliploidia.

Por resultar na diminuição de sua eficiências, a aplicação da técnica de

transferência nuclear está limitada ao período de cultivo in vitro das células

doadoras. Desta maneira, estudos têm utilizado passagens iniciais (anteriores a 9ª

passagem) de fibroblastos doadores de núcleo para TNCS para produzir animais

clonados com sucesso (SCHNIEKE, et al., 1997; CIBELLI, et al., 1998; WELLS, et al., 1999;

POLEJAEVA, et al., 2000).

Este efeito foi estudado por Jang e colaboradores (2004) que relataram

diferenças no desenvolvimento de embriões TNCS derivados de passagens iniciais e

tardias de fibroblastos. Embriões reconstruídos com fibroblastos de passagens tardias

apresentaram um aumento significativo de blastômeros em apoptose em

comparação àqueles produzidos com fibroblastos em passagens iniciais.

Apesar de reconhecidamente gerar problemas, o uso de cultivos

prolongados é importante na produção eficiente de animais transgênicos, pois há

necessidade de estabelecimento de uma incorporação estável do gene exógeno

na célula doadora. Para obter esta incorporação estável, células doadoras

precisam tolerar os distúrbios causados pela transfecção e seleção após cultivos

prolongados (períodos de cultivo e passagens celulares). Além disso, cultivos

prolongados de células doadoras de núcleo torna-se essencial para modificações

genéticas das células doadoras por recombinação homóloga (BHUIYAN et al.,

2004).

Células senescentes são reconhecidamente portadoras de telômeros

menores e outra característica envolvendo a reprogramação nuclear somática é o

9

potencial para restaurar o tamanho do telômero e superar a senescência. Embora

exista evidência de que o comprimento do telômero seja restaurado em núcleos

somáticos após a transferência para o oócito, muitas mutações no DNA no núcleo

somático não podem ser restauradas (SHIELS et al., 1999).

Parte das mutações pode ser tolerável em uma célula diferenciada, mas

dada a característica totipotente do zigoto, elas podem ser letais no

desenvolvimento embrionário. Isto certamente também contribui à baixa eficiência

do desenvolvimento de embriões produzidos por transferência nuclear a partir de

células somáticas. Shiels e colaboradores (1999) afirmaram que Dolly, um clone de

ovelha, herdou os telômeros curtos do animal adulto que doou as células para a

realização da transferência nuclear. Além disso, os telômeros de Dolly sofreram um

encurtamento adicional durante o cultivo in vitro das células doadoras.

Estas observações provocam questionamentos como, por exemplo, se clones

saudáveis podem ser obtidos de animais doadores velhos, particularmente, após

cultivos in vitro por longos períodos.

Apesar destes relatos, Kubota e colaboradores (2000), encontraram dados

que diferem do que é observado mais frequentemente, pois demonstraram que a

utilização de fibroblastos derivados de animal adulto e cultivados por um longo

período (acima da 30ª passagem), não comprometeu a eficiência da clonagem

em termos de desenvolvimento a termo, além disso, resultou em maior taxa de

desenvolvimento comparado àqueles derivados da utilização de passagens iniciais.

Outra variável de interesse neste trabalho é o sexo, pois aparentemente

trata-se de outro fator que influencia a produção de blastocistos e a competência

de desenvolvimento pré e pós-implantação de embriões produzidos in vitro.

Apesar de muitos trabalhos relatarem que embriões machos alcançam o

estádio de blastocisto mais rapidamente que embriões fêmeas, e que este

fenômeno aparentemente pode ser alterado pelas condições de cultivo (AVERY et

al., 1989, 1991; CARVALHO et al., 1996; GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2001), ainda

permanece uma dúvida sobre o efeito do sexo na velocidade de desenvolvimento,

pois outros trabalhos demonstraram uma proporção muito próxima entre os gêneros

quando alcançaram o estádio de compactação, formação da blastocele ou

mesmo na duração do ciclo celular (HOLM et al., 1998).

Apesar de embriões bovinos apresentarem capacidade de adaptação ao

meio em que são cultivados, tendo como resposta o progresso no desenvolvimento,

10

aparentemente, a tolerância do embrião ao estresse do ambiente é mediada pela

unidade materno-fetal ou diretamente no cultivo in vitro e influenciada pelo sexo

(EDWARDS et al., 2001).

O meio de cultivo utilizado na produção in vitro de embriões afeta o

desenvolvimento após a fecundação, interferindo no metabolismo ou na expressão

de genes importantes para o desenvolvimento, podendo influenciar no

desenvolvimento embrionário, fetal e placentário em bovinos (BAVISTER, 1995;

NIEMANN e WRENZYCKI, 2000). Os componentes dos meios de cultivo podem, ainda,

afetar a sobrevivência de embriões femininos, alterando a proporção do sexo

(RIEGER, 1992; KOCHHAR et al., 2001), o que pode explicar o número superior de

bezerros machos nascidos de embriões produzidos in vitro.

A identificação das condições que levam a este desvio no nascimento,

fornece subsídios para melhor interpretar os fatores que controlam o

desenvolvimento pré e pós-implantação de embriões machos e fêmeas. Por outro

lado, é difícil chegar a uma conclusão clara baseada na literatura, pois alguns

estudos não mostraram diferença na proporção do sexo (CARVALHO et al., 1995),

porém na maioria deles o número de embriões machos foi superior (GUTIÉRREZ-

ADÁN et al., 1996 e LONERGAN et al., 1999).

Evidências sugerem que o sexo do embrião pode estar relacionado com a

habilidade deste em conduzir uma resposta ao estresse durante os estádios iniciais

do desenvolvimento. King e colaboradores (1992) encontraram maior número de

fetos bovinos machos aos 90 dias de gestação em embriões produzidos in vivo que

foram submetidos à biopsia, sexados, cultivados in vitro, congelados e

descongelados e transferidos no estádio de blastocisto. Estes autores concluíram

que a exposição à variação da temperatura durante o cultivo, a criopreservação e

a transferência resultaram em morte de embriões fêmeas.

Estes estudos comprovam que a resposta do embrião ao estresse do

ambiente não apenas é influenciada pelo estádio do desenvolvimento em que o

embrião se encontra no momento em que está sofrendo o estresse, mas também

pela composição de seus cromossomos sexuais.

Devido aos seus cromossomos, embriões machos e fêmeas diferem na

composição e no número de cópias de genes (DE LA FUENTE, et al., 1999). O

mecanismo responsável pela compensação do nível de expressão dos genes

ligados ao cromossomo X, é a inativação de um dos cromossomos homólogos nas

11

fêmeas, inibindo a transcrição de muitos genes e resultando numa equivalência

funcional com os machos.

Shimizu e colaboradores (1981) relataram que o aumento da expressão de

genes metabolicamente vitais localizados no X antes da inativação e a

compensação do nível de expressão estabelecida em fêmeas contribuíram

significativamente no desenvolvimento diferencial entre embriões machos e

fêmeas.

Acredita-se que a inativação do cromossomo X é essencial para

embriogênese normal, pois foi comprovado que a manutenção de dois

cromossomos X ativos durante a implantação em camundongos retardou o

desenvolvimento e causou morte destes embriões (TAKAGI et al., 1990).

12

3) Objetivos

3.1) Objetivo Geral

Esta etapa do trabalho objetivou avaliar a competência dos embriões

oriundos de TNCS reconstruídos com células somáticas adultas provindas de

diferentes passagens, bem como, de animais de gêneros diferentes.

3.2) Objetivos Específicos

1) avaliar o efeito do número da passagem de células doadoras de núcleo

após cultivo por período curto (3ª a 5ª passagens), intermediário (6ª a 8ª passagens)

e prolongado (9ª a 12ª passagens) na produção de blastocistos por TNCS, na

gestação e sobrevivência após nascimento;

2) avaliar o efeito do sexo das células doadoras de núcleo no

desenvolvimento in vitro dos embriões oriundos de TNCS e no potencial pós-

implantação, mediante observação da gestação e sobrevivência dos bezerros.

13

4) Hipóteses

A partir do momento em que propriedades das células doadoras de núcleo

contribuem diretamente no sucesso da transferência nuclear, características como

o número da passagem e o sexo destas células são variáveis determinantes deste

processo. Desta maneira, as hipóteses deste trabalho foram: 1) H1 = células

cultivadas in vitro durante períodos curtos proporcionam maior viabilidade do

embrião produzido por TNCS; 2) H1 = embriões clonados reconstruídos com células

cultivadas in vitro durante períodos curtos apresentam maior competência em

completar uma gestação a termo. 3) H1 = células masculinas doadoras de núcleo

proporcionam maior viabilidade do embrião produzido por TNCS; 4) H1 = embriões

machos apresentam maior competência em completar uma gestação e sobreviver

após o nascimento.

14

5) Material e Métodos

5.1) Produção dos embriões

5.1.1) Maturação in vitro

A produção in vitro de embriões submetidos ao processo de transferência

nuclear a partir de células somáticas, teve início com o procedimento de

maturação de oócitos viáveis. Para tanto, ovários de vacas zebus ou mestiças

foram obtidos em abatedouro, transportados em solução salina (0,9%) a 37ºC, e

encaminhados até o laboratório. Os complexos cumulus-oócito foram aspirados de

folículos entre 2 a 8 mm utilizando uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha

de 18 G, e somente os oócitos de qualidade I, com cumulus compacto completo e

citoplasma límpido e de aspecto homogêneo (finas granulações), foram

selecionados para os experimentos. Os oócitos foram, em seguida, maturados em

TCM199 com sais de Earles, glutamina e NaHCO3 suplementado com 10% de soro

fetal bovino (SFB), piruvato (22 µg/mL), gentamicina (50 µg/mL), 0,5 µg de FSH/mL,

50 µg de LH/mL e 1 µg de estradiol/mL em microgotas de 100 µL de meio de

maturação, cobertas com óleo mineral (30 oócitos/gota). A incubação foi realizada

a uma temperatura de 38,5°C e atmosfera gasosa de 5% CO2 em ar, durante 18

horas.

5.1.2) Transferência Nuclear

Após o período de maturação, as células do cumulus foram removidas

por exposição à solução de hialuronidase (2 mg/mL) em PBS simples acrescido de

0,4% de BSA e os oócitos foram selecionados pela presença do 1º corpúsculo polar.

Em seguida, foram transferidos para uma solução de citocalasina B (10 µg/mL) e

Hoechst 33342 (10 µg/mL) em meio CR2 (WATANABE et al., 1999) suplementado com

10% de SFB durante 20 minutos.

Os oócitos foram então enucleados, removendo uma pequena porção

do citoplasma próxima à região do 1º corpúsculo polar (eliminação do material

genético do oócito). Esta porção aspirada foi visualizada sob luz ultra-violeta para

15

confirmação da enucleação. Cada oócito foi, posteriormente, reconstruído com

uma célula somática de um animal adulto no estádio G1/G0 do ciclo celular

(restrição de soro), inserindo a célula no espaço perivitelino.

5.1.3) Eletrofusão e Ativação Química

Os conjuntos oócitos-células somáticas foram eletricamente fundidos

após 24 a 26 horas de maturação em uma solução contendo 0,3 M de manitol, 0,1

mM MgSO4, 0,5 mM Hepes e 0,05% BSA. Os embriões reconstruídos foram alinhados

manualmente de maneira que a superfície de contato entre o oócito e a célula

estava paralela aos eletrodos. As células foram, então, expostas a dois pulsos

elétricos de 2,25 kV/cm durante 65 µseg. Aproximadamente uma hora após a

eletrofusão, os oócitos fundidos foram quimicamente ativados em 5 µM de

ionomicina durante 4 minutos e, em seguida, cultivados em CR2 acrescido de 2 mM

de 6-dimetilaminopurina (6DMAP) durante 3 horas.

Ao término do período de ativação, os oócitos foram então cultivados

em meio CR2 suplementado com 10% de SFB em co-cultivo com células da

granulosa, em temperatura de 38,5ºC e atmosfera de 5% CO2 em ar, durante sete

dias, quando foram transferidos para receptoras sincronizadas.

5.1.4) Células Doadoras

As células somáticas doadoras de núcleo foram obtidas a partir de

biópsias realizadas em animais adultos machos e fêmeas. A biópsia foi retirada da

prega da cauda do animal e transportada imediatamente para o laboratório em

solução tampão fosfato (PBS) em gelo. O tecido foi então triturado em pequenos

pedaços de aproximadamente 1 mm, lavados em PBS e fixados numa placa de

Petri de 35 mm de diâmetro. O cultivo procedeu-se em meio DMEM suplementado

com 20% de SFB, piruvato (22 µg/mL), glutamina (1 mM) e gentamicina (50 µg/mL).

A incubação foi realizada a uma temperatura de 38,5°C e atmosfera gasosa de 5%

CO2 em ar, trocando-se o meio de três em três dias.

Ao crescimento das primeiras células, o meio foi substituído por DMEM

suplementado com 10% de SFB e o cultivo processado até a 3ª passagem,

momento em que as células estavam prontas para o procedimento de

16

48 horas 7º e 9º dias

transferência nuclear. Aproximadamente 5 dias antes da realização do

experimento, o meio de cultivo foi substituído por DMEM suplementado com 0,5% de

SFB (restrição de soro), procedimento este que visava bloquear o ciclo celular das

células somáticas no estádio G1/G0 do ciclo celular (Figura 1).

Figura 1. Ilustração das diferentes etapas do processo de transferência nuclear. (a) Oócito

no estádio de metáfase II antes da enucleação. (b) Aspiração do corpúsculo

polar e citoplasma adjacente. (c) Oócito enucleado. (d) Controle fluorescente

da presença dos cromossomos em metáfase dentro da pipeta de






nuclear desenvolvido in vitro. (k) Bezerros produzidos por transferência nuclear

(modificado de Heyman, 2005).

K

Avaliação da gestação a termo e sobrevivência

Avaliação da produção de blastocistos

Avaliação da clivagem e produção de 8 células

17

5.2) Sincronização do cio das receptoras e transferência

dos embriões

A sincronização do cio tem sido uma prática cada vez mais difundida, por

facilitar o manejo concentrado e aumentar a eficiência de observação de cio,

resultando em melhores índices reprodutivos. Neste trabalho, somente um embrião

produzido por transferência nuclear, com 7 dias de cultivo in vitro e na fase de

blastocisto, foi transferido para cada receptora através de procedimento não

cirúrgico.

Para as inovulações dos embriões foram utilizadas fêmeas nulíparas

provenientes de cruzamento (½ zebu e ½ europeu) com no mínimo 350 kg e com

exames de brucelose e tuberculose negativos. Estes animais foram mantidos em

sistema de pastagem composto por capim-braquiarão (Brachiaria brizantha cv.

Marandu), complementada com suplementação mineral e água a disposição.

Para a sincronização do ciclo estral foram utilizados agentes farmacológicos

que possibilitaram a transferência dos embriões em tempo fixo (TETF), isto é, sem a

necessidade de observação do cio.

Independentemente da fase do ciclo em que as receptoras se

encontravam, todos os animais receberam implantes auriculares contendo 3,0 mg

de norgestomet (Crestar®, Intevet) associados a uma injeção intramuscular de 2,0

mg de benzoato de estradiol (BE). Este tratamento visou suprimir a manifestação de

cio e a ovulação até total regressão do corpo lúteo. Os animais permaneceram

com os implantes durante um período de 8 dias.

No 5° dia do tratamento foi administrado 500 UI de gonadotrofina coriônica

eqüina (eCG - Novormon®), como agente estimulador do desenvolvimento folicular.

No dia da remoção dos implantes (D8), todos os animais receberam aplicação

intramuscular de prostaglandina sintética Prosolvin® (7,5 mg de luprostiol) para

assegurar a luteólise e, 24 horas após a remoção dos implantes, receberam uma

dose intramuscular de benzoato de estradiol (1,0 mg) como agente sincronizador

das ovulações (Figura 2).

18

Figura 2. Esquema resumido do cronograma de sincronização do cio dos animais

utilizados como receptoras dos embriões produzidos por transferência

nuclear.

5.3) Análise Estatística

As taxas de desenvolvimento embrionário pré-implantação e pós-implantação

entre embriões bovinos submetidos à transferência nuclear a partir de diferentes

passagens celulares e diferentes sexos, foram avaliadas utilizando a análise qui-

quadrado (χ2).

Diferenças no desenvolvimento entre os grupos foram transformadas a anti-log

para aproximar a uma distribuição normal e avaliados pelo teste de análise de

variância e a comparação das médias realizada pelo teste t de Student, utilizando

o programa JMP, versão 2.4 SAS Institute (Cary, NC, EUA).

Implantes + 2mg BE

Remoção implantes + prostaglandina

500 UI eCG 1,0 mg BE

TETF

D0 D5 D8 D9 D17

19

6) Resultados

6.1) Efeito do número da passagem dos fibroblastos

Para cumprir esta etapa do trabalho, 5.629 oócitos foram submetidos ao

procedimento de transferência nuclear, 3.076 (55%) zigotos foram efetivamente

reconstruídos (fundidos), 2.349 (42%) embriões alcançaram o estádio de 2 células

(clivaram), 934 (17%) embriões desenvolveram até o estádio de 8 células e

finalmente, 438 (8%) embriões foram competentes para formar um blastocisto.

Células doadoras que partiram de passagens iniciais (3ª a 5ª) e intermediárias

(6a a 8a) apresentaram taxas de clivagem e desenvolvimento até 8 células

significativamente melhores quando comparadas com passagens tardias (9a a 12a;

p < 0,05; Figura 3). Além disso, zigotos reconstituídos com células que partiram de

passagens iniciais apresentaram maior competência ao desenvolvimento a

blastocisto quando comparados com aqueles reconstituídos com passagens

intermediárias e tardias. Da mesma maneira, um maior número de embriões

produzidos com células em passagens intermediárias desenvolveu até o estádio de

blastocisto comparados com aqueles produzidos com células em passagens tardias

(p < 0,05).

Na tabela 1 estão apresentados os dados numéricos da produção dos embriões

durante o desenvolvimento pré-implantação que foram submetidos à transferência

nuclear a partir dos grupos de células estudados.


transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em relação ao tempo

de cultivo da célula doadora de núcleo.

Número de oócitos Oócitos fundidos No passagem da célula doadora Total Fundidos 2 células 8 células blastocisto

3ª a 5ª 2.844 1.594 1.232 494 249 6ª a 8ª 2.355 1.257 967 389 174

9ª a 12ª 430 225 150 51 15 Total 5.629 3.076 2.349 934 438

20

76% 77%

67%

31% 31%

23%

16% 14%7%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

Clivagem 8 células Blastocisto

Iniciais Intermediárias Tardias


submetidos à transferência nuclear com células somáticas em diferentes

passagens. Estas porcentagens foram calculadas sobre zigotos

efetivamente reconstituídos (fundidos; iniciais = 3ª a 5ª passagens;

intermediárias = 6ª a 8ª passagens e tardias = 9ª a 12ª passagens).

Em relação ao desenvolvimento pós-implantação, 277 embriões no 7º dia de

cultivo in vitro foram transferidos para receptoras, porém apenas 75 (30%)

apresentaram prenhez aos 30 dias, resultando em 21 (8%) gestações a termo,

destas, 11 (4%) animais clonados sobreviveram após o nascimento.

Embora o grupo de embriões produzidos a partir de células em passagens

tardias tenha apresentado resultados semelhantes de prenhez aos 30 dias

comparado aos demais, este mesmo grupo não apresentou gestação a termo

(Figura 4).

Apesar de não significativas, embriões reconstruídos com células em passagens

iniciais resultaram em melhores taxas de gestação a termo comparadas com as

intermediárias (34 e 25%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após o

nascimento foram semelhantes entre os grupos (50 e 57%, respectivamente; p >

0,05).

a a

b

a a

b a b

c

21

Argumenta-se que os resultados não apresentaram diferenças significativas

possivelmente devido ao número limitado de receptoras que apresentaram prenhez

aos 30 dias e gestação a termo e de animais que sobreviveram após o nascimento.

Na tabela 2 estão apresentados os dados numéricos de gestação durante o

desenvolvimento pós-implantação dos embriões que foram submetidos à

transferência nuclear a partir dos grupos de células estudados.


de embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas

(TNCS) em relação ao tempo de cultivo da célula doadora de núcleo.

Número de embriões transferidos Gestação No passagem da célula doadora Total Prenhez 30 dias A termo Sobrevivência

3ª a 5ª 154 41 14 7 6ª a 8ª 106 28 7 4

9ª a 12ª 17 6 0 0 Total 277 75 21 11

27% 26%

35% 34%

25%

0%

50%

57%

0%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Prenhez A termo Sobrevivência


Figura 4. Taxas de prenhez aos 30 dias, gestação a termo e sobrevivência pós

nascimento de embriões submetidos a transferência nuclear com células

somáticas em diferentes passagens (iniciais = 3ª a 5ª passagens;

intermediárias = 6ª a 8ª passagens e tardias = 9ª a 12ª passagens).

a a

a a

a

a

a a

a

22

Durante o período de gestação, as receptoras apresentaram perdas

gestacionais a partir das primeiras semanas de gestação até o nascimento dos

bezerros. Não houve diferença significativa entre as passagens celulares, porém a

gestação de embriões clones apresentou três fases agudas de perda gestacional:

no período de implantação, ou seja, nos primeiros dias de desenvolvimento,

evidenciado pela baixa taxa de prenhez aos 30 dias; no período que variou entre

30 e 60 dias; e também durante a organogênese, entre 90 a 150 dias de gestação

(Figura 5).

100%

35%18% 12%

0% 0% 0% 0% 0% 0%

100%

23% 15% 15% 11% 10% 7% 7% 7% 7%

100%

27% 20% 20% 13% 10% 9% 9% 6% 6%0%

20%

40%

60%

80%

100%

Taxa

de

pren

hez

Transfer. D30 D60 D90 D120 D150 D180 D210 D240 Nascidos

Inic

iais

Inte

rmed

iária

s

Tard

ias

Dias de gestação



bovinos produzidos a partir de transferência nuclear de células somáticas

submetidas a diferentes passagens em cultivo in vitro. As setas indicam os

intervalos de maior perda gestacional.

23

6.2) Efeito do Sexo dos Fibroblastos

Para a avaliação do efeito do sexo dos fibroblastos no desenvolvimento de

embriões produzidos por transferência nuclear foi excluído das análises o grupo de

embriões reconstruídos com células somáticas de passagens prolongadas,

evitando, assim, a influência desta variável.

Durante o desenvolvimento pré-implantação, especialmente em relação aos

parâmetros estudados: clivagem, 8 células e formação de blastocisto, o gênero

apresentou efeito significativo nos resultados obtidos. Embriões fêmeas

apresentaram maior taxa de clivagem (78% vs 74%; p < 0,05), porém, menor taxa de

formação de blastocisto comparados com embriões machos (14% vs 16%; p < 0,05).

Em relação ao estádio de 8 células, embriões machos e fêmeas não diferiram entre

si (Figura 6).

Na tabela 3 estão apresentados os dados numéricos de produção dos embriões

durante o desenvolvimento pré-implantação que foram submetidos à transferência

nuclear a partir dos grupos de células estudados (macho e fêmea).


transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em relação ao sexo da

célula doadora de núcleo.

Número de oócitos Oócitos fundidos Sexo célula doadora Total Fundidos 2 células 8 células blastocisto Fêmea 4.337 2.324 1.807 721 339 Macho 862 527 392 162 84

Total 5.199 2.851 2.199 883 423

24

78% 74%

31% 31%

14% 16%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Clivagem 8 células Blastocisto

Fêmea Macho


submetidos à transferência nuclear a partir de células doadoras de

núcleos femininas e masculinas.

Embora exista proximidade em relação às taxas de prenhez aos 30 dias entre

indivíduos machos e fêmeas, os resultados, apesar de não significativos, sugerem

uma tendência à maior competência de desenvolvimento a termo de machos

comparada a fêmeas em relação às prenhezes detectadas (40% vs 27%,

respectivamente; p = 0,13; Figura 7).

Da mesma maneira, bezerros nascidos a partir de embriões produzidos por

transferência nuclear utilizando células doadoras de núcleos masculinas

apresentaram tendência a uma maior taxa de sobrevivência em relação àqueles

nascidos de células femininas (63% vs 46%, respectivamente; p = 0,14).

Como ocorreram para os grupos das passagens celulares, os resultados não

apresentaram diferenças estatisticamente significativas possivelmente devido ao

número limitado de receptoras que apresentaram prenhez aos 30 dias e gestação a

termo e de animais que sobreviveram após o nascimento.

Na tabela 4 estão apresentados os dados numéricos de gestação durante o

desenvolvimento pós-implantação dos embriões que foram submetidos à

transferência nuclear a partir dos grupos de células estudados (macho e fêmea).

a b

a a

a b

25


de embriões produzidos por transferência nuclear de células somáticas

(TNCS) em relação ao sexo da célula doadora de núcleo.

Número de embriões transferidos Gestação Idade célula

doadora Total Prenhez 30 dias A termo Sobrevivência

Fêmea 193 49 13 6 Macho 67 20 8 5

Total 260 69 21 11

25%

30%

27%

40%46%

63%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Prenhez A termo Sobrevivência

Fêmea Macho

Figura 7. Taxas de prenhez, gestação a termo e sobrevivência após o nascimento

de embriões submetidos à transferência nuclear a partir de células

doadoras de núcleos femininas e masculinas.

Como mencionado anteriormente, durante o período de gestação, as

receptoras apresentaram perdas gestacionais a partir do momento em que o

embrião foi transferido até o nascimento dos bezerros. Diferenças significativas

foram observadas entre os sexos, sendo que fêmeas apresentaram maior taxa de

aborto entre 90 a 150 dias de gestação (Figura 8).

a a

a

a

a

a

26

100%

25% 18% 18% 12%10% 8% 7% 7% 6%

100%

30%18% 18% 16% 16% 12% 12% 12% 12%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Taxa

de

pren

hez

Transfer. D30 D60 D90 D120 D150 D180 D210 D240 Nascidos Macho

Fêmea

Dias de gestação


bovinos machos e fêmeas produzidos a partir de transferência nuclear de

células somáticas. As setas indicam o período crítico de perda

gestacional.

Crítico aos clones

Crítico às fêmeas

27

7) Discussão

7.1) Efeito do número da passagem dos fibroblastos

Os resultados deste estudo demonstram que o número da passagem das

células doadoras de núcleo influencia a competência de desenvolvimento dos

embriões submetidos à transferência nuclear, bem como a taxa de gestação a

termo, uma vez que embriões reconstruídos com células somáticas de passagens

prolongadas apresentaram menor desenvolvimento a blastocisto e não

progrediram durante a gestação.

Concordando com estes dados, Jang et al. (2004), apesar de não

encontrarem diferenças de desenvolvimento em embriões clones derivados de

células de diferentes passagens, evidenciaram um aumento de blastômeros

apoptóticos em embriões reconstruídos com células de número de passagens

elevados, sugerindo que o uso destas células poderia diminuir as taxas de prenhez e

nascimento de embriões clones pela diminuição da viabilidade dos blastocistos.

Por outro lado, resultados obtidos por Kubota et al. (2000) não apresentaram

diferenças no desenvolvimento de embriões submetidos à transferência nuclear

utilizando fibroblastos adultos entre a 5ª e a 15ª passagens. Além disso, Bhuiyan e

colaboradores (2004), também não encontraram efeito no número da passagem

de células doadoras transfectadas no desenvolvimento in vitro de embriões

transgênicos (3ª a 7ª = 11%; 8ª a 12ª passagens = 12% de blastocistos).

Roh e colaboradores (2000), trabalhando com fibroblastos fetais transgênicos,

demonstraram que embriões oriundos de células provindas de passagens iniciais (8ª

a 16ª) e tardias (17ª a 32ª) foram capazes de suportar o desenvolvimento in vitro

após a transferência nuclear, porém com taxas reduzidas de formação de

blastocistos para aqueles oriundos de passagens tardias.

Dados da literatura relatam que cultivos prolongados, em termos de duração

e número de passagens de células doadoras transfectadas, são essenciais para

integração estável do gene transfectado e para a seleção das células

transfectadas antes do procedimento de transferência nuclear (WESTHUSIN et al.,

2001). Contudo, foi evidenciado que o número da passagem de células doadoras

28

transfectadas influencia a competência do desenvolvimento embrionário (ARAT et

al., 2001; ROH et al., 2000; SCHNIEKE et al., 1997).

Neste estudo, foi evidenciado que embriões reconstruídos com células

somáticas em passagens iniciais e intermediárias foram equivalentemente

competentes em número de prenhez e gestação a temo, entretando, aqueles

produzidos com células em passagens tardias não foram competentes em sinalizar

e manter uma gestação a termo.

Em contraste, Kubota et al. (2000) demonstraram que fibroblastos oriundos da

pele de um animal adulto, cultivados por um longo período (acima da 15ª

passagem), apresentaram taxas superiores de desenvolvimento comparados

àqueles cultivados por um curto período, obtendo sucesso no nascimento de

bezerros clones.

Atualmente, uma grande preocupação sobre a utilização de células oriundas

de longas passagens na TNCS é que estas poderiam estar influenciando a eficiência

da clonagem devido ao seu estado de senescência. Este envelhecimento celular

pode ser um fator limitante nas aplicações de TNCS na biotecnologia animal, pois

compromete a correta divisão celular (JANG et al., 2004).

Além disso, quando as células são cultivadas por um longo período, as

alterações genéticas e epigenéticas podem ser acumuladas durante os ciclos de

divisões celulares, podendo resultar em falhas durante a gestação que levam ao

aborto ou problemas congênitos (CAMPBELL et al., 1996a).

Analisando a expressão de genes, Walker et al. (1996) e Young et al. (1998)

observaram que alterações na regulação de genes marcados foram conseqüência

da utilização de células doadoras de núcleo cultivadas por longos períodos,

inviabilizando, desta maneira, o desenvolvimento embrionário e fetal.

Neste estudo, apesar de fibroblastos oriundos de animais adultos cultivados in

vitro por longo período (9ª a 12ª passagens) apresentarem maior taxa de prenhez,

os resultados indicam que células oriundas de animal adulto e cultivadas por um

longo período não são competentes como doadoras de núcleo para produzir

embriões viáveis ao desenvolvimento gestacional a termo.

29

7.2) Efeito do Sexo dos Fibroblastos

Relatos da literatura mostram-se divergentes em relação ao desequilíbrio na

produção de embriões machos e fêmeas a partir de fecundação in vitro, pois

embora alguns estudos não tenham identificado diferenças na proporção entre os

sexos (CARVALHO et al., 1995), outros autores revelaram um número superior de

embriões machos que se desenvolveram até o estádio de blastocisto (GUTIÉRREZ-

ADÁN et al., 1996; LONERGAN et al., 1999).

Neste trabalho, a produção de embriões por transferência nuclear apresentou

maior taxa de desenvolvimento a blastocisto de embriões machos. Além disso,

embora não tenham sido observadas diferenças em relação à taxa de prenhez aos

30 dias, foi explícito o sucesso das gestações de machos durante o desenvolvimento

pós-implantação, indicando uma possível alteração durante a gestação de

fêmeas.

Concordando com estes resultados, autores relataram uma possível vantagem

no desenvolvimento de embriões machos oriundos de sistemas de produção in vitro

comparado a fêmeas, bem como um maior número de nascimento de bezerros,

comprovando um maior sucesso de gestações de machos, porém, a literatura atual

não revela o mecanismo que possa estar influenciando nestes desvios durante o

desenvolvimento de embriões machos e fêmeas pré e pós-implantação (GUTIÉRREZ-

ADÁN et al., 1996; LONERGAN et al., 1999).

Sugere-se que o ponto de transição que distancia a produção de machos em

relação à produção de fêmeas ocorra entre os estádios de blastocisto inicial e

demais fases de blastocisto. Blastocistos expandidos e eclodidos no 7º dia de cultivo

(desenvolvimento rápido) apresentaram significativamente maior proporção de

machos (68 e 100%, respectivamente), comparada ao estádio de mórula

(desenvolvimento lento), onde mostraram menor proporção (24%; CARVALHO et al.,

1996).

Outros autores observaram efeitos de distorção entre machos e fêmeas logo

no 3º dia após a inseminação (MARQUANT-LE GUIENNE et al., 1992), no estádio de 8

células no bovino, que coincide com a primeira expressão do genoma embrionário,

onde a capacidade de síntese de RNA é adquirida (KOPECNY e NIEMANN, 1993).

A razão pela qual, embriões machos apresentam maior velocidade de

desenvolvimento ainda não está completamente esclarecida. Sugere-se que o

30

consumo de glicose fornecida no meio de cultivo possa estar relacionado com este

desvio. Embriões bovinos produzidos in vitro aumentam acentuadamente o

consumo de glicose entre o estádio de 2 células ao estádio de blastocisto eclodido

em conseqüência do aumento do metabolismo. Este evento ocorre

preferencialmente em duas etapas do desenvolvimento embrionário: o início da

transcrição do genoma embrionário (8 a 16 células), e no momento da

compactação (RIEGER et al., 1992).

O consumo de glicose pode estar relacionado com as diferenças no

desenvolvimento entre machos e fêmeas, pelo fato de que enzimas ligadas ao

cromossomo X, responsáveis pelo seu metabolismo, estão presentes em menor

concentração nos machos durante as primeiras clivagens, causando assim, maior

nível de radicais livres, que são responsáveis pelo aumento na velocidade de

clivagem (LEQUARRE et al., 1997).

Gutierrez-Adán e colaboradores (1993) também mostraram que as condições

de cultivo in vitro interferem na proporção de embriões machos e fêmeas, pois seus

resultados revelaram uma perda preferencial de embriões de camundongos

fêmeas comparado com embriões machos. Apesar destes relatos, King e

colaboradores (1991) não observaram esta distorção para embriões bovinos

produzidos por fecundação in vitro, afirmando que as condições de cultivo in vitro

não influenciam na proporção entre os sexos.

Da mesma maneira, Holm et al. (1998) relataram uma proximidade entre as

taxas obtidas para machos e fêmeas (53:47%, respectivamente) quando avaliados

após a fecundação e em todos os eventos de clivagem, incluindo o estádio de

compactação, formação de blastocele e a cada duração do ciclo celular.

Concordando com estes resultados Lê Bourhis e colaboradores (1998), não

observaram diferenças significativas nas taxas de blastocistos produzidos por

transferência nuclear a partir de núcleos embrionários machos e fêmeas analisados

no 7º dia de cultivo in vitro. Além disso, também avaliaram o potencial de destes

blastocistos em proporcionar o nascimento de bezerros vivos após sua transferência

para receptoras, verificando que não houve diferença na taxa de prenhez aos 35

dias, 90 dias e nascimento.

Thibier e Nibart (1995), trabalhando com embriões produzidos in vivo e

submetidos ao processo de sexagem, obtiveram taxas de 54% de nascimentos de

31

embriões machos e 46% de nascimentos de embriões fêmeas, não apresentando

diferença significativa na relação 50:50.

Durante o período gestacional, evidenciamos pontos críticos que parecem ser

característicos de gestação de clones. Na Figura 9 está esquematizada a perda

gestacional de machos e fêmeas e observou-se que existe uma equivalência para

ambos os sexos no primeiro trimestre de gestação (entre 30 e 90 dias).

A partir deste momento, a gestação de embriões fêmeas sofreu maior perda

em relação à gestação de machos (p < 0,05), tornando-se novamente equilibrada

a partir do 6º mês de gestação (180 dias). Embora a taxa de mortalidade, após o

nascimento, de fêmeas tenha sido superior a de machos, os resultados não foram

significativos (fêmeas 6/13; machos 5/8).

Acredita-se que o desvio em relação à perda gestacional entre machos e

fêmeas, caracterizado preferencialmente entre os dias 90 e 150 da gestação, esteja

correlacionado ao evento da organogênese, ou seja, primeiro trimestre da

gestação onde ocorre a formação dos órgãos, sugerindo que embriões fêmeas

tenham maiores alterações congênitas ocasionando, assim, maior taxa de aborto

comparada com machos (Figura 10).

Por ocorrer em fêmeas, tais relatos levam à especulação de que mecanismos

epigenéticos que controlam e modulam a inativação do X estão sujeitos a

alterações num sistema in vitro. Partindo-se da informação de que o evento de

inativação do X é um processo altamente regulado e extremamente necessário,

King e colaboradores (2006) evidenciaram que falhas durante a inativação de um

dos cromossomos X, ocasionada por mutação ou transfecção, acarretaram em

letalidade embrionária para fêmeas.

Assim, falhas neste processo poderiam estar ocasionando as diferentes taxas

de nascimento entre machos e fêmeas, prejudicando a produção embrionária e as

gestações de fêmeas que foram encontradas neste trabalho.

32

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

30 60 90 120 150 180 210 240 270 290 morte

Dias de gestação

Taxa

de

perd

a ge

stac

iona

lFêmea Macho

Figura 9. Principais pontos de perda gestacional influenciados pelo sexo de

embriões bovinos machos e fêmeas submetidos à transferência nuclear.

A perda gestacional no período entre 30 e 90 dias foi considerada

independente do sexo. As setas indicam o valor de p para as taxas de

aborto de fêmeas em comparação com machos. O período de 90 a 150

dias foi considerado um ponto crítico para a perda gestacional em

fêmeas por apresentar p < 0,01.

p = 0,08 p = 0,01 p = 0,26

p = 0,1 p = 0,07

p = 0,07 p = 0,08

p = 0,07

Período independente do sexo

Período sexo-dependente

33

Embrião pré-implantação

Desenvolvimento embrionário (semanas)

Desenvolvimento fetal (semanas)

1 - 2 3 4 5 6 7 8 12 16 20-36 38 14 dias 50 dias 90 dias 120

dias 270 dias

290 dias

Clivagem, implantação e

gastrulação

Maior risco de anomalias morfológicas

Erros funcionais e fisiológicos; menor risco de anomalias morfológicas

Músculo cardíaco e primeiras células sanguíneas

Sistema nervoso

Visão e audição

Diferenciação do tubo digestivo

Sistema respiratório e fígado

Membros superiores

Membros inferiores

Estomago e rins

Cordão umbilical

Cartilagem, pele e músculos

Dentes

Palato

Genitais externos

Maturação

do pulmão

Figura 10. Organogênese do desenvolvimento embrionário e fetal após

implantação, evidenciando os períodos críticos durante a gestação

(modificado de MOORE e PERSAUD, 2000).

34

8) Conclusões

1) Células doadoras de núcleos cultivadas por um longo período

prejudicam a produção de blastocistos e aumentam as chances de

perdas durante a gestação em embriões produzidos por transferência

nuclear de células somáticas (TNCS).

2) Células do gênero masculino quando aplicadas na TNCS resultam em

maior taxa de desenvolvimento embrionário e maior competência a uma

gestação a termo.

9) Perspectivas

Sugere-se que embriões machos são reprogramados de maneira mais eficiente

que embriões fêmeas possivelmente devido ao evento de inativação do

cromossomo X.

35

10) Referências Bibliográficas

ALLSOPP, R.C.; VAZIRI, H.; PATTERSON, C.; GOLDSTEIN, S.; YOUNGLAI, E.V.; FUTCHER,

A.B.; GREIDER, C.W.; HARLEY, C.B. Telomere length predicts replicative capacity

of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 89, p. 10114-10118, 1992.

ARAT, S.; RZUCIDLO, S.J.; GIBBONS, J.; MIYOSHI, K.; STICE, S.L. Produciton of transgenic

bovine embryos by transfer of transfected granulosa cells into enucleated

oocytes. Molecular Reproduction and Development, v. 60, p. 20-26, 2001.

AVERY, B.; BAK, A.; SCHMIDT, M. Differential cleavage rates and sex determination in

bovine embryos. Theriogenology, v. 32, p. 139-147, 1989.

AVERY, B.; MADISON, V.; GREVE, T. Sex and development in bovine in-vitro fertilized

embryos. Theriogenology, v. 35, p. 953-963, 1991.

BAGUISI, A.; BEHBOODI, E.; MELICAN, D.T.; POLLOCK, J.S.; DESTREMPES, M.M.;

CAMMUSO, C.; WILLIAMS, J.L.; NIMS, S.D.; PORTER, C.A.; MIDURA, P.; PALACIOS,

M.J.; AYRES, S.L.; DENNISTON, R.S.; HAVES, M.L.; ZIOMEK, C.A.; MEADE, H.M.;

GODKE, R.A.; GAVIN, W.G.; OVERSTROM, E.W.; ECHELARD, Y. Production of goats

by somatic cell nuclear transfer. Nature Biotecnology, v. 17, n. 5, p. 456-461, 1999.

BAVISTER, B.D. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Human

Reproduction Update, v. 1, n. 2, p. 91-148, 1995.

BENN, P.A. Specific chromosome aberrations in senescent fibroblast cell lines derived

from human embryos. American Journal of Human Genetics, v. 28, p. 465-473,

1976.

BHUIYAN, M.M.U.; CHO, J.; JANG, G.; PARK, E.; KANG, S.; LEE, B.; HWANG, W. Effect of

transfection and passage number of ear fibroblasts on in vitro development of

bovine transgenic nuclear transfer embryos. The Journal of Veterinary Medical

Science, v. 66, n. 3, p. 257-261, 2004.

36

BIGGERS, J.D. The potential use of artificially produced monozygotic twins for

comparative experiments. Theriogenology, v. 26, p. 1-25, 1986.

BOURC’HIS, D.; Le BOURHIS, D.; PATIN, D.; NIVELEAU, A.; COMIZZOLI, P.; RENARD, J.P.;

VIEGAS-PEQUIQNOT, E. Delayed and incomplete reprogramming of

chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos. Current Biology, v.

11, n. 19, p. 1542-1546, 2001.

BUREAU, W.S.; BORDIGNON, V.; LEVEILLEE, C.; SMITH, L.C.; KING, W.A. Assessment of

chromosomal abnormalities in bovine nuclear transfer embryos and in their donor

cells. Cloning Stem Cells, v. 5, p. 123-132, 2003.

CAMPBELL, K.H.S.; LOI, P.; OTAEGUI, P.J.; WILMUT, I. Cell cycle co-ordination in

embryo cloning by nuclear transfer. Reviews of Reproduction, v. 1, p. 40-46,

1996a.

CAMPBELL, K.H.S.; McWHIR, J.; RITCHIE, W.A.; WILMUT, I. Sheep cloned by nuclear

transfer from a cultured cell line. Nature, v. 380, p. 64-66, 1996b.

CARVALHO, R.V. DEL CAMPO, M.R.; PLANTE, Y.; MAPLETOFT, R.J. Effects of stage of

development on sex ratio and survival after freezing of day 7 bovine IVF embryos.

Theriogenology, v. 43, p. 183, 1995.

CARVALHO, R.V.; DEL CAMPO, M.R.; PALASZ, A.T.; PLANTE, Y.; MAPLETOFT, R.J.

Survival rates and sex ratio of bovine IVF embryos frozen at different

developmental stages on day 7. Theriogenology, v. 45, p. 489-498, 1996.

CHESNE, P.; ADENOT, P.G.; VIGLIETTA, C.; BARATTE, M.; BOULANGER, L.; RENARD, J.P.

Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature

Biotecnology, v. 20, p. 366-369, 2002.

CIBELLI, J.B.; STICE, S.L.; GOLUEKE, P.J.; KANE, J.J.; JERRY, J.; BLACKWELL, C.; LEÓN,

F.A.P.; ROBL, J.M. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal

fibroblasts. Science, v. 280, p. 1256-1258, 1998.

37

DEAN, W.; SANTOS, F.; STOJKOVIC, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; WALTER, J.; WOLF, E.;

REIK, W. Conservation of methylation reprogramming in mammalian

development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, n. 24, p.

13734-13738, 2001.

DE LA FUENTE, R.; HAHNEL, A.; BASRUR, P.K.; KING, W.A. X Inactive-specific transcript

(Xist) expression and X chromosome inactivation in the preattachment bovine

embryo. Biology of Reproduction, v. 60, p. 769-775, 1999.

DINDOT, S.V.; FARIN, P.W.; FARIN, C.E.; ROMANO, J.; WALKER, S.; LONG, C.;

PIEDRAHITA, J.A. Epigenetic and genomic imprinting analysis in nuclear transfer

derived Bos gaurus/Bos taurus hybrid fetuses. Biology of Reproduction, v. 71, n. 2,

p. 470-478, 2004.

EDWARDS, G.L.; KING, W.A.; KAWARSKY, S.J.; EALY, A.D. Responsiveness of early

embryo to environmental insults: potential protective roles for HSP70 and

glutathione. Theriogenology, v. 55, p. 209-224, 2001.

GALLI, C.; LAGUTINA, I.; CROTTI, G.; COLLEONI, S.; TURINI, P.; PONDERATO, N.; DUCHI,

R.; LAZZARI, G. Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature, v. 424, n.

6949, p. 635, 2003.

GIRALDO, A.M.; GOMEZ, M.C.; DRESSER, B.L.; HARRIS, R.F.; KING, A.L.; POPE, C.E.

Chromosomal stability of African wild cat (Felis silvestres libica) somatic cells and

cloned embryos. Reproduction, Fertility and Development, v. 16, p. 124-125, 2004.

GUTIERREZ-ADÁN, A.; PINTADO, B.; FUENTES, S.; PAYAS, A.; UGARTE, C.; De La FUENTE,

J. Influence of micromanipulation and in vitro culture in the sex dependent loss of

embryos. 9th Scientific Meeting of Europe association AETE, p. 206, 1993.

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; BEHBOODI, E.; ANDERSON, G.B.; MEDRANO, J.F.; MURRAY, J.D.

Relationship between stage of development and sex of bovine IVM-IVF embryos

38

cultured in vitro versus in the sheep oviduct. Theriogenology, v. 46, p. 515-525,

1996.

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; LONERGAN, P.; RIZOS, D.; WARD, F.A.; BOLAND, M.P.; PINTADO,

B.; De La FUENTE, J. Effect of the in vitro culture system on the kinetics of

blastocyst development and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology, v. 55,

p. 1117-1126, 2001.

HAMILTON, M.L.; VAN REMMEN, H.; DRAKE, J.A.; YANG, H.; GUO, Z.M.; KEWITT

RICHARDSON, A. Does oxidative damage to DNA increases with age?

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v. 98, p. 10469-10474, 2001.

HANADA, H.; TAKEDA, K.; TAGAMI, T.; NIRASAWA, K.; AKAGI, S.; ADACHI, N.;

TAKAHASHI, S.; IZAIKE, Y.; IWAMOTO, M.; FUCHIMOTO, D.; MIVASHITA, N.; KUBO, M.;

ONISHI, A.; KING, W.A. Chromosome instability in the cattle clones derived by

somatic cell nuclear transfer. Molecular Reproduction and Development, v. 71, n.

1, p. 36-44, 2005.

HEYMAN, Y. Nuclear transfer: a new tool for reproductive biotechnology in cattle.

Reproduction Nutrition Development, v. 45, n. 3, p. 353-361, 2005.

HINRICHS, K. Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology, v. 64, p. 535-541,

2005.

HOLM, P.; SHUKRI, N.N.; VAJTA, G.; BOOTH, P.; BENDIXEN, C.; CALLESEN, H.

Developmental kinetics of the first cell cycles of bovine in vitro produced embryos

in relation to their in vitro viability and sex. Theriogenology, v. 50, p. 1285 – 1299,

1998.

HUMPHERYS, D.; EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT 3rd, W.M.;

BINISZKIEWIEZ, D.; YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Epigenetic instability in ES cells

and cloned mice. Science, v. 293, n. 5527, p. 95-97, 2001.

39

JANG, G.; PARK, E.S.; CHO, H.K.; BHUIYAN, M.M.U.; LEE, B.C.; KANG, S.K.; HWANG, W.S.

Preimplantation embryo development and incidence of blastomere apoptosis in

bovine somatic cell nuclear transfer embryos reconstructed with long-term

cultured cells. Theriogenology, v. 62, p. 512-521, 2004.

KANG, Y.K.; KOO, D.B.; PARK, J.S.; CHOI, Y.H.; CHUNG, A.S.; LEE, K.K. et al. Aberrant

methylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nature Genetic, v. 28,

p. 173-177, 2001.

KATO, Y.; TANI, T.; SOTOMARU, Y.; KUROKAWA, K.; KATO, J.Y.; DOGUCHI, H.; YASUE, H.;

TSUNODA, Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, v.

282, p. 2095-2098, 1998.

KING, W.A.; YADAV, B.R.; XU, K.P.; PICARD, L.; SIRARD, M.A.; VERINI SUPPLIZI, A.;

BETTERIDGE, K.J. The sex ratios of bovine embryos produced in vivo and in vitro.

Theriogenology, v. 36, p. 779-788, 1991.

KING, W.A.; PICARD, L.; BOUSQUET, D.; GOFF, A.K. Sex-dependent loss of bisected

bovine morulae after culture and freezing. Journal of Reproduction and Fertility,

v. 96, p. 453-459, 1992.

KING, W.A; COPPOLA, G.; ALEXANDER, B.; MASTROMONACO, G.; PERRAULT, S.; NINO-

SOTO, M.I.; PINTON, A.; JOUDREY, E.M.; BETTS, D.H. The impact of chromosomal

alteration on embryo development. Theriogenology, v. 65, p. 166-177, 2006.

KOPECNY, V.; NIEMANN, H. Formation of nuclear microarchitecture in the

preimplantation bovine embryo at the onset of transcription: implications for

biotechnology. Theriogenology, v. 39, p. 109-119, 1993.

KOCHHAR, H.P.S.; PEIPPO, J.; KING, W.A. Sex related embryo development.

Threriogenology, v. 55, p. 3-14, 2001.

KUBOTA, C.; YAMAKUCHI, H.; TODOROKI, J.; MIZOSHITA, K.; TABARA, N.; BARBER, M.;

YANG, X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term

40

culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America, v. 97, n. 3, p. 990-995, 2000.

LE BOURHIS, D.; CHESNE, P.; NIBART, M.; MARCHAL, J.; HUMBLOT, P.; RENARD, J.P.;

HEYMAN, Y. Nuclear transfer from sexed parent embryos in cattle: efficiency and

birth of offspring. Journal of Reproduction and Fertility, v. 113, p. 343-348, 1998.

LEE, B.C.; KIM, M.K.; JANG, G.; OH, H.J.; YUDA, F.; KIM, H.J. et al. Dogs cloned from

adult somatic cells. Nature, v. 436, p. 641, 2005.

LEQUARRE, A.S.; GRISART, B.; MOREAU, B.; SCHUURBIERS, N.; MASSIP, A.; DESSY, F.

Glucose metabolism during bovine preimplantation development: analysis of

gene expression in single oocytes and embryos. Molecular Reproduction and

Development, v. 48, p. 216-226, 1997.

LONERGAN, P.; KHATIR, H.; PIUMI, F. et al. Effect of time interval from insemination to

first cleavage on the developmental characteristics, sex ratio and pregnancy

rate after transfer of bovine embryos. Journal of Reproduction and Fertility, v.

117, p. 159-167, 1999.

MARQUANT-LE GUIENNE, B.; NIBART, M; GUYADER, C.; KOHEN, G.; ESPOSITO, L.;

THUARD, M.; THIBIER, M. DNA probe sexing of young in vitro fertilized bovine

embryos. Theriogenology, v. 37, p. 253, 1992.

MASTROMONACO, G.F.; PERRAULT, S.D.; BETTS, D.H.; KING, W.A. Role of chromosome

stability and telomere length in the production of viable cell lines for somatic cell

nuclear transfer. BMC Developmental Biology, v. 6:41, p. 1-13, 2006.

MEIRELLES, F.V.; PROVIDELO, F.D.; MERIGHE, G.K.F.; MIRANDA, M. TRALDI, A.; BIRGEL,

E.; VALIM, J.R.; WATANABE, Y.F. Desafios para clonagem comercial – planejando

o futuro. Acta Scientiae Veterinariae, 34 (Supl 1), p. 235-242, 2006.

MEIRELLES, F.V.; PROVIDELO, F.D.; PERECIN, F.; MERIGHE, G.K.F.; FERREIRA, C.R.;

FERRAZ, J.B.S.; ELER, J.P.; MIRANDA, M.S.; CHIARATTI, M.R.; DE BEM, T.H.C.

41

Transferência de núcleos: potenciais aplicações no controle genético nuclear e

citoplasmático. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 31, n. 3, p. 382-390,

2007.

MOORE, K.L.; PERSAUD, T.V.N. Embriologia Básica, 5a ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 453 p., 2000.

NIEMANN, H.; WRENZYCKI, C. Alterations of expression of developmentally important

genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions:

implications for subsequent development. Theriogenology, v. 53, p. 21-34, 2000.

ONISHI, A.; IWAMOTO, M.; AKITA, T.; MIKAWA, S.; AWATA, T. et al. Pig cloning by

microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science, v. 289, p. 1188-1190, 2000.

ORTEGON, H.; BETTS, D.H.; LIN, L.; COPPOLA, G.; PERRAULT, S.D.; BLONDIN, P.; KING,

W.A. Genomic stability and physiological assessments of live offspring sired by a

bull clone, Starbuck II. Theriogenology, v. 67, p. 116-126, 2007.

PIGNOLO, R.J.; CRISTOFALO, V.J.; ROTENBERG, M.O. Senescent WI-38 cells fail to

express EPC-I, a gene induced in young cells upon entry into the G0 state. The

Journal of Biological Chemistry, v. 268, p. 8949-8957, 1993.

PRATHER, R.S.; BARNES, F.L.; SIMS, M.; ROBL, J.M.; EYESTONE, W.H.; FIRST, N.L. Nuclear

transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient

oocytes. Biology of Reproduction, v. 37, p. 859-866, 1987.

POLEJAEVA, I.A.; CHEN, S.H.; VAUGHT, T.D.; PAGE, R.L.; MULLINS, J.; BALL, S.; DAI, Y.;

BOONE, J.; WALKER, S.; AYARES, D.L.; COLMAN, A.; CAMPBELL, K.H.S. Cloned pigs

produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, v. 407, p. 86-90,

2000.

RIDEOUT 3rd, W.M.; EGGAN, K.; JAENISCH, R. Nuclear cloning and epigenetic

reprogramming of the genome. Science, v. 293, p. 1093-1098, 2001.

42

RIEGER, D. Relationship between energy metabolism and development of early

mammalian embryos. Theriogenology, v. 37, p. 75-93, 1992.

ROH, S.; SHIM, H.; HWANG, W.S.; YOON, J.T. In vitro development of green

fluorescent protein (GFP) transgenic bovine embryos after nuclear transfer using

different cell cycles and passages of fetal fibroblasts. Reproduction, Fertility and

Development, v. 12, p. 1-6, 2000.

SANTOS, F.; ZAKHARTCHENKO, V.; STOJKOVIC, M.; PETERS, A.; JENUWEIN, T.; WOLF, E.;

REIK, W.; DEAN, W. Epigenetic marking correlates with developmental potential

in cloned bovine preimplantation embryos. Current Biology, v. 13, n. 13, p. 1116-

1121, 2003.

SAS User’s Guide SAS Institute Inc., Cary, NC.

SCHNIEKE, A.E.; KIND, A.J.; RITCHIE, W.A.; MYCOCK, K.; SCOTT, A.R.; RITCHIE, M.;

WILMUT, I.; COLMAN, A.; CAMPBELL, K.H.S. Human factor IX transgenic sheep

produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science, v. 278,

p. 2130-2133, 1997.

SHIELS, P.G; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S.; WADDINGTON, D.; WILMUT, I.; COLMAN, A.;

SCHNIEKE, A.E. Analysis of telomere lengths in cloned sheep. Nature, v. 399, p.

316 – 317, 1999.

SHIMIZU, N.; SHIMIZU, Y.; KONDO, I.; WOODS, C.; WEGNER, T. The bovine genes for

phosphoglycerate kinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alpha-

galactosidase and hypoxanthine phosphoribosyltransferase are linked to the X

chromosome in cattle-mouse cell hybrids. Cytogenetics and Cell Genetics, v. 29,

n. 1, p. 26-31, 1981.

SHIN, T.; KRAEMER, D.; PRYOR, J.; LIU, L.; RUGILA, J.; HOWE, L.; et al. A cat cloned by

nuclear transplantation. Nature, v. 415, p. 859, 2002.

43

SMITH, L.C.; BORDIGNON, V.; BABKINE, M.; FECTEAU, G.; KEEFER, C. Benefits and

problems with cloning animals. The Canadian Veterinary Journal, v. 41, p. 919-

924, 2000.

SMITH, L.C. Bovine cloning: a new technique developed at University of Montreal.

The Canadian Veterinary Journal, v. 43, n. 3, p. 177, 2002.

SMITH, L.C.; MURPHY, B.D. Genetic and epigenetic aspects of cloning and potential

effects on offspring of cloned mammals. Cloning Stem Cells, v. 6, p. 126-132, 2004.

STRELCHENKO, N. Bovine pluripotent stem cells. Theriogenology, v. 45, p. 131-140,

1996.

TAKAGI, N.; ABE, K. Detrimental effects of two active chromosomes on early mouse

development. Development, v. 109, p. 189-201, 1990.

THIBIER, M.; NIBART, M. The sexing of bovine embryos in the field. Theriogenology, v.

43, p. 71-80, 1995.

VANDERWALL, D.K.; WOODS, G.L.; ASTON, K.I.; BUNCH, T.D.; LI, G.; MEERDO, L.N. et al.

Cloned horse pregnancies produced using adult cumulus cells. Reproduction,

Fertility and Development, v. 16, p. 675-679, 2004.

WAKAYAMA, T.; PERRY, A.C. ZUCCOTTI, M.; JOHNSON, K.R.; YANAGIMACHI, R. Full-

term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell

nuclei. Nature, v. 394, p. 369-374, 1998.

WALKER, S.K.; HARTWICH, K.M.; SEAMARK, R.F. The production of unusually large

offspring following embryo manipulation: concepts and challenges.


WATANABE, Y.F.; WATANABE, M.R.; GALERANI, M.A.V.; VILA, R.A.; LÔBO, R.B. The

influence of B2 and a modified CR2 medium on the in vitro production of bovine

44

embryos with cumulus and oviduct co-culture. Theriogenology, v. 51, n. 1, p. 259,

1999.

WESTHUSIN, M.E.; LONG, C.R.; SHIN, T.; HILL, J.R.; LOONEY, C.; PRYOR, G.H.;

PIEDRAHITA, J.A. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology, v. 55,

p. 35-49, 2001.

WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R.; VIVANCO, W.H. Adult somatic cell nuclear

transfer is used to preserve the last surviving cow of Enderby Island cattle breed.

Reproduction, Fertility and Development, v. 10, p. 369-378, 1998.

WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R. Production of cloned calves following nuclear

transfer with cultured adult mural granulose cells. Biology of Reproduction, v. 60,

p. 996-1005, 1999.

WELLS, D.N.; FORSYTH, J.T.; McMILLAN, V.; OBACK, B. The health of somatic cell

cloned cattle and their offspring. Cloning Stem Cells, v. 6, p. 101-110, 2004.

WOODS, G.L.; WHITE, K.L.; VANDERWALL, D.K.; LI, G.P.; ASTON, K.I.; BUNCH, T.D.;

MEERDO, L.N.; PATE, B.J. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer.

Science, v. 301, n. 5636, p. 1063. 2003.

WRENZYCKI, C.; WELLS, D.; HERRMANN, D.; MILLER, A.; OLIVER, J.; TERVIT, R.; NIEMANN,

H. Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned

bovine blastocysts. Biology of Reproduction, v. 65, n. 1, p. 309-317, 2001.

XUE, F.; TIAN, X.C.; DU, F.; KUBOTA, C.; TANEJA, M.; DINNYES, A.; DAI, Y.; LEVINE, H.;

PEREIRA, L.V.; YANG, X. Aberrant patterns of X chromosome inactivation in bovine

clones. Nature Genetics, v. 31, n. 2, p. 216-220, 2002.

YOUNG, L.E.; SINCLAIR, K.D.; WILMUT, I. Large offspring syndrome in cattle and sheep.

Reviews of Reproduction, v. 3, p. 155-163, 1998.

45

YOUNG, L.E.; FAIRBURN, H.R. Improving the safety of embryo technologies: possible

role of genomic imprinting. Theriogenology, v. 53, p. 627-648, 2000.

46

CAPÍTULO 2

Efeito da reprogramação nuclear na

expressão de genes relacionados ao

cromossomo X em embriões bovinos

produzidos in vitro

47

Resumo

MERIGHE, G.K.F. Efeito da reprogramação nuclear na expressão de genes relacionados ao

cromossomo X em embriões bovinos produzidos in vitro. Tese de Doutorado – Faculdade de

Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2007.

Conforme descrito no capítulo anterior, os resultados evidenciaram uma maior

competência de embriões machos, produzidos por transferência nuclear, em alcançar o

estádio de blastocisto e concluir uma gestação, sugerindo alterações durante a

reprogramação nuclear entre os sexos. No início do desenvolvimento embrionário, embriões

fêmeas (XX) poderiam potencialmente produzir duas vezes a quantidade de transcritos dos

genes ligados ao X em relação aos embriões machos (XY). Contudo, o processo de

inativação do cromossomo X, equilibra a dosagem de genes ligados ao X, tornando viável o

desenvolvimento de embriões fêmeas. Neste trabalho foi investigada a expressão de três

genes ligados ao cromossomo X e importantes para o desenvolvimento, XIST, G6PD e HPRT e

do transcrito Interferon-tau (IFN-τ) em blastocistos bovinos machos e fêmeas produzidos por

transferência nuclear e por fecundação in vitro. Oócitos derivados de matadouro foram

enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto a partir de 18 horas

pós-maturação. Após a fusão (dois pulsos de 2,25 kv/cm) e ativação química (ionomicina -

5,0 µM durante 5 minutos e 6-DMAP - 2,0 mM durante 3 horas), os conjuntos oócito-célula

somática foram cultivados em CR2 com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC,

em atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar. Embriões produzidos in vitro foram

inseminados, após centrifugação do gradiente de percoll, com 2 x 106 espermatozóides/mL

em meio TALP suplementado com BSA e PHE e cultivados nas mesmas condições dos

embriões clonados. Mediante análises de PCR em tempo real, avaliou-se a expressão

relativa dos genes estudados tomando-se como referência o gene GAPDH. As eficiências

das reações, os limiares de fluorescência e os Cts foram calculados utilizando o programa

LinRegPCR, as comparações e análises estatísticas foram realizadas pelo programa REST.

Conforme esperado, os resultados mostraram que o gene XIST foi expresso nos embriões

fêmeas e não detectado em embriões machos produzidos por FIV, porém foi discretamente

expresso em embriões machos produzidos por TN. Em contraste com dados já relatados, o

transcrito de G6PD foi expresso em menor quantidade em fêmeas comparado com

machos, sugerindo um efeito de silenciamento duplo ou outro mecanismo de controle deste

gene. Embriões fêmeas clonados apresentaram menor quantidade do transcrito de HPRT em

comparação aos embriões fêmeas produzidos por fecundação in vitro, confirmando um

efeito de silenciamento duplo dos genes ligados ao X em embriões clonados fêmeas. Não

foi encontrada diferença na expressão de Interferon-tau nos embriões estudados. Portanto,

48

embriões fêmeas reconstituídos por transferência nuclear apresentam alteração na

expressão de genes importantes ao desenvolvimento, particularmente aqueles relacionados

ao evento de inativação do cromossomo X, que foram alvo deste estudo, sugerindo maior

comprometimento destes embriões às falhas durante o mecanismo de reprogramação

nuclear.

Palavras-chave: inativação do cromossomo X, reprogramação nuclear, embriões bovinos,

transferência nuclear, sexo.

49

Abstract

MERIGHE, G.K.F. Effects of nuclear reprogramming on the expression of X chromosome-

related genes in in vitro produced bovine embryos. Tese de Doutorado – Faculdade de

Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2007.

In the previous chapter, we showed that male embryos produced by nuclear transfer

have higher competence to develop to the blastocyst stage and term pregnancy,

suggesting sex-related alterations during nuclear reprogramming. Early cleavage stages

female embryos (XX) could potentially produce twice the amount of X-linked gene products

relative to male embryos (XY). However, X chromosome inactivation, responsible for X-linked

genes dosage compensation, is necessary for female embryo development. The present

study investigated the relative expression of three X chromosome specific transcripts, XIST,

G6PD and HPRT and also of Interferon-tau (IFN-τ) in male and female bovine blastocysts

produced by nucleus transfer (NT) and in vitro fertilization (IVF). Oocytes obtained from

slaughtered cows were enucleated and reconstructed by somatic cell nucleus transfer

(TNCS) from an adult animal at 18 hours of in vitro maturation. After fusion (two 2.25 kv/cm DC

pulses for 65 µsec) and chemical activation (5.0 µM ionomycin for 5 min followed by 2.0 mM

6-DMAP for 3 hours), the couplets were cultured in CR2 on a granulosa cell monolayer at

38.8ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. IVF embryos were inseminated following

Percoll centrifugation with 2 x 106 spermatozoids/mL in TALP medium supplemented with BSA

and PHE and further cultured in the same condition as cloned embryo. For real time analysis,

GAPDH was used as reference gene. Reaction efficiencies, fluorescence thresholds and Cts

were calculated using the LinRegPCR software and comparisons and statistical analyses were

performed using the REST software. XIST transcripts were higher in female embryos, discretely

expressed in male NT embryos and not detected in IVF male embryos. In contrast with

previous reports, G6PD expression was lower in female embryos in comparison with males,

suggesting a double silencing or another control mechanism for this gene. Female NT

embryos presented lower HPRT expression compared to female IVF embryos, confirming a

double silencing of X-linked genes in female NT embryos. No differences in Interferon-tau

expression were observed among the analyzed embryos. In conclusion, the nuclear

reprogramming mechanism in bovine NT embryos alters the expression of genes important for

development, particularly those related with X chromosome inactivation which were

analyzed in this study.

Key-words: X chromosome inactivation, nuclear reprogramming, bovine embryos, nuclear

transfer, sex.

50

1) Introdução

Todas as células de um organismo multicelular superior têm basicamente um

genótipo idêntico, mas são funcionalmente e morfologicamente diferentes. Isto

ocorre não apenas pela especificidade do tecido, mas devido à expressão

espacial e temporal de genes que são controlados por mecanismos genéticos e

epigenéticos.

O sucesso da clonagem por transferência de núcleo de tecidos

diferenciados em oócitos enucleados demonstra que estes programas genéticos e

epigenéticos podem ser revertidos e que a totipotência celular pode ser restaurada.

Embora experimentos relatem a grande plasticidade de núcleos de tecidos

diferenciados, a clonagem a partir de células somáticas ainda é um processo

pouco compreendido e ineficiente, e uma série de anormalidades tem sido descrita

em embriões, fetos e recém-nascidos.

Várias evidências indicam que a reprogramação epigenética incompleta ou

inapropriada do núcleo doador é, provavelmente, a causa primária das falhas da

transferência nuclear, pois o sucesso desta biotecnologia necessita do

cancelamento da transcrição do genoma somático, e o restabelecimento de

padrões de expressão gênica embrionária (reprogramação nuclear).

Por este motivo, ocorrem eventos de silenciamento e reorganização da

cromatina, por exemplo, o silenciamento gênico de um dos cromossomos X em

fêmeas. Este evento, denominado inativação do cromossomo X (ICX) é responsável

pela equalização dos transcritos do cromossomo X entre os gêneros.

No início do desenvolvimento, o embrião feminino possui dois cromossomos X

ativos. Quando a diferenciação celular tem início, um dos dois cromossomos X, em

cada célula, é selecionado e inativado. Este evento é iniciado pela ativação do

gene XIST a partir do cromossomo X escolhido. O X inativo (Xi) adquire uma série de

características que o difere do X ativo (Xa). Entre estas diferenças encontram-se o

alto nível de metilação de seu DNA em regiões promotoras e a hipoacetilação das

histonas H4.

Enquanto que nas células que formarão o embrião a ICX se dá de forma

aleatória, no tecido extra-embrionário, em camundongos, ela é submetida à

marcação genética, sendo o X paterno preferencialmente inativado. Assim, esses

51

dois processos epigenéticos, marcação e ICX, se sobrepõem nos tecidos extra-

embrionários.

No zigoto fêmea normal os dois cromossomos X estão ativos, por outro lado, o

zigoto fêmea produzido por transferência nuclear possui um Xa e um Xi do núcleo

somático. Desta maneira, durante a reprogramação nuclear, essas marcas devem

ser apagadas para que o processo de ICX ocorra de forma normal no embrião

clonado.

Os estudos de herança epigenética em clones mamíferos indicam que a

natureza desses rastros pode ser distinta. Mecanismos celulares envolvidos na

reprogramação celular podem distinguir os rastros relativos à marcação genômica

daqueles relativos ao estado de atividade do cromossomo X, mantendo os

primeiros intactos e apagando os últimos.

Este trabalho procurou avaliar o processo de inativação do cromossomo X

em embriões clones bovinos, investigando a expressão relativa de genes ligados ao

cromossomo X, comparando blastocistos machos e fêmeas produzidos por

fecundação in vitro (FIV) e por transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

52

2) Revisão de Literatura

Embora não seja uma tecnologia recente e esteja sendo aplicada para

várias espécies, muitos dos eventos biológicos básicos envolvidos na transferência

nuclear são ainda pouco compreendidos, especialmente quando células

somáticas adultas são usadas para clonagem.

A maioria dos embriões e fetos submetidos à transferência nuclear morre

durante os diferentes estágios de gestação, e pode sofrer sérias anormalidades

como o aumento do peso ao nascer, disfunção placentária e falhas nos sistemas

vascular, respiratório, metabólico e endócrino (CROSS, 2001; HILL, 2002).

Dados da literatura relatam que tais anomalias são conseqüências de

alterações de expressão gênica nestes animais, sugerindo que mecanismos de

regulação transcricional sofram prejuízos durante o processo de reprogramação

nuclear, em virtude do bloqueio da transcrição do genoma somático, e o

restabelecimento da expressão gênica embrionária (McGRAW et al., 2002).

Dentre os mecanismos que regulam a transcrição, o padrão de acetilação

da cromatina apresentou-se alterado em embriões bovinos clonados comparado

aos produzidos por fecundação in vitro. Wee e colaboradores (2005), trabalhando

com embriões de camundongo clonados, observaram que o tratamento com

tricostatina A (TSA) e ácido valpróico (VPA), inibidores das enzimas desacetilases,

aumentou significativamente a eficiência da clonagem (KISHIGAMI et al., 2006;

RYBOUCHKIN et al.; 2006).

Como mencionado anteriormente, anormalidades observadas em animais

clonados sugerem que genes marcados e alterações na reprogramação

epigenética contribuem para a falha no desenvolvimento de embriões clones. Uma

série de estudos sobre embriões submetidos à transferência nuclear mostrou que a

metilação do DNA e expressão de genes marcados estão alterados em embriões e

animais clonados (EGGAN et al., 2000; BOURC’HIS et al., 2001; DEAN et al., 2001;

HUMPHERYS et al., 2001; JONES et al., 2001; KANG et al., 2001, 2002; XUE et al., 2002;

INOUE et al., 2002; CEZAR et al., 2003).

A metilação do DNA em embriões, principal fenômeno epigenético pelo qual

um gene é silenciado, altera o estabelecimento de padrões de marcação que são

vitalmente importantes para uma série de eventos biológicos. As enzimas DNA

metiltransferases (DNMTs) são responsáveis pelo estabelecimento e manutenção da

53

metilação do DNA (YODER e BESTOR, 1996; BESTOR, 2000). As DNMT3a e DNMT3b são

suspeitas de agirem na origem da metilação, uma vez que suas atividades

parecem estar ligadas a um determinado domínio do genoma, sendo que a DNMT1

é responsável pela manutenção da metilação do DNA durante o processo de

duplicação (OKANO et al., 1999; BESTOR, 2000).

Além das variações na metilação do DNA em embriões clones (BOURC’HIS et

al., 2001; DEAN et al., 2001; KANG et al., 2002; MANN et al., 2003), genes críticos para

o desenvolvimento, tais como aqueles envolvidos na resposta ao estresse e funções

trofoblásticas também estão alterados (BOIANI, et al., 2002; CHUNG et al., 2003;

WRENZYCKI et al., 2001).

De maneira geral, as taxas de sucesso com a transferência nuclear são

extremamente baixas, onde apenas 0,9% a 5% dos embriões clonados geram

animais vivos e saudáveis (WILMUT et al., 2002). Estudos analisando as modificações

epigenéticas em animais clonados indicam que a reprogramação incorreta pode

ser parcialmente responsável pela baixa taxa de sucesso (BOIANI et al., 2002;

BORTVIN et al., 2003; EGGAN et al., 2000).

Uma das modificações epigenéticas muito estudada em embriões normais é

a inativação do cromossomo X (ICX), contudo, ainda permanece caracterizada de

maneira incompleta em embriões clones. Sabendo-se que fêmeas possuem dois

cromossomos X e machos possuem apenas um, teoricamente, elas teriam expressão

gênica duas vezes superior aos machos em relação aos genes presentes no

cromossomo X. Entretanto, no início do desenvolvimento, um dos dois cromossomos

X torna-se inerte, resultando na equalização da transcrição de genes ligados ao X

(PLATH et al., 2002).

Em todas as células, um dos dois cromossomos X, o X materno herdado (Xm)

ou o X paterno herdado (Xp), podem ser inativados aleatoriamente. Após o

silenciamento, o X inativo permanece extremamente estável, apresentando

características específicas tais como heterocromatinização, replicação tardia do

DNA, níveis altos de expressão do gene XIST, acumulação de RNA do XIST,

metilação das ilhas CpG e modificações de histonas (TAKAGI, 2003).

Vários estudos relatam que uma única região do cromossomo X,

denominada Centro de Inativação do X (CIX), é essencial para a iniciação,

propagação e manutenção da inativação. O início da inativação envolve o

reconhecimento do número de cromossomos X presentes na célula, assegurando a

54

permanência de um cromossomo X ativo numa célula diplóide masculina e a

inativação de apenas um único cromossomo X numa célula diplóide feminina

(CHUREAU et al., 2002).

Este processo, no qual é conhecido como contagem, seleciona um dos

cromossomos X para permanecer ativo (Figura 10). Para tanto, uma célula diplóide

produz um único fator bloqueador que aleatoriamente associa-se com um

cromossomo X e o protege da inativação, enquanto que o X não bloqueado é

inativado (CHUREAU et al., 2002).

Nos tecidos extra-embrionários, tais como a placenta, em camundongos no

início do desenvolvimento, é sempre o cromossomo X herdado do pai que é

inativado. A expressão gênica de apenas um membro parental de um par de

cromossomos é conhecida como marcação (imprinting), e é causada por uma

memória epigenética carregada no oócito ou no espermatozóide. Mais tarde, nos

tecidos embrionários, a inativação do X é aleatória em relação à origem parental

dos cromossomos X (EGGAN et al., 2000).

Estudando clones de camundongos, Eggan e colaboradores (2000),

analisando o gene XIST e outros dois genes ligados ao X, observaram que a

inativação do cromossomo X (ICX) ocorreu de forma normal nestes animais, ou seja,

os fetos apresentaram ICX aleatória, enquanto na placenta o X inativo (Xi) foi o X

paterno.

Análises citogenéticas e bioquímicas da inativação do cromossomo X em

embriões de camundongos (EPSTEIN et al., 1978; MUKHERJEE, 1976) mostraram que

no estádio de blastocisto (3,5 a 4 dias do desenvolvimento), o cromossomo X

paterno no trofectoderma apresentou replicação tardia e transcrição inativa

(TAKAGI e SASAKI, 1975; WEST et al., 1977), enquanto no ectoderma embrionário, a

inativação do X ocorreu tardiamente (6,5 dias de desenvolvimento) e envolveu ou o

cromossomo X paterno ou o materno (TAKAGI e SASAKI, 1975).

Esses resultados indicaram que, durante a reprogramação nuclear, as marcas

epigenéticas do Xi foram apagadas. É interessante notar que, enquanto as marcas

epigenéticas de origem parental foram mantidas nos clones de camundongos, as

de atividade do cromossomo X foram apagadas, sugerindo que elas têm naturezas

bioquímicas distintas (EGGAN et al., 2000).

Um estudo posterior em clones bovinos analisou a expressão do gene XIST e

de outros 10 genes ligados ao X em clones bovinos vivos e mortos (WILMUT et al.,

55

1997). Em contraste com os resultados em camundongos, foram observados dois

padrões de ICX, de acordo com a viabilidade dos clones analisados. Enquanto em

fibroblastos de pele de clones vivos a ICX se deu de forma aleatória normal, nos

clones mortos observou-se um padrão complexo e inédito de ICX em todos os

órgãos analisados, de maneira que, em cada órgão, pelo menos dois genes ligados

ao X estavam silenciados em ambos os cromossomos X.

Além disso, a análise da ICX na placenta de animais normais demonstrou

que, como em camundongos, em bovinos essa inativação é submetida à

marcação, ou seja, o Xi é paterno. Enquanto que na placenta dos clones vivos, a

ICX era submetida à marcação, nos animais mortos a ICX era aleatória. Assim, os

autores concluíram que a reprogramação nuclear incompleta pode gerar marcas

epigenéticas anormais no cromossomo X em clones bovinos, o que pode estar

relacionado com a não-viabilidade desses animais (WILMUT et al., 1997).

2.1) Transcrito específico do X inativo (XIST)

O principal fator responsável pelas várias etapas da cascata de inativação é

o gene XIST que está localizado no centro de inativação do X (CIX) no qual

transcreve um RNA não-codificante que permanece associado ao cromossomo X

inativo (FARAZMAND, et al., 2001).

Antes da inativação, ocorre expressão do XIST a partir de todos os

cromossomos X e este RNA permanece apenas no local da transcrição,

propagando-se e acumulando-se do CIX ao longo de todo comprimento do

cromossomo correlacionado ao silenciamento.

O cromossomo X inativo torna-se heterocromático e hipoacetilado (JEPPESEN

e TURNER, 1993), apresenta replicação tardia na fase S do ciclo celular (TAKAGI e

OSHIMURA, 1973) e, com exceção de pouquíssimos genes que escapam da

inativação, torna-se transcricionalmente quiescente (GRAVES e GARTLER, 1986).

O processo de inativação do X apresenta múltiplas etapas, envolvendo

desde a contagem de cromossomos X, a seleção de um cromossomo X para

permanecer ativo e iniciação da inativação do cromossomo X (ou cromossomos X

no caso de indivíduos com mais de dois cromossomos X) para ser silenciado (LYON,

1991; Figura 11).

56

Figura 11. Escolha do Xa (cromossomo X ativo) pelo fator de bloqueio. (A) Fator

bloqueador (FB), codificado autossomicamente, é produzido em

quantidades suficientes para escolher um Xa. (B) Durante o processo de

escolha do Xa, ambos os cromossomos X competem pelo fator de bloqueio

limitante na região cis-atuante descriminada como elemento de contagem

(EC). A escolha do Xa é determinada quando o fator de bloqueio interage

com o elemento de contagem em um dos cromossomos X. Neste momento,

moléculas de RNA do XIST são produzidas, porém restritas ao local de

transcrição. (C) Durante o período de inativação, a atividade do RNA-XIST é

reprimida no Xa eleito em conseqüência de sua modificação pelo fator de

bloqueio, e a expressão de XIST é, então, cessada. No suposto Xi (X inativo),

RNA-XIST reveste o cromossomo em cis, levando à inativação de seus genes

(modificado de PLATH et al., 2002).

Autossomo

Autossomo Fator bloqueador

Fator bloqueador

(A) Produção do fator bloqueador:

FB

(C) Xa/Xi

= Xa

FB

X ativo eleito XIST CE genes ligados ao X XIST CE genes ligados ao X

FB

suposto Xi XIST CE genes ligados ao X XIST CE genes ligados ao X = Xi

Suposto X inativo

X ativo eleito

Cromossomo X

Cromossomo X XIST

(B) Escolha do X ativo:

XIST

CE

CE

FB

XIST

XIST

CE

CE

FB RNA do XIST

57

O RNA do XIST carece de maior conhecimento estrutural para sua

interpretação, permanecendo como um RNA nuclear não traduzido. A inativação,

então, propaga-se do seu local de transcrição em direção às regiões mais próximas

até alcançar todo o comprimento do cromossomo X selecionado, tornando-se

inativo (BROCKDORFF et al., 1992; CLEMSON et al, 1996).

Em bovinos, o XIST foi detectado em níveis muito baixos em embriões no

estádio de duas células, aumentando sua quantidade quando analisado em

embriões de oito células no terceiro dia do desenvolvimento (DE LA FUENTE et al.,

1999), no momento da ativação do genoma embrionário (TELFORD et al., 1990).

Contudo, a replicação tardia do cromossomo X inativo foi somente detectada no

estádio de blastocisto inicial no sétimo dia do desenvolvimento in vitro em bovinos

(DE LA FUENTE et al., 1999).

A porcentagem de embriões fêmeas com replicação tardia do cromossomo

X e o número de células por embrião que apresenta esta característica, aumenta

com o avanço do desenvolvimento (DE LA FUENTE et al., 1999), sugerindo que existe

uma variação individual inter-embrião, assim como, intra-embrionária (entre

blastômeros) na progressão do processo de inativação.

No processo de transferência nuclear, a introdução de um núcleo somático

contendo um cromossomo X inativo no citoplasma do oócito receptor cria uma

situação epigenética artificial. Estudos revelaram que, embora o gene XIST esteja

hipermetilado no cromossomo X ativo das células somáticas, ambos os

cromossomos X estão hipometilados nas células do embrião na fase pré-

implantação (McDONALD et al., 1998; NORRIS et al., 1994).

58

2.2) Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD) e Hipoxantina

fosforibosiltransferase (HPRT)

Genes como glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e hipoxantina

fosforibosiltransferase (HPRT) são importantes para o metabolismo, estão localizados

no cromossomo X e ambos estão sujeitos à inativação. G6PD é uma enzima que

atua como fator limitante na via pentose fosfato (PPP) na qual produz NADPH e

ribose-5-fosfato, precursor de todos os nucleotídeos (RIEGER, 1992; Figura 12).

NADPH é critico para manutenção da glutationa (GSH) em sua forma

reduzida na qual é fundamental para desintoxicação de radicais livres e

hidroperóxidos lipídicos. Dada a importância de G6PD no estresse oxidativo,

embriões e fetos que apresentam deficiência de G6PD são mais susceptíveis ao

estresse oxidativo que os demais indivíduos (RIEGER, 1992).

Figura 12. Participação da G6PD no ciclo das pentoses. GSH = Glutationa reduzida

(atividade anti-oxidante); GSSH = Glutationa oxidada; H2O2 = peróxido de

hidrogênio; NADP+ = nicotinamida adenina difosfato; NADPH =

nicotinamida adenina difosfato reduzida (modificado de VOGEL e

MOTULSKY, 1997).

Glicose

ATP ADP Glicoquinase

Glicose-6-Fosfato Frutose-6-Fosfato Fosfoglicoisomerase

Glicose-6-Fosfato Desidrogenase

Ácido Pirúvico + 2 ATP + 2H+

70%

30% (Ciclo Pentose-Fosfato)

6-Fosfogluconato

RIBOSE

várias reações

NADP+

NADPH

GSH

☺

GSSH

2H2O2

2H2O + O2

Glutationa Peroxidase

Glutationa Redutase

59

Em alguns estudos tem sido observado um número desproporcional de

bezerros machos versus fêmeas oriundos de embriões cultivados in vitro (HASLER et

al., 1995; MASSIP et al., 1996). Gutiérrez-Adán et al. (2000) relataram que, em muitos

sistemas de cultivo in vitro, embriões bovinos machos apresentam tanto

desenvolvimento mais rápido ao estádio de blastocisto, quanto maior porcentagem

destes embriões alcança o estádio de blastocisto expandido. Este fato justifica o

número desproporcional de nascimentos de bezerros machos oriundos de embriões

produzidos in vitro (BEHBOODI et al., 1997).

Estas diferenças entre os sexos acontecem antes da diferenciação sexual das

gônadas. Uma hipótese interessante é que estas diferenças no desenvolvimento são

ocasionadas pela expressão de alguns genes localizados no cromossomo X ou no

cromossomo Y ou em ambos. Os genes do cromossomo Y podem desempenhar um

efeito acelerador nos embriões machos, ao invés disto, a expressão potencialmente

desbalanceada dos genes ligados ao cromossomo X exerceria efeito de

retardamento nos embriões fêmeas durante o desenvolvimento pré-implantação

(GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 1996, 2001a).

A expressão de ambos G6PD e HPRT está envolvida no controle da

quantidade de radicais livres. Durante o estádio das primeiras clivagens, ambos os

cromossomos X das fêmeas estão ativos (EPSTEIN et al., 1978; KRATZER e GARTLER,

1978; DE LA FUENTE et al., 1999), e a inativação do X ocorre a partir de células

diferenciadas de linhagem totipotente (MONK e HARPER, 1978).

O papel das enzimas ligadas ao cromossomo X envolvidas no metabolismo

energético, especialmente G6PD, a primeira enzima do ciclo pentose-fosfato, tem

sido considerado como um possível indicador de diferenças entre os sexos (Rieger,

1992). Sugere-se que a sobrevivência do embrião pode estar relacionada à

capacidade deste em manter a homeostase celular em relação ao meio. A G6PD,

contribuindo na desintoxicação de espécies reativas de oxigênio (ROS), se torna

responsável por manter este equilíbrio celular (RIEGER, 1992; IWATA et al., 1998;

NICOL et al., 2000).

A atividade do ciclo pentose-fosfato apresenta-se quatro vezes maior em

embriões fêmeas comparada aos embriões machos (TIFFIN et al., 1991), levando a

uma maior eficiência na desintoxicação de radicais de oxigênio (PEIPPO e

BREDBACKA, 1995). Estes radicais não apenas estão envolvidos no mecanismo de

60

morte celular, mas também tem um efeito estimulante do crescimento (RIEGER,

1992).

O menor nível de radicais de oxigênio em fêmeas, devido à dose dupla de

G6PD, poderia ser responsável pelo efeito de retardamento no desenvolvimento.

Machos, com radicais de oxigênio apropriado, poderiam formar blastocistos mais

rapidamente que as fêmeas. Estes efeitos poderiam explicar porque embriões

produzidos in vitro mostram um significativo desvio da razão 1:1 do sexo; em cultivo,

eles são expostos às condições do ambiente que facilitam a formação de radicais

livres.

Outra possível justificativa para a maior proporção de blastocistos machos

produzidos in vitro (AVERY et al., 1991, 1992; XUE et al., 1992) pode ser explicada pela

grande sensibilidade de embriões fêmeas à presença de glicose no meio de cultivo.

Altas concentrações de glicose causam deficiência nas fêmeas bloqueando seu

desenvolvimento no estádio de mórula, consequentemente um menor número de

embriões fêmeas alcançam o estádio de blastocisto comparado com embriões

machos (GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2001a, 2001b; LARSON et al., 2001; PEIPPO et al.,

2001).

A concentração de glicose no meio de cultivo embrionário associada à

produção de espécies reativas de oxigênio são fatores que poderiam influenciar o

desenvolvimento embrionário in vitro (RIEGER, 1992; BREDBACKA e BREDBACKA,

1996; GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2001a; PEIPPO et al., 2001), além de contribuir na maior

velocidade no desenvolvimento de embriões machos (AVERY et al., 1991; XUE et al.,

1992; YADAV et al., 1993; PERGAMENT et al., 1994; RAY et al., 1995; BREDBACKA e

BREDBACKA, 1996; CARVALHO et al., 1996; GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 1996, 2001a;

PEGORARO et al., 1998; PEIPPO et al., 2001).

A enzima hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT) participa do metabolismo

das purinas nas células através de seu envolvimento na via de recuperação das

purinas (Figura 13). A enzima produzida por este gene converte bases purinas livres

nas células aos seus 5’-mononucleotídeos correspondentes (VOGEL e MOTULSKY,

1997). A HPRT metaboliza hipoxantina, inibidora do desenvolvimento embrionário, na

qual é produzida pela degradação de nucleotídeos purínicos, a inosinato (IMP), um

precursor de outros nucleotídeos purínicos, tais como adenilato (AMP) e guanilato

(GMP).

61

Em conseqüência do déficit de hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT) há

um aumento importante da produção de ácido úrico que resulta em várias

complicações fetais por causa de seu aumento na circulação sangüínea.

Figura 13. Participação da HPRT da via de recuperação das purinas. A enzima

produzida por este gene converte bases purinas livres nas células aos seus

5’-mononucleotídeos correspondentes (modificado de VOGEL e

MOTULSKY, 1997).

Visto que a inativação do X inicia-se e propaga-se a partir do CIX (LYON,

1991), os níveis de expressão de genes localizados no cromossomo X sob diferentes

distancias do CIX poderiam informar o estado de inativação do X através da

avaliação da dosagem dos genes entre os embriões.

Sabe-se que o gene HPRT localiza-se mais próximo à região CIX do que o

gene G6PD no cromossomo X em humanos (BROWN et al., 1991; Figura 14). O gene

XIST está localizado na região do CIX sobre o braço longo do cromossomo X em

humanos, bovinos e camundongos (BROCKDORFF et al., 1991; BROWN et al., 1991) e

a localização dos genes HPRT e G6PD é na porção distal do braço longo do

cromossomo X, porém estando o G6PD mais distante que o HPRT (XIAO et al., 1998).

Sugere-se que a propagação da metilação, um mecanismo envolvido na

AMP + ATP 2 ADP adenilato quinase

ADP

ATP

adenosina quinase

ADENOSINA

Pi NH3

NH3 Pi

IMP

AMP desaminase 5-N

adenosina desaminase

INOSINA

5’-nucleotidase

HIPOXANTINA

nucleosídeo fosforilase

PPi

PRPP

HGPRT

xantina oxidase

XANTINA

xantina oxidase

ÁCIDO ÚRICO

Radicais de Oxigênio

62

inativação do X, está extremamente ligada a distância entre o centro de

inativação (CIX) e o gene (GRANT et al., 1993).

Figura 14. Representação esquemática do cromossomo X em humanos e a

localização dos genes estudados XIST, G6PD e HPRT. (adaptado de

Genetics Home Reference).

2.3) Interferon-Tau

Interferon-τ (IFN-τ) é a proteína de secreção mais abundante produzida

pelas células do trofectoderma de embriões bovinos e desempenha papel vital no

estabelecimento da prenhez por seu efeito anti-luteolítico, responsável pela

degeneração do corpo lúteo (CL; ROBERTS et al., 1992).

A expressão de IFN-τ é restrita ao período de desenvolvimento pré-

implantação do concepto, iniciando no estádio de blastocisto expandido e

declinando acentuadamente após a fixação definitiva do trofoblasto alongado à

parede uterina. Sabe-se que age pontualmente no endométrio materno, e, de

maneira ainda não totalmente compreendida, anula a liberação da luteolisina

uterina, prostaglandina F2α e simultaneamente aumenta a produção do fator

luteotrófico e prostaglandina E (BINELLI et al., 2000; AROSH et al., 2002).

Em sistemas de cultivo in vitro, o estádio do desenvolvimento, a qualidade

dos embriões (HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1992), as condições de cultivo utilizadas,

e a velocidade de formação de blastocistos (KUBISCH et al., 1998) influenciam

significativamente na expressão e na secreção de IFN-τ.

CIX/XIST HPRT G6PD

63

A quantificação da produção de IFN-τ por blastocistos individuais é de

grande valor para avaliar a qualidade do embrião quando produzidos in vitro

(HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1992, 1993; KUBISCH et al., 1998; LARSON e KUBISCH,

1999; STOJKOVIC et al., 1999; KUBISCH et al., 2001a).

As taxas de prenhez apresentadas após a transferência de embriões

produzidos in vitro são ligeiramente menores que após a transferência de embriões

produzidos in vivo (REICHENBACH et al., 1992). Além disso, apesar das taxas de

desenvolvimento a blastocistos não apresentarem diferenças acentuadas, a

proporção de embriões clones que originam uma prenhez e bezerros nascidos vivos

é geralmente muito baixa (WESTHUSIN et al., 1991; STICE et al., 1994).

Estudos indicam uma correlação entre a qualidade morfológica e a

secreção de IFN-τ por blastocistos. Hernandez-Ledezma et al. (1993) concluíram que

blastocistos eclodidos de alta qualidade secretaram mais IFN-τ que blastocistos

eclodidos de baixa qualidade. Além disso, Stojkovic et al. (1999) também

encontraram maior secreção de IFN-τ por blastocistos eclodidos no 8º dia de cultivo

comparados à secreção por blastocistos não eclodidos no 8º dia de cultivo.

A partir da secreção de IFN-τ pelo trofectoderma diferenciado, esta proteína

passa a ser um indicador do potencial de viabilidade e qualidade do concepto, e

particularmente do trofoblasto, num período crítico do desenvolvimento.

A quantidade de IFN-τ secretada por blastocistos produzidos in vitro de

mesma idade de desenvolvimento e mesmo número de células varia

consideravelmente (KUBISCH et al., 2003; STOJKOVIC et al., 1999). Foi relatada uma

associação positiva entre a qualidade do embrião e a produção de IFN-τ

(HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1993), porém outros relatos sugerem que blastocistos

devem produzir mais IFN-τ quando estão sujeitos ao estresse do ambiente, e que os

melhores embriões devem ser aqueles que alcançam o estádio de blastocisto mais

rapidamente e produzem menores quantidades de IFN-τ (KUBISCH et al., 2001b;

LARSON et al., 2001).

Estes trabalhos, contudo, têm sofrido questionamentos devido a três

observações importantes. A primeira delas é que quanto mais tarde um embrião

alcança o estádio de blastocisto, mais IFN-τ é produzido durante as subseqüentes 24

e 48 horas de cultivo in vitro (KUBISCH et al., 1998, 2001a).

A segunda é que blastocistos fêmeas produzem cerca de duas vezes mais

IFN-τ que machos com equivalente período de desenvolvimento, estádio de

64

desenvolvimento e qualidade (LARSON e KUBISCH, 1999; KUBISCH et al., 2003). A

terceira é o suplemento macromolecular disponível no meio de cultivo, por

exemplo, soro fetal bovino versus albumina sérica bovina versus polivinil álcool,

podem influenciar na produção de IFN-τ (KUBISCH et al., 2001b).

Embriões fêmeas produzidos in vitro (PIV) diferem dos machos em relação a

expressão de IFN-τ. Eles são, por exemplo, muito mais susceptíveis aos prejudiciais

efeitos da glicose adicionada aos meios de cultivo para uso in vitro se este açúcar

está oferecido em concentrações que aproximam daquelas encontradas no soro e

na maioria dos meios de cultivo comerciais (GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2001a; LARSON

et al., 2001; PEIPPO et al., 2001).

Sob tais condições, uma alta proporção de fêmeas alcança o estádio de

mórula, mais falham para avançar para o estádio de blastocisto. Uma possível

explicação para este fenômeno é que fêmeas, pelo menos até o estádio de

blastocisto expandido, possuem dois cromossomos X ativos e poderiam, dessa

maneira, ser mais susceptível ao não balanceamento metabólico como um

resultado da dosagem de genes (GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2000; WRENZYCKI et al.,

2002).

A produção aumentada de IFN-τ por blastocistos fêmeas deve, portanto, ser

um efeito indireto da dosagem do cromossomo X, mesmo o gene IFN-τ sendo de

origem autossômica (RYAN e WOMACK, 1993). Por exemplo, estes genes poderiam

ser sensíveis ao estado redox das células e alterados na sua expressão como um

resultado do alto fluxo do ciclo pentose-fosfato, já que o gene G6PD, o “guardião”

do ciclo das pentoses, parece estar expresso mais fortemente em mórulas e

blastocistos fêmeas que em machos (DE LA FUENTE et al., 1999; GUTIÉRREZ-ADÁN et

al., 2000; IWATA et al., 2002; WRENZYCKI et al., 2002).

Alternativamente, eles podem ser sensíveis a um fator de transcrição

codificado no cromossomo X. Claramente, não se pode esperar uma expressão de

genes equivalente entre blastocistos machos e fêmeas, mesmo porque fêmeas tem

dois cromossomos X ativos e os machos tem apenas um cromossomo X além do seu

único cromossomo Y.

Um exemplo de dimorfismo sexual entre embriões bovinos tem sido a

observação que blastocistos expandidos fêmeas produzem significativamente mais

o hormônio reconhecedor da prenhez, interferon-tau, que machos (LARSON et al.,

2001; KUBISCH et al., 2003). Esta observação levanta a questão de como esta

65

diferença entre os sexos deve também ser uma conseqüência das condições de

cultivo.

Quando o braço oxidativo da via pentose-fosfato está ativo, a transcrição de

IFN-τ, por sua vez, também deve estar aumentada. Ainda é desconhecido o valor

adaptativo para este aumento de IFN-τ por blastocistos fêmeas, porém é evidente

que esta diferença não pode ser atribuída a um artefato do desenvolvimento in

vitro, ao contrário, representa real diferença entre os dois sexos (KIMURA et al., 2004).

Contudo, condições de cultivo com baixa concentração de glicose não

levam à equalização na produção de IFN-τ entre os sexos (LARSON et al., 2001).

Fêmeas continuam a produzir cerca de duas vezes a quantidade de IFN-τ que

machos adicionando ou não glicose no meio de cultivo.

A produção de IFN-τ por blastocistos parece ser influenciada por vários

fatores, incluindo o grupo de oócitos selecionados (LARSON et al., 2001), número de

embriões cultivados juntos (LARSON e KUBISCH, 1999), a idade do embrião quando

forma blastocisto (KUBISCH et al., 1998) e o genótipo do doador de espermatozóides

(KUBISCH et al., 2001a), mas a causa do dimorfismo sexual permanece

desconhecida.

O que nos chama a atenção, é que nenhuma diferença tem sido detectada

na produção total de IFN-τ entre blastocistos expandidos produzidos in vivo e in vitro

e entre blastocistos expandidos cultivados em diferentes meios de cultivo (KUBISCH

et al., 2001a).

O maior fator que contribui para o dimorfismo sexual entre embriões no início

do desenvolvimento é a dosagem de cromossomos X (ERICKSON, et al., 1997;

KOCHHAR et al., 2001; WRENZYCKI et al., 2002). Como fêmeas carregam dois

cromossomos X, potencialmente produzem duas vezes a quantidade de genes

ligados ao X que machos.

Em camundongo o processo tem início com a formação do blastocisto e

está, a princípio, confinado ao trofectoderma, onde o cromossomo X paterno é

seletivamente inativado (HARPER et al., 1982; GOTO e MONK, 1998). A inativação do

cromossomo X é também iniciada no estádio de blastocisto em embriões bovinos

(DE LA FUENTE et al., 1999), e, pela analogia com o camundongo, pode ser limitada

ao trofectoderma.

Uma possível explicação é que a maior dosagem de genes localizados no

cromossomo X no trofectoderma de blastocistos expandidos fêmeas levam à maior

66

expressão de IFN-τ, porém tendo em vista que o gene IFN-τ não está localizado no

cromossomo X (RYAN e WOMACK, 1993), qualquer efeito deste torna-se indireto.

Embriões bovinos, como também de outras espécies, são sensíveis ao estresse

oxidativo. A partir do momento em que a expressão de G6PD é maior em mórulas e

blastocistos fêmeas do que em machos (IWATA et al., 2002; GUTIÉRREZ-ADÁN et al.,

2000), é concebível que a menor produção de IFN-τ por machos pode refletir numa

maior sensibilidade de machos ao estresse oxidativo.

Portanto, a maior produção de IFN-τ por fêmeas pode ser favorecida pela

maior concentração de G6PD, associada ao aumento do fluxo da via pentose-

fosfato. Dessa maneira, caracteriza a sensibilidade das atividades dos fatores de

transcrição ao estado redox do meio celular (MOREL e BAROUTI, 1999; WENGER,

2000; HADDAD, 2002).

67

3) Objetivos 3.1) Objetivo Geral

O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de genes ligados ao processo

de inativação do cromossomo X em embriões produzidos por transferência nuclear

de células somáticas adultas masculinas e femininas.

3.2) Objetivos Específicos

3.2.1) Investigar a expressão relativa dos genes XIST, G6PD, HPRT e IFN-τ em

blastocistos eclodidos bovinos machos e fêmeas produzidos por

fecundação in vitro (FIV) e por transferência nuclear de células somáticas

(TNCS) com nove dias de cultivo.

68

4) Hipótese

Evidenciado que características como menor taxa de desenvolvimento a

blastocisto, maior taxa de aborto e maior taxa de mortalidade após o nascimento

estavam ligados ao sexo, por se apresentarem em indivíduos clones fêmeas,

sugeriu-se que estes fenômenos poderiam estar relacionados com a expressão

errônea de genes ligados ao cromossomo X, evidenciando falha na

reprogramação nuclear durante a inativação do X. Portanto, a hipótese deste

trabalho foi que a expressão de genes relacionados ao cromossomo X estaria

alterada em embriões fêmeas produzidos por transferência nuclear.

69

5) Material e Métodos

5.1) Produção dos embriões por Fecundação in vitro


A produção in vitro de embriões, técnica realizada rotineiramente no

laboratório, procedeu-se a partir de oócitos viáveis maturados in vitro (MIV),

fecundados com espermatozóides capacitados in vitro (FIV) e mantidos de zigoto

até o estádio de blastocisto em sistema de co-cultivo in vitro. Para tanto, ovários de

vacas zebus ou mestiças foram obtidos em abatedouro, transportados em solução

salina (0,9%) a 37ºC, e encaminhados até o laboratório. Os complexos cumulus-

oócito foram aspirados de folículos entre 2 a 8 mm utilizando uma seringa de 10 mL

acoplada a uma agulha de 18 G, e somente os oócitos de qualidade I, com

cumulus compacto completo e citoplasma límpido e de aspecto homogêneo (finas

granulações), foram selecionados para os experimentos. Os oócitos foram, em

seguida, maturados em TCM199 com sais de Earles, glutamina e NaHCO3

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), piruvato (22 µg/mL), gentamicina

(50 µg/mL), 0,5 µg de FSH/mL, 50 µg de LH/mL e 1 µg de estradiol/mL em microgotas

de 100 µL de meio de maturação, cobertas com óleo mineral (30 oócitos/gota). A

incubação foi realizada a uma temperatura de 38,5°C e atmosfera gasosa de 5%

CO2 em ar, durante 22 a 24 horas.

5.1.2) Fecundação in vitro

Após o período de maturação, os oócitos foram submetidos à

fecundação in vitro, em microgotas de 100 µL de meio TALP suplementado com

heparina (10 µg/mL), piruvato (22 µg/mL), gentamicina (50 µg/mL), BSA sem ácidos

graxos (6 mg/mL) e solução de PHE (2 µM de penicilamina, 1 µM de hipotaurina e

0,25 µM de epinefrina). As palhetas de sêmen congelado de touros da raça Nelore

foram descongelados em banho-maria a 35ºC, durante 30 segundos e seu

conteúdo centrifugado em gradiente de Percoll (45 e 90%) para obtenção dos

espermatozóides móveis, além da remoção do diluidor e do plasma seminal. A

70

concentração espermática utilizada foi de 2 x 106 células/mL e, após 30 minutos de

incubação dos espermatozóides, os oócitos foram transferidos para as microgotas

(30 oócitos/gota) onde permaneceram sob incubação em atmosfera com 5% de

CO2 em ar, temperatura de 38,5ºC durante 18 horas.

5.1.3) Cultivo in vitro

Após o processo de MIV e FIV, os zigotos tiveram as células do cumulus

removidas e foram então cultivados em meio CR2 modificado suplementado com

10% de SFB, em co-cultivo com células da granulosa (WATANABE et al., 1999), em

temperatura de 38,5ºC e atmosfera de 5% CO2 em ar, durante nove dias, quando

foram retirados do sistema de cultivo e armazenados individualmente para posterior

análise de expressão gênica (Figura 15).

Figura 15. Ilustração das diferentes etapas do processo de produção de embriões

por fecundação in vitro. (a) Aspiração dos folículos ovarianos. (b) Fluído

folicular contendo oócitos. (c) Oócito selecionado no estádio imaturo. (d)

I

A C B

D E F

G H

71

Oócito no estádio de metáfase II antes da fecundação. (e) Confirmação

fluorescente da presença dos cromossomos em metáfase II e da extrusão

do 1º corpúsculo polar. (f) Preparação do gradiente de percoll. (g)

Seleção dos espermatozóides viáveis por centrifugação do gradiente de

Percoll. (h) Blastocistos produzidos por fecundação in vitro. (i)

Armazenamento individual de blastocistos eclodidos no 9º dia de cultivo

in vitro para posterior análise de expressão gênica.

5.2) Produção dos embriões por Transferência Nuclear


A produção in vitro de embriões submetidos ao processo de transferência

nuclear a partir de células somáticas, iniciou-se com o procedimento de maturação

de oócitos viáveis. Para tanto, ovários de vacas zebus ou mestiças foram obtidos em

abatedouro, transportados em solução salina (0,9%) a 37ºC, e encaminhados até o

laboratório. Os complexos cumulus-oócito foram aspirados de folículos entre 2 a 8

mm utilizando uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha de 18 G, e somente

os oócitos de qualidade I, com cumulus compacto completo e citoplasma límpido

e de aspecto homogêneo (finas granulações), foram selecionados para os

experimentos. Os oócitos foram, em seguida, maturados em TCM199 com sais de

Earles, glutamina e NaHCO3 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB),

piruvato (22 µg/mL), gentamicina (50 µg/mL), 0,5 µg de FSH/mL, 50 µg de LH/mL e 1

µg de estradiol/mL em microgotas de 100 µL de meio de maturação, cobertas com

óleo mineral (30 oócitos/gota). A incubação foi realizada a uma temperatura de

38,5°C e atmosfera gasosa de 5% CO2 em ar, durante 18 horas.

5.2.2) Transferência Nuclear

Após o período de maturação, os oócitos foram desnudados mediante

solução de hialuronidase (2 mg/mL) e então selecionados em relação a presença

do 1º Corpúsculo Polar. Em seguida, foram transferidos para uma solução de

72

citocalasina B (10 µg/mL) e Hoechst 33342 (10 µg/mL) em meio CR2 suplementado

com 10% de SFB durante 20 minutos.

Os oócitos foram então enucleados, removendo uma pequena porção

do citoplasma próxima à região do 1º corpúsculo polar (eliminação do material

genético do oócito). Esta porção aspirada foi visualizada sob luz ultra-violeta para

confirmação da enucleação. Os oócitos foram posteriormente reconstruídos com

células somáticas de um animal adulto no estádio G0 do ciclo celular, inserindo a

célula no espaço perivitelíno.

5.2.3) Eletrofusão e Ativação Química

Os conjuntos oócitos-células somáticas foram transferidos para uma

solução contendo 0,3 M de manitol e expostos a dois pulsos elétricos de 2,25 kV/cm

durante 65 µseg. Aproximadamente uma hora após a eletrofusão, os oócitos

fundidos foram quimicamente ativados em 5 µM de ionomicina durante 4 minutos e,

em seguida, em 2 mM de 6DMAP durante 3 horas.

Ao término do período de ativação, os oócitos foram então cultivados

em meio CR2 suplementado com 10% de SFB em co-cultivo com células da

granulosa, em temperatura de 38,5ºC e atmosfera de 5% CO2 em ar, durante nove

dias, quando foram retirados do sistema de cultivo e armazenados individualmente

para posterior análise de expressão gênica.

5.2.4) Células Doadoras

As células somáticas doadoras de núcleo foram obtidas a partir de

biópsias realizadas em animais adultos machos e fêmeas. O tecido foi retirado da

prega da cauda do animal, e transportado imediatamente para o laboratório em

solução tampão fosfato (PBS) sob gelo. O tecido foi então triturado em pequenos

pedaços de aproximadamente 1 mm, lavados em PBS e fixados numa placa de

Petri de 35 mm de diâmetro. O cultivo procedeu-se em meio DMEM suplementado

com 20% de SFB, piruvato (22 µg/mL), glutamina (1 mM) e gentamicina (50 µg/mL).

A incubação foi realizada a uma temperatura de 38,5°C e atmosfera gasosa de 5%

CO2 em ar, trocando-se o meio de três em três dias.

Ao crescimento das primeiras células, o meio foi substituído por DMEM

suplementado com 10% de SFB e o cultivo processado até a 3ª passagem,

73

momento em que as células estavam prontas para o procedimento de

transferência nuclear. Aproximadamente 5 dias antes da realização do

experimento, o meio de cultivo foi substituído por DMEM suplementado com 0,5% de

SFB (restrição de soro), procedimento este que visava “pausar” as células somáticas

no estádio G0 do ciclo celular (Figura 16).



corpúsculo polar e citoplasma adjacente. (c) Oócito enucleado. (d)

Controle fluorescente da presença dos cromossomos em metáfase

dentro da pipeta de micromanipulação após coloração do DNA. (e)

Cultivo de fibroblastos bovinos a partir de biópsia da prega da cauda. (f)

Células doadoras isoladas da cultura de fibroblastos. (g) Inserção da

célula doadora no espaço perivitelino do oócito enucleado. (h) Fusão da

célula doadora com o citoplasma receptor. (i) Primeira clivagem do

embrião reconstituído. (j) Blastocisto produzido por transferência nuclear

desenvolvido in vitro. (k) Armazenamento individual de blastocistos

eclodidos no 9º dia de cultivo in vitro para posterior análise de expressão

gênica (modificado de HEYMAN, 2005).

K

74

5.3) Armazenamento e sexagem dos embriões

5.3.1) Armazenamento dos embriões

Após finalização dos procedimentos de produção dos embriões tanto

por fecundação in vitro quanto por transferência nuclear, exatamente no 9º dia de

cultivo, os embriões no estádio de blastocisto eclodido (Be) foram armazenados

individualmente em solução de PBS simples acrescido de 0,1% de polivinilpirolidona

(PVP) e 1 unidade/µL de inibidor de RNase. Imediatamente foram mergulhados em

nitrogênio líquido e armazenados no freezer -80ºC para posterior análise da

expressão gênica.

5.3.2) Sexagem dos embriões produzidos por fecundação in vitro

Para realização das comparações entre os sexos, os embriões produzidos

por fecundação in vitro, foram sexados aplicando a reação em cadeia da

polimerase (PCR). Os fragmentos de DNA foram amplificados a partir de 1/3 de um

blastocisto. A PCR foi realizada em um volume final de 25 µL contendo tampão para

PCR 1X [20 mM Tris-HCl (pH 8,0); 50 mM KCl], 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada

dNTP, 0,5 µM do oligonucleotídeo iniciador Y-específico, 0,08 µM do

oligonucleotídeo iniciador X-específico (Tabela 5; WRENZYCKI et al., 2002) e 1

unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen). A PCR iniciou-se a 97ºC por 2 minutos,

seguida por 32 ciclos de 30 segundos a 95ºC para desnaturação do DNA, 30

segundos a 60ºC para anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores e 45 segundos

a 72ºC para extensão do oligonucleotídeo iniciador. A extensão final foi realizada a

72ºC durante 5 minutos e resfriada a 4ºC. O produto da amplificação foi submetido

à eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TBE 1X (89 mM de tris, 89 mM

ácido bórico e 2 mM de EDTA, pH 8,0), contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo.

A imagem foi visualizada no Scanner FLA 3000G (FUJIFILM) sobre um comprimento

de onda de 520 nm de excitação e 580 nm de emissão.

75

Tabela 5. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores para o estudo do sexo de embriões bovinos.

Gene Seqüência do primer Fragmento (pb) Y específico Direto Reverso

CCTCCCCTTGTTCAAACGCCCGGAATCATT TGCTTGACTGCAGGGACCGAGAGGTTTGGG

210 pb

X específico Direto Reverso

AGGTCGCGAGATTGGTCGCTAGGTCATGCA AAGACCTCGAGAGACCCTCTTCAACACGT

300 pb

5.4) Análise da expressão gênica

5.4.1) Amplificação do RNA

Para a amplificação do RNA, partindo de um único embrião selecionado

no estádio de blastocisto eclodido, foi empregado o kit Superscript™ RNA

Amplification System (Invitrogen; Figura 17). Resumidamente, o protocolo iniciou-se

com a síntese da 1ª fita de cDNA, adicionando ao tubo contendo o RNA, oligo(dT)-

T7 e água livre de RNase. A reação procedeu-se a 70ºC durante 10 minutos, para

então ser adicionado os demais componentes: tampão de síntese da 1ª fita, DTT,

dNTP, inibidor de RNase, enzima transcriptase reversa Superscript III. A reação foi

então incubada a 46ºC por 2 horas, seguida por 10 minutos a 70ºC, para inativação

da enzima.

Após a síntese da primeira fita, procedeu-se imediatamente a síntese da

segunda fita, adicionando-se ao tubo de reação o tampão de síntese da 2ª fita,

dNTP, as enzimas DNA polimerase I, DNA ligase e RNase II. A incubação foi realizada

a 16ºC por 2 horas.

A purificação da dupla fita de cDNA foi realizada logo após o término da

síntese, adicionando ao tubo de reação o tampão de carregamento e, após

homogeneização, transferindo-o para a coluna de purificação e centrifugado a

12.000 x g. Adicionou-se tampão de lavagem à coluna e centrifugou-se novamente

a 12.000 x g. O último passo envolveu a adição de água livre de RNase e

centrifugação a 12.000 x g para recuperação do cDNA. Para concentração do

cDNA, este foi precipitado com etanol absoluto, acetato de sódio 3 M e glicogênio.

A transcrição in vitro, realizada na seqüência, foi responsável por gerar o

RNA amplificado a partir da dupla fita de cDNA. Para tanto, foi utilizada a enzima T7

76

RNA polimerase, tampão de reação T7 e dNTP (ATP, CTP, GTP e UTP), incubando a

reação a 37ºC por 16 horas. Ao término da reação, o RNA amplificado foi exposto à

enzima DNase I durante 30 minutos a 37ºC.

Finalmente, procedeu-se a purificação do RNA amplificado, adicionando

ao tubo de reação tampão de ligação e etanol absoluto e, após

homogeneização, foi transferido para a coluna de purificação e centrifugado a

12.000 x g. Adicionou-se tampão de lavagem à coluna e centrifugou-se novamente

a 12.000 x g. O último passo envolveu a adição de água livre de RNase e

centrifugação a 12.000 x g para recuperação do RNA.

Figura 17. Esquema do protocolo utilizado para amplificação do RNA obtido a

partir de um único embrião no estádio de blastocisto eclodido no nono

dia de cultivo.

5’

UUUUU 5’

UUUUU 5’

UUUUU 5’

AAAAA 3’ RNA total T T T T T-T7 Oligo(dT)-T7

Síntese da primeira fita de cDNA

AAAAA T T T T T-T7 cDNA

Síntese da segunda fita de cDNA

AAAAA-T7 T T T T T-T7

Purificação do cDNA Transcrição in vitro (amplificação)

cDNA dupla-fita

RNA antisenso (RNAa)

Purificação do RNAa

RNA amplificado está pronto para a transcrição reversa

77

5.4.2) Transcrição Reversa

Para a transcrição reversa do RNA amplificado foi empregado o kit

Improm II (Promega). Resumidamente, o protocolo iniciou-se com a incubação do

RNA com 0,5 µg do oligonucleotídeo randômico poly A (5’AAA AAA AAA AAA 3’)

por 5 minutos a 70ºC. Em seguida, foi adicionado ao tubo de reação tampão 1X, 3

mM de MgCl2, 0,5 mM de dNTP, 40 unidades de inibidor de RNases e 1,0 µL da

enzima transcriptase reversa Improm, totalizando um volume final de 20 µL. A

reação procedeu-se a 42ºC por 60 minutos, seguindo por 15 minutos a 70ºC e

resfriamento a 4ºC.

5.4.3) Amplificação do cDNA dos genes de interesse

Amostras de cDNA dos embriões no estádio de blastocisto eclodido

produzidos por fecundação in vitro e por transferência nuclear foram analisadas

através de PCR em tempo real, utilizando o Sistema de PCR 7500 da Applied

Biosystems. Os produtos da PCR dos genes GADPH, XIST, G6PD, IFN-τ e HPRT foram

detectados através do sistema TaqMan® (Applied Biosystems). Para tanto, as

reações foram realizadas em quadruplicata, num volume final de 20 µL, contendo

1X do mix para PCR TaqMan®, 0,9 µM de cada oligonucleotídeo iniciador, 0,25 µM

da sonda (Tabela 6) e 1% do embrião. A PCR iniciou-se com a ativação da Uracil-N-

glicosilase (UNG) a 50ºC por 2 minutos, seguida por 10 minutos a 95ºC para ativação

da enzima DNA polimerase, 57 ciclos de amplificação de 15 segundos a 95ºC para

desnaturação do DNA e 1 minuto a 60ºC para anelamento e extensão dos

oligonucleotídeos iniciadores (Figura 18). A seqüência dos oligonucleotídeos

iniciadores, bem como, o tamanho do fragmento gerado pela PCR estão descritos

na Tabela 6. A confirmação dos fragmentos obtidos para cada oligonucleotídeo

iniciador foi realizada por eletroforese em gel de agarose 2%.

78

Figura 18. Protocolo utilizado no sistema de PCR em tempo real para amplificação

do cDNA obtido a partir do RNA amplificado de um único embrião no

estádio de blastocisto eclodido no nono dia de cultivo.

Ativação da UNG

Ativação da AmpliTaq Gold Desnaturação

Anelamento e Extensão

79

Tabela 6. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores e tamanho dos fragmentos dos genes escolhidos para estudo da expressão em embriões bovinos (GAPDH, XIST, IFN-τ, G6PD e HPRT).

Gene Seqüência do oligonucleotídeo iniciador e sonda

Fragmento (pb)

Identificador GenBank

GAPDH Direto Reverso Sonda

AAGGCCATCACCATCTTCCA CCACTACATACTCAGCACCAGCAT AGCGAGATCCTGCCAACATCAAGTGG

76 pb NM_001034034

XIST Direto Reverso Sonda

TTGGCTTTTAGATTAATTTGATGAACAGCAT CCCTTTAGACTAGGCCCATTTCATA ATTCTAGGTCCTGAGCATAAG

99 pb NR_001464

INTERFERON-TAU Direto Reverso Sonda

CCTTCGTGCTCTCTCTACTGATG CAGGTAACAACCCAGAGATCGT CCGTAGCTGACCAGCACC

74 pb AF238612

G6PD Direto Reverso Sonda

GCCGTCCTCTATGTGGAAAATGA CGCAGCGCAGGATGAAG CACCCCGTCCCAGCGC

58 pb XM_583628

HPRT Direto Reverso Sonda

GTTGTGGGATATGCCCTTGACTAT GCTTTGTATTTTGCTTTTCCAGTTTCG CACACACGTGATTCAAG

92 pb NM_001034035

5.5) Análise Estatística

Foi utilizado o método de quantificação relativa utilizando o gene GAPDH como

referência. A expressão relativa está baseada na taxa de expressão de um gene

alvo versus um gene de referencia e é adequada para investigar alterações no

nível de expressão de genes.

A eficiência das amplificações dos fragmentos de interesse a partir de um

oligonucleotídeo iniciador específico durante a reação em cadeia da polimerase

foi estimada utilizando a regressão linear do logaritmo da fluorescência em cada

ciclo através do programa LinRegPCR (RAMARKES, et al., 2003).

Cada curva de regressão foi ajustada para conter no mínimo 4 e no máximo 6

pontos, mantendo sempre um coeficiente de regressão máximo. Para cada par de

oligonucleotídeo iniciador, a linha do limiar de fluorescência foi fixada no ponto

médio da janela de linearidade, correspondendo a fase de amplificação

exponencial das amostras. A janela de linearidade foi determinada pelos valores

mínimos (limite inferior) e máximos (limite superior) de fluorescência utilizada para

estimar a eficiência da PCR (Figuras 19 e 20).

80

As diferenças relativas entre os grupos (TN F, TN M, FIV F e FIV M) para cada

gene estudado, XIST, G6PD, HPRT e IFN-τ, foram estimadas tendo o GAPDH como

gene de referência (PFAFFL et al., 2001). O grau de significância entre os níveis de

expressão foi calculado utilizando o programa REST e os resultados foram

comparados pela diferença entre as amostras testadas e a amostra controle

(PFAFFL et al., 2002).

Foi considerada hipótese nula (H0), como ausência de diferença entre os

grupos e, hipótese alternativa (H1), diferença significativa entre os grupos quando

p < 0,05.

Figura 19. Curva de regressão linear utilizando o programa LinRegPCR. Os limites

superior e inferior da janela de linearidade foram utilizados para os

cálculos da eficiência da reação de PCR e índice de correlação da

curva. Cada curva de regressão foi ajustada para conter no mínimo 4 e

no máximo 6 pontos, mantendo sempre um coeficiente de regressão

máximo.

Limite superior

Limite inferior

81

Figura 20. Curva de amplificação obtida a partir de uma reação em cadeia da

polimerase apresentada em tempo real. O limiar de fluorescência

corresponde ao ponto médio da janela de linearidade (região de

amplificação exponencial), onde a eficiência da PCR é próxima de

dois. O ciclo em que cada curva de amplificação atravessa o limiar de

fluorescência (Ct) serve como base para comparação entre as

amostras.

Limiar de fluorescência

82

6) Resultados

6.1) Sexagem dos embriões produzidos por fecundação in

vitro

Para obtenção dos embriões produzidos a partir de fecundação in vitro foi

realizado um único procedimento laboratorial que resultou em quantidade de

blastocistos suficiente para a realização das comparações entre os sexos. Estes

embriões foram armazenados individualmente e, previamente à manipulação do

RNA, foram sexados aplicando a reação em cadeia da polimerase (PCR; Figura 21).

Na Tabela 7 estão apresentados os valores numéricos da produção in vitro de

embriões utilizando protocolo padrão do laboratório, descrito anteriormente. Neste

experimento, não obtivemos diferenças no número de embriões machos e fêmeas

que alcançaram o estádio de blastocisto eclodido (9º dia de cultivo).

Figura 21. Eletroforese dos fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de

oligonucleotídeos iniciadores específicos para identificação de machos e

fêmeas da espécie bovina. (♀) Fragmento de DNA de fêmea amplificado

apenas pelo oligonucleotídeo específico para cromossomo X; (♂)

fragmentos de DNA de machos amplificados tanto pelo oligonucleotídeo

específico para X quanto específico para cromossomo Y; (C) controle.

♂ ♀

♂ ♂ ♂ ♀

C C

83


fecundação in vitro utilizando protocolo padrão do laboratório (M =

embriões machos e F = embriões fêmeas).

Desenvolvimento embrionário Experimento Número

de oócitos 2 células 8 células Blastocisto Blastocisto eclodido Sexagem

M = 16 (53%) Experimento 1 132 101 (77%) 60 (59%) 39 (39%) 30 (77%) F = 14 (47%)

6.2) Amplificação do cDNA dos genes de interesse

Após amplificação das amostras de cDNA dos embriões no estádio de

blastocisto eclodido produzidos por fecundação in vitro e por transferência nuclear,

através de PCR em tempo real, foi realizada a confirmação dos fragmentos obtidos

para cada oligonucleotídeo iniciador dos genes XIST, IFN-τ, G6PD e HPRT mediante

eletroforese em gel de agarose (Figura 22).

Figura 22. Eletroforese dos fragmentos de cDNA amplificados por PCR em tempo

real a partir de oligonucleotídeos iniciadores específicos dos genes XIST,

IFN-τ, G6PD e HPRT em bovinos.

50 pb GAPDH 76 pb 50 pb XIST

99 pb Interferon-τ

74 pb G6PD 58 pb

HPRT 92 pb

84

Transcritos dos genes GAPDH, XIST, G6PD, HPRT e IFN-τ foram detectados em

blastocistos eclodidos com 9 dias de cultivo produzidos tanto por fecundação in

vitro quanto por transferência nuclear. A expressão relativa destes genes foi

individualmente avaliada em quadruplicata de 16 embriões sendo, oito produzidos

por transferência nuclear, quatro machos (TN M) e quatro fêmeas (TN F), e oito

produzidos por fecundação in vitro, quatro machos (FIV M) e quatro fêmeas (FIV F).

O número de ciclos de amplificação de cada amostra suficiente para atingir

o limiar de fluorescência (Ct) foi normalizado com o Ct obtido para o gene GAPDH,

fornecendo um valor normalizado. Como o valor de Ct é inversamente proporcional

à quantidade de cDNA inicial, valores maiores significam menores quantidades de

transcritos e vice-versa. Para as comparações entre os grupos, embriões produzidos

por fecundação in vitro do gênero masculino (FIV M) foram utilizados como amostra

controle.

Embriões bovinos fêmeas produzidos por transferência nuclear e fecundação

in vitro apresentaram maior nível de expressão do gene XIST quando comparados

aos embriões machos produzidos pelas mesmas biotecnologias (p < 0,05). No

entanto, embriões machos produzidos por transferência nuclear mostraram maior

expressão de XIST comparados com embriões machos produzidos por fecundação

in vitro (p < 0,05; Figura 23).

0 .0 0 0 0 .0 0 4

1.0 0 0 1.0 4 8

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

Expr

essã

o

FIV M TN M FIV F TN F

Figura 23. Expressão relativa do transcrito do gene XIST em blastocistos bovinos

produzidos por transferência nuclear e por fecundação in vitro.

Excepcionalmente para este transcrito, embriões FIV F foram utilizados

como amostra controle para comparação com as amostras

investigadas, pois FIV M não expressou XIST. Letras distintas indicam

diferença significativa entre os grupos (p < 0,05).

a

c

b

c

85

Ao contrário dos resultados relatados na literatura, a expressão de G6PD, foi

significativamente maior em embriões machos produzidos por transferência nuclear

quando comparados com embriões fêmeas oriundos do mesmo sistema de

produção e por fecundação in vitro (p < 0,05). Embriões machos produzidos por

fecundação in vitro também apresentaram maior expressão comparados às

fêmeas produzidas pelo mesmo sistema (p < 0,05; Figura 24).

1.0 0 0

5.0 2 7

0 .14 3 0 .2 0 0

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

Expr

essã

o


Figura 24. Expressão relativa do transcrito do gene G6PD em blastocistos bovinos

produzidos por transferência nuclear e por fecundação in vitro. Letras

distintas indicam diferença significativa entre os grupos (p < 0,05).

Analisando a expressão de HPRT, não foram observadas diferenças significativas

entre os sexos, porém a expressão variou entre os sistemas de produção para

embriões fêmeas, onde aqueles produzidos por fecundação in vitro apresentaram

maior expressão em relação aos embriões fêmeas oriundos de transferência nuclear

(p < 0,05; Figura 25).

a,b

a,c c

b

86

1.000

1.774

2.262

0.976

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

Expr

essã

o


Figura 25. Expressão relativa do transcrito do gene HPRT em blastocistos bovinos



Quanto à expressão do gene IFN-τ foi observada similaridade entre os grupos

estudados, não evidenciando diferenças significativas entre eles (Figura 26).

1.000

2.140

0.974

0.753

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

Expr

essã

o


Figura 26. Expressão relativa do transcrito do gene IFN-τ em blastocistos bovinos



a, b b

a

a, b

a

a a

a

87

7) Discussão

Neste trabalho foi investigado o padrão de expressão de quatro genes, sendo

três deles ligados ao cromossomo X, XIST, G6PD e HPRT e o quarto gene, ligado

indiretamente, IFN-τ, normalizados com o padrão de expressão do gene constitutivo

GAPDH, em embriões bovinos no estádio de blastocisto eclodido, produzidos por

transferência nuclear e por fecundação in vitro.

Acredita-se que sistemas de produção de embriões in vitro, tais como

fecundação in vitro e transferência nuclear, provocam anormalidades na expressão

de genes extremamente importantes para o desenvolvimento. Rotineiramente tem

sido relatado que embriões sofrem alterações devido às condições de cultivo in

vitro, incluindo os meios de cultivos, a suplementação protéica e o protocolo de

transferência nuclear (WRENZYCKI et al., 1999).

De acordo com os resultados obtidos neste estudo, além da divergência de

expressão entre embriões machos e fêmeas, notou-se que a quantidade dos

transcritos analisados também variou entre as biotecnologias aplicadas, ou seja, a

compensação da dosagem dos genes ligados ao cromossomo X variou entre

indivíduos do mesmo sexo, porém produzidos por transferência nuclear e

fecundação in vitro.

O transcrito de XIST é responsável pelo sinal citológico da inativação durante

o estádio de blastocisto (DE LA FUENTE et al., 1999), porém foi detectado RNA do

gene XIST em pools de embriões machos. Além disso, mesmo após a expressão de

XIST, níveis dimórficos de transcritos ligados ao X persistem no embrião no estádio de

blastocisto. Dessa maneira, o papel do XIST como precursor da inativação do

cromossomo X durante o desenvolvimento embrionário, ainda permanece

duvidoso.

Neste trabalho, conforme esperado, evidenciou-se maior expressão do gene

XIST em embriões fêmeas tanto produzidos por transferência nuclear quanto por

fecundação in vitro. Quando se avaliou este mesmo gene para embriões machos

produzidos pelas duas tecnologias, percebeu-se que nos embriões produzidos por

TN a expressão foi menor que nas fêmeas (p < 0,05), já nos produzidos por

fecundação in vitro, não foi detectada expressão do gene XIST no estádio de

blastocisto eclodido.

88

Peippo et al. (2002), também encontraram transcritos do gene XIST em

embriões bovinos machos, embora um nível significativamente maior tenha sido

encontrado em fêmeas no mesmo estádio de desenvolvimento.

A expressão gênica embrionária de XIST, por outro lado, foi detectada em

pools de embriões no estádio entre 8 a 16 células, em mórulas e em blastocistos,

porém não foi observada em embriões com 2 e entre 4 a 8 células. No estádio de

blastocisto a expressão de XIST foi detectada somente em embriões fêmeas (PEIPPO

et al., 2002).

RNA de XIST foi detectado em zigotos machos humanos, embriões nas

primeiras clivagens (DANIELS et al., 1997) e blastocisto humanos (RAY et al., 1997) e

camundongos (LEE et al., 1999). Estes dados sugerem que, como XIST foi detectado

em embriões machos e fêmeas, exista algum outro mecanismo envolvido na

inativação que junto com o transcrito XIST desempenham o papel na escolha do

cromossomo X a ser inativado (DANIELS et al., 1997).

Outras observações sugerem que o cromossomo X materno nos embriões

machos de camundongo, além de alojarem o gene XIST, inclui também a sua forma

antisenso, na qual não é distinguível de XIST pelo PCR convencional (LEE et al.,

1999), e desempenha papel na escolha do cromossomo X ativo e inativo (LEE, 2000).

Embora ainda permaneça não esclarecido se o gene XIST desempenha ou

não papel na inativação de um dos cromossomos X ou na escolha do cromossomo

X para permanecer ativo, o que está claro é que em bovinos, assim como em

humanos e camundongos, XIST está presente em embriões machos e fêmeas

durante o período pré-implantação (WRENZYCKI et al., 2002).

Peippo e colaboradores (2002) demonstraram a existência de expressão

dimórfica entre alguns, mas não entre todos os genes localizados no cromossomo X

durante o desenvolvimento de mórulas e blastocistos produzidos in vitro. Estes

autores sugerem que a equalização dos níveis de RNA mensageiro detectado em

machos e fêmeas pode ser influenciada por fatores não necessariamente

relacionados à inativação de um dos cromossomos X em fêmeas.

A expressão do gene XIST em embriões fêmeas equilibra o nível desigual de

expressão dos genes ligados ao cromossomo X. Assim, a quantidade de transcritos

dos genes G6PD e HPRT, que estão sujeitos à compensação, não deveriam

diferenciar entre os sexos, a partir do momento em que o gene XIST fosse detectado

nestes embriões.

89

Contudo, a partir do momento em que a inativação do X propaga-se

durante os vários ciclos celulares (DE LA FUENTE et al., 1999) e ocorre em diferentes

momentos nas diferentes linhagens celulares (MONK e HARPER, 1979), a equalização

dos níveis dos transcritos ocorre gradualmente.

Além disso, a equalização tardia dos transcritos entre os sexos deve-se

também ao aumento no número de células do estádio de mórula ao estádio de

blastocisto eclodido, pois embriões machos apresentam maior número de células

quando comparado aos embriões fêmeas produzidos in vitro (YADAV et al., 1993;

RAY et al., 1995).

Ao contrário dos relatos da literatura, a expressão de G6PD encontrada neste

estudo tanto para embriões fêmeas produzidos por transferência nuclear quanto

para aqueles produzidos por fecundação in vitro foi significativamente menor

comparada com embriões machos. Uma possível explicação para este desvio de

expressão seria o silenciamento do gene G6PD nos dois cromossomos X em parte

das células dos blastocistos fêmeas.

Não subestimando as conseqüências das falhas na reprogramação nuclear

de embriões clones e desconhecendo a extensão do silenciamento gênico e os

possíveis genes comprometidos, apesar de ter sido detectada expressão normal do

gene XIST, não implica que níveis normais dos demais genes sejam encontrados,

visto que existem outras formas de controle da expressão destes e de outros

transcritos além do processo de inativação.

Wilmut e colaboradores (1997) observaram que, enquanto em fibroblastos de

pele de clones vivos a ICX ocorreu de forma aleatória normal, nos clones mortos

observou-se um padrão complexo e inédito de ICX em todos os órgãos analisados:

em cada órgão, pelo menos dois genes ligados ao X estavam silenciados nos dois

cromossomos X.

Porém, Peippo et al. (2002) encontraram níveis dos transcritos para G6PD

significativamente maiores em fêmeas do que em machos no estádio de mórula e

blastocisto, sendo que esta diferença foi aumentada à medida que o embrião

passava do estádio de mórula para o estádio de blastocisto.

Todavia, espera-se que as diferenças nos níveis de expressão entre machos e

fêmeas declinem à medida que o desenvolvimento progride. Contudo, Peippo et

al. (2002) revelaram dados diferentes dos esperados. Por exemplo, níveis similares de

transcritos do gene HPRT foram detectados em pools de mórulas e blastocistos

90

machos e fêmeas 2 ou 3 três dias após ser detectada a expressão de XIST e um ou

dois dias antes de ser detectada a replicação tardia do cromossomo X inativo (DE

LA FUENTE et al., 1999).

Em nossos resultados, encontramos níveis similares de transcritos do gene HPRT

entre machos e fêmeas, porém, variando entre embriões fêmeas produzidos por

transferência nuclear e por fecundação in vitro. Neste caso, como foram

detectado níveis maiores de HPRT em embriões fêmeas produzidos por FIV em

comparação aos clonados, acredita-se que este gene ainda não tenha sido

silenciado em um dos cromossomos X em parte das células embrionárias, pois,

como descrito anteriormente, a equalização dos níveis dos transcritos ocorre

gradualmente.

Peippo et al. (2002) encontraram níveis maiores de HPRT em fêmeas nos

estádios de mórula e blastocisto que em machos, porém, ao contrário dos níveis de

G6PD, eles não diferiram significativamente.

A quantidade observada de RNA mensageiro de G6PD foi similar entre

embriões machos e fêmeas no estádio de 2 células anteriormente a ativação do

genoma embrionário (LONERGAN et al., 2000), mas maior em fêmeas que em

machos no estádio de blastocisto (GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2000; LONERGAN et al.,

2000).

O nível do transcrito do gene HPRT também foi similar entre embriões bovinos

no estádio de 2 células machos e fêmeas (LONERGAN et al., 2000), mas em

contraste com o estudo de Peippo et al. (2002) foi significativamente maior em

fêmeas do que em machos no estádio de blastocisto (GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2000;

LONERGAN et al., 2000).

Estas observações são sugestivas de que o processo de compensação de

expressão dos genes para HPRT ocorre no estádio de mórula, mas para G6PD o

processo está incompleto. Na fase de blastocisto, na presença do XIST sugere-se

que tenha sido iniciada a inativação do cromossomo X a partir do CIX e

propagação ao longo do cromossomo X selecionado para inativação (LYON, 1991).

Aqueles locais tais como HPRT que estão mais próximos ao CIX deveriam mostrar

sinais de inativação e compensação de expressão anteriormente àqueles situados

mais distantes do CIX, tais como o G6PD.

A metilação padrão do cromossomo X em camundongos suporta esta

hipótese de propagação linear da inativação do X a partir do CIX (GOTO e MONK,

91

1998). Contudo, tanto o aumento quanto a diminuição na diferença dos níveis de

RNAm para HPRT e G6PD entre machos e fêmeas nos estádios de mórula e

blastocisto apresentados por Peippo et al. (2002), e os efeitos da expressão de HPRT

e G6PD na produção dos embriões relatados em outros trabalhos (GUTIÉRREZ-ADÁN

et al., 2000; LONERGAN et al., 2000; LUCAS-HAHN et al., 2001) sugerem que outros

fatores além da inativação podem estar envolvidos na equalização da expressão

entre machos e fêmeas.

A estabilidade do RNA mensageiro do HPRT em embriões bovinos não está

esclarecida. Tem sido mostrado que a estabilidade do mensageiro associada com

a poliadenilação do transcrito está relacionada ao potencial de desenvolvimento

nos oócitos bovinos (BREVINI-GANDOLFI et al., 1999) e que os níveis de transcritos do

HPRT são maiores em embriões de alta capacidade de desenvolvimento em

sistemas de produção in vitro (LONERGAN et al., 2000).

Além disso, em camundongos, tem sido demonstrado que a expressão de

HPRT é mais intensa no cromossomo X materno do que no paterno (MOORE e

WHITTINGHAM, 1992). Por esta razão os níveis similares de transcritos do HPRT em

mórulas e blastocistos poderiam refletir a estabilidade da mensagem, baixo

metabolismo de HPRT e baixo nível de transcrição do cromossomo X paterno em

embriões fêmeas mais propriamente que a compensação provocada pela

inativação do X.

No caso do G6PD, Lucas-Hahn e co-autores (2001) relataram que enquanto

os níveis de G6PD foram maiores em blastocistos bovinos fêmeas produzidos in vitro

do que em machos, os níveis encontrados para machos e fêmeas produzidos in vivo

foram similares. Desta maneira, acredita-se que o período de inativação do X ou a

síntese e acumulação de transcritos diferem entre os embriões produzidos in vivo e

in vitro e preferencialmente são susceptíveis a influência do ambiente.

Dada a importância de G6PD no estresse oxidativo, embriões e fetos que

apresentam deficiência de G6PD são mais susceptíveis ao estresse oxidativo que os

demais indivíduos (RIEGER, 1992). Neste trabalho, como foi evidenciado menor nível

de G6PD em embriões fêmeas, acredita-se que as baixas taxas de formação de

blastocistos, bem como, maior taxa de morte durante a gestação possam estar

correlacionados com a deficiência na expressão deste gene.

Por outro lado, a deficiência na expressão de G6PD em embriões fêmeas não

pode ser atribuída somente ao evento de inativação do cromossomo X, visto que, a

92

expressão de XIST e HPRT ocorreu de forma normal em relação aos machos.

Acredita-se que, além da inativação, ocorreu um efeito de sistema in vitro, uma vez

que, em cultivo, os embriões são expostos às condições do ambiente, por exemplo

a concentração de glicose no meio, que podem alterar a expressão de genes

importantes ao desenvolvimento, neste caso, sendo mais susceptível nas fêmeas.

Embriões bovinos, como também de outras espécies, são sensíveis ao estresse

oxidativo. Sabendo-se que a expressão de G6PD é maior em mórulas e blastocistos

fêmeas do que em machos (IWATA et al., 2002; GUTIÉRREZ-ADÁN et al., 2000), é

concebível que a menor produção de IFN-τ por machos seja conseqüência da

maior sensibilidade de machos ao estresse oxidativo.

Alternativamente, a maior produção de IFN-τ por fêmeas pode ser

favorecida pelo aumento de G6PD e está associada ao aumento do fluxo da via

pentose-fosfato. Dados da literatura revelam que as atividades de vários fatores de

transcrição são sensíveis ao estado redox do meio celular (MOREL e BAROUTI, 1999;

WENGER, 2000; HADDAD, 2002).

Observou-se, neste trabalho, que embriões bovinos submetido à transferência

nuclear e fecundação in vitro não diferiram em relação à expressão de IFN-τ no

estádio de blastocisto eclodido, apesar das diferenças na expressão de G6PD.

Neste caso, mesmo com o baixo nível de expressão de G6PD pelos embriões

fêmeas, não foi suficiente para influenciar na transcrição de IFN-τ.

Kimura et al. (2004) relataram que conceptos no 14º dia do desenvolvimento

produziram em média cerca de 150.000 vezes mais IFN-τ que blastocistos

expandidos no 9º dia de cultivo, embora maior variabilidade tenha sido encontrada

entre os conceptos. O dimorfismo sexual evidente entre os blastocistos no dia 8 e 9

de cultivo aparentemente não persistiu durante a progressão do desenvolvimento.

Além disso, estes mesmos autores verificaram que o peróxido de hidrogênio

(H2O2) e altas concentrações de O2 no sistema de cultivo, e inibidores de G6PD

como desidroepiandrosterona (DHEA) e 6-aminonicotinamida (6-AN), reduziram

acentuadamente a produção de IFN-τ por blastocistos bovinos, tendo ambos os

suplementos, um maior efeito nas fêmeas do que em machos. Em conseqüência, a

expressão sexualmente dimórfica de IFN-τ foi abolida pelo uso dos tratamentos.

Estes efeitos, particularmente aqueles mediados pelo 6-AN, não

comprometeram a qualidade ou o progresso do desenvolvimento, pois muitos

blastocistos eclodiram tanto na presença quanto na ausência dos inibidores

93

(KIMURA et al., 2004). Além disso, o tratamento com 6-AN, não levou à redução no

número de células nos blastocistos em cultivo.

DHEA é inibidor específico de G6PD, ligando-se diretamente à enzima e

agindo num domínio não competitivo (GORDON et al., 1995), 6-AN é inicialmente

metabilizada a 6-amino-NAD(P+), um componente que competitivamente inibe um

número de reações que utilizam NADP+, incluindo duas enzimas limitantes da via

pentose-fosfato, 6-fosfogluconato desidrogenase, e G6PD (KÖHLER et al., 1970).

Ambos componentes, embora apresentando diferentes modelos de ação, agem

para reduzir o fluxo de G6PD diretamente nas etapas oxidativas da via pentose-

fosfato e alterar o balanço redox dos embriões (HARVEY et al., 2002).

Os dados do trabalho de KIMURA e colaboradores (2004) sugerem que a

produção sexualmente dimórfica de IFN-τ observada entre blastocistos bovinos é

uma conseqüência direta da dosagem relativa ao cromossomo X no trofectoderma

de embriões machos e fêmeas e à maior atividade de G6PD em fêmeas.

Como em embriões bovinos, a inativação do X inicia-se no estádio de

blastocisto e completa-se no 14º dia do desenvolvimento (DE LA FUENTE et al., 1999),

a expressão sexualmente dimórfica de IFN-τ é também perdida entre os dias 08 e 14

entre os conceptos produzidos in vivo (KIMURA et al., 2004), uma observação que

está claramente consistente com a hipótese da dosagem compensatória.

Estes experimentos consistentemente correlacionam o braço oxidativo da via

pentose-fosfato e produção de IFN-τ, embora um mecanismo lógico esteja longe

de atingir o óbvio.

O gene IFN-τ é autossômico, formando um grupo com outro gene, IFN tipo-I,

no cromossomo 8 em bovinos (RYAN e WOMACK, 1993). Portanto, a compensação

da dosagem de genes é um improvável mecanismo para explicar a maior

expressão de IFN-τ em embriões fêmeas, onde no 10º dia de desenvolvimento,

apresenta menor número de células que machos da mesma idade. Outra

possibilidade é que um ou mais fatores que controlam a transcrição de IFN-τ sejam

sensíveis ao estado redox da célula e mais ativos quando a concentração de

NADPH está alta.

94

8) Modelos Hipotéticos

A partir dos resultados obtidos e discutidos neste trabalho, pode-se sugerir que

a velocidade da progressão do evento de inativação de um dos cromossomos X

em fêmeas seja maior nos embriões produzidos por transferência nuclear quando

comparados àqueles produzidos por fecundação in vitro, visto que, a expressão do

gene HPRT por fêmeas FIV foi maior comparada às fêmeas TN que por sua vez foi

semelhante aos machos. Este atraso no equilíbrio da expressão gênica entre fêmeas

FIV e fêmeas TN colabora com a sugestão de que este processo possa ser

conseqüência de uma memória genética do núcleo da célula somática utilizada

na transferência nuclear que, por sua vez, já passou pelo mesmo processo de

inativação do cromossomo X (Figura 27).

Figura 27. Modelo hipotético proposto da velocidade da progressão do evento de

inativação do cromossomo X em embriões fêmeas produzidos por

transferência nuclear (TN) e por fecundação in vitro (FIV).

TN

Progressão do desenvolvimento

Progressão da inativação

FIV

2-células 4-células 8-células 16-células Mórula inicial

Mórula compacta

Blastocisto

95

Sim

Sim

Não

Não

Não

Sim

Por outro lado, acredita-se que o processo de silenciamento gênico não

ocorra isoladamente, mas é dependente das condições ambientais fornecidas

durante a progressão do desenvolvimento embrionário in vitro.

Além do controle transcricional convencional a que são submetidos machos

e fêmeas, o meio de cultivo utilizado na produção in vitro afeta o desenvolvimento,

interferindo no metabolismo ou na expressão de genes importantes para o

desenvolvimento, podendo influenciar no desenvolvimento embrionário, fetal e

placentário em bovinos (BAVISTER, 1995; NIEMANN e WRENZYCKI, 2000).

Desta maneira, sugere-se que a baixa expressão de G6PD por embriões

fêmeas, está relacionada à falta de glicose no meio de cultivo, pois, ao contrário

dos machos, as células embrionárias femininas possuem todos os componentes

necessários para o silenciamento dos genes no cromossomo X, dispensando, assim,

a transcrição de G6PD na ausência de glicose (Figura 28).

Figura 28. Modelo hipotético da expressão de G6PD durante o desenvolvimento

embrionário frente a disponibilidade de glicose no meio de cultivo.

Desenvolvimento embrionário

Fatores de inativação

Metabólitos

(glicose)

Metabólitos

(glicose)

Ausência de silenciamento

Silenciamento Transcricional

Expressão monoalélica

Ausência de silenciamento

96

9) Conclusões

1) Embriões machos e fêmeas submetidos à transferência nuclear diferem na

expressão de genes localizados no cromossomo X no estádio de blastocisto

eclodido.

2) Embriões fêmeas oriundos de transferência nuclear são mais susceptíveis à

falhas durante a reprogramação provavelmente em virtude da inativação do

cromossomo X e ao comprometimento de genes essenciais ao desenvolvimento.

10) Perspectivas

Sugere-se a existência de outros fatores que influenciam na expressão de

genes ligados ao cromossomo X além do processo de inativação, como a escolha

do X paterno ou do X materno para permanecer ativo, bem como as condições do

ambiente de um sistema in vitro.

97

11) Referência Bibliográfica

AROSH, J.; PARENT, J.; CHAPDELAINE, P.; SIROIS, J.; FORTIER, M. Expression of

cyclooxygenases 1 and 2 and prostaglandin E synthase in bovine endometrial

tissue during the estrous cycle. Biology of Reproduction, v. 67, n. 1, p. 161-169,

2002.

AVERY, B.; MADISON, V.; GREVE, T. Sex and development in bovine in-vitro fertilized

embryos. Theriogenology, v. 35, p. 953-963, 1991.

BAVISTER, B.D. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Human

Reproduction Update, v. 1, n. 2, p. 91-148, 1995.

BEHBOODI, E.; GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; ANDERSON, G.B. Inadvertent sex selection in a

protocol of in vitro bovine embryo production. Theriogenology, v. 47, n. 1, p. 265,

1997.

BESTOR, T.H. The DNA methyltransferases of mammals. Human Molecular Genetics, v.

9, n. 16, p. 2395-2402, 2000.

BINELLI, M.; GUZELOGLU, A.; BADINGA, L.; ARNOLD, D.R.; SIROIS, J.; HANSEN, T.R.;

THATCHER, W.W. Interferon-tau modulates phorbol ester-induced production of

prostaglandin and expression of cyclooxygenase-2 and phospholipase-A(2) from

bovine endometrial cells. Biology of Reproduction, v. 63, n. 2, p. 417-424, 2000.

BOIANI, M.; ECKARDT, S.; SCHOLER, H.R.; MCLAUGHLIN, K.J. Oct4 distribution and level

in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes & Development, v. 16, n.

10, p. 1209-1219, 2002.

BORTVIN, A.; EGGAN, K.; SKALETSKY, H.; AKUTSU, H.; BERRY, D.L.; YANAGIMACHI, R.;

PAGE, D.C.; JAENISCH, R. Incomplete reactivation of Oct-4-related genes in

mouse embryos cloned from somatic nuclei. Development, v. 130, n. 8, p. 1673-

1680, 2003.

98

BOURC’HIS, D.; Le BOURHIS, D.; PATIN, D.; NIVELEAU, A.; COMIZZOLI, P.; RENARD, J.P.;

VIEGAS-PEQUIGNOT, E. Delayed and incomplete reprogramming of

chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos. Current Biology, v.

11, n. 19, p. 1542-1546, 2001.

BREDBACKA, K.; BREDBACKA, P. Glucose controls sex-related growth rate differences

of bovine embryos produced in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, v. 106,

n. 2, p. 169-172, 1996.

BREVINI-GANDOLFI, T.A.L.; FAVETTA, L.A.; MAURI, L.; LUCIANO, A.M.; CILLO, F.;

GANDOLFI, F. Changes in poly(A) tail length of maternal transcripts during in vitro

maturation of bovine oocytes and their relation with developmental

competence. Molecular Reproduction and Development, v. 52, n. 4, p. 427-433,

1999.

BROCKDORFF, N.; ASHWORTH, A.; KAY, G.F.; COOPER, P.J.; SMITH, S.; McCABE, V.M.;

NORRIS, D.P.; PENNY, G.D.; PATEL, D.; RASTAN, S. Conservation of position and

exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature, v.

351, n. 6324, p. 329-331, 1991.

BROCKDORFF, N.; ASHWORTH, A.; KAY, G.F.; McCABE, V.M.; NORRIS, D.P.; COOPER,

P.J.; SWIFT, S.; RASTAN, S. The product of the mouse XIST gene is a 15 kb inactive

X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus.

Cell, v. 71, p. 515-526, 1992.

BROWN, C.J.; BALLABIO, A.; RUPERT, J.L.; LAFRENIERE, R.G.; GROMPE, M.; TONLORENZI,

R.; WILLARD, H.F. A gene from the region of the human X inactivation centre is

expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature, v. 349, n. 6304, p.

38-44, 1991.

CARVALHO, R.V.; DEL CAMPO, M.R.; PALASZ, A.T.; PLANTE, Y.; MAPLETOFT, R.J.

Survival rates and sex ratio of bovine IVF embryos frozen at different

developmental stages on day 7. Theriogenology, v. 45, n. 2, p. 489-498, 1996.

99

CEZAR, G.G.; BARTOLOMEI, M.S.; FORSBERG, E.J.; FIRST, N.L.; BISHOP, M.D.; EILERTSEN,

K.J. Genome-wide epigenetic alterations in cloned bovine fetuses. Biology of

Reproduciton, v. 68, n. 3, p. 1009-1014, 2003.

CHUNG, Y.G.; RATNAM, S.; CHAILLET, J.R.; LATHAM, K.E. Abnormal regulation of DNA

methyltransferase expression in cloned mouse embryos. Biology of Reproduction,

v. 69, n. 1, p. 146-153, 2003.

CHUREAU, C.; PRISSETTE, M.; BOURDET, A.; BARBE, V.; CATTOLICO, L.; JONES, L.;

EGGEN, A.; AVNER, P.; DURET, L. Comparative sequence analysis of the X-

inactivation center region in mouse, human, and bovine. Genome Research, v.

12, n. 6, p. 894-908, 2002.

CLEMSON, C.M.; McNEIL, J.A.; WILLARD, H.F.; LAWRENCE, J.B. XIST RNA paints the

inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in

nuclear/chromosome structure. Journal of Cell Biology, v. 132, n. 3, p. 259-275,

1996.

CROSS, J.C. Factors affecting the developmental potential of cloned mammalian

embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America, v. 98, n. 11, p. 5949-5951, 2001.

DANIELS, R.; ZUCCOTTI, M.; KINIS, T.; SERHAL, P.; MONK, M. Xist expression in human

oocytes and preimplantation embryos. American Journal of Human Genetics, v.

61, n. 1; p. 33-39, 1997.

DEAN, W.; SANTOS, F.; STOJKOVIC, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; WALTER, J.; WOLF, E.;

REIK, W. Conservation of methylation reprogramming in mammalian

development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p. 13734-

13738, 2001.

100

DE LA FUENTE, R.; HAHNEL, A.; BASRUR, P.K.; KING, W.A. X Inactive-specific transcript

(XIST) expression and X chromosome inactivation in the preattachment bovine

embryo. Biology of Reproduction, v. 60, n. 3, p. 769-775, 1999.

EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.; YANAGIMACHI, R.;

JAENISCH, R. X-chromosome inactivation in cloned mouse embryos. Science, v.

290, n. 5496, p. 1578-1581, 2000.

EPSTEIN, C.J.; SMITH, S.; TRAVIS, B.; TUCKER, G. Both X chromosomes function before

visible X chromosome inactivation in female mouse embryos. Nature, v. 274, p.

500-503, 1978.

ERICSON, R.P. Does sex determination start at conception? Bioessays, v. 19, n. 11, p.

1027-1032, 1997.

FARAZMAND, A.; KOYKUL, W.; PEIPPO, J.; BAGUMA-NIBASHEKA, M.; KING, W.A.;

BASRUR, P.K. Sex-linked genes are not silenced in fetal bovine testes expressing X-

inactive specific transcript (XIST). Journal of Experimental Zoology, v. 290, p. 327-

340, 2001.

GENETICS HOME REFERENCE. Disponível em: http://ghr.nlm.nih.gov). Acesso em: 02

abril 2007.

GORDON, G.; MACKOW, M.C.; LEVY, H.R. On the mechanism of interaction of

steroids with human glucose-6-phosphate dehydrogenase. Archives of

Biochemistry and Biophysics, v. 318, n. 1, p. 25-29, 1995.

GOTO, T; MONK, M. Regulation of X-chromosome inactivation in development in

mice and humans. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, n. 2, p.

362-378, 1998.

GRANT, M.; ZUCCOTTI, M.; MONK, M. X chromosome activity and imprinting. In Reed,

K.C. and Marshall Graves, J.A. (eds.) Sex Chromosomes and Sex-Determining

Genes. Harwood Academic Publishers GmbH, Chur, Switzerland, p. 243-257, 1993.

101

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; BEHBOODI, E.; ANDERSON, G.B.; MEDRANO, J.F.; MURRAY, J.D.

Relationship between stage of development and sex of bovine IVM-IVF embryos

cultured in vitro versus in the sheep oviduct. Theriogenology, v. 46, p. 515-525,

1996.

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; OTER, M.; MARTÍNEZ-MADRID, B.; PINTADO, B.; DE LA FUENTE, J.

Differential expression of two genes located on the X chromosome between

mate and female in vitro-produced bovine embryos at the blastocyst stage.

Molecular Reproduction and Development, v. 55, p. 146-151, 2000.

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; GRANADOS, J.; PINTADO, B.; De La FUENTE, J. Influence of

glucose on the sex ratio of bovine IVM/IVF embryos cultured in vitro.

Reproduction, Fertility and Development, v. 13, n. 5-6, p. 361-365, 2001a.

GUTIÉRREZ-ADÁN, A.; LONERGAN, P.; RIZOS, D.; WARD, F.A.; BOLAND, M.P.; PINTADO,

B.; DE LA FUENTE, J. Effect of the in vitro culture system on the kinetics of

blastocyst development and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology, v. 55,

p. 1117-1126, 2001b.

GRAVES, J.A.; GARTLER, S.M. Mammalian X chromosome inactivation: testing the

hypothesis of transcriptional control. Somatic cell and molecular genetics, v. 12,

n. 3, p. 275-280, 1986.

HADDAD, J.J. Antioxidant and prooxidant mechanisms in the regulation of redox(y)-

sensitive transcription factors. Cellular Signalling, v. 14, n. 11, p. 879-897, 2002.

HARPER, M.I.; FOSTEN, M.; MONK, M. Preferential paternal X inactivation in

extraembryonic tissues of early mouse embryos. Journal of Embryology and

Experimental Morphology, v. 67, p. 127-135, 1982.

HARVEY, A.J.; KIND, K.L.; THOMPSON, J.G. REDOX regulation of early embryo

development. Reproduction, v. 123, n. 4; p. 479-486, 2002.

102

HASLER, J.F.; HENDERSON, W.B.; HURTGEN, P.J.; JIN, Z.Q.; MCCAULEY, A.D.; MOWER,

S.A.; NEELY, B.; SHUEY, L.S.; STOKES, J.E.; TRIMMER, S.A. Production, freezing and

transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, v.

43, p. 141-152, 1995.

HERNANDEZ-LEDEZMA, J.J.; SIKES, J.D.; MURPHY, C.N.; WATSON, A.J.; SCHULTZ, G.A.;

ROBERTS, R.M. Expression of bovine trophoblast interferon in conceptuses derived

by in vitro techniques. Biology of Reproduction, v. 47, n. 3, p. 374-380, 1992.

HERNANDEZ-LEDEZMA, J.J.; MATHIALAGAN, N.; VILLANUEVA, C.; SIKES, J.D.; ROBERTS,

R.M. Expression of bovine trophoblast interferons by in vitro-derived blastocysts in

correlated with their morphological quality and stage of development. Molecular

Reproduction and Development, v. 36, p. 1-6, 1993.

HEYMAN, Y. Nuclear transfer: a new tool for reproductive biotechnology in cattle.

Reproduction Nutrition Development, v. 45, n. 3, p. 353-361, 2005.

HILL, J.R. Abnormal in utero development of cloned animals: implications for human

cloning. Differentiation, v. 69, n. 4-5, p. 174-178, 2002.

HUMPHERYS, D.; EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.M.;

BINISZKIEWICZ, D.; YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Epigenetic instability in ES cells

and cloned mice. Science, v. 293, p. 95-97, 2001.

INOUE, K.; KOHDA, T.; LEE, J.; OGONUKI, N.; MOCHIDA, K.; NOGUCHI, Y.; TANEMURA,

K.; KANEKO-ISHINO, T.; ISHINO, F.; OGURA, A. Faithful expression of imprinted

genes in cloned mice. Science, p. 295-297, 2002.

IWATA, H.; AKAMATSU, S.; MINAMI, N.; YAMADA, M. Effects of antioxidants on the

development of bovine IVM/IVF embryos in various concentrations of glucose.


IWATA, H.; KIMURA, K.; HASHIMOTO, S.; OHTA, M.; TOMINAGA, K.; MINAMI, N. Role of

G6PD activity on sex ratio and developmental competence of bovine embryos

103

under oxidative stress. Journal of Reproduction and Development, v. 48, n. 5, p.

447-453, 2002.

JEPPESEN, P.; TURNER, B.M. The inactive X chromosome in female mammals is

distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene

expression. Cell, v. 74, p. 281-289, 1993.

JONES, K.L.; HILL, J.; SHIN, T.Y.; LUI, L.; WESTHUSIN, M. DNA hypomethylation of

karyoplasts for bovine nuclear transplantation. Molecular Reproduciton and

Development, v. 60, p. 208-213, 2001.

KANG, Y.K.; KOO, D.B.; PARK, J.S.; CHOI, Y.H.; KIM, H.N.; CHANG, W.K.; LEE, K.K.; HAN,

Y.M. Typical demethylation events in cloned pig embryos. Clues on species-

specific differences in epigenetic reprogramming of a clone donor genome. The

Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 43, p. 39980-39984, 2001.

KANG, Y.K.; PARK, J.S.; KOO, D.B.; CHOI, Y.H.; KIM, S.U.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. Limited

demethylation leaves mosaic-type methylation states in cloned bovine pre-

implantation embryos. The EMBO Journal, v. 21, n. 5, p. 1092-1100, 2002.

KIMURA, K.; SPATE, L.D.; GREEN, M.P.; MURPHY, C.N.; SEIDEL JR., G.E.; ROBERTS, R.M.

Sexual dimorphism in interferon-τ production by in vivo-derived bovine embryos.


KIMURA, K.; SPATE, L.D.; GREEN, M.P.; ROBERTS, R.M. Effects of oxidative stress and

inhibitors of the pentose phosphate pathway on sexually dimorphic production of

IFN-τ by bovine blastocysts. Molecular Reproduction and Development, v. 68, p.

88-95, 2004.

KISHIGAMI, S.; MIZUTANI, E.; OHTA, H.; HIKICHI, T.; THUAN, N.V.; WAKAYAMA, S.; BUI,

H.T.; WAKAYAMA, T. Significant improvement of mouse cloning technique by

treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochemical and

Biophysical Research Communications, v. 340, n. 1, p. 183-189, 2006.

104

KOCHHAR, H.P.S.; PEIPPO, J.; KING, W.A. Sex related embryo development.

Threriogenology, v. 55, p. 3-14, 2001.

KÖHLER, E.; BARRACH, H.J.; NEUBERT, D. Inhibition of NADP dependent

oxidoreductases by the 6-aminonicotinamide analogue of NADP. FEBS Letters, v.

6, n. 3, p. 225-228, 1970.

KRATZER, P.G.; GARTLER, S.M. HGPRT activity changes in preimplantation mouse

embryos. Nature, v. 274, p. 503-504, 1978.

KUBISCH, H.M.; LARSON, M.A.; ROBERTS, R.M. Relationship between age of

blastocysts formation and interferon-τ secretion by in vitro-derived bovine

embryos. Molecular Reproduction and Development, v. 49, p. 254-260, 1998.

KUBISCH, H.M.; LARSON, M.A.; EALY, A.D.; MURPHY, C.N.; ROBERTS, R.M. Genetic and

environmental determinants of interferon-τ secretion by in in vitro-and in vitro-

derived bovine blastocysts. Animal Reproduction Science, v. 66, p. 1-13, 2001a.

KUBISCH, H.M.; LARSON, M.A.; KIESLING, D.O. Control of interferon-tau secretion by in

vitro-derived bovine blastocysts during extended culture and outgrowth

formation. Molecular Reproduction and Development, v. 58, n. 4, p. 390-397,

2001b.

KUBISCH, H.M.; RASMUSSEN, T.; JOHNSON, K. Interferon-tau in bovine blastocysts

following parthenogenetic activation of oocytes: Pattern of secretion and

polymorphism in expressed mRNA sequences. Molecular Reproduction and

Development, v. 64, p. 79-85, 2003.

LARSON, M.A.; KUBISCH, H.M. The effects of group size on development and

interferon-τ secretion by in vitro fertilized and cultured bovine blastocysts. Human

Reproduction, v. 14, p. 2075-2079, 1999.

LARSON, M.A.; KIMURA, K.; KUBISCH, H.M.; ROBERTS, R.M. Sexual dimorphism among

bovine embryos in their ability to make the transition to expanded blastocysts

105

and in the expression of the signaling molecule IFN-tau. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, n. 17, p.

9677-9682, 2001.

LEE, J.T.; DAVIDOW, L.S.; WARSHAWSKY, D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-

inactivation centre. Nature Genetics, v. 21, p. 400-404, 1999.

LEE, J.T. Disruption of imprinted X inactivation by parent-of-origin effects at Tsix. Cell,

v. 103, n. 1, p. 17-27, 2000.

LYON, M.F. The quest for the X-inactivation centre. Trends in genetics, v. 7, n. 3, p. 69-

70, 1991.

LONERGAN, P.; GUTIÉRREZ-ADAN, A.; PINTADO, B.; FAIR, T.; WARD, F.; De La FUENTE,,

J.; BOLAND, M. Relationship between time of first cleavage and the expression of

IGF-I growth factor, its receptor, and two housekeeping genes in bovine two-cell

embryos and blastocysts produced in vitro. Molecular Reproduction and

Development, v. 57, 146-152, 2000.

LUCAS-HAHN, A.; HERRMANN, D.; LEMME, E.; KORSAWE, K.; HADELER, K.G.; NIEMANN,

H.; WRENZYCKI, C. Sex-related expression on the two X chromosome specific

transcripts (G6PD, PGK) and the X inactive-specific transcript (XIST) in bovine

blastocysts. Theriogenology, v. 55, p. 412, 2001.

MANN, M.R.; CHUNG, Y.G.; NOLEN, L.D.; VERONA, R.I.; LATHAM, K.E.; BARTOLOMEI,

M.S. Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned

preimplantation stage mouse embryos. Biology of Reproduction, v. 69, p. 902-914,

2003.

MASSIP, A.; MERMILLOD, P.; VAN LANGENDONCKT, A.; REICHENBACH, H.D.;

LONERGAN, P.; BERG, U.; CAROLAN, C.; DE ROOVER, R.; BREM, G. Calving

outcome following transfer of embryos produced in vitro in different conditions.

Animal Reproduction Science, v. 44, p. 1-10, 1996.

106

MCDONALD, L.E.; PATERSON, C.A.; KAY, G.F. Bisulfite genomic sequencing-derived

methylation profile of the Xist gene throughout early mouse development.

Genomics, v. 54, n. 3, p. 379-386, 1998.

MCGRAW, S.; ROBERT, C.; MASSICOTTE, L.; SIRARD, M.A. Quantification of histone

acetyltransferase transcripts in early bovine embryo development. Biology of

Reproduction, v. 66, p. 245-245, 2002.

MONK, M.; HARPER, M. X-chromosome activity in preimplantation mouse embryos

from XX and XO mothers. Journal of Embryology and Experimental Morphology,

v. 46, p. 53-64, 1978.

MONK, M.; HARPER, M. Sequential X chromosome inactivation coupled with

differentiation in early mouse embryos. Nature, v. 281, n. 5729, p. 311-313, 1979.

MOORE, T.F.; WHITTINGHAM, D.G. Imprinting of phosphoribosyltransferases during

preimplantation development of the mouse mutant, HPRTb-m3. Development, v.

115, n.4, p. 1011-1016, 1992.

MOREL, Y.; BAROUTI, R. Repression of gene expression by oxidative stress. The

Biochemical Journal, v. 342, n. 3, p. 481-496, 1999.

MUKHERJEE, A.B. Cell cycle analysis and X chromosome inactivation in the

developing mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 73, n. 5, p. 1608–1611, 1976.

NICOL, C.J.; ZIELENSKI, J.; TSUI, L.C.; WELLS, P.G. An embryoprotective role for

glucose-6-phosphate dehydrogenase in developmental oxidative stress and

chemical teratogenesis. The FASEB Journal : official publication of the Federation

of American Societies for Experimental Biology, v. 14, p. 111-127, 2000.

NIEMANN, H.; WRENZYCKI, C. Alterations of expression of developmentally important

genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions:

implications for subsequent development. Theriogenology, v. 53, p. 21-34, 2000.

107

NORRIS, D.P.; PATEL, D.; KAY, G.F.; BROCKDORFF, N.; SHEARDOWN, S.A.; RASTAN, S.

Evidence that random and imprinted Xist expression is controlled by methylation.

Cell, v. 77, n. 1, p. 41-51, 1994.

OKANO, M.; BELL, D.W.; HABER, D.A.; LI, E. DNA methyltransferases DNMT3a and

DNMT3b are essential for de novo methylation and mammalian development.

Cell, v. 99, n. 3, p. 247-257, 1999.

PLATH, K.; MLYNARCZYK-EVANS, S.; NUSINOW, D.A.; PANNING, B. Xist RNA and the

mechanism of X chromosome inactivation. Annual Reviews of Genetics, v. 36, p.

233 a 278, 2002.

PEGORARO, L.M.C.; THUARD, J.M.; DELALLEAU, N.; GUÉRIN, B.; DESCHAMPS, J.C.;

MERQUANT-LEGUIENNE, B.; HUMBLOT, P. Comparison of sex ratio and cell number

of IVM-IVF bovine blastocysts co-culture with bovine oviduct epithelial cells or

with vero cells. Theriogenology, v. 49, n. 8, p. 1579-1590, 1998.

PEIPPO, J.; BREDBACKA, P. Sex-related growth rate differences in mouse

preimplantation embryos in vivo and in vitro. Molecular Reproduction and

Developmental, v. 40, n. 1, p. 56-61, 1995.

PEIPPO, J.; KURKILAHTI, M.; BREDBACKA, P. Developmental kinetics of in vitro

produced bovine embryos: The effect of sex, glucose and exposure to time-lapse

environment. Zygote, v. 9, n. 2, p. 105-113, 2001.

PEIPPO, J.; FARAZMAND, A.; KURKILAHTI, M.; MARKKULA, M.; BASRUR, P.K.; KING, W.A.

Sex-chromosome linked gene expression in in-vitro produced bovine embryos.

Molecular Human Reproduction, v. 8, n. 10, p. 923-929, 2002.

PERGAMENT, E.; FIDDLER, M.B.; CHO, N.; JOHNSON, D. Sexual differentiation and

preimplantation cell growth. Hum. Reprod, v. 9, p. 1730-1732, 1994.

PFAFFL, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-

PCR. Nucleic Acids Research, v. 29, n. 9, p. 2002-2007, 2001.

108

PFAFFL, M.W.; HORGAN, G.W.; DEMPFLE, L. Relative expression software tool (REST©)

for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in

real-time PCR. Nucleic Acids Research, v. 30, n. 9, p. 1-10, 2002.

RAMAKERS, C.; RUIJTER, J.M.; DEPREZ, R.H.L.; MOORMAN, A.F.M. Assumption-free

analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data.

Neuroscience Letters, v. 339, p. 62-66, 2003.

RAY, P.F.; CONAGHAN, J.; WINSTON, R.M.L.; HANDYSIDE, A.H. Increased number of

cells and metabolic activity in male human preimplantation embryos following in

vitro fertilization. Journal of Reproduction and Fertility, v. 104, p. 165-171, 1995.

RAY, P.F.; WINSTON, R.M.; HANDYSIDE, A.H. Xist expression from the maternal X

chromosome in human male preimplantation embryos at the blastocyst stage.

Human Molecular Genetics, v. 6, n. 8, p. 1323-1327, 1997.

REICHENBACH, H.D.; LIEBRICH, J. ; BERG, U.; BREM, G. Pregnancy rates and births after

unilateral or bilateral transfer of bovine embryos produced in vitro. Journal of

Reproduction and Fertility, v. 95, n. 2, p. 363-370, 1992.

RIEGER, D. Developmental related changes in the uptake and metabolism of

glucose, glutamine Relationships between energy metabolism and development

of early mammalian. Theriogenology, v. 37, n. 1, p. 75-93, 1992.

ROBERTS, R.M.; LEAMAN, D.W.; CROSS, J.C. Role of interferons in maternal

recognition of pregnancy in ruminants. Proceedings of the Society for

Experimental Biology and Medicine, v. 200, p. 7-18, 1992.

RYAN, A.M.; WOMACK, J.E. Type I interferon genes in cattle: restriction fragment

length polymorphisms, gene numbers, and physical organization on bovine

chromosome 8. Animal Genetics, v. 24, n. 1, p. 9-16, 1993.

109

RYBOUCHKIN, A.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Role of histone acetylation in

reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biology of

Reproduction, v. 2006.

STICE, S.L.; KEEFER, C.L.; MATTHEWS, L. Bovine nuclear transfer embryos: oocytes

activation prior to blastomere fusion. Molecular Reproduction and Development,

v. 38, n. 1, p. 61-68, 1994.

STOJKOVIC, M.; BÜTTNER, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; RIEDL, J.; REICHENBACH, H.-D.;

WENIGERKIND, H.; BREM, G.; WOLF, E. Secretion of interferon-tau by bovine

embryos in long-term cultured: comparison of in vitro derive, in vitro produced,

nuclear transfer and demi-embryos. Animal Reproduction Science, v. 55, n. 3-4,

p. 151-162, 1999.

TAKAGI, N.; OSHIMURA, M. Fluorescence and Giemsa banding studies of the

allocycloc X chromosome in embryonic and adult mouse cell. Experimental Cell

Research, v. 78, n. 1, p. 127-135, 1973.

TAKAGI, N.; SASAKI, M. Preferential inactivation of the paternally derived X

chromosome in the extraembryonic membranes of the mouse. Nature, v. 256, p.

640-642, 1975.

TAKAGI, N. Imprinted X-chromosome inactivation: enlightenment from embryos in

vivo. Seminars in Cell & Development Biology, v. 14, p. 319-329, 2003.

TELFORD, N.A.; WATSON, A.J.; SCHULTZ, G.A. Transition from maternal to embryonic

control in early mammalian development: a comparison of several species.


TIFFIN, G.J.; RIEGER, D.; BETTERIDGE, K.J.; YADAV, B.R.; KING, W.A. Glucose and

glutamine metabolism in pre-attachment cattle embryos in relation to sex and

stage of development. Journal of Reproduction and Fertility, v. 93, n. 1, p. 125-

132, 1991.

110

VOGEL, F.; MOTULSKY, A. Gene action: genetic diseases. In: Human genetics, 3rd ed.

New York: Springer, p. 257-360, 1997.

WATANABE, Y.F.; WATANABE, M.R.; GALERANI, M.A.V.; VILA, R.A.; LÔBO, R.B. The

influence of B2 and a modified CR2 medium on the in vitro production of bovine

embryos with cumulus and oviduct co-culture. Theriogenology, v. 51, n. 1, p. 259,

1999.

WEE, G.; KOO, D.B.; SONG, B.S.; KIM, J.S.; KANG, M.J.; MOON, S.J.; KANG, Y.K.; LEE,

K.K.; HAN, Y.M. Inheritable histone H4 acetylation of somatic chromatins in

cloned embryos. The Journal of Biological Chemistry, v. 281, n. 9, p. 6048-6057,

2005.

WENGER, R.H. Mammalian oxygen sensing, signaling, and gene regulation. Journal

of Experimental Biology, v. 203, n. 8, p. 1253-1263, 2000.

WEST, J.D.; FRELS, W.I.; CHAPMAN, V.M.; PAPAIOANNOU, V.E. Preferential expression

of the maternally derived X chromosome in the mouse yolk sac. Cell, v. 12, n. 4, p.

873-882, 1977.

WESTHUSIN, M.E.; PRYOR, J.H.; BONDIOLI, K.R. Nuclear transfer in the bovine embryo:

a comparison of 5-day, 6-day, frozen-thawed, and nuclear transfer donor

embryos. Molecular Reproduction and Development, v. 28, n. 2, p. 119-123, 1991.

WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; MCWHIR, J.; KING, A.J.; CAMPBELL, K.H.S. Viable offspring

derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, v. 385, p. 810-813, 1997.

WILMUT, I.; BEAUJEAN, N.; De SOUSA, P.A.; DINNYES, A.; KING, T.J.; PATERSON, L.A.;

WELLS, D.N. YOUNG, L.E. Somatic cell nuclear transfer. Nature, v. 419, p. 583-586,

2002.

WRENZYCKI, C.; HERRMANN, D.; CARNWATH, J.W.; NIEMANN, H. Alterations in the

relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos

111

cultured in medium supplemented with either serum or PVA. Molecular

Reproduction and Development, v. 53, p. 8-18, 1999.

WRENZYCKI, C.; HERRMANN, D.; KESKINTEPE, L.; MARTINS Jr, A.; SIRISATHIEN, S.;

BRACKETT, B.; NIEMANN, H. Effects of culture systems and protein

supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.

Human Reproduction, v. 16, n. 5, p. 893-901, 2001.

WRENZYCKI, C.; LUCAS-HAHN, A.; HERRMANN, D.; LEMME, E.; KORSAWE, K.; NIEMANN,

H. In vitro production and nuclear transfer affect dosage compensation of the X-

linked gene transcripts G6PD, PGK, and Xist in preimplantation bovine embryos.

Biology of Reproduction, v. 66, p. 127-134, 2002.

XIAO, C.; TSUCHIYA, K.; SUTOU, S. Cloning and mapping of bovine ZFX gene to the

long arm of the X-chromosome (Xq34) and homologous mapping of ZFY gene to

the distal region of the short arm of the bovine (Yp13), ovine (Yp12-p13), and

caprine (Yp12-p13) Y chromosome. Mammalian Genome, v. 9, n. 2, p. 125-130,

1998.

XUE, F.; TIAN, X.C.; DU, F.; KUBOTA, C.; TANEJA, M.; DINNYES, A.; DAI, Y.; LEVINE, H.;

PEREIRA, L.V.; YANG, X. Aberrant patterns of X chromosome inactivation in

bovine clones. Nature Genetics, v. 31, p. 216-220, 2002.

YADAV, B.R.; KING, W.A.; BETTERIDGE, K.J. Relationship between the completion of

first cleavage and the chromosomal complement, sex, and developmental rates

of bovine embryos generated in vitro. Molecular Reproduction and

Development, v. 36, n. 4, p. 434-439, 1993.

YODER, J.A.; BESTOR, T.H. Genetic analysis of genomic methylation patterns in plants

and mammals. Biological Chemistry, v. 377, n. 10, p. 605-610, 1996.

Documents

Giovana Krempel Fonseca Merighe - USP · 2007. 12. 11. · no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear. / Giovana Krempel Fonseca Merighe