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CHRISTIAN DOMBROWSKI
GÉNÉRATION ET CARACTÉRISATION D’ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGÉS CONTRE LA PROTÉINE FMR1 ET LEUR UTILISATION POUR LE
DIAGNOSTIC DU SYNDROME X-FRAGILE
Thése présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph. D.)
Département de biologie médicale
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
JUILLET 2003
© Christian Dombrowski, 2003
Résumé Le syndrome X-fragile, la première cause de retard mental héréditaire, est causé dans la majorité des cas par l’expansion d’une séquence répétée située dans la région 5’ non-traduite du gène FMR1. Cette expansion entraîne l’inactivation du gène et l’absence des protéines FMR1 (6 isoformes) est directement responsable des phénotypes observés chez les patients. L’anticorps monoclonal 1C3, disponible depuis près d’une décennie, a permis l’étude de la protéine sous tous ses aspects ou presque. Cependant, il a été montré récemment que cet anticorps détecte aussi la protéine homologue FXR1. La contribution de cette réaction croisée au signal observé n’a pas été quantifiée mais représente probablement une proportion faible mais non négligeable selon la technique utilisée. Nous avons utilisé deux techniques en parallèle pour obtenir de nouveaux anticorps. Tout d’abord, nous avons tenté la sélection de fragments d’anticorps par la technologie du “phage display”. Nous avons aussi entrepris la création de nouveaux hybridomes en injectant la protéine FMR1 purifiée à des souris Balb/C. Nous avons obtenu 23 lignées d’hybridomes parmi lesquelles 4 types d’anticorps différents ont été identifiés. La caractérisation de ces anticorps a débuté par l’identification de leur classe d’IgG et la chaîne lègère utilisée. Nous avons aussi vérifié leur spécificité et identifié l’épitope reconnu. L’anticorps produit par l’hybridome 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant compte tenu de sa spécificité et de la possibilité de le purifier. Nous avons évalué son efficacité en immunobuvardage, en immunofluorescence, en immunohistochimie, en ELISA et en immunoprécipitation. L’anticorps 14D3 s’est avéré un excellent anticorps pour toutes ces techniques à l’exception de l’immunoprécipitation. Certains de nos résultats diffèrent des travaux effectués avec l’anticorps 1C3. Cette différence est peut-être attribuable à la différence de spécificité des anticorps ou au fait que l’épitope reconnu par notre anticorps peut être absent de certaines isoformes. Nous avons aussi utilisé les anticorps 14D3 et 11F7 pour préparer un test de dosage par ELISA-sandwich. L’ELISA a été mis au point sur la protéine purifiée. Les tests effectués sont reproductibles et la précision de la courbe standard est excellente (R2 > 0.98).
II
Avant-propos
Je voudrais tout d’abord remercier le Dr François Rousseau de m’avoir permis de réaliser ce projet au sein de son équipe, pour la grande latitude qu’il m’a laissée quant aux directions prises au cours de mes recherches et à l’optimisme qu’il a conservé pour nous deux malgré les nombreuses incertitudes.
J’aimerais exprimer ma gratitude à Mme Dominique Heitz pour l’aide et le support qu’elle m’a apportés au cours de ces années et la rigueur scientifique qu’elle a su m’inculquer. Je voudrais aussi la remercier sincèrement pour l’aide qu’elle a apportée à la rédaction de cette thèse.
Merci à M. Richard Réhel pour bien des services dont la liste serait trop longue pour paraître dans cette page.
J’aimerais remercier le Dr John Wilkins de l’Université du Manitoba et particulièrement son assistante Mme Patricia Jean Sauder pour la création des hybridomes et une coopération hors du commun.
Merci à M. Jean-Sébastien Côté pour les nombreuses immunohistochimies, la préparation d’extraits de tissus, et conséquemment toutes les souris euthanasiées au profit de la science.
Merci au Dr. Edouard W. Khandjian et à Mme Sandra Tremblay pour le surnageant 1C3, les peptides FXR1 et les multiples lignées cellulaires qu’ils m’ont généreusement fournies.
Merci à M. Marc Bronsard pour son aide lors des nombreuses utilisations du microscope ainsi que pour la saisie des images.
Merci à toutes les personnes de l’Unité de Recherche en Génétique Humaine et Moléculaire qui ont fait de ce doctorat une partie de plaisir plutôt qu’une corvée. Comme quoi il est possible de faire de la recherche sans toujours se prendre au sérieux.
Finalement, je voudrais remercier le Fonds FCAR et le Dr. François Rousseau pour le soutien financier de ce doctorat.
III
Table des matières
RÉSUMÉ ..........................................................................................................................................................................I AVANT-PROPOS .......................................................................................................................................................... II TABLE DES MATIÈRES.......................................................................................................................................... III TABLE DES ILLUSTRATIONS...............................................................................................................................VI LISTE DES TABLEAUX........................................................................................................................................VIII LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................................................................IX LISTE DES UNITÉS ET DES MESURES.......................................................................................................... XII LIGNÉES CELLULAIRES UTILISÉES .............................................................................................................XIII LIGNÉES BACTÉRIENNES UTILISÉES ...........................................................................................................XIII 1 INTRODUCTION .............................................................................................................................................. 1
1.1 HISTORIQUE................................................................................................................................................. 2 1.2 PHÉNOTYPES (MANIFESTATIONS CLINIQUES) ............................................................................................... 3 1.3 PRÉVALENCE ............................................................................................................................................... 4 1.4 MODE DE TRANSMISSION ............................................................................................................................. 6 1.5 MUTATION................................................................................................................................................... 6
1.5.1 Classification.......................................................................................................................................... 7 1.5.2 Stabilité et transmission ......................................................................................................................... 9
1.6 LE GÈNE FMR1.......................................................................................................................................... 11 1.6.1 Conservation parmi les espèces ........................................................................................................... 11 1.6.2 L’épissage ............................................................................................................................................ 12 1.6.3 Expression tissulaire ............................................................................................................................ 13
1.6.3.1 Hybridation Northern ..................................................................................................................................13 1.6.3.2 Hybridation in situ.......................................................................................................................................13
1.7 GÈNES HOMOLOGUES FXR1/FXR2 ........................................................................................................... 16 1.7.1 Expression ARNm................................................................................................................................. 16
1.8 LA PROTÉINE FMR1 .................................................................................................................................. 17 1.8.1 Domaines fonctionnels ......................................................................................................................... 19
1.8.1.1 Domaines de liaison à l’ARN......................................................................................................................19 1.8.1.2 NES et NLS.................................................................................................................................................24 1.8.1.3 Domaine d’homo/hétérodimérisation ..........................................................................................................25
1.9 ANTICORPS ANTI-FMR1 ET ÉTUDES D’EXPRESSION................................................................................... 26 1.10 FONCTION DE LA PROTÉINE........................................................................................................................ 28 1.11 LA SOURIS “KNOCK-OUT” ......................................................................................................................... 30 1.12 PROTÉINES FXR1/FXR2............................................................................................................................ 32
1.12.1 Expression et localisation de FXR1/FXR2 ...................................................................................... 34 1.13 PARTENAIRES CELLULAIRES ...................................................................................................................... 35 1.14 LE DIAGNOSTIC.......................................................................................................................................... 37
1.14.1 Hybridation Southern ...................................................................................................................... 37 1.14.2 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ............................................................................. 38 1.14.3 Détection de la protéine .................................................................................................................. 39
1.15 LE PHAGE DISPLAY .................................................................................................................................... 42 1.15.1 Introduction ..................................................................................................................................... 42 1.15.2 Phages filamenteux.......................................................................................................................... 43 1.15.3 Banque d’anticorps ......................................................................................................................... 46
1.16 OBJECTIFS DU PROJET DE DOCTORAT ......................................................................................................... 48 2 MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................................................. 50
IV
2.1 LA BANQUE GRIFFIN.1 ............................................................................................................................... 51 2.1.1 Construction de la banque ................................................................................................................... 51 2.1.2 Vecteur pHEN2 .................................................................................................................................... 53
2.2 PRODUCTION DE LA PROTÉINE FMR1 DANS UN SYSTÈME D’EXPRESSION BACTÉRIEN................................ 54 2.2.1 Préparation de cellules électrocompétentes......................................................................................... 55 2.2.2 Transformation par électroporation .................................................................................................... 56 2.2.3 Vérification de la présence et de l’orientation de l’insert.................................................................... 57 2.2.4 Production du plasmide d’intérêt......................................................................................................... 58 2.2.5 Production de la protéine et test de solubilité...................................................................................... 58 2.2.6 Mini-gel de polyacrylamide 8 % (SDS-PAGE) .................................................................................... 60 2.2.7 Immunobuvardage................................................................................................................................ 61 2.2.8 Production et purification de la protéine FMR1 recombinante ........................................................... 62
2.3 SÉLECTIONS AVEC LA BANQUE GRIFFIN.1.................................................................................................. 65 2.3.1 Croissance de la banque ...................................................................................................................... 65 2.3.2 Croissance des banques secondaires ................................................................................................... 67 2.3.3 Première sélection sur Immunotubes™ ................................................................................................ 67 2.3.4 Préparation des phages........................................................................................................................ 69 2.3.5 Production de fragments d’anticorps solubles..................................................................................... 70
2.4 DOT-BLOT.................................................................................................................................................. 72 2.5 HYBRIDOMES............................................................................................................................................. 73
2.5.1 Immunisation........................................................................................................................................ 73 2.5.2 Fusion................................................................................................................................................... 74
2.6 CARACTÉRISATION DES ANTICORPS ........................................................................................................... 74 2.6.1 Purification des anticorps .................................................................................................................... 75 2.6.2 Spécificité ............................................................................................................................................. 75 2.6.3 Immunoprécipitation ............................................................................................................................ 76 2.6.4 Immunofluorescence............................................................................................................................. 78 2.6.5 Immunohistochimie .............................................................................................................................. 80 2.6.6 Cartographie des épitopes ................................................................................................................... 81
2.6.6.1 Purification phénol/chloroforme des digestions ..........................................................................................82 2.6.6.2 Précipitations à l’alcool ...............................................................................................................................82
2.6.7 ELISA ................................................................................................................................................... 84 2.7 COMPOSITION DES TAMPONS ..................................................................................................................... 86
3 RÉSULTATS .................................................................................................................................................... 89 3.1 PRODUCTION DE LA PROTÉINE ET TEST DE SOLUBILITÉ .............................................................................. 90 3.2 PURIFICATION DE LA PROTÉINE RECOMBINANTE........................................................................................ 92 3.3 PHAGE DISPLAY ......................................................................................................................................... 94 3.4 ANTICORPS MONOCLONAUX ...................................................................................................................... 98
3.4.1 Immunisation des souris Balb C femelles............................................................................................. 98 3.4.2 Caractérisation des anticorps ............................................................................................................ 100
3.4.2.1 Spécificité..................................................................................................................................................100 3.4.2.2 Classe ........................................................................................................................................................102 3.4.2.3 Immunobuvardage.....................................................................................................................................102 3.4.2.4 Production et purification d’anticorps .......................................................................................................103 3.4.2.5 Immunoprécipitation .................................................................................................................................105 3.4.2.6 Immunofluorescence .................................................................................................................................107 3.4.2.7 Immunohistochimie...................................................................................................................................109 3.4.2.8 Cartographie des épitopes..........................................................................................................................118 3.4.2.9 ELISA .......................................................................................................................................................121
4 DISCUSSION.................................................................................................................................................. 123 4.1 PRODUCTION DE LA PROTÉINE ................................................................................................................. 125 4.2 PHAGE DISPLAY ....................................................................................................................................... 127 4.3 PRODUCTION D’ANTICORPS MONOCLONAUX ........................................................................................... 131 4.4 IMMUNOFLUORESCENCE .......................................................................................................................... 132 4.5 IMMUNOHISTOCHIMIE.............................................................................................................................. 133
V
4.6 CARTOGRAPHIE DES ÉPITOPES ................................................................................................................. 135 4.7 ELISA-SANDWICH ET DIAGNOSTIC.......................................................................................................... 137 4.8 PERSPECTIVES.......................................................................................................................................... 139
5 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................... 142
VI
Table des illustrations
Figure 1: Pedigree artificiel d’une famille où on retrouve le syndrome X-fragile. .........................5 Figure 2: Représentation schématique des domaines fonctionnels de la protéine FMR1 par
rapport aux exons les codant. .................................................................................................21 Figure 3: Comparaison des séquences protéiques entre les protéines FMR1, FXR1 et FXR2......33 Figure 4: Représentation du processus de sélection de fragments d’anticorps par la technique du
“phage display”. ....................................................................................................................44 Figure 5: Structure du bactériophage M13. ...................................................................................45 Figure 6: Représentation des différents types de fragments d’anticorps pouvant être exprimés à la
surface de phages pour la sélection en phage display. ...........................................................47 Figure 7: Construction du répertoire de chaînes lourdes et légères et vecteurs utilisés pour leur
clonage. .................................................................................................................................52 Figure 8: Vecteur pHEN2 dans lequel ont été clonées les portions VH -VL pour la création de la
banque Griffin.1. ....................................................................................................................53 Figure 9: Vecteur pQE31. ..............................................................................................................55 Figure 10: Montage pour l’électroélution de protéines à la suite d’une électrophorèse sur gel
d’acrylamide préparatif. .........................................................................................................64 Figure 11: Cinétique de la production de la protéine FMR1 dans la souche M15 sur une période
de 6 heures suivant l’induction à l’IPTG et test de solubilité dans différents tampons de lyse.................................................................................................................................................91
Figure 12: Immunobuvardage avec l’anticorps 1C3 sur différentes dilutions d’un lysat de cellules
produisant la protéine FMR1 recombinante. .........................................................................92 Figure 13: Résultat de la purification des protéines recombinantes par électroélution. ...............94 Figure 14: Immunobuvardages avec les scFvs obtenus après la sélection avec les peptides issus
des protéines FXR1 et FMR1.................................................................................................97 Figure 15: Résultats du criblage des anticorps sur des extraits de lignées de cellules normales et
X-fragile effectué par immunobuvardage. .............................................................................99 Figure 16: Immunobuvardage démontrant la spécificité des anticorps monoclonaux 14D3 et 1C3.
..............................................................................................................................................101
VII
Figure 17: Immunobuvardage sur des extraits de tissus murins sauvages. ..................................103 Figure 18: Résultat de la purification des anticorps 14D3 sur colonne de protéine-L agarose. .104 Figure 19: Immunoprécipitation de la protéine FMR1 endogène avec l’anticorps 14D3. ..........106 Figure 20: Immunofluorescence sur des cellules HeLa. .............................................................108 Figure 21: Immunohistochimies sur des coupes de cerveau de souris sauvages avec l’anticorps
14D3 purifié. ........................................................................................................................110 Figure 22: Immunohistochimies sur des coupes de testicules de souris normales. .....................111 Figure 23: Immunohistochimies sur des coupes d’intestin, de colon et de poumon de souris
normales. ..............................................................................................................................112 Figure 24: Immunohistochimies sur des coupes de rein, de foie et de rate de souris normales. .113 Figure 25: Immunohistochimies sur des coupes d’œsophage et d’estomac de souris normales. 114 Figure 26: Immunohistochimies sur des coupes de coeur et de muscles squelettiques de souris
normales. ..............................................................................................................................115 Figure 27: Contrôles négatifs des immunohistochimies sur des tissus de souris normales. ........116 Figure 28: Représentation schématique des fragments utilisés pour la cartographie des épitopes.
..............................................................................................................................................118 Figure 29: Résultats de la cartographie des épitopes par immunobuvardage. .............................119 Figure 30: Courbe standard pour la quantification de la protéine FMR1 tronquée par ELISA-
sandwich...............................................................................................................................122
VIII
Liste des tableaux
Tableau 1: Niveau d’expression comparatif de l’ARNm du gène Fmr1 dans les tissus d’une
souris adulte............................................................................................................................15 Tableau 2: Amorces utilisées pour l’amplification de fragments PCR ayant servi à la production
de peptides pour la cartographie des épitopes........................................................................84 Tableau 3: Résultats de l’isotypage d’un anticorps de chaque type obtenu.................................102 Tableau 4: Résultats de la cartographie des épitopes des 22 hybridomes...................................120 Tableau 5: Ratio de la densité optique (D.O.) à 450 nm de l’échantillon divisé par la D.O. du 0 en
fonction de la quantité de protéine FMR1 recombinante.....................................................122
IX
Liste des abréviations
a.a. : acides aminés
A : Alanine
D : Acide aspartique
E : Acide glutamique
G : Glycine
H : Histidine
I : Isoleucine
N : Asparagine
P : Proline
R : Arginine
S : Sérine
T : Thréonine
Bases de l’ADN:
A : Adénine
C : Cytosine
G : Guanine
T : Thymidine
N : N’importe quel nucléotide
ADN : Acide déoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
Amp : Ampicilline
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : ARN messager
BrEt : Bromure d’éthidium
BSA : Albumine de sérum bovin
CDR : Région hypervariable (Complementary determining region)
X
CGDN : Réseau canadien sur les maladies génétiques
D.O. : Densité optique
DMEM : Milieu Eagle modifié de Dulbeco
DNTP : Déoxynucléotide triphosphate
EDTA : Acide éthylènediamine tétraacétique
ELISA : Immunoessais enzymatique (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
Fab : Fragment d’anticorps
Fc : Fragment constant
FITC : Isothiocyanate de fluorescéine
FMR1 : Fragile X Mental Retardation 1
Fv : Fragment variable
FXR1 : Fragile X Related 1
FXR2 : Fragile X Related 2
GAM : Anticorps anti-souris de chèvre (goat anti-mouse)
HBSS: Solution saline balancée de Hank
HCl : Acide chloridrique
IPTG : Isopropylthiogalactoside
K-0 : Knock-out
Kan : Kanamycine
KH : K Homology
LB : Milieu de culture Luria
MAb : Anticorps monoclonal
MCS : Site de clonage multiple
MNT : Mâles normaux transmetteurs
mRNP: Ribonucléoprotéine messagère
NaCl : Chlorure de sodium
NES : Signal d’exportation nucléaire (Nuclear Export Signal)
Ni : Nickel
NLS : Signal de localisation nucléaire (Nuclear Localisation Signal)
NTA : Acide nitrilotriacetique
p : Bras court du chromosome
XI
p.c. : Post-conception
PAGE : Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
pb : Paire de bases
PBS : Tampon phosphate salin
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)
PEG : Polyéthylène glycol
PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
PSA : Persulfate d’ammonium
q : Bras long du chromosome
RBS : Site d’attachement des ribosomes
RMGA:Réseau sur les Maladies Génétiques Appliquées
RMN : Résonnace magnétique nucléaire
RNAse:Ribonucléase
RNP : Ribonuléoprotéine
RPM : Rotation par minute
RT : Transcripase inverse (reverse transcriptase)
SAM : Anticorps anti-souris de brebis (sheep anti-mouse )
ScFv: : Fragment variable sur une seule chaine (single-chain fragment variable)
SDS : Sodium dodécyl sulfate
SNC : Système nerveux central
TAE : Tampon de migration Tris-acide acétique-EDTA
TMB : Tetraméthyl benzidine
U : Uracile
UV : Ultra-violet
VH : Chaîne lourde
VL : Chaîne légère
XII
Liste des unités et des mesures
Ω : ohms
A : ampère
M (méga) = 106 b : base
k (kilo) = 103 Da : Dalton (g/mole)
c (centi) = 10-2 F : Faraday
m (milli) = 10-3 g : gramme
µ (micro) = 10-6 L : Litre
n (nano) = 10-9 m : mètre
p (pico) = 10-12 M : Molaire (mole/L)
f (femto) = 10-15 mole : 1023 molécules
sec : seconde
V : volt
CC : Centimètre cube = 1 millilitre
g : Constante gravitationnelle = 9.8 m/s2
S : Coefficient de sédimentation
oC : Degré Celcius
XIII
Lignées cellulaires utilisées
C2C4 : Lignée myoblastique de muscles murins
COS : Lignée de cellules de rein simiesque (Singe vert d’Afrique)
HeLa : Adénocarcinome humain
875 A : Lignée lymphoblastique humaine normale (Banque du RMGA)
GM 09145 : Lignée lymphoblastique humaine X-fragile (Coriell Cell Repository)
Sp2/O : Myélome de souris (non-sécréteur)
Lignées bactériennes utilisées
TG1 :(K12, del(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F'traD36, proA+B+, lacIq,
lacZdelM15)
HB2151 :(K12, ara, del(lac-pro), thi/F'proA+B+, lacIq, lacZdelM15)
M15 :(K12, Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+,
Lon+)
XL1Blue :(F’::Tn10 proA+B+lacIq ∆(lacZ) M15/recA1, endA1, gyrA96, (Nalr) thi
hsdR17 (rk-mk+)gln V44 relA1 lac)
1 INTRODUCTION
2
1.1 Historique
Bien avant l’avènement de la biologie moléculaire, la transmission du matériel
génétique a été étudiée en suivant des traits physiques caractéristiques tels
ceux décrits dans les travaux de Gregor Johann Mendel. Ce dernier a établi les
lois de la ségrégation génétique (publiées en 1866 dans les Comptes Rendus de
la Société des Sciences Naturelles de Brno) permettant d’expliquer la
transmission de caractères physiques et introduisant les concepts de
dominance et de récessivité. Ces lois sont demeurées les fondements de la
génétique moderne et expliquent la majorité des transmissions génétiques.
Cependant, en 1943, J. Martin et J. Bell ont identifié un désordre lié au
chromosome X présentant une ségrégation non conforme aux lois de Mendel
(Martin and Bell 1943). Ces chercheurs ont étudié deux générations d’une
famille où se trouvaient onze individus atteints de retard mental qui
présentaient des traits physiques communs. La maladie fut désignée sous le
nom de syndrome de Martin-Bell jusqu’en 1969, année où Lubs observa chez
les sujets atteints un site fragile à l’extrémité du bras long du chromosome X
qu’il nomma FRAXA (FRAgile chromosome X site A) (Lubs 1969). Ce site fragile
peut être visualisé sur les chromosomes en métaphase de mâles atteints de
retard mental ainsi que chez les femmes porteuses obligatoires de la même
famille. On conserva la notion de fragilité pour nommer le syndrome. Quelques
années plus tard, Sutherland démontra que les sites fragiles s’induisaient dans
des conditions de culture où l’acide folique où la thymidine était absents
(Sutherland 1977). Le site fut localisé en Xq27.3 en 1985 (Krawczun et al.
1985).
3
1.2 Phénotypes (manifestations cliniques)
Bien qu’il soit la première cause de retard mental héréditaire, le syndrome X-
fragile demeure un désordre difficile à identifier car les personnes atteintes
présentent une très grande variabilité phénotypique, y compris à l’intérieur
d’une même famille. Le retard mental présent chez la majorité des garçons
atteints est habituellement de modéré à profond mais certains patients
présentant un retard léger ont aussi été observés.
Au niveau physique, les caractéristiques les plus courantes chez les mâles
atteints sont la macroorchidie (augmentation du volume des testicules), les
pieds plats, un faciès allongé, une mâchoire et des oreilles proéminentes (70 %
des patients). On retrouve aussi une hyperlaxité des articulations (plus
particulièrement celles des doigts), une voûte de palais arquée, des anomalies
cardiaques et bien d’autres phénotypes plus rares (Hagerman et al. 1991;
Hagerman 1996). Les caractéristiques physiques reliées au syndrome
apparaissent au cours de l’enfance et s’accentuent après la puberté (tel le
macroorchidisme). Ainsi, elles sont moins souvent utilisées pour le diagnostic
de la maladie qui est habituellement posé avant la puberté car l’enfant atteint
présentera un retard d’apprentissage et certains des comportements énumérés
ci-dessous.
Au niveau comportemental, les personnes atteintes souffrent d’hyperactivité, de
difficultés d’attention, de l’écholalie et des problèmes d’élocution (Hagerman et
al. 1991; Hagerman 1996). On retrouve aussi certains comportements
normalement associés à l’autisme tel le contact visuel fuyant, battement et
morsure des mains, mais aucune corrélation n’a été trouvée entre l’autisme et
le syndrome X-fragile (Fisch 1993).
4
Le syndrome affecte aussi les femmes mais de façon plus modérée car elles
possèdent deux chromosomes X. L’un des deux chromosomes est inactivé de
façon aléatoire et cette inactivation se traduit par l’abolition de l’expression de
la majorité des gènes du chromosome. Le gène normal est donc exprimé dans
des proportions variables de cellules réduisant ainsi la sévérité des phénotypes
habituellement observés (Abrams et al. 1994; Reiss et al. 1995). De plus, une
étude a démontré une inactivation préférentielle des allèles mutés dans les
cellules sanguines de femmes adultes, suggérant un processus de sélection
favorisant les allèles qui expriment le gène normal (Rousseau et al. 1991).
Les femmes présentent donc des phénotypes plus modérés que les hommes
tant au niveau physique qu’intellectuel. Les caractéristiques physiques chez la
femme sont rarement assez prononcées pour permettre de poser le diagnostic.
On retrouve du retard mental chez 52 % à 82 % de ces femmes mais à un degré
moindre que chez l’homme atteint. Les comportements ressemblant à l’autisme
chez l’homme font place à de la dépression et des problèmes d’ordre sociaux
chez la femme. Parmi les plus fréquents on retrouve de la gène, de l’anxiété
sociale, une communication inadéquate, une baisse du contact visuel et le
désordre d’hyperactivité de déficit d’attention. (Abrams et al. 1994; Reiss et al.
1995)
1.3 Prévalence
Compte tenu du caractère variable des phénotypes, les premières estimations
de la prévalence du syndrome X-fragile furent basées sur la méthode
cytogénétique de visualisation du site fragile. Cependant, cette méthode ne
permettait pas d’identifier tous les porteurs de la mutation, et la présence d’un
autre site fragile en Xq28 fut responsable d’une surestimation de la prévalence
(Sutherland and Baker 1992). Depuis l’identification de la mutation
5
responsable de la maladie, une estimation plus fiable a pu être produite et
l’incidence est maintenant évaluée à 1 garçon atteint sur 4000 (Murray et al.
1996; Turner et al. 1996; Imbert et al. 1998). De cette incidence, celle des
femmes atteintes peut être déduite à 1 sur 6500-8000.
I
IV V II III
9 % 5 %
50 %
XI XII
28 %
40 %
VI VII VIII IX X
0 % 16 %
XIII XIV
40 %
0 %
16 %
Figure 1: Pedigree artificiel d’une famille où on retrouve le syndrome X-fragile.
Le pourcentage se retrouvant sous les symboles représente la fréquence de retard mental à chaque génération. D’après Nussbaum and Ledbetter (1986) Chaque membre du pedigree est identifié par le chiffre romain à la gauche. Femmes et hommes (MNT) porteurs d’une prémutation
Femmes et hommes atteints
6
1.4 Mode de transmission
Selon les publications, le syndrome X-fragile fut qualifié comme un désordre
dominant ou récessif lié au chromosome X. En considérant que seulement une
portion des femmes porteuses du gène muté sont affectées par un retard léger
ou modéré, certains auteurs ont qualifié le désordre comme étant récessif par
défaut. D’un autre côté, si le désordre était dominant, tous les hommes seraient
atteints. Or, 20 % des hommes porteurs de la mutation sont phénotypiquement
normaux (Sherman et al. 1984; Sherman et al. 1985).Ces porteurs sains sont
nommés MNT (mâles normaux transmetteurs: Figure 1, individu V). Ainsi, le
syndrome X-fragile peut être qualifié de dominant à pénétrance incomplète. Son
mode de transmission est particulier car les MNT ont toujours des enfants
sains mais leurs petits-enfants (nés de fille(s) de MNT (Figure 1, individus XIII
et XIV)) auront un risque élevé d’être atteints du syndrome, un phénomène
connu sous la dénomination de “Paradoxe de Sherman” (Sherman et al. 1984).
1.5 Mutation
La lumière se fit sur le paradoxe de Sherman lors de la découverte du
mécanisme mutationel inusité responsable de la maladie: une mutation
dynamique. Ce type de mutation se caractérise par l’allongement d’une
séquence répétée instable lors de sa transmission. L’expansion d’une répétition
de trinucléotide CGG associée au syndrome X-fragile est le premier cas décrit
de ce type de mutation (Kremer et al. 1991; Oberle et al. 1991; Verkerk et al.
1991; Vincent et al. 1991; Yu et al. 1991). Depuis la découverte des mutations
dynamiques, plusieurs maladies y ont été associées telles l’ataxie de Friedreich
(Campuzano et al. 1996), la maladie de Huntington (Huntington Disease
Collaborative Research Group 1993), la dystrophie myotonique (Mahadevan et
7
al. 1992; Brook et al. 1992), les ataxies spinocérébelleuses de type 1, 3, 6 et 7
(Koide et al. 1994; Kawaguchi et al. 1994; Zhuchenko et al. 1997; Lindblad et
al. 1996) et les atrophies musculaire spinobulbaire (La Spada et al. 1991) et
dentatorubrale-pallidoluysienne (Koide et al. 1994).
1.5.1 Classification
Les répétitions de CGG sont très polymorphiques dans la population générale et
l’étude de leur structure a amené une catégorisation selon le nombre de triplets
et leur stabilité.
A) La première catégorie d’allèles comprend les répétitions de longueur
normale dont le nombre de triplet se situe entre 6 et 54. Les répétitions
sont composées en moyenne de 29 ou 30 triplets selon les populations
étudiées (Fu et al. 1991; Yu et al. 1991). La portion supérieure (40-54
triplets) de cette catégorie constitue une sous-division, une “zone grise”
(intermédiaire) un peu moins stable qui pourrait bien être la source des
prémutations.
B) Les allèles prémutés composent la seconde catégorie. Leurs répétitions
sont faites de 55 à environ 200 triplets. La dénomination “prémutation”
vient du fait que ces allèles précèdent l’apparition des mutations
complètes. Elles ne provoquent aucun état pathologique chez l’homme
mais une augmentation du nombre de ménopause précoce est observé
chez les femmes porteuses (Schwartz et al. 1994; Turner et al. 1994;
Murray et al. 1998; Allingham-Hawkins et al. 1999; Uzielli et al. 1999).
Ce phénotype est toutefois absent chez les femmes atteintes du
syndrome.
8
C) Finalement, on retrouve les mutations complètes qui sont des répétitions
dont la longueur excède 200-230 triplets. L’expansion des prémutations
en mutations complètes s’effectuent uniquement via la transmission
maternelle. Ce qui caractérise particulièrement la mutation complète,
hormis sa longueur, est la présence d’une hyperméthylation des
répétitions elles-mêmes ainsi que de l’îlot CpG tous deux situés dans la
région 5’ du gène FMR1.
Cette méthylation fut d’abord détectée à la suite de la digestion de l’ADN de
patients X-fragile à l’aide d’enzymes de restriction coupant rarement et inhibées
par la méthylation (Bell et al. 1991; Heitz et al. 1991; Verkerk et al. 1991;
Vincent et al. 1991; Hornstra et al. 1993). Ce sont d’ailleurs ces digestions qui
permirent de mettre en évidence l’allongement de l’ADN associé au désordre. La
méthylation s’effectuant dans une région régulatrice du gène FMR1, il fut
postulé qu’elle pourrait être responsable de l’inactivation du gène observée lors
d’une étude d’expression de l’ARN messager chez des patients X-fragile (Pieretti
et al. 1991). D’ailleurs, une corrélation inverse entre le taux de méthylation
des répétitions et de l’îlot CpG et la production de la protéine FMR1 a été
observée chez des patients ayant une mutation complète pas ou partiellement
méthylée (Loesch et al. 1993; McConkie-Rosell et al. 1993; Hagerman et al.
1994; Rousseau et al. 1994b; Feng et al. 1995; Smeets et al. 1995; de Vries et
al. 1996; Wang et al. 1996). Ces études suggèrent aussi que la sévérité du
phénotype serait liée au taux de méthylation et que les différents patrons de
méthylation pourraient expliquer la variabilité phénotypique observée.
Récemment, une équipe a démontré que la méthylation des îlots CpG entraînait
la condensation de la chromatine à la suite de la déacétylation des histones 3 et
4 (Coffee et al. 1999). Cette condensation empêcherait les facteurs de
transcription de se lier au promoteur du gène FMR1 (Drouin et al. 1997;
9
Schwemmle et al. 1997) provoquant son inactivation. L’implication du gène
FMR1 dans le syndrome X-fragile fut pleinement confirmée par l’identification
de patients dont les phénotypes X-fragile étaient causés par une mutation
ponctuelle (De Boulle et al. 1993; Lugenbeel et al. 1995; Wang et al. 1997) ou
par une délétion partielle ou totale du gène FMR1 (Gedeon et al. 1992; Wohrle
et al. 1992; Tarleton et al. 1993; Albright et al. 1994; Gu et al. 1994; Meijer et
al. 1994; Trottier et al. 1994; Hirst et al. 1995; Prior et al. 1995; Quan et al.
1995; Gronskov et al. 1997; Hammond et al. 1997; Wolff et al. 1997).
1.5.2 Stabilité et transmission
Les répétitions de longueur normale sont généralement transmises de façon
stable mais il arrive parfois que de légères instabilités soient observées
(Zhong et al. 1996; Mogk et al. 1998 ; Sullivan et al. 2002)(Rousseau et al.
résultats non-publiés). Ces instabilités sont des variations (expansions ou
délétions) de quelques triplets qui sont sans conséquences. La zone grise a
été identifiée comme telle parce qu’elle constitue une zone un peu plus
instable. L’expansion d’un allèle de la zone normale en mutation complète
n’a jamais été observée. Par contre, il est possible que les petites expansions
conduisent éventuellement à la transformation des allèles normaux en allèle
prémutés bien que cela n’aie pas été prouvé encore.
La frontière entre les allèles normaux et prémutés (55 triplets) est basée sur
la probabilité d’expansion de la répétition en mutation complète. La frontière
entre la prémutation et la mutation complète est l’apparition de la
méthylation (≅ 200-230 triplets). Ces deux limites ne sont pas précises et
sont basées sur les observations effectuées sur la stabilité des prémutations
dans les familles où l’on retrouve le syndrome X-fragile. Lors de sa
transmission, la prémutation est rarement stable et son potentiel
d’expansion est directement proportionnel au nombre de triplets qui la
10
compose (Fu et al. 1991; Heitz et al. 1992). Les personnes ayant une
prémutation ont habituellement un nombre de triplets supérieur à celui du
parent transmetteur augmentant ainsi les chances, pour les femmes, de
transmettre une mutation complète à la génération suivante (Figure 1 p.5,
individus IV, VIII et XII (femmes) et individus II, VI et XI (hommes)). Ce
phénomène est similaire à l’anticipation génétique où la sévérité d’un
désordre s’accentue dans les générations subséquentes, une situation
classique pour les maladies à triplets. Cependant, les hommes prémutés
(Fig. 1, individu V) ou atteints du syndrome ne transmettent jamais une
mutation complète (Willems et al. 1992; Rousseau et al. 1994b) car il
semblerait y avoir un processus de sélection durant la spermatogénèse en
faveur des spermatozoïdes ayant une prémutation, donc produisant la
protéine (Hori et al. 1993; Reyniers et al. 1993).
Compte tenu que les femmes sont moins affectées que les hommes par le
syndrome, il arrive que l’on observe la transmission de mutations complètes.
Celles-ci sont instables lors de leur transmission et contrairement aux
autres types d’allèles, sont aussi instables au niveau somatique (qu’elles
proviennent de la transmission d’une prémutation ou d’une mutation
complète). Cette instabilité serait limitée au début du développement
embryonnaire, avant la méthylation des répétititons. Plusieurs croient
d’ailleurs que la méthylation sert à stabiliser l’expansion des mutations
complètes. L’instabilité somatique se présente sous la forme de mosaïcisme
de taille chez les patients atteints du syndrome, c’est-à-dire la coexistence de
mutations complètes méthylées et de répétitions plus courtes non-
méthylées. Les études démontrent que 15 à 40 % des porteurs de mutations
complètes sont des mosaïques de taille (Devys et al. 1992; Heitz et al. 1992;
Snow et al. 1993; Kaplan et al. 1994; Nolin et al. 1994; von Koskull et al.
1994), un certain nombre de leur cellules ayant soit une prémutation (Nolin
et al. 1994; Pintado et al. 1995) ou un allèle de longueur normale (Snow et
al. 1993; de Graaff et al. 1995; Hirst et al. 1995; Mila et al. 1996). Dans les
11
cellules porteuses de ces répétitions plus courtes, le gène est exprimé et la
protéine est produite normalement, ce qui pourrait expliquer une partie de
la variabilité phénotypique. On retrouve aussi des mosaïques de
méthylation, des patients dont les mutations sont partiellement méthylées
ou pas du tout. La proportion de mutations non-méthylées varie de 10 à 100
% et les individus ayant plus de 60 % de leur mutation non-méthylées
présentent en général une intelligence normale (McConkie-Rosell et al. 1993;
Reyniers et al. 1993: Loesch et al. 1993; Hagerman et al. 1994; Rousseau et
al. 1994b; Feng et al. 1995; Smeets et al. 1995; de Vries et al. 1996; Wang et
al. 1996). Les différents patrons de méthylation pourraient aussi expliquer
une partie de la variabilité phénotypique observée.
1.6 Le gène FMR1
La séquence répétée dont l’expansion est associée au syndrome X-fragile se
trouve dans la région 5’ non-traduite de l’exon 1 du gène FMR1 (Fragile X
Mental Retardation 1). Le gène fut localisé en 1991 (Verkerk et al. 1991) juste
après la mutation dynamique. L’étude de sa structure révéla qu’il est composé
de 17 exons répartis sur 38 kb (Eichler et al. 1993; Eichler et al. 1994).
1.6.1 Conservation parmi les espèces
Le gène FMR1 a été bien conservé durant l’évolution comme le démontrent les
différents orthologues caractérisés chez la souris (Ashley et al. 1993b), le poulet
(Price et al. 1996), Xenopus laevis (Siomi et al. 1995) et tout récemment chez la
drosophile (Wan et al. 2000). Les séquences en acides aminés produites par le
gène murin, celui du poulet et celui de la grenouille sont identiques à 97 %,
12
86 % et 31 % à la séquence humaine respectivement. Quant à la drosophile,
son gène présente des similitudes tant avec FMR1 qu’avec ses deux homologues
qui seront discutés plus tard. Cette conservation démontre bien l’importance
que doit avoir la protéine pour la cellule, bien que son absence ne soit pas
létale.
1.6.2 L’épissage
Chez l’humain, le transcrit primaire du gène normal a une longueur observée
de 4.4 kb en hybridation Northern alors que théoriquement il devrait avoir 3.9
kb, soit une région 5’ non-traduite d’environ 200 pb (varie selon le nombre de
triplets), une région codante de 1.9 kb et une région 3’ non-traduite de 1.8 kb
(Verkerk et al. 1991; Eichler et al. 1993) mais cette différence n’a pu être
expliquée. Le transcrit primaire peut subir un épissage alternatif important et
des études par RT-PCR ont démontré la présence de transcrits dont les exons
12 et 14 étaient épissés (Ashley et al. 1993b; Verkerk et al. 1993a; Verkerk et
al. 1993b). De plus, l’étude de la séquence nucléotidique a permis d’identifier
des sites accepteurs d’épissage alternatif supplémentaires dans les exons 10
(Eichler et al. 1993), 15 et 17 (Ashley et al. 1993b; Eichler et al. 1993; Verkerk
et al. 1993b; Sittler et al. 1996). Ainsi, le nombre d’ARNs messagers distincts
possibles s’élève jusqu’à 48! Vingt-quatre de ces messagers ont été caractérisés
par RT-PCR mais rien ne prouve qu’ils soient traduits en protéines. L’épissage
de l’exon 12 et les différents sites accepteurs ne modifient pas la séquence en
acides aminés contrairement à l’épissage de l’exon 14 qui génère une nouvelle
extrémité carboxy-terminale (Ashley et al. 1993b; Sittler et al. 1996).
L’abondance des différents messagers, analysée par RT-PCR, varie selon les
tissus observés mais aucun n’est spécifique à un tissu particulier (Verkerk et
al. 1993b).
13
1.6.3 Expression tissulaire
L’expression du messager du gène FMR1/Fmr1 (4.4 kb) a été étudiée par
hybridation Northern et in situ afin d’identifier quels tissus et structures
exprimaient le gène. Ces études ont aussi permis de faire des liens entre
l’absence d’expression du gène et les différents phénotypes observés chez les
patients X-fragile. Ces études ont été effectuées sur des tissus d’embryons
humains et sur des souris (foetus et adulte) dont la protéine Fmr1 présente une
très grande homologie de séquence à l’orthologue humain.
1.6.3.1 Hybridation Northern
Les études effectuées par hybridation Northern ont démontré que le messager
de 4.4 kb est fortement exprimé dans le cerveau et les testicules humains, deux
organes affectés par le syndrome X-fragile. Une forte expression est aussi
détectée dans les poumons, le placenta, le foie et les reins alors que dans le
pancréas, le coeur et les muscles squelettiques elle est absente ou inférieure à
la limite de détection de la technique (Hinds et al. 1993). On retrouve des
résultats similaires chez la souris (Bachner et al. 1993a; Khandjian et al. 1995).
1.6.3.2 Hybridation in situ
Une étude par hybridation in situ a été effectuée sur des coupes d’embryons
humains agés de 8, 9 et 25 semaines par Abitbol et al (1993). Les structures
exprimant le messager dans le système nerveux central (SNC) sont impliquées
dans les processus de motivation, d’apprentissage et de la mémoire (tel le
noyau basal magnocellulaire). Ces résultats pourraient expliquer certaines
phénotypes de retard mental observés chez les patients.
14
En général, les résultats obtenus suggèrent que FMR1 pourrait jouer un rôle
majeur dans le développement compte tenu de la nature quasi-ubiquiste de
l’expression du gène durant cette période (Abitbol et al. 1993; Hanzlik et al.
1993). Le fait que le messager soit exprimé dans les cellules en prolifération et
en migration du SNC confère un rôle crucial au gène FMR1 pour les derniers
stades de développement du SNC (migration et maturation cellulaire).
Chez la souris, les mêmes types de résultats ont été obtenus par Hinds et al
(1993). Les auteurs mentionnent que dans certains tissus tel le cerveau, le gène
n’est plus exprimé partout vers la fin du développement mais devient restreint à
certaines cellules. L’expression perd son caractère ubiquiste pour devenir plus
spécifique. Fait intéressant, après 14 et 19 jours de gestation, le muscle
cardiaque exprime clairement Fmr1 alors que dans le coeur adulte, celui-ci est
absent. On peut émettre l’hypothèse que ce soit en lien avec le développement
incomplet du coeur et que dans les stades ultimes de la myogénèse, la protéine
Fmr1 cesse d’être exprimée pour laisser place aux superformes de l’homologue
Fxr1 comme il a été démontré dans les cellules de muscles squelettiques C2C4
(Khandjian et al. 1998). Cela pourrait expliquer les problèmes cardiaques de
certains patients X-fragile. Les niveaux d’expression relatifs du gène Fmr1 dans
les différents tissus sont compilés dans le tableau 1 à la page suivante.
Deux études réalisées par Bachner et al (1993a, 1993b) portant sur l’expression
du gène dans les gonades lors du développement montrent que le gène Fmr1 est
exprimé de façon marquée dans les testicules et les ovaires. Dans les testicules
immatures de souris agées d’une semaine, l’expression du gène est homogène
dans tous les tubules. Le signal devient plus hétérogène avec les semaines
suivantes pour devenir restreint à la périphérie des tubules où se trouvent les
spermatogonies de type A1 (3e semaine). Cette expression continue de
diminuer au cours des semaines subséquentes pour ne devenir qu’un faible
15
signal vers la 17e semaine. Ceci correspond à l’activité proliférative des
spermatogonies de type A1, progénitrices de tous les autres types de
spermatogonies nécessaires à la spermatogénèse (Bachner et al. 1993a;
Bachner et al. 1993b). Dans les testicules, les auteurs rapportent des niveaux
d’expression de Fmr1 30-40 fois plus élevés que dans les autres tissus étudiés
et suggèrent que la forte expression du gène pourrait expliquer le processus de
sélection à l’origine de la présence de prémutations dans le sperme de patients
X-fragile.
Tableau 1: Niveau d’expression comparatif de l’ARNm du gène Fmr1 dans les tissus d’une souris adulte. Tiré de Hinds et al. (1993).
Tissus Niveaux d’expression
Cerveau Cervelet, couche granulaire +++ Hippocampe, couche granulaire +++ Cortex cérébralet habenula ++
Testicules Tubules séminifères +++ Œsophage Épithélium ++++ Thymus Cortex ++++
Medulla +++ Rate Pulpe rouge ++
Pulpe blanc +++ Ovaires Follicule +++
Yeux Rétine +++ Épithélium de la lentille ++ Épithélium des paupières ++ Épithélium de la cornée +
Colon ++ Utérus ++
Thyroïde + Foie + Rein +
Poumons + Coeur - Aorte -
Muscle -
16
1.7 Gènes homologues FXR1/FXR2
La recherche de séquences homologues au gène FMR1 dans des banques
d’ADNc de cerveau foetal humain et murin a conduit à la découverte du gène
FXR1 (Fragile X Related 1), cartographié sur la région chromosomique 3q28
chez l’homme (Coy et al. 1995) ainsi q’une forme sans introns de ce gène
(pseudogène) en 12q12 (Coy et al. 1995; Siomi et al. 1995). Un orthologue du
gène FXR1 a aussi été identifié chez Xenopus laevis (Siomi et al. 1995). Aussi,
une protéine homologue interagissant avec la protéine FMR1 a été identifiée
avec le système double-hybride de la levure. Cette protéine est codée par le gène
FXR2 qui est localisé sur le chromosome 17 humain en position 17p13.1
(Zhang et al. 1995; Wilgenbus et al. 1996) et son orthologue a été caractérisé
chez la souris. Aucun orthologue de ces deux protéines n’a été identifié chez la
drosophile, suggérant que le gène dFMR1 serait l’ancêtre commun des trois
membres de cette nouvelle famille de protéines chez les organismes plus
complexes.
1.7.1 Expression ARNm
Les études par RT-PCR sur le messager de FXR1 ont démontré que, tout comme
FMR1, le gène FXR1 est soumis a un épissage alternatif (Siomi et al. 1995)
produisant jusqu’à 7 isoformes distinctes (Kirkpatrick et al. 1999). Les
messagers sont fortement exprimés dans le coeur humain et les muscles
squelettiques et plus faiblement dans les autres tissus (coeur, placenta,
poumon, foie, reins et pancréas) (Coy et al. 1995). Il n’y a que très peu
d’information disponible sur le gène FXR2, le messager a 3.1 kb et il n’a pas été
déterminé si des isoformes pouvaient exister mais on détecte deux protéines
différentes par immunobuvardage (Zhang et al. 1995).
17
Des études par hybridation in situ ont été effectuées pour Fxr1 chez la souris.
Durant l’embryogénèse (11.5 jours post-conception), l’expression la plus forte
se trouve dans le SNC. À 12.5 jours p.c., l’expression est remarquable dans les
futures gonades et après 14.5 jours elle devient plus marquée dans les muscles
squelettiques (muscles intercostaux, abdominaux, muscle de la langue). Vers la
fin de l’embryogénèse, l’expression se limite aux couches en division active du
cerveau alors que les neurones différenciés ne l’expriment plus (Coy et al.
1995).
1.8 La protéine FMR1
La traduction de la séquence codante de FMR1 donne une protéine de 632
acides aminés ayant un poids moléculaire théorique de 69 kDa (Ashley et al.
1993b). L’outil de choix pour l’étude des protéines est l’anticorps qui permet
leur visualisation in situ, dans des extraits protéiques par immunobuvardage
ou tout simplement leur immunoprécipitation avec leurs partenaires cellulaires
lorsque cela est possible. Les anticorps sont habituellement produits sous
forme monoclonale à partir de la rate de souris immunisées (et parfois de rats),
ou sous forme polyclonale dans le sérum de lapins.
Dans le cas de la protéine FMR1, la tâche n’a pas été aisée car la séquence
protéique est extrèmement bien conservée parmi les mammifères. Chez le lapin,
on obtient un mélange d’anticorps ayant des affinités pour différentes portions
de la protéine ce qui augmente les chances de réussite. Par contre, chez la
souris, l’obtention de monoclonaux est plus délicate. La souris possède une
protéine Fmr1 dont l’homologie atteint 97 % avec l’orthologue humain, la souris
ne produira donc pas des anticorps de forte affinité qui pourraient créer une
réaction autoimmune. De plus, les protéines homologues FXR1 et FXR2
présentent aussi une bonne homologie de séquences avec la protéine FMR1,
18
augmentant les chances de réactions croisées. Malgré ces obstacles, deux
équipes ont réussi à produire des anticorps polyclonaux (Verheij et al. 1993;
Verheij et al. 1995) et monoclonaux (Devys et al. 1993).
L’utilisation de ces anticorps en immunobuvardage permet de détecter un
ensemble de 6 protéines dont les poids moléculaires se situent entre 70 et 80
kDa. De plus, l’immunobuvardage d’un gel en 2 dimensions effectué par
Khandjian et al. (1995) a révélé que 10 isoformes distinctes se dissimulaient
dans les 6 bandes observées précédemment. Il est plausible que les
nombreuses isoformes observées soient produites à la suite de l’épissage
alternatif mentionné antérieurement. Une tentative d’identification des
isoformes a été effectuée à l’aide de constructions permettant la production de
protéines tronquées (Sittler et al. 1996). L’expérience consistait à mimer
l’épissage alternatif déduit de la séquence nucléotidique du gène puis à
comparer les protéines tronquées aux isoformes endogènes par
immunobuvardage. Cependant, les résulats ne permettent pas de tirer de
conclusions puisqu’il est possible que les formes endogènes aient subies des
modifications post-traductionnelles telles la glycosylation et/ou la
phosphorylation. Ainsi, le poids moléculaire apparent des protéines endogènes
n’est pas uniquement fonction de la séquence protéique. Il est donc impossible
de conclure que les protéines FMR1 produites dans les bactéries et les
protéines endogènes possèdent la même séquence protéique en se basant
uniquement sur le fait qu’elles présentent un poids moléculaire apparent
identique.
Certains auteurs ont aussi émis l’hypothèse qu’un regroupement de résidus
acides retrouvé dans la séquence pourrait ralentir la mobilité de la protéine lors
de sa migration dans un gel d’acrylamide, lui donnant un poids moléculaire
apparent plus élevé que celui attendu (Siomi et al. 1993b).
19
L’absence de ces protéines dans des extraits de lymphocytes immortalisés de
patients X-fragile confirma que les protéines observées étaient bien issues du
gène FMR1 puisqu’elles étaient présentes dans les lignées de lymphocytes
normaux (Devys et al. 1993; Verheij et al. 1993).
1.8.1 Domaines fonctionnels
L’étude de l’expression du messager du gène FMR1 a démontré une implication
directe avec les phénotypes retrouvés chez les patients X-fragile mais n’a pas
éclairé la communauté scientifique sur son rôle dans la cellule. Les différents
motifs identifiés dans la séquence protéique, sont les premiers indices obtenus
quant à la fonction de la protéine même si son caractère quasi-ubiquiste
suggérait déjà un rôle de base. La recherche de séquences consensus réalisée
sur la protéine a permis d’identifier des domaines de liaison à l’ARN (Siomi et
al. 1993b; Brown et al. 1998), un signal d’exportation cytoplasmique et une
séquence de localisation nucléaire (Eberhart et al. 1996). La position des
domaines fonctionnels ainsi que les exons par lesquels ils sont codés sont
schématisés dans la figure 2 à la page suivante.
1.8.1.1 Domaines de liaison à l’ARN
1.8.1.1.1 Domaines KH
Les domaines KH (K Homology) ont été identifiés pour la première fois sur la
protéine hnRNP K, une protéine liant l’ARN messager au niveau du noyau et
impliqué dans son transport et sa maturation (Siomi et al. 1993a). La protéine
FMR1 possède deux domaines KH situés au coeur de sa séquence protéique.
(KH1 = a.a. 212-266 KH2 = a.a. 285-328) L’importance fonctionnelle des
20
domaines KH fut confirmée par l’identification d’une mutation ponctuelle dans
le KH2 changeant une isoleucine très conservée par une asparagine (I304N)
causant un phénotype X-fragile très sévère (De Boulle et al. 1993). L’étude
tridimensionnelle de ce domaine KH muté par résonnance magnétique
nucléaire (RMN) a révélé qu’il ne se repliait pas correctement (Musco et al.
1996) entraînant une détérioration de sa capacité de liaison in vitro à des
homopolymères d’ARN en présence de hautes concentrations de sel (Siomi et al.
1994; Verheij et al. 1995). Cependant, une autre étude a démontré que dans
des conditions salines physiologiques, la protéine mutée conserve une bonne
capacité de liaison à l’ARN (Brown et al. 1998). Il semblerait plutôt que la
mutation nuise à l’interaction protéine-protéine lui permettant de s’associer
aux polysomes [Feng et al. 1997].
Récemment, Adinofi et al (1999) ont disséqué les différents domaines de la
protéine FMR1 afin d’identifier quelles portions pouvaient lier des
homopolymères d’ARN. La protéine a été disséquée en portion N-terminale
(Figure 2, fragment 1), plus le domaine KH1 (fragment 2), les domaines KH1
(fragment 3) et KH2 (fragment 4) seuls, les deux ensembles (fragment 5), le
domaine KH2 plus l’exon 14 (fragment 6) et finalement la portion C-terminale
comprenant les trois derniers exons (fragment 7).
21
NES RGG
516
NLS KH1 KH2
632 422 446 280 204 a.a. 1
3 4 6 2 65 1 Exons
1
7
6
5
4
3
2
Figure 2: Représentation schématique des domaines fonctionnels de la protéine FMR1 par rapport aux exons les codant. Les barres horizontales sous les exons représentent les fragments générés par Adinolfi et al. (1999 ) pour l’étude de la liaison à l’ARN par les différents domaines de la protéine FMR1. a.a.: acides aminés, N: bout amino-terminal, NLS: Signal de localisation nucléaire, KH : K Homology, NES: Signal d’exportation cytoplasmique, RGG: Boîte RGG et C: bout carboxy-terminal.
Les résultats obtenus sont très surprenants puisque la seule portion de la
protéine ne liant pas l’ARN est le second domaine KH. Les études par
spectroscopie RMN ont démontré que ce domaine ne se repliait pas
correctement et c’est pourquoi les auteurs ont vérifié:
1) une construction contenant le domaine KH2 et la séquence en aval
comprenant l’exon 14
2) une construction comprenant les deux domaines KH.
C
N2
5 8 9 10 11 1 13 14 1 1 17 7
22
Dans le premier cas, le peptide n’était pas du tout replié alors que dans l’autre
seul le domaine KH1 était replié correctement. Les auteurs concluent donc que
le domaine KH2 ne se comporte pas comme une entité se repliant
indépendamment mais aurait besoin d’autres structures pour adopter un
arrangement tridimensionnel lui permettant d’exercer sa fonction. De manière
surprenante, la portion N-terminale démontre une affinité pour les
homopolymères d’ARN malgré l’absence de séquence consensus de liaison à
l’ARN. Elle aurait aussi une tendance à former des aggrégats ce qui
confirmerait les observations faites par Siomi et al qui rapportent
l’homodimérisation de la protéine FMR1 via une portion de 40 acides aminés
situés entre les résidus 171 et 211 (Siomi et al. 1996). Finalement, la portion C-
terminale de la protéine est aussi en mesure de lier l’ARN et cette liaison serait
médiée par la boîte RGG discutée dans la section suivante.
1.8.1.1.2 La boîte RGG Les connaissances accumulées sur l’activité de liaison à l’ARN de la protéine
FMR1 ont longtemps laissé supposer que la spécificité de cette liaison s’effectue
par les domaines KH. Cette liaison se trouve renforcée par une séquence riche
en arginine (R) et en glycine (G) dans la portion C-terminale nommée boîte RGG
(a.a. 527-552) (Siomi et al. 1993b). Celle-ci fut identifiée à l’origine dans des
protéines nucléaires et nucléolaires liant l’ARN (Kiledjian and Dreyfuss 1992;
Dreyfuss et al. 1993). Dans le cas de la protéine FMR1, la boîte RGG possède
une activité de liaison qui lui est propre (Adinolfi et al. 1999) (Fig. 2 fragment 7)
et ce domaine est très important pour la liaison à l’ARN car il a été montré que
la protéine FMR1 dont la boîte RGG est tronquée, mais dont les deux domaines
KH demeurent intacts ne possède plus d’affinité pour l’ARN (Siomi et al. 1993b;
Brown et al. 1998). Il en va de même pour l’isoforme dont l’exon 14 est épissé
créant une portion carboxy-terminale différente (Brown et al. 1998).
23
1.8.1.1.3 La liaison à l’ARN La protéine FMR1 a donc tout ce qu’il lui faut pour lier l’ARN. Tel que
mentionné précédemment, la protéine est en mesure de lier des homopolymères
d’ARN in vitro avec une préférence pour les poly (G): poly G > poly U > poly C ≅
poly A (Ashley et al. 1993a; Siomi et al. 1993b; Siomi et al. 1994; Adinolfi et al.
1999). Évidemment, on ne retrouve pas de très long homopolymères in vivo
mais il a été montré que la protéine est capable de lier son propre messager
(Ashley et al. 1993a; Brown et al. 1998) via un quatuor de purine dans la
portion 3’ au niveau de la séquence codant pour la boîte RGG (Schaeffer et al.
2001). De plus, la protéine FMR1 serait capable de lier 4 % des messagers
exprimés au cerveau (Ashley et al. 1993a).
Des travaux sont actuellement en cours afin d’identifier d’éventuels autres
messagers pouvant lier la protéine FMR1:
- À l’aide d’une forme biotinylée de la protéine capturée par la suite sur
une colonne de streptavidine (Sung et al. 2000) ou sur des billes
magnétiques couplées à la streptavidine (Brown et al. 1998).
- En comparant la population d’ARNm entre des lignées lymphoblastoïdes
normales et X-fragile (Jin et al. 2000).
- Par immunoprécipitation du complexe comprenant FMR1 et les
messagers associés à partir d’extraits de cerveau murin (Brown et al.
2000; Brown et al. 2001).
24
1.8.1.2 NES et NLS
Alors qu’ils étudiaient les différentes isoformes possiblement traduites à la suite
de l’épissage alternatif, Sittler et al (1996) ont remarqué que la protéine FMR1
sans l’exon 14 se retrouvait dans le noyau tandis que la forme complète se
retrouvait majoritairement dans le cytoplasme (Devys et al. 1993). Cette
divergence s’explique par la présence d’un signal d’exportation cytoplasmique
(NES: Nuclear Export Signal) dans l’exon 14 (Eberhart et al. 1996). Différentes
constructions avec des formes tronquées de l’exon 14 permirent d’identifier les
17 premiers acides aminés de cet exon comme étant nécessaires et suffisants à
l’exportation cytoplasmique de la protéine FMR1. L’étude de la séquence (Fridell
et al. 1996) révéla une forte similitude avec le NES des protéines Rev (Fischer et
al. 1995) et PKI (Wen et al. 1995) spécialement au niveau de 3 leucines très
conservées. Bardoni et al (1997)ont démontré l’importance de ces leucines en
les remplaçant par des sérines, ce qui abolissait l’exportation et résultait en
une localisation nucléaire de la protéine.
Cette localisation nucléaire des protéines FMR1 sans l’exon 14 ou ayant un
NES muté suggérait fortement la présence d’un signal de localisation nucléaire
(NLS: Nuclear Localisation Signal). Toutefois, les études portant sur la séquence
protéique ne révélèrent aucune séquence consensus de NLS. Des groupes de
résidus arginine et lysine sont présents dans les 184 premiers acides aminés de
FMR1 et ces acides aminés basiques (24 en tout) sont aussi conservés chez la
souris, le poulet et Xenopus laevis (Ashley et al. 1993b; Siomi et al. 1995; Price
et al. 1996) et pourraient constituer un nouveau type de NLS. Des études de
transfection ont restreint la zone du NLS potentiel aux résidus 115 à 150
comme étant suffisant pour confiner une protéine dans le noyau (Eberhart et
al. 1996; Bardoni et al. 1997). Les auteurs mentionnent cependant que les
séquences entourant cette région pourraient servir à renforcer l’activité de
localisation nucléaire.
25
1.8.1.3 Domaine d’homo/hétérodimérisation
L’utilisation du système double-hybride dans la levure a permis de mettre en
évidence pour la première fois une protéine interagissant avec la protéine FMR1
(Zhang et al. 1995). Cette protéine est l’homologue FXR2 et cette étude
démontra aussi que la protéine FMR1 ainsi que ses homologues FXR1 et FXR2
(discutés dans la section suivante) peuvent s’hétérodimériser ainsi que
s’homodimériser. Afin d’identifier la région responsable de cette association,
Siomi et al (1996)ont préparé des constructions dont certaines régions des
portions amino et carboxy-terminale de FMR1 étaient délétées puis ont vérifié
leur association avec FXR2 in vitro. La région située entre les acides aminés 171
et 211 de la protéine FMR1 est suffisante pour son interaction avec FXR2 et les
régions correspondantes sur FXR1 et FXR2 leur permettent de s’associer avec
FMR1. Cette région est une séquence codée par l’exon 7, suggérant que
l’interaction entre ces protéines ne nécessite pas la liaison à l’ARN. De plus,
Adinolfi et al (1999) ont remarqué qu’un peptide comprenant la portion amino-
terminale de la protéine FMR1 (a.a. 1-204) formait des aggrégats in vitro
appuyant l’observation précédente.
La même année, Tamanini et al (1999) ont observé l’interaction de ces protéines
entre elles in vivo lors de la surexpression de l’une de ces trois protéines dans
des cellules COS. Ils ont aussi montré que l’interaction de la forme transfectée
de FMR1 sans l’exon 14 avec les protéines FXR1 et FXR2 endogènes est
suffisante pour la rapatrier dans le cytoplasme. Cependant, les résultats
obtenus dans les homogénats de cellules HeLa et de lignées lymphoblastoïdes
suggèrent que les hétérodimères n’existent peut-être pas in vivo et que
l’interaction observée in vitro et in vivo dans les cellules surexprimant les
protéines résulterait uniquement de la présence d’un domaine coil-coil (a.a.
171-211) similaire sur les trois protéines. Ce type de domaine régit les
interactions protéine-protéine et il est possible que la similarité de ces
domaines soit suffisante pour qu’ils interagissent entre eux lorsqu’ils sont en
26
excès. La protéine mutée (I304N) est en mesure de s’hétérodimériser avec les
homologues mais il est intéressant de noter qu’elle est incapable de
s’homodimériser (Laggerbauer et al. 2001). Il est plausible que la dimérisation
de FMR1 soit nécessaire à sa fonction ou à son incorporation dans les
polysomes.
1.9 Anticorps anti-FMR1 et études d’expression
L’expression tissulaire de la protéine FMR1 a été principalement étudiée grâce à
l’anticorps monoclonal 1C3 (autrefois appelé mAb 1a) produit par Devys et al
(1993) et aux anticorps polyclonaux de Verheij et al (1993). Devys et al ont
préparé différentes constructions comprenant la portion amino-terminale ou la
séquence complète de la protéine FMR1 dans des vecteurs eucaryotes et
procaryotes. Des corps d’inclusion comprenant la forme complète ou la portion
N-terminale purifiée ont été injectés à des souris Balb C et des lapins. Deux
anticorps polyclonaux et 4 monoclonaux furent obtenus et leur spécificité
vérifiée par immunobuvardage. Le meilleur anticorps, 1a, a ensuite été utilisé
pour étudier l’expression de la protéine FMR1 sur des tissus humains.
Dans le cerveau, la protéine est exprimée dans les neurones du cortex ainsi que
dans le cervelet au niveau des cellules de Purkinje. Dans les axones, FMR1 se
retrouve dans la portion proximale et les dendrites. Dans tous les tissus
épithéliaux examinés, les auteurs ont observé une expression décroissante de
la couche de cellules en division active vers les cellules plus différenciées. Ce
gradient a aussi été constaté dans l’oesophage, l’estomac et le petit intestin.
Dans les testicules, la protéine est exprimée dans les spermatogonies de type
A1 alors que les cellules plus matures ne l’expriment pas. Finalement, la
protéine FMR1 est absente du coeur, des muscles squelettiques et des muscles
lisses.
27
Fait intéressant à noter, suite à une blessure, la protéine est produite dans des
tissus en réparation qui normalement ne produisent pas FMR1 chez l’adulte. La
protéine recommence aussi à être exprimée dans des cellules de rein dont la
prolifération est induite suite à leur infection par le virus SV40 (Khandjian et al.
1995). Au niveau intracellulaire, la protéine est exprimée dans le cytoplasme
des cellules en culture (HeLa) ou de celles des tissus étudiés (neurones, cellules
de Purkinje et spermatogonies)(Devys et al. 1993).
L’anticorps monoclonal 1C3 a aussi été utilisé par Khandjian et al. (1995) pour
étudier la distribution de la protéine FMR1 dans l’organisme murin. Cette étude
a été effectuée par immunobuvardage sur des homogénats de différents
organes. En bref, les mêmes cellules des tissus mentionnés précédemment chez
l’humain expriment la protéine Fmr1. Cependant, dans le coeur et les muscles
squelettiques, deux formes ayant un mobilité réduite ont été détectées. Ces
deux protéines furent identifiées par la suite comme étant des superformes de
la protéine Fxr1 exprimées dans le muscle et les spermatocytes et produisant
une réaction croisée avec l’anticorps 1C3 (Khandjian et al. 1998).
L’expression chez la souris a aussi été étudiée par immunohistochimie. Au
cours du développement, l’expression de Fmr1 débute deux jours après la
conception (stade 8 cellules). Après 9 jours la majorité des cellules de l’embryon
expriment la protéine dans leur cytoplasme. Cette expression atteint son apogée
chez les embryons ayant entre 11 et 13 jours pour ensuite décroître et devenir
plus spécifique. Finalement, chez les embryons ayant entre 15 et 19 jours,
l’expression reste élevée uniquement dans les neurones et les gonades (de Diego
Otero et al. 2000). Chez la souris adulte, le patron d’expression ressemble à
celui observé chez l’humain dans les neurones au niveau des dendrites et dans
les cellules de Purkinje. Au niveau des gonades, la protéine Fmr1 est exprimée
dans le cytoplasme des ovules et des spermatogonies (Bakker et al. 2000; de
Diego Otero et al. 2000). La protéine est absente du muscle squelettique selon
les résultats de Khandjian et al. (1998). Cependant, c’est dans cette étude qu’ils
28
démontraient que l’anticorps détecte les superformes de la protéine Fxr1 et
cette réaction croisée a peut-être empêché la visualisation des rares protéines
Fmr1.
1.10 Fonction de la protéine
A priori, l’identification de domaines de liaison à l’ARN sur la protéine FMR1 et
sa capacité à lier des homopolymères d’ARN et des ARNm (dont son propre
messager) suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans le métabolisme de
l’ARN. De plus, la protéine possède un signal d’exportation cytoplasmique et
une activité de localisation nucléaire retrouvés sur des protéines naviguant
entre le noyau et le cytoplasme. Elle pourrait bien être impliquée dans le
transport d’ARNm du noyau vers la machinerie de traduction. En effet, la
protéine FMR1 est associée avec les polyribosomes en traduction active (Corbin
et al. 1997; Feng et al. 1997) mais jamais avec les ribosomes seuls
contrairement à ce que le laissaient croire les premières études de
fractionnement sur gradient de sucrose (Khandjian et al. 1996; Siomi et al.
1996; Tamanini et al. 1996).
Le traitement des polyribosomes avec de la RNAse démontra que l’association
de la protéine FMR1 aux polyribosomes se faisait via une interaction avec
l’ARNm ou avec une protéine liant l’ARN (Siomi et al. 1996; Tamanini et al.
1996). Cette association fut confirmée en traitant les polyribosomes avec de
l’EDTA. Ce produit a pour effet de dissocier les ribosomes en sous-unités,
relâchant ainsi les mRNPs (Particules RiboNucléiques Messagères) associées.
Les complexes dissociés furent ensuite incubés en présence d’une matrice
d’oligo d(T)-cellulose, poly(U)-sépharose ou latex-oligo d(T). La protéine FMR1,
relâchée dans une mRNP de plus de 600 kDa, se retrouva dans les fractions
liées aux différentes matrices démontrant qu’elle, ou ses partenaires, liait
29
l’ARNm poly (A)+ (Corbin et al. 1997; Feng et al. 1997). Aussi, lorsque les
cellules en culture sont soumises à des conditions minimales de survie, toutes
les protéines FMR1 détectables sont associées avec les polyribosomes. C’est une
preuve in vivo compatible avec la possibilité que FMR1 soit un gène domestique
tel que suggéré par Heitz et al (1991) et fortement appuyée par l’expression
quasi-ubiquiste de la protéine. Finalement, la forme mutante (I304N) est
incapable de s’incorporer aux polyribosomes démontrant l’importance de
l’intégration de FMR1 dans les mRNPs pour qu’elle exerce son rôle.
L’association de la protéine FMR1 avec les polyribosomes suggère qu’elle
pourrait avoir un rôle à jouer dans la régulation de la traduction de certains
ARNm. Effectivement, il a été montré que la protéine Fmr1 se trouvait dans les
préparations de réticulocytes de lapin permettant de traduire des séquences
nucléotidiques en peptides in vitro et que les protéines FMR1 ajoutées aux
réticulocytes se trouvaient incorporées dans les mRNPs du système (Tamanini
et al. 1996). Or, Li et al (2001) ont constaté que l’ajout en excès de FMR1 dans
un tel système provoquait une inhibition de la traduction de certains ARNm
spécifiques. Plus encore, cette inhibition est effective uniquement avec les
messagers pouvant s’associer avec la protéine FMR1 in vitro. La délétion des
extrémités 3’ non-traduites, où se lie la protéine, est suffisante pour lever cette
inhibition. La stabilité des ARNm n’étant pas affectée, il semble que la simple
liaison de FMR1 soit à l’origine de l’inhibition.
Laggerbauer et al (2001) ont aussi observé les mêmes résultats mais ont poussé
plus loin leurs investigations. Premièrement, selon eux, l’inhibition de la
traduction ne serait pas due à une séquence spécifique sur le messager. En
second lieu, l’inhibition est vraiment une caractéristique intrinsèque de la
protéine FMR1 puisque d’autres protéines possèdant des domaines KH et liant
l’ARN n’ont pas cet effet. Troisièmement, la protéine mutante (I304N) n’exerce
pas d’effet inhibiteur suggèrant que l’incorporation dans les polyribosomes
serait nécessaire à l’inhibition de la traduction. Quatrièmement, les auteurs ont
30
vérifié cette inhibition ex vivo en injectant la protéine et ses ARNm cibles dans
des oocytes de Xenopus laevis. Encore une fois, ils ont constaté une baisse
remarquable de la traduction de ces messagers qui n’est pas observée avec la
protéine mutante.
Selon les données recueillies, la présence de la protéine FMR1 interfèrerait avec
l’initiation de la traduction en empêchant l’assemblage du complexe ribosomal
80S (Laggerbauer et al. 2001). Il est toutefois improbable que ce soit le cas dans
un contexte cellulaire normal puisque la protéine se retrouve associée aux
polyribosomes en traduction active où l’on retrouve de multiples unités 80S. La
protéine FMR1 pourrait aussi servir de séquestrateur d’ARNm dans l’attente
d’un signal pour leur transport jusqu’à la machinerie de traduction. Il ne faut
cependant pas exclure certains types cellulaires (tel les neurones) où la protéine
FMR1 pourrait être en excès ce qui entrainerait une inhibition subséquente de
la traduction de messagers spécifiques, dont le sien, créant une boucle de
rétroaction négative.
1.11 La souris “knock-out”
Un des outils puissants de la biologie moléculaire pour l’étude de la fonction
d’un gène consiste à utiliser un modèle animal chez lequel le gène à l’étude est
inactivé (knock-out). Le mammifère le plus couramment utilisé est la souris et
ce modèle convient parfaitement au syndrome X-fragile car la séquence
protéique murine est identique à 97 % à celle humaine.
La souris “knock-out” pour le gène Fmr1 a été produite en 1994 par un
consortium de chercheurs belges et hollandais. L’insertion d’une cassette
néomycine par recombinaison homologue dans l’exon 5 du gène Fmr1,
empêchant l’expression de la protéine intégrale, a permis de recréer les
phénotypes observés chez les patients X-fragile (Consortium 1994). Le
31
dysmorphisme facial n’est pas remarquable mais la macroorchidie est évidente
chez les souris k-o mâles adultes. Au niveau comportemental, les souris
démontrent de l’hyperactivité et des difficultés d’apprentissage.
À l’origine, des tests permirent de démontrer un certain retard mental chez ces
souris (mémoire spatiale), confirmé par la suite par d’autres équipes (D'Hooge
et al. 1997: Kooy et al. 1996). Cependant, les résultats furent contestés sur la
base du profil génétique par Paradee et al (1999) qui croisèrent la souris knock-
out originale (profil 129) à une souris de profil C57BL/6 pendant plus de 15
générations. Ils observèrent que les souris k-o issues de ces croisements
performaient presque normalement aux tests utilisés avec la souris k-o
originale. Cette observation a été aussi faite par Dobkin et al (2000) mais sur
des tests différents et suggère que ces tests ne sont pas parfaitement au point
pour évaluer et comparer l’intelligence des souris X-fragile.
Malgré tout, ces modèles animaux ont permis de comprendre certains aspects
physiologiques du syndrome X-fragile. Tout d’abord, il a été démontré que les
épines dendritiques des souris k-o étaient anormalement longues, minces et
tortueuses (Comery et al. 1997), des caractéristiques d’épines immatures
observées précédemment sur les cadavres de patients X-fragile (Rudelli et al.
1985; Hinton et al. 1991). Une équipe s’est aussi attardée sur l’origine de la
macroorchidie et celle-ci est causée par une augmentation de la prolifération
des cellules de Sertoli lors du développement des testicules (Slegtenhorst-
Eegdeman et al. 1998). Fait intéressant à mentionner, une équipe a corrigé le
phénotype X-fragile en créant des souris knock-out ayant un YAC (Yeast
Artificial Chromosome) produisant 10 à 15 fois plus de protéines Fmr1 que le
gène sauvage. Ces souris transgéniques avaient des testicules de taille normale
et performaient très bien aux tests d’intelligence utilisés (Peier et al. 2000). Ces
souris présentaient malgré tout des comportements anormaux différents de
ceux observés chez la souris k-o telle de l’hypoactivité et un haut niveau
d’anxiété.
32
Des souris k-o ont aussi été créées pour les protéines homologues discutées
dans la section suivante. Aucune publication n’est parue sur la souris k-o Fxr1,
celle-ci meurt peu de temps après sa naissance à la suite de problèmes
pulmonaires et cardiaques. Récemment, une équipe a publié des résultats sur
la souris k-o Fxr2. Cette souris présente un retard mental et des phénotypes
comportementaux ressemblant à ceux observés chez la souris k-o Fmr1 mais
aussi certains phénotypes qui lui sont propres. Toutefois, au niveau des
structures du cerveau et des testicules, il n’y a pas de différences entre la
souris sauvage et la knock-out (Bontekoe et al. 2002).
1.12 Protéines FXR1/FXR2
Les protéines produites par les gènes FXR1 et FXR2 sont très similaires à la
protéine FMR1. Elles présentent les mêmes domaines fonctionnels et ces
régions sont les plus conservées entre les membres de la famille, ainsi qu’avec
leur orthologues. On retrouve 92 et 97 % d’identité respectivement entre les
acides aminés des domaines KH1 et KH2 des trois protéines, et l’espacement
entre ces deux domaines est conservé. Le NES et les séquences l’entourant sont
identiques à 86 %. Les 200 premiers acides aminés contenant l’activité de
localisation nucléaire présentent 70 % d’identité. La portion carboxy-terminale
est celle démontrant le plus de divergence (6 % de similitude) mais on retrouve
aussi une boîte RGG dans les deux homologues.(Figure 3) La conservation de la
séquence protéique de FXR1 entre les espèces est encore plus frappante. On
retrouve 97.7 % d’homologie et 96.7 % d’identité entre les séquences humaine
et murine. Par exemple, la séquence en acides aminés est totalement conservée
entre les domaines KH de la souris et de l’humain.
33
Figure 3: Comparaison des séquences protéiques entre les protéines FMR1, FXR1 et FXR2. Les barres horizontales représentent les acides aminé identiques dans les 3 protéines. Les barres verticales ou les vides représentent les acides aminés divergents ou absents dans les protéines homologues par comparaison avec la protéine FMR1. Les domaines fonctionnels sont inscrits à la gauche de la figure et à la droite de chaque protéine est indiqué la région reconnue par les différents anticorps. (Tiré de Khandjian et al. 1999)
34
1.12.1 Expression et localisation de FXR1/FXR2 L’expression des homologues Fxr1 et Fxr2 a été étudiée grâce à des anticorps
spécifiques dirigés contre la portion C-terminale qui est la moins conservée (Fig.
3) (Tamanini et al. 1997; Khandjian et al. 1998). En immunobuvardage, deux
isoformes FXR1 de 70 et 78 kDa sont détectées dans la plupart des tissus,
ainsi qu’une protéine FXR2 de 94 kDa et une isoforme mineure de 86 kDa. Tout
comme FMR1, les deux protéines homologues sont exprimées dans le
cytoplasme des neurones du cortex, dans la portion proximale des dendrites et
le périkaryon. Dans les axones, cette distribution concorde avec celle des
ribosomes (Steward and Levy 1982). Dans le cervelet humain, l’expression des
deux homologues se limite au cytoplasme des cellules de Purkinje.
Dans les testicules, la protéine FXR1 est exprimée principalement dans les
cellules plus matures vers le centre des tubules séminifères alors que la
protéine FXR2 est présente dans le cytoplasme de toutes les cellules du tubule.
L’expression de FMR1 est différente car elle n’est produite que dans les
spermatogonies à la périphérie des tubules. Ceci suggère que les trois
protéines, quoique similaires, exercent certaines fonctions indépendantes dans
la maturation des spermatozoïdes.
Dans le muscle squelettique, l’anticorps 1C3 détecte deux protéines ayant une
mobilité réduite. Ces deux protéines sont en fait des superformes de la
protéines FXR1, exprimées dans les muscles et les spermatocytes, et résultant
d’une insertion de 81 paires de base (Khandjian et al. 1995; Khandjian et al.
1998). La réaction croisée observée n’est pas l’effet de cette insertion
supplémentaire mais elle est plus facilement observable dans les cellules où la
protéine FMR1 est absente. Puisque l’anticorps est dirigé contre un épitope en
N-terminal, une région conservée entre les homologues, l’anticorps 1C3
reconnaît une séquence similaire dans FXR1. Il est aussi probable que les
35
isoformes de 70 et de 78 kDa de FXR1 soient responsables d’une partie du
signal observé dans les isoformes de FMR1.
Malgré les nombreuses similitudes entre les protéines de la famille FXR, les
données recueillies suggèrent qu’elles jouent des rôles différents dans la cellule,
mais qui pourraient se chevaucher. Chez les patients X-fragile, les niveaux
d’expression des protéines FXR1/FXR2 restent inchangés. Toutefois, il est
possible qu’elles compensent subtilement l’absence de la protéine FMR1 par
une augmentation de leur activité.
1.13 Partenaires cellulaires
La recherche de la fonction de la protéine FMR1 passe inévitablement par
l’identification de ses partenaires cellulaires. Tout d’abord, il a été montré que
les trois protéines de la famille FMR/FXR pouvaient s’hétérodimériser mais que
leur homodimérisation s’accordait plus avec la réalité in vivo (Zhang et al.
1995). L’immunoprécipitation de la protéine FMR1 (avec une protéine
recombinante portant un flag) a permis de démontrer la présence des
homologues dans les mêmes extraits (Bardoni et al. 1999; Ceman et al. 1999).
La nucléoline est l’une des premières protéines à avoir été identifiée et bien
qu’elle soit majoritairement située dans le nucléole, une portion est
cytoplasmique et se retrouve dans des RNPs (Ceman et al. 1999). En plus de la
nucléoline, les auteurs ont co-précipité 4 protéines de 100, 120, 150 et 400
kDa qu’ils tentent d’identifier actuellement. Ils ont aussi précipité la protéine
hnRNPA1 mais son association à la mRNP s’effectue via l’ARN. Une étude
subséquente a permis d’identifier la protéine YB1/P50 (Y-box binding protein)
comme partenaire de FMR1 dans la mRNP (Ceman et al. 2000). Comme FMR1,
cette protéine est aussi retrouvée dans les réticulocytes de lapin (Minich et al.
36
1993; Evdokimova et al. 1995) et sa séquence est extrêmement bien conservée
entre le lapin et l’humain (97 % d’identité).
Le criblage d’une banque d’expression de cDNAs d’embryon murin à l’aide du
système double-hybride dans la levure a aussi permis d’identifier d’autres
protéines interagissant avec la protéine FMR1. Un des premiers partenaire
identifié est une protéine nucléaire; NUFIP (NUclear Fmrp Interacting Protein 1)
qui interagit avec la protéine FMR1 mais pas avec les homologues (Bardoni et
al. 1999). Deux autres partenaires, NUCIF1 (NUclear and Cytoplasmic
Interactor of Fmrp 1) et CYFIP1 (CYtoplasmic Fmrp Interacting Protein 1) ont
été isolés et la recherche de séquences homologues a permis de trouver
l’homologue CYFIP2 qui interagit aussi avec la protéine FMR1. Ces protéines
sont retrouvées principalement dans le cytoplasme où elles sont associées aux
polyribosomes. Au niveau fonctionnel, CYFIP1 a été caractérisée comme
intéragissant avec la petite GTPase Rac1 (Kobayashi et al. 1998). Cette dernière
est impliquée dans différents aspects de la biologie neuronale dont la
maturation et le maintien des épines dendritiques, des structures fortement
affectées chez les patients X-fragile (Rudelli et al. 1985; Hinton et al. 1991) et la
souris knock-out (Consortium 1994; Comery et al. 1997; Kooy et al. 1999;
Nimchinsky et al. 2001). Alors que CYFIP2 interagit avec les trois protéines
FMR/FXR, CYFIP1, NUCIF1 et NUFIP s’associent uniquement à FMR1 et cette
différence d’interaction pourrait conférer une certaine spécificité à la protéine.
De plus, les protéines identifiées comme composantes potentielles du complexe
ribonucléoprotéique comprenant la protéine FMR1 n’ont pas toutes une
localisation intracellulaire identique indiquant que leur fonction dans la mRNP
se situerait à différents niveaux.
37
1.14 Le diagnostic
Avant l’identification de la mutation dynamique responsable de la majorité des
cas de syndrome X-fragile, le diagnostic des malades s’effectuait uniquement
par la visualisation du site fragile par cytogénétique. Toutefois, seulement 50 %
des personnes atteintes présentent le site fragile (Sherman et al. 1984) et deux
autres sites fragiles se trouvent à proximité: le site FRAXE à 600 kb et le site
FRAXF à 1-2 Mb de FRAXA (Suthers et al. 1990; Flynn et al. 1993; Hirst et al.
1993). Le test cytogénétique ne convenait donc pas pour le diagnostic prénatal
compte tenu de sa faible fiabilité.
1.14.1 Hybridation Southern
L’identification de l’expansion de l’ADN et de la méthylation responsable du
syndrome s’effectue grâce à des doubles digestions avec une enzyme coupant
fréquemment (EcoRI) et une enzyme sensible à la méthylation (Eag I). L’ADN
digéré est ensuite séparé par électrophorèse sur gel d’agarose et les produits de
digestion visualisés à l’aide d’une sonde marquée s’hybridant spécifiquement
aux fragments comprenant la séquence répétée (Oberle et al. 1991).
L’hybridation Southern est devenue, et demeure la méthode diagnostique de
référence puisqu’elle permet d’identifier avec certitude les personnes normales,
les porteuses d’une prémutation et celles ayant une mutation complète. Seule
la limite inférieure des prémutations est une zone d’incertitude car la résolution
de cette technique est d’environ 90 paires de bases, soit 30 triplets, et ne
permet pas toujours de distinguer les petites prémutations des grands allèles
normaux. Toutefois, cela ne nuit pas au diagnostic et on peut toujours mesurer
précisément le nombre de triplets par PCR. La double digestion permet de
déterminer le niveau de méthylation et de différencier les grandes prémutations
des mutations complètes. La méthylation étant responsable de l’inactivation du
38
gène, cette information s’avère autant sinon plus importante que la longueur de
l’expansion.
La technique est coûteuse et fastidieuse mais puisqu’aucune autre méthode
diagnostique n’offre une sensibilité et une spécificité aussi proche de 100 %,
l’hybridation Southern restera le modus operandi des laboratoires de diagnostic
fiables pour le moment. D’ailleurs, une mini-méthode permettant d’examiner
un grand nombre d’échantillons simultanément, plus rapidement et à un coût
similaire à celui de la PCR a été mise au point dans le laboratoire du Dr.
Rousseau (Rousseau et al. 1994a).
1.14.2 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Puisque l’expansion d’une séquence répétée est associé au syndrome X-fragile,
plusieurs laboratoires ont tenté de mettre au point un protocole pour amplifier
les répétitions à l’aide de la réaction PCR (Fu et al. 1991; Brown et al. 1993;
Haddad et al. 1996; Boday et al. 1998; Duran Dominguez et al. 2001). En
comparant le produit PCR (radioactif ou non) à une échelle de référence, il est
possible de calculer exactement le nombre de triplets composant la répétition.
Par contre, le contenu riche en cytosine (C) et guanine (G) de cette région
(pratiquement 100 %) rend techniquement difficile, pour ne pas dire impossible,
d’amplifier suffisamment de fragments pour permettre la visualisation directe
des mutations complètes. Pour contourner ce problème, un protocole incluant
une étape de transfert sur nitrocellulose et d’hybridation avec une sonde
(CGG)n marquée a été mis au point et permet de détecter et mesurer les allèles
mutés (el-Aleem et al. 1995; Hecimovic et al. 1997). Ces étapes supplémentaires
ont toutefois des répercussions sur le coût et le temps alloués au diagnostic
ainsi que sur la précision de la mesure du nombre de triplet. De plus, cette
technique ne permet pas de déterminer le statut de méthylation. Récemment,
deux méthodes permettant d’amplifier uniquement les CpG méthylés chez les
39
mâles atteints ont été publiées (Das et al. 1997; Panagopoulos et al. 1999)
mais elles ne sont pas encore utilisées pour le diagnostic.
Au cours des dernières années, deux polymérases permettant “supposément”
d’amplifier les mutations complètes sont devenues disponibles
commercialement (Herculase™ et Expand™ long PCR). Malgré tout, un problème
persiste dans l’utilisation de la PCR: il s’agit du mosaïcisme décrit
précédemment. Au cours de la réaction PCR, l’amplification préférentielle des
petits fragments peut générer un résultat faux-négatif pour le diagnostic. Nous
avons vérifié cette hypothèse sur des patients diagnostiqués antérieurement par
hybridation Southern. Chez plus de 10 % des patients ayant une mutation
complète, la PCR a généré un produit de longueur normale ou prémutée. De
plus, les patients pour lesquels la PCR a généré un produit PCR visible
n’étaient pas tous des mosaïques tel que déterminé par hybridation Southern.
Ceci suggère que le taux de mosaïcisme est peut-être plus élevé que ce qui est
mesurable par hybridation Southern et qu’il est détecté plus efficacement par la
PCR. Ainsi, malgré des polymérases plus performantes, l’hybridation Southern
restera, pour le moment, la méthode la plus fiable pour le diagnostic.
1.14.3 Détection de la protéine
La détection de la mutation et de sa méthylation ont toujours été l’élément
central pour le diagnostic. La maladie étant causée par l’absence de la protéine
FMR1, certaines équipes ont préféré diriger leurs efforts vers la détection de la
protéine pour diagnostiquer la maladie. Les techniques immunologiques sont
habituellement moins onéreuses que la PCR ou l’hybridation Southern car elle
ne nécessitent que des anticorps qui peuvent être, la plupart du temps,
produits par un hybridome que le laboratoire crée ou achète.
40
En 1993, Verheij et al (19993) ont préparé une série d’anticorps polyclonaux et
ont démontré, tout comme Devys et al (1993) précédemment, que la protéine
FMR1 est produite dans le cytoplasme des cellules d’une lignée
lymphoblastique (Verheij et al. 1995). Puisque la protéine est absente chez les
patients X-fragile, ce résultat ouvrait la voie au diagnostic avec les anticorps. La
même année, Willemsen et al (1995) ont mis au point un test permettant de
détecter la présence de la protéine dans les lymphocytes sur un frottis de sang.
Cependant, il arrivait fréquemment que chez les patients X-fragile le cytoplasme
des lymphocytes était coloré (donc exprimant la protéine), reflètant le
mosaïcisme mentionné précédemment. Malgré cela, la puissance diagnostique
de ce test est excellente pour les hommes puisqu’il n’y a aucun chevauchement
entre le nombre de cellules colorées chez les normaux et es atteints.
Ceci n’est cependant pas le cas pour les femmes, compte tenu du processus
d’inactivation aléatoire du chromosome X. En effet, certaines femmes porteuses
d’une mutation complète expriment la protéine dans plus de 80 % de leur
cellules, alors que 40 % des femmes normales expriment la protéine dans
moins de 80 % de leur lymphocytes (Willemsen et al. 1997b).
Pour le diagnostic post-natal, la même équipe a développé un test non-invasif
permettant de détecter la protéine dans la racine des cheveux (Willemsen et al.
1999). Ce test a une puissance équivalente, chez les hommes, à celle du test
effectué sur des frottis de sang. Les auteurs mentionnent qu’il pourrait y avoir
une meilleure corrélation entre l’expression de FMR1 à la racine des cheveux et
le retard mental compte tenu de l’origine embryonnaire commune entre le
cerveau et la peau. Le test sur les racines de cheveux a été utilisé avec succès
lors d’un programme de dépistage parmi des hommes retardés mentalement en
Turquie (Tuncbilek et al. 2000).
41
La détection de la protéine FMR1 a aussi été appliquée au diagnostic prénatal
sur des villosités choriales chez des femmes à risque enceintes de garçons
(Willemsen et al. 1996). La protéine est fortement exprimée dans le
cytotrophoblaste des villosités chez les enfants normaux. Cependant, le test ne
peut-être effectué que sur les foetus agés de plus de 12.5 semaines puisque
c’est à ce moment que les mutations complètes deviennent méthylées et que la
protéine n’est plus exprimée (Willemsen et al. 2002). La détection de la protéine
a aussi été effectuée sur le liquide amniotique (Willemsen et al. 1997a) et sur le
sang foetal (Lambiris et al. 1999). L’avantage principal de cette méthode
immunochimique est que le résultat est disponible la journée même du test,
alors que l’hybridation Southern peut prendre jusqu’à 2 semaines. Le
désavantage vient du fait que les femmes porteuses d’une mutation complète ne
peuvent être identifiées avec certitude. Cette lacune est liée au fait que ces tests
sont qualitatifs ou semi-quantitatifs. De plus, puisque la plupart des personnes
ayant une prémutation produisent la protéine en quantité presque normale,
elles ne peuvent être identifiées ainsi. Toutefois, deux études mentionnent que
certaines personnes ayant une prémutation produisent moins de protéines
qu’une personne ayant des allèles de longueurs normales (Tassone et al. 2000a;
Tassone et al. 2000b). Il est possible qu’un test quantitatif suffisamment
sensible permettre de quantifier cette différence contrairement aux tests
mentionnés précédemment qui ne permettent pas d’identifier toutes les femmes
porteuses d’une mutation complète ni les personnes ayant une prémutation. Le
test immunochimique quantitatif deviendrait donc intéressant pour les
laboratoires de diagnostic.
42
1.15 Le phage display
1.15.1 Introduction
Les anticorps sont des outils complémentaires de biologie moléculaire pour
l’étude des protéines in vitro et in vivo. Toutefois, la production de ces anticorps
doit inévitablement passer par l’immunisation d’un animal (un lapin ou une
souris habituellement) et plusieurs facteurs tels l’immunogénicité et la
conservation de la séquence protéique détermineront la qualité (affinité et
avidité) des anticorps obtenus. Au cours de la dernière décennie, un outil de
sélection et de synthèse combinatoire des protéines a été développé: le “phage
display” ou la présentation de molécules à la surface de phages filamenteux.
Différentes molécules telles des peptides aléatoires, des enzymes, des
inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, des banques d’ADNc,
des cytokines, des domaines extracellulaires de récepteurs ou des fragments
d’anticorps peuvent être présentées en les fusionnant à une des protéines de la
capside du phage. Ensuite, les phages portant la molécule d’intérêt seront
sélectionnés pour leur interaction avec une autre molécule (un antigène par
exemple) fixée à un support solide et ces phages seront ensuite utilisés pour
infecter une souche d’E. coli et ainsi enrichir la population de phages
spécifiques (Figure 4 p.43). Cette technique permet aussi d’associer la protéine
exposée en surface avec sa séquence nucléotidique insérée dans le génome du
phage.
43
1.15.2 Phages filamenteux
Les phages filamenteux M13, f1 et fd ont tous été utilisés pour la création de
banques de phage display compte tenu de leur capacité commune à infecter les
souches d’Escherichia coli exprimant le pilus codé par le facteur F. Les phages
filamenteux sont composés de 5 protéines (Figure 5) entourant un ADN
circulaire simple brin d’environ 6500 nucléotides. L’adsorption du phage
s’effectue à l’aide des protéines g6 et g3 (Boeke et al. 1982) et cette dernière est
habituellement utilisée pour fusionner les molécules à sélectionner. Pour de
petites molécules, cette fusion n’affecte pas la capacité d’infection du phage. Le
génome des phages d’une banque de phage display (phagemide) ne contient que
l’information nécessaire à la production de la protéine g3 recombinante et à la
réplication du génome. Le reste du matériel génétique permettant la production
des autres protéines de la capside est fourni par la co-infection avec un phage
auxiliaire (M13K07). Cependant, le génome de ce dernier ne sera pas produit
(ou très peu) puisqu’une mutation dans le gène g2 diminue l’affinité de la
protéine produite pour sa propre origine de réplication. Le produit du gène 2
n’est pas présent dans la capside du phage mais sert à initier la réplication par
cercle roulant en créant une cassure dans le génome double brin puis en
coupant les génomes complets avant leur empaquetage. Ainsi le phagemide
sera produit préférentiellement au génome du phage auxiliaire (Vieira and
Messing 1987). Ce dernier fournira aussi une protéine g3p sauvage qui entrera
en compétition avec la protéine g3p de fusion pour son incorporation dans la
capside du phage. Ceci crée une certaine hétérogénéité dans le nombre de
protéines de fusion présentés à la surface des bactériophages. Ainsi, certains
phages présenteront de 1 à 5 copies de la protéine de fusion alors que les
autres n’en présenteront aucune. Pour éviter cette compétition et s’assurer que
tout les phages présentent les molécules d’intérêt, des phages auxiliaires
n’ayant plus le gène codant pour la protéine g3p ont été développés (Griffiths et
al. 1993; Rakonjac et al. 1997; Rondot et al. 2001).
44
Banque de phage display (Ex: Griffin.1 = 1010 phages)
Tours de sélections suivants
Première sélection
Lavage des phages non-spécifiques
Élution des phages spécifiques
E coli E coli
Production de phages spécifiques
E coli
Infection d’ E.coli
suppressive (+ M13K07)
Figure 4: Représentation du processus de sélection de fragments d’anticorps par la technique du “phage display”. Les rectangles représentent les phages et les cercles colorés représentent les fragments d’anticorps (scFv). = antigènes fixés sur un support solide (immunotubes) pour la sélection.
45
Protéines de fusion*
Protéines g3p (≈ 5 / 43 kDa)
Protéines g6p (≈ 5 / 12 kDa)
Protéines g8p (≈ 2700 / 5 kDa)
ADN simple brin (≈ 6500 nucléotides)
Protéines g7p (≈ 5 / 3.5 kDa)
Protéines g9p (≈ 5 / 3.5 kDa)
Figure 5: Structure du bactériophage M13.
Ce phage a été est le plus utilisé pour la construction de banques de “phage display”. * Les protéines ou peptides exprimés dans la banque sont fusionnés avec la protéine g3p. Les fragments d’anticorps pouvant être fusionnés sont représentés à la figure 6 et le processus de sélection est représenté à la figure 5. Le nombre de protéines ainsi que leur poids moléculaire est inscrit entre parenthèse.
46
1.15.3 Banque d’anticorps
Une des applications prometteuses de cette technologie est la création de
banques synthétiques de fragments d’anticorps. (Figure 6) Ce type de banque
permet entre autre d’outrepasser l’immunisation et d’obtenir des anticorps
dirigés contre des molécules de l’hôte. Ces anticorps seraient normalement
difficiles à obtenir à cause du mécanisme de tolérance du système immunitaire
de l’hôte. Pour obtenir des anticorps de haute affinité, il faut exposer l’hôte
plusieurs fois à l’antigène et de meilleurs anticorps seront créés par mutation
de ceux obtenus lors de la réponse primaire (Berek and Milstein 1987). Dans le
phage display, on peut aussi obtenir ce type de maturation artificiellement. Un
répertoire de fragments d’anticorps est obtenu en combinant les différentes
chaînes lourdes (VH) et légères (VL= Vκ + Vλ). L’approche utilisée influencera
grandement la diversité générée. Chaque répertoire, VH et VL peut être cloné
dans deux vecteurs différents pour être recombiné in vitro (Hogrefe et al. 1993a;
Hogrefe et al. 1993b) ou in vivo (Waterhouse et al. 1993) par la suite. Il est
aussi possible de cloner séquentiellement chacun des gènes dans un même
vecteur (Barbas et al. 1991) ou de procéder à leur assemblage par PCR et les
cloner dans un vecteur commun (Clackson et al. 1991). Les répertoires sont
combinés au hasard ce qui permet de créer de nouvelles spécificités (Marks et
al. 1991). À la suite de la sélection des meilleurs fragments, des mutations
peuvent être introduites au hasard in vitro (Gram et al. 1992; Hawkins et al.
1992), en utilisant une polymérase faisant des erreurs (Leung et al. 1989), ou in
vivo en infectant des souches bactériennes créant des mutations (Schaaper
1988; Yamagishi et al. 1990). Une nouvelle sélection est ensuite effectuée sur
les nouveaux phages afin de sélectionner les meilleurs. Cette maturation
artificielle permet d’obtenir des anticorps ayant une affinité semblable à celle
des anticorps issus d’une réponse secondaire chez un animal. On retrouve
quelques exemples intéressants dans la littérature (Clackson et al. 1991;
Griffiths et al. 1993 et 1994, de Lorenzo et al. 2002)
47
Région d’attachement aux macrophages
Région d’activation du complément
A
CDR: Complementary determining region (Régions hypervariables)
Fab
VH VL
Fab
CDR
3
2
1
S-S
VH VL
S-S
Fv
VH VL
scFv (single chain Fv)
B
C Fc
D
Liaison à l’antigène
VL
Fragment variable (Fv)
VH
Figure 6: Représentation des différents types de fragments d’exprimés à la surface de phages pour la sélection en phage display. A) Anticorps complet, B) Fragments Fab, C) Fragments variables reliéD) Fragments variables reliés en une seule chaîne par un peptide artifSer3)3).
LINKER
anticorps pouvant être
s par un pont disulfure et iciel (souvent une (Gly3-
48
1.16 Objectifs du projet de doctorat Une décennie s’est écoulée depuis l’obtention des premiers anticorps dirigés
contre la protéine FMR1 et l’anticorps 1C3 s’est avéré le plus efficace pour les
études effectuées malgré les nombreuses tentatives d’en produire des meilleurs.
Cet anticorps présente une bonne spécificité mais la réaction croisée avec la
protéine homologue FXR1 peut limiter certaines expériences. L’anticorps 1C3
détecte toutes les isofomes de la protéine FMR1 mais il serait intéressant
d’obtenir un outil permettant de les discriminer.
Dans cette optique, nous avons entrepris la génération d’anticorps par la
technologie du phage display et la création de nouveaux hybridomes. Dans un
premier temps, nous utiliserons la banque de phage Griffin.1 pour sélectionner
des scFvs dirigés contre la protéine FMR1 complète et un peptide de 15 acides
aminés qui lui est unique. La protéine complète servira aussi à l’immunisation
de 4 souris pour la génération d’hybridomes. La caractérisation des anticorps et
des scFvs débutera avec la cartographie des épitopes reconnus et la classe et
sous-classe des anticorps monoclonaux obtenus. Nous vérifierons ensuite si les
anticorps (et scFvs) peuvent être utilisés pour les techniques suivantes:
immunobuvardage, immunofluorescence, immunohistochimie, l’ELISA et
l’immunoprécipitation. Nous espérons ainsi fournir de nouveaux outils de
biologie moléculaire pour l’étude de la protéine impliquée dans le syndrome X-
fragile.
Nous tenterons aussi la mise au point d’un test de dosage par ELISA-sandwich
à l’aide d’anticorps reconnaissant des épitopes suffisamment distants. La mise
au point se fera sur la protéine FMR1 purifiée qui servira de courbe standard
lors du dosage. Nous effectuerons ensuite la mise au point sur des extraits de
lignées lymphoblastiques normale et X-fragile, le but ultime de cette expérience
étant de doser la protéine de leucocytes extraits du sang afin de créer une
49
méthode diagnostique plus rapide et moins onéreuse que celles présentement
disponibles.
Si la sélection de scFv avec la banque Griffin.1 fonctionne bien, nous tenterons
la sélection de fragments variables (scFvs) dirigés contre les nouvelles jonctions
exon-exon et la nouvelle portion carboxy-terminale créée à la suite de l’épissage
alternatif du transcrit primaire de FMR1. Ces scFvs seront ensuite utilisés pour
déterminer l’existence des différentes isoformes de FMR1. Nous vérifierons par
la suite la localisation cellulaire des isoformes existantes ainsi que leur
distribution tissulaires. Ces informations pourraient permettre d’éclaircir le rôle
joué par la protéine FMR1 et la signification biologique de l’existence des
multiples isoformes.
2 Matériels et méthodes
51
2.1 La banque Griffin.1
2.1.1 Construction de la banque
La banque Griffin.1 a été construite par l’équipe du Dr Greg Winter en
combinant les portions codant pour les régions variables des immunoglobulines
humaines dont les gènes ont été clonées antérieurement par d’autres équipes.
La variabilité des répertoires a été augmentée en insérant des codons aléatoires
dans la séquence codant pour la région hypervariable 3 (CDR3: Complementary
Determining Region). Tout d’abord, le répertoire de chaînes lourdes a été
construit à partir des 49 segments VH clonés par (Tomlinson et al. 1992; Nissim
et al. 1994) et 4 à 12 codons aléatoires ont été insérés à la place de la région
hypervariable 3 (> 108 clones différents) (Fig 7A). Le répertoire de chaînes
légères κ a été préparé à partir des 26 segments Vκ clonés par Cox et al. (1994)
et le CDR 3 a été remplacé par 2 codons aléatoires ou moins (9 x 104 clones)
(Fig 7B). Finalement, le répertoire de chaînes légères λ a été construit à partir
des 21 segments Vλ clonés par Williams and Winter (1993) en introduisant une
boucle CDR3 comprenant de 0 à 3 résidus aléatoires (7.4 x 105 clones) (Fig 7C).
Les différentes chaînes légères (kappa et lambda) ont été clonées par la suite
dans le vecteur “accepteur” fdDOG2loxVκDel comprenant le gène de résistance
à la tétracycline (Fig 7D). Le répertoire de chaînes lourdes a été cloné dans le
vecteur “donneur” pUC19-2loxVHDel (Fig 7E) comprenant un gène de résistance
à l’ampicilline. Les répertoires de chaînes lourdes (> 108) et légères (> 105) ont
été combinés en infectant une souche d’E. coli ayant le vecteur “donneur” (VH)
avec des phages fd ayant le vecteur “accepteur” (VL). La culture a ensuite été
coinfectée avec le phage P1 (résistance chloramphénicol) fournissant la
recombinase Cre (recombinaison lox) (Waterhouse et al. 1993). Sur une
possibilité de 8 x 1013 clones différents, 6.5 x 1010 colonies ont poussé sur un
milieu comprenant les trois antibiotiques, certaines combinaisons n’ont donc
52
pas eu lieu. Les répertoires VH -VL ont ensuite été clonés dans le phagemide
pUC119HismycXba (Fig 7F). Avec cette banque, les auteurs ont obtenu des
Fabs de haute affinité dirigés contre des haptènes, des antigènes étrangers
mais aussi contre des protéines humaines (Griffiths et al. 1994). Pour la
création de la banque Griffin.1, les portions VH -VL du répertoire de Fab ont été
clonées dans le vecteur pHEN2 (Figure 8) pour la production de scFvs.
Figure 7: Construction du répertoire de chaînes lourdes et légères et vecteurs utilisés pour leur clonage.
DA
B E
C F
(A) Construction du répertoire de chaînes lourdes. (B) Construction du répertoire de chaînes kappa. (C) Construction du répertoire de chaînes lambda. (D) Vecteur “accepteur” du phage fd dans lequel les répertoires de chaînes légères ont été clonés. (E) Vecteur plasmidique “donneur” dans lequel a été cloné le répertoire de chaînes lourdes. (F) Phagemide dans lequel les répertoires de chaînes lourdes et légères codant pour des Fabs ont été insérés en fragments XbaI-NotI. (Tiré de (Griffiths et al. 1994).)
53
2.1.2 Vecteur pHEN2
Le vecteur utilisé dans la banque Griffin.1 est un phagemide: un vecteur
comprenant une origine de réplication bactérienne (E.coli), un gène de
résistance à un antibiotique (ampicilline) et une origine de réplication phagique
(M13 ori). Les portions VH-VL ont été clonées de part et d’autre d’une séquence
codant pour un lien peptidique artificiel afin de créer les scFvs. Un codon
ambre a été inséré entre la séquence codant pour protéine g3p et celle codant
pour les scFvs. Ainsi, pour obtenir des phages portant la protéine de fusion, on
infecte une souche suppressive d’E.coli (TG1 (Gibson 1984)) avec les phages
sélectionnés. Le codon ambre est traduit en glutamine et la protéine de fusion
scFv-g3p est produite. Pour obtenir uniquement les scFvs, on doit infecter une
souche non-suppressive d’E.coli (HB2151 (Carter et al. 1985)) qui reconnaît le
codon ambre (TAG) comme un codon stop. Les fragments d’anticorps sont
produits dans le périplasme puis sécrétés dans le milieu grâce à la présence
d’un peptide leader en C-terminal (Boeke et al. 1982; Hoogenboom et al. 1991).
Finalement, on retrouve un tag c-myc permettant de détecter les scFvs avec
l’anticorps 9E10 (Munro and Pelham 1986) et un tag hexa-histidine pour la
purification des scFvs à l’aide d’une matrice Ni-NTA. (Figure 8)
linker
pHEN
amcolE1 ori
c RBS leader s myc g3p
1 2 3 4 5
Figure 8: Vecteur pHEN2 dans lequelde la banque Griffin.1.
Hi
Placodonambre
2
p M13 ori
Sites de restriction :1- Sfi I 2- Nco I 3- Xho I 4- ApaL I 5- Not I
ont été clonées les portions VH -VL pour la création
54
2.2 Production de la protéine FMR1 dans un système d’expression bactérien
L’ADNc du gène FMR1, amplifié par RT-PCR antérieurement au début de ce
projet, a été cloné dans le vecteur pQE31. (Figure 9) Dans ce vecteur, le gène
inséré est sous le contrôle du promoteur T5. En aval de ce dernier, on retrouve
deux opérons lac où se lient les répresseurs qui inhibent la transcription de
l’ARN diminuant ainsi les fuites. La production de la protéine s’induit en
ajoutant de l’IPTG au milieu de culture. L’IPTG est un analogue du lactose qui
se fixe irréversiblement aux répresseurs, permettant ainsi la liaison de l’ARN
polymérase au promoteur T5 et la production de la protéine recombinante.
Nous avons tranformé la souche XL1Blue avec le vecteur pQE31/FMR1 afin
d’en produire une quantité suffisante pour le recloner dans la souche M15
d’E.coli. (The Qiaexpressionnist kit de Qiagen) Nous avons aussi fait synthétiser
un peptide de la portion carboxy-terminale (a.a. 550-570:
DHSRTDNRPRNPREA) par le service de synthèse de l’Université Laval. Cette
sequence peptidique a été sélectionnée car elle absente dans les homologues et
présente une forte hydrophilicité.
55
pQE31 3464 pb
Figure 9: Vecteur pQE31 Ce vecteur a été utilisé pour la production de peptides de fusion pour l’expression dans la souche E. coli M15. En amont du site de clonage multiple (MCS) on retrouve un tag hexa-histidine pour la purification des peptides, un site d’attachement des ribosomes, deux opérons lac et le promoteur T5. En aval on retrouve des codons stop dans les 3 cadres de lecture. Sur le plasmide est aussi présent un gène de résistance à l’ampicilline.
2.2.1 Préparation de cellules électrocompétentes
Nous avons préparé une mini-culture en ensemençant 10 mL de milieu LB avec
le stock glycérol de bactéries XL1Blue et laissé croître toute la nuit à 37 oC en
agitant à 250 rotations par minute (RPM). (Toutes les agitations de cultures ont
été effectuées à 250 RPM sauf si mentionné.)
Le lendemain, 200 mL de milieu LB ont été ensemencés avec 2 mL de la mini-
culture et incubés à 37 oC sous agitation jusqu’à l’obtention d’une densité
optique (D.O.) se situant entre 0.5 et 1.0 (phase de croissance exponentielle).
(Toutes les prises de D.O. des cultures s’effectuent à 600nm.)
56
Afin que les cellules soient préparées pour l’électroporation, il est nécessaire
d’éliminer tous les sels dans le milieu où elles se trouvent. Ceci est effectué par
des lavages à l’eau distillée suivi de centrifugations à 3000 RPM à 4oC et à la
suite de la dernière centrifugation, les cellules sont reprises dans une solution
10% glycerol. Celles-ci sont ensuite conservées à –80oC jusqu’à leur utilisation.
2.2.2 Transformation par électroporation
Les cellules compétentes sont décongelées sur glace puis ≅ 50 ng de vecteur est
mélangé aux cellules et le tout est conservé sur la glace pendant 1 minute.
Réglage des paramètres de l’électroporation
- 25 µF (Capacitance)
- 200 Ω (Résistance)
- 2.5 kV (Voltage)
Le mélange bactéries/ADN est placé au fond de la cuve d’électroporation (0.2
cm) de manière à ce que le mélange soit bien réparti d’un bord à l’autre pour
assurer la diffusion du courant électrique. (Lorsque le courant traverse les
cellules, il y a formation de pores dans la membrane cellulaire et l’ADN peut
alors pénétrer dans la cellule.)
Le voltage est appliqué (constante de temps : 4.5-5 msec) puis 1 mL de milieu
de culture LB à température ambiante est ajouté immédiatement. Le tout est
transféré dans un microtube conique 1,7 mL et incubé 1 heure à 37oC sans
agitation. Nous avons étalé 10 µL, 50 µL et 100 µL sur un milieu LB-agar avec
ampilline (100 µg/mL) et laissé croître toute la nuit à 37 oC.
57
2.2.3 Vérification de la présence et de l’orientation de l’insert
Dans la majorité des clonages que nous avons effectués nous avons utilisé une
seule enzyme de restriction pour digérer le vecteur et le produit PCR. La
produite PCR pouvait donc se lier au vecteur dans les deux orientations. Ainsi,
une fois les cellules transformées, elles sont étalées sur une boîte de Pétri à une
dilution permettant d’obtenir des colonies isolées, c’est–à-dire issues d’une
seule bactérie théoriquement. En effectuant une PCR sur l’ADN de ces colonies,
nous pouvions déterminer l’orientation de l’insert. Pour cela, nous avons
utilisés une amorce dans le plasmide et une amorce dans le gène. Si l’insert
n’est pas dans la bonne orientation, les amorces se retrouvent sur le même
brin, et il n’y a pas d’amplification.
Nous avons piqué des colonies isolées et les avons diluées dans 50 µL d’eau
ultrapure. Nous avons ensuite préparé un mélange pour une réaction PCR
contenant 10 µL de colonies diluées, 1,25 µM de l’oligo PBF (sur le vecteur),
1,25 µM d’un oligo dans le gène FMR1 (par exemple Pst XIII, voir tableau 2 p.
78), 200 µM de dNTPs, la solution Q, le tampon PCR et 2 unités de Taq de
Qiagen dans un volume final de 40 µL.
L’amplification PCR a été effectuée dans un thermocycleur MJ-research PTC-
200 selon les conditions suivantes:
5 minutes à 95 oC
1 minute à 95 oC
1 minute à 60 oC 35 cycles
1 minute à 72 oC
10 minutes à 72 oC
4 oC jusqu’à la sortie des tubes du thermocycleur
58
Les produits PCR ont ensuite été déposés sur un gel d’agarose 1 % et la
migration effectuée à 100 Volts (10 V/cm) pendant 1 heure. Le gel est coloré au
bromure d’éthidium (BrET) et les produits visualisés sur une plaque UV. En
utilisant un oligo dans le vecteur et un autre à l’intérieur de l’insert, nous
pouvions ainsi vérifier simultanément la présence, la taille et l’orientation de
l’insert.
2.2.4 Production du plasmide d’intérêt
La dilution de bactéries ayant servie de source d’ADN pour la PCR (et dont
l’insert est dans la bonne orientation) est utilisée pour inoculer 100 mL de
milieu LB contenant de l’ampicilline. La culture est incubée à 37 oC toute la
nuit et le lendemain le plasmide est purifié à l’aide du kit QIAfilter Midi prep de
Qiagen en suivant les instructions du manufacturier. Le plasmide est séquencé
pour vérifier l’intégrité de la séquence (Service de séquençage de l’universtié
Laval).
Le plasmide est ensuite incorporé par électroporation dans les bactéries
compétentes M15 d’E. coli, selon les conditions décrites pour XL1Blue dans la
section “Transformation”. Les bactéries transformées sont étalées sur un
milieu sélectif (ampiciline + kanamycine).
2.2.5 Production de la protéine et test de solubilité
Une colonie isolée est utilisée pour inoculer une mini-culture de 10 mL de
milieu de culture LB contenant de l’ampicilline (100 µg/mL) et de la
kanamycine (25 µg/mL). La culture est incubée à 37 oC toute la nuit en agitant.
59
La mini-culture (2.5 mL) est utilisée pour inoculer 50 ml de milieu LB
(ampicilline et kanamycine) préchauffé à 37oC et la croissance s’effectue jusqu’à
la phase de croissance exponentielle (D.O. entre 0.5 et 0.7). Nous avons prélevé
1 mL de la mini-culture pour analyse. Cet aliquot est centrifugé à 12 000 RPM
pendant 5 minutes, le culot est repris dans 50 µL de tampon Laemmli 3X et
chauffé à 100oC pendant 10 minutes. L’échantillon est conservé à -20oC jusqu’à
son analyse par SDS-PAGE. (Contrôle non-induit)
La production de la protéine recombinante est induite en ajoutant de l’IPTG à
une concentration finale de 1 mM à la culture. Un millilitre est prélevé à chaque
60 minutes afin de mesurer l’expression de la protéine en fonction du temps
(cinétique d’expression). Les échantillons recueillis sont traités tel que décrit
précédemment pour le contrôle non-induit.
Après 6 heures d’induction, les cellules sont récupérées par centrifugationn et
nous avons vérifié la solubilité de la protéine. Trois échantillons de 1 ml ont été
recueillis dans des tubes coniques 1.7 mL et centrifugés à 12 000 RPM pendant
5 minutes. Les culots sont repris dans trois différents tampons de lyse: un
tampon permettant de conserver les protéines dans leur état natif et deux
tampons dénaturants.
Les échantillons sont centrifugés pendant 5 minutes à 12 000 RPM. Les
surnageants sont conservés et les culots repris dans 50 µL de tampon Laemmli
3X pour l’analyse. Le tampon Laemmli 3X est ajouté au surnageant pour avoir
une concentration finale de 1X et les échantillons sont conservés à –20oC
jusqu’à leur analyse sur gel d’acrylamide dénaturant (SDS-PAGE).
60
2.2.6 Mini-gel de polyacrylamide 8 % (SDS-PAGE) (Les mêmes concentrations ont été utilisées pour les gels préparatifs.)
L’électrophorèse sur gel d’acrylamide permet de séparer des protéines selon leur
poids moléculaire. La matrice est crée par la polymérisation d’acrylamide et de
bis-acrylamide. La grosseur des pores formés est fonction de la concentration
d’acrylamide. Plus la concentration est élevée, plus les pores seront petits et les
molécules les mieux séparées seront celles de petits poids moléculaires. Dans
un gel dénaturant, on retrouve du SDS qui se lie aux protéines selon un ratio
constant (1 molécule de SDS par 2 acides aminés). En se liant à la protéine, le
SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative. Ceci
permet sa migration dans la matrice à l’aide d’un courant électrique et la
séparation des protéines s’effectue uniquement en fonction de leurs poids
moléculaires.
Gel d’entassement:
126 mM mM Tris pH 6.9, 8% Acrylamide 38:2, 0.1 % SDS, APS et TEMED
Gel de séparation: 375 mM Tris pH 8.8, 8% Acrylamide 38:2, 0.1 % SDS, APS et TEMED.
La migration du gel est effectuée à 90 Volts pendant 1h45 dans le tampon tris-
glycine-SDS. Le gel d’entassement sert, comme son nom l’indique, à regrouper
les protéines ensembles. Durant l’électrophorèse, dans le gel à pH 6.9, les ions
de chlores migrent plus rapidement que les protéines et la glycine, et cette
dernière se déplace plus lentement que les protéines. La migration rapide des
ions crée un gradient de faible voltage en avant des protéines alors que la lente
migration de la glycine crée un gradient de haut voltage à l’arrière des
protéines. Ceci a pour effet d’entasser les protéines entre les glycines et les ions
de chlores avant leur séparation dans le gel à pH 8.8.
61
Lorsque les protéines ont été séparées, leur visualisation peut être effectuée en
les colorant directement (Bleu de Coomassie ou nitrate d’argent). Cette
coloration permet de visualiser toutes les protéines dans l’échantillon dont la
concentration dépasse la limite de détection de la coloration. Cependant, il est
possible de détecter spécifiquement certaines protéines par la technique de
l’immunobuvardage.
2.2.7 Immunobuvardage
Cette technique consiste à transférer les protéines séparées par électrophorèse
sur un support solide tel la nitrocellulose à l’aide d’un courant électrique. On
utilise ensuite un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine à étudier
et à l’aide d’un substrat chromogénique ou chemiluminescent, la position et la
quantité de la protéine sont déterminées.
Après le transfert, le blocage des sites de liaison restant de la membrane de
nitrocellulose s’effectue dans le Blotto 5 % (5 grammes de lait en poudre dans
100 ml de PBS) contenant 0.1 % Tween-20 pendant 1 heure en remuant à
température de la pièce.
L’anticorps primaire (surnageant d’hybridome ou anticorps purifiés dilués avec
Blotto 5 %) est ajouté et incubé pendant 1 heure en remuant à température
ambiante. Les anticorps qui ne se sont pas fixés spécifiquement sont éliminés
par 2 lavages consécutifs de 15 minutes avec du PBS/Tween-20 0.1 %.
L’anticorps secondaire GAM-HRP (Goat Anti-Mouse couplé à la Peroxydase de
raifort de Jackson Laboratories), dilué 1:10 000 dans le Blotto 5%/Tween-20
0.1%, est incubé pendant 1 heure en remuant à température ambiante. Les
anticorps qui ne se sont pas fixés sont éliminés par 3 lavages consécutifs de 15
minutes avec du PBS/Tween-20 0.1 %.
62
La révélation est effectuée en recouvrant la membrane avec le substrat
chemiluminescent ECL (Enhance ChemiLuminescence) pendant 1 minute puis
en exposant la membrane sur film Biomax MR (temps variables selon l’intensité
du signal).
2.2.8 Production et purification de la protéine FMR1 recombinante
Tel que mentionné précédemment, la production de la protéine recombinante
s’induit par l’ajout d’IPTG. Lorsque le maximum de production est atteint, les
cellules sont récoltées par centrifugation puis lysées, dans un tampon où la
protéine recombinante est soluble, afin de la purifier avec la matrice Ni-NTA de
Qiagen. L’acide nitriloacétique (NTA) est un agent chélatant les ions nickel
(dans ce cas) laissant deux protons libres sur l’ion. Le tampon de lyse étant à
pH 8.7, les histidines sont déprotonnées, donc chargées négativement (au
niveau de l’azote de l’imidazole: pKa à 6.5). Ainsi, un atome de nickel chélaté
par la NTA peut former des liens avec 2 histidines adjacentes.
Des cultures de 200 mL ont servi à la production de la protéine FRM1
recombinantes. Quatre heures après l’induction à l’IPTG, les cellules ont été
récupérées par centrifugation à 4000 g pendant 20 minutes. Le culot a été
repris dans un volume de 20 mL de tampon de lyse “natif”. Trois cycles de gel
dans une solution de glace sèche et de méthanol puis de dégel dans l’eau froide
ont permis de compléter la lyse.
Le lysat est ensuite centrifugé à 4000 g pendant 20 minutes afin de récupérer
la fraction insoluble contenant la protéine FMR1. Cette étape permet d’éliminer
une bonne quantité de protéines bactériennes s’attachant à la résine Ni-NTA de
façon non-spécifique. Le culot est repris dans le tampon dénaturant “urée” et
63
une fois bien solubilisé, le tout est re-centrifugé à 4000 g afin d’éliminer les
débris cellulaires insolubles.
L’étape de purification débute par l’ajout de la matrice Ni-NTA-agarose au
surnageant dans un ratio 1:30 (format “batch”). Le tout est agité lentement
toute la nuit à la température ambiante. Le lendemain, le mélange est
centrifugé à 800 g, le surnageant est éliminé et les billes Ni-NTA reprises dans 2
mL de tampon d’élution (PBS/500 mM imidazole). L’imidazole entre en
compétition avec l’histidine pour la liaison aux atomes de nickel et les protéines
recombinantes sont éluées.
Après une heure d’agitation, le surnageant est récupéré à la suite d’une
centrifugation à 4000 g pendant 20 minutes et un aliquot du surnageant est
déposé sur gel d’acrylamide afin de vérifier la présence de la protéine FMR1.
Le reste du surnageant contenant la protéine FMR1 est déposé sur un gel
d’acrylamide préparatif pour sa purification. La migration dans le gel
d’entassement est effectuée à 20 mA pendant 90 minutes et celle dans le gel de
séparation à 40 mA pendant 3h30-4h00.
À la suite de la migration, le gel est coloré dans une solution de sulfate de
cuivre 0.3 M pendant 5 minutes puis déposé sur une vitre (afin de visualiser la
bande car c’est une coloration négative) et la bande correspondant à FMR1 est
excisée. Le sulfate de cuivre est éliminé de la bande avec 3 lavages successifs de
15 minutes dans une solution 0.25 M EDTA/0.25 M Tris, l’EDTA servant
d’agent chélatant les ions de cuivre. Une fois la bande lavée, elle est découpée
en petit fragments qui seront insérés dans les carottes servant à
l’électroélution. (Figure 10) Dans le tampon d’électroélution, on retrouve du
SDS qui jouera le même rôle que dans les gels de polyacrylamide.
64
L’électroélution s’effectue dans un montage permettant au courant de passer à
travers des morceaux de gel contenant la protéine à purifier. Le gel est retenu
par une grille au bas de la carotte et les protéines sont entraînées par le
courant électrique jusqu’à une membrane empêchant les molécules de plus de
5 kDa de passer.
À la fin de l’électroélution, la majorité des protéines éluées se retrouvent dans le
bouchon où la membrane se situe. Les différentes fractions de la carotte sont
récupérées et analysées par SDS-PAGE.
Tampon de transfert
Protéines
Morceaux d’acrylamide
Grille
Bouchon + membrane
Figure 10: Montage pour l’électroélution de protéines à la suite d’une électd’acrylamide préparatif. En passant du compartiement supérieur à celui du bas, le courant électrique ent(chargées négativement) hors des morceaux d’acrylamide jusqu’à ce qu’elles sune membrane poreuse qui laisse passer les molécules de poids moléculaire inLe triangle représente le gradient de concentration en protéine qui l’électroélution.
+
rophorèse sur gel
raine les protéines oient arrêtées par
férieur à 5000 Da. se crée pendant
65
2.3 Sélections avec la banque Griffin.1
Les manipulations décrites ci-dessous sont celles que nous avons effectuées
avec la banque Griffin.1. Elles sont tirées du protocole complet disponible sur le
site internet http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/g1p.php.
2.3.1 Croissance de la banque
1- La banque Griffin.1 est un stock bactérien d’environ 1010 clones
différents. La première étape consiste à l’utiliser pour inoculer 500 mL de
milieu 2XTY contenant de l’ampicilline (100 µg/mL) et 1 % de glucose.
2- Laisser croître à 37oC en brassant jusqu’à l’obtention d’une densité
optique (D.O.) de 0.5 (90 à 120 minutes). (Les D.O. sont toujours prises à
600 nm.)
3- Infecter 25 mL (1010 clones) de cette culture avec le phage auxiliaire
M13K07 (Pharmacia) dans un ratio 1:20 (cellules bactériennes:phages)
selon la règle de 1 unité D.O. = 8X108 bactéries/mL. Le reste des 475 mL
de culture servira à faire les stocks de banques secondaires.
4- Incuber les bactéries et les phages à 37oC sans agiter afin de permettre
l’infection.
5- Centrifuger les bactéries infectées à 3300g pendant 10 minutes.
Resuspendre le culot doucement dans 30 mL de milieu 2XTY contenant
de l’ampicilline (100 µg/mL) et de la kanamycine (25 µg/mL). (Les
quantités d’antibiotique sont identiques dans tous les protocoles.)
66
6- Ajouter 470 mL de milieu 2XTY (amp + kan) préchauffé et incuber à 30oC
toute la nuit avec agitation à 300 RPM.
7- Le lendemain, centrifuger la culture à 10 800 g pendant 10 minutes et
récupérer le surnageant.
8- Ajouter 1/5 volume de PEG/NaCl (20 % Polyéthylène glycol, 2.5 M NaCl)
au surnageant. Bien mélanger et laisser une heure ou plus à 4oC.
9- Centrifuger à 10 800 g pendant 30 minutes, resuspendre le culot dans 40
mL d’eau et ajouter 8 mL de PEG/NaCl. Mélanger et conserver à 4oC
pendant au moins 20 minutes.
10-Centrifuger à 10 800 g pendant 10 minutes et aspirer le surnageant.
11-Recentrifuger brièvement et aspirer les restes de PEG/NaCl.
12-Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS et centrifuger à 11 600 g
pendant 10 minutes dans une micro-centrifugeuse pour éliminer les
débris cellulaires restant.
13-Conserver le surnageant de phages à 4oC à court terme ou ajouter 15 %
de glycérol au PBS pour la conservation à long terme.
14-Pour titrer le stock de phages, diluer 1 µL dans 1 mL de PBS et prendre 1
µL pour infecter 1 mL d’une culture de la souche TG1 (non-suppressive)
à une D.O. de 0.4-0.6. Étaler 50 µL de cette culture ainsi que 50 µL des
dilutions 1/100 et 1/10 000 sur des boîte de Pétri contenant du milieu
TYE-agar, de l’ampicilline et 1 % glucose et incuber toute la nuit à 37oC.
67
2.3.2 Croissance des banques secondaires
1- Laisser croître pendant 2 heures à 37oC avec agitation les 475 mL de
culture restants de l’étape 2 de la section précédente.
2- Récupérer les cellules par une centrifugation de 10 minutes à 3300 g.
Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu 2XTY contenant 15 % de
glycérol et faire 10 aliquots de 1 mL.
3- Conserver ces stocks secondaires à -70oC. Titrer le stock avant
l’utilisation de ces banques. Il faut utiliser 1010 clones pour avoir une
bonne représentativité.
2.3.3 Première sélection sur Immunotubes™
Nous avons choisi d’effectuer nos sélections dans des immunotubes™ (Nunc),
des tubes en polypropylène sur lesquels peuvent être accrochés des antigènes à
l’aide de liens non-covalents.
1- Fixer l’antigène à l’immunotube en remplissant ce dernier de tampon
carbonate à pH 9.6 contenant l’antigène (50 µg de protéines FMR1
recombinante/mL) et en le laissant à température ambiante toute la nuit.
2- Le jour suivant, rincer le tube 3 fois avec du PBS.
3- Remplir le tube jusqu’au bord avec du Blotto 2 %. Couvrir et incuber à
37oC pour 2 heures afin de bloquer les sites de liaison restés disponibles.
68
4- Laver le tube 3 fois avec du PBS.
5- Additionner 4 mL de Blotto 2 % contenant 1013 phages (100 µL ) obtenus
à l’étape 13 de la section 2.3.1. Incuber 30 minutes à la température de
la pièce, en rotation continue, et ensuite laisser reposer pendant 90
minutes. Jeter les phages qui ne se sont pas liés.
6- Pour le premier tour de sélection, laver le tube 10 fois avec du PBS-
Tween-20 0.1 % puis 10 fois avec du PBS pour éliminer le détergent. Pour
les autres tours de sélections, 20 lavages avec puis sans détergent seront
effectués.
7- Éliminer l’excès de PBS du tube et éluer les phages en ajoutant 1 mL
d’une solution de triéthylamine 100 mM et mettre en rotation continue
pendant 10 minutes.
8- Lors du décrochage des phages, préparer un tube contenant 0.5 mL de
Tris 1 M pH 7.4 afin de neutraliser la solution contenant les phages de
l’étape précédente. Les phages peuvent être conservés à 4 oC ou utlisés
pour l’infection à la sélection suivante.
9- Après l’élution, ajouter un autre 200 µL de Tris 1M dans l’immunotube
pour neutraliser le triéthylamine contenant les phages restants.
10-Prendre 9.25 mL d’une culture TG1 en phase exponentielle et
ajouter 0.75 mL de phages élués. Ajouter un autre 4 ml de la même
culture dans l’immunotube et incuber à 37 oC pendant 30 minutes sans
brasser.
69
11- Rassembler le 10 mL et le 4 mL de bactéries TG1 infectées et prendre 100
µL pour effectuer 5 dilutions 1/100 en séries. Étaler ces dilutions sur des
Pétris TYE contenant de l’ampicilline et 1 % de glucose.
12-Prendre le reste de la culture TG1 infectée et la centrifuger à 3300g
pendant 10 minutes. Resuspendre le culot de bactéries dans 1 mL de
milieu 2XTY et étaler sur un pétri Nunc Bio-Assay (30 cm X 30 cm) de
TYE contenant ampicilline et 1 % glucose.
13-Laisser le tout croître à 30 oC toute la nuit.
2.3.4 Préparation des phages
1- Ajouter 5 mL de milieu 2XTY (ampicilline-1 % glucose) sur le Pétris Bio-
Assay et ramasser les bactéries stérilement à l’aide d’un râteau de verre.
Utiliser 50-100 µL de bactéries pour inoculer 100 mL de milieu 2XTY
(ampicilline-1 % glucose). Ranger le reste des bactéries à -80 oC. S’assurer
que la D.O. des 100 mL de culture est inférieure à 0.1.
2- Laisser croître les bactéries jusqu’à l’obtention d’une D.O. de 0.5.
3- Infecter 10 mL de cette culture avec M13K07 en utilisant le même ratio
que mentionné précédemment.
4- Incuber à 37 oC pendant 30 minutes sans agiter (bain).
5- Centrifuger les bactéries infectées à 3300 g pendant 10 minutes.
Resuspendre doucement le culot dans 50 mL de milieu 2XTY (ampicilline
et kanamycine) et incuber toute la nuit à 30 oC sous agitation.
70
6- Prendre 40 mL de cette culture et la centrifuger à 10 800 g pendant 10
minutes.
7- Ajouter 1/5 volume (8 mL) de PEG/NaCl au surnageant, bien mélanger et
laisser au moins 1 heure à 4 oC.
8- Centrifuger à 10 800 g pendant 10 minutes et aspirer le surnageant.
9- Recentrifuger brièvement et aspirer les restes de PEG/NaCl.
10- Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS et centrifuger à 11 600 g dans
une micro-centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires restants.
11- 1 mL de ces phages peut être conservé à 4 oC et l’autre millilitre peut être
utilisé pour le tour de sélection suivant.
12- Répéter 2 à 3 autres sélections. (sections 2.3.2 et 2.3.3)
2.3.5 Production de fragments d’anticorps solubles
1- Prendre 10 µL de phages élués à chaque sélection (environ 105 phages) et
infecter 200 µL d’une culture de la souche HB2151 (non-supressive) en
phase de croissance exponentielle (D.O. 0.5-0.7) à 37 oC pendant 30
minutes sans brasser. Étaler 1, 10 et 100 µL et une dilution 1:10 sur des
boîtes de Pétri contenant ampicilline et 1 % glucose. Incuber à 37 oC
toute la nuit.
2- Inoculer une plaque de 96 puits contenant 100 µL de milieu 2XTY
(ampicilline-1 % glucose) à partir de colonies isolées et faire croître toute
la nuit à 37 oC sous agitation.
71
3- Transférer un inoculum (2 µL) à chaque puits d’une seconde plaque de 96
puits contenant 200 µL de milieu 2XTY frais (ampicilline/glucose 0.1 %).
Croître à 37 oC jusqu’à une D.O. de 0.9.
4- Une fois cette densité optique atteinte, ajouter 25 µL de milieu 2XTY
contenant de l’ampicilline et 9 mM d’IPTG (final 1 mM). Continuer à
agiter en incubant à 30 oC pendant 16 à 24 heures.
5- Pendant cette incubation, tapisser une plaque ELISA 96 puits avec 100
µL d’une solution d’antigène (50 µg/mL) toute la nuit à température
ambiante dans un tampon carbonate pH 9.6.
6- Le jour suivant, rincer la plaque ELISA 3 fois avec du PBS et bloquer la
plaque avec une solution PBS-BSA 3 % pendant 2 heures à 37 oC.
7- Centrifuger les plaques contenant les cultures bactériennes à 1800 g
pendant 10 minutes, prendre 100 µL du surnageant (contenant les
scFvs), l’ajouter à la plaque ELISA et laisser incuber à température
ambiante pendant 1 heure.
8- Éliminer le surnageant de la plaque ELISA et laver 3 fois avec du PBS.
9- Ajouter 50 µL d’anticorps 9E10 à une concentration de 4 µg/mL dans
une solution de PBS-BSA 1 %. Incuber 60 minutes à température de la
pièce et laver 3 fois avec une solution de PBS-Tween-20 0.05 % puis 3
fois avec du PBS seul.
10-Développer avec le substrat TMB (100 mg TMB/mL dans une solution
d’acétate de sodium pH 6.0. Ajouter 10 µL de peroxyde d’hydrogène 30 %
par 50 mL de solution TMB juste avant son utilisation.
72
11-Ajouter 100 µL de substrat à tous les puits et attendre 10 minutes. Une
coloration bleue va se développer.
12-Arrêter la réaction par l’ajout de 50 µL d’acide sulfurique 1M.
13-Lire la D.O. à 650 nm et à 450 nm. Soustraire la D.O. à 650 nm de celle
à 450 nm.
2.4 Dot-blot
Le dot-blot consiste à déposer des protéines sur une membrane de
nitrocellulose sous forme de points puis à effectuer les étapes d’un
immunobuvardage classique. Dans notre cas, nous avons utilisé le système de
Life Technologies (The convertible® filtration manifold system) qui permet de
transférer les protéines sur la membrane à travers de petites fentes à l’aide
d’une succion. Nous avons effectué le dot-blot sur 2 échantillons de 10 µL de
phages élués lors de la dernière sélection avec le peptide de la portion C-
terminale de la protéine FMR1. L’anticorps primaire utilisé pour l’un des
échantillons était l’anti-M13 (Amersham Biosciences) et l’autre était l’anticorps
9E10 (anti-cmyc, Santa Cruz Biotechnology). L’anticorps secondaire utilisé est
SAM-HRP (Anti-souris chez la brebis, Amersham) et la détection est faite telle
que décrit dans la section immunobuvardage. Cette expérience nous a permis
d’évaluer la proportion de phages exprimant les scFvs à leur surface.
73
2.5 Hybridomes
L’immunisation des souris et la fusion ont été effectuées par Patricia John
Sauder de l’équipe du Dr. John Wilkins. (CGDN Immunoprobe core facility,
Université du Manitoba)
2.5.1 Immunisation
Pour la première immunisation, 4 souris Balb C femelles ont reçu une injection
sous-cutanée d’environ 50 µg de protéines FMR1 tronquées diluées 1:2 dans
l’adjuvant TiteMax Gold (Cederlane). Chacune des souris a été réinjectée 4 et
12 semaines après la première injection avec la même quantité de protéines et
d’adjuvant. L’adjuvant sert à stimuler le système immunitaire augmentant ainsi
les chances d’obtenir de bons anticorps contre la protéine.
Nous avons vérifié la présence d’anticorps spécifiques dans les fluides
péritonéaux par immunobuvardage sur des homogénats totaux de lignées
lymphoblastiques normales (875 A) et X-fragile (GM 09145). Le mini-gel
d’acrylamide 8 % et l’immunobuvardage ont été effectué tel que décrit
précédemment. Les liquides péritonéaux des souris immunisées constituaient
la source des anticorps primaires pour l’immunobuvardage (dilués 1:200 dans
le Blotto 5 %). Finalement, une dernière injection intrapéritonéale a été
effectuée sur la souris produisant des anticorps dirigés contre la protéine FMR1
(50 µg sans adjuvant) avant l’excision de la rate.
74
2.5.2 Fusion
Dans le processus de création d’hybridomes, la fusion permet de rendre
immortelles des cellules productrices d’anticorps en les fusionnant à des
cellules cancéreuses à l’aide de polyéthylène glycol (PEG).
Les cellules de rate de la souris ont été lavées avec du HBBS et le ratio de
cellules de rate: cellules de myélome Sp2/O était de 4:1 lors de la fusion. Le
milieu de culture utilisé est le RPMI (Gibco) enrichie avec 10 % de sérum de
veau foetal (Gibco), du CPSR-3 (Sigma), un mélange pénicilline-streptomycine
(Bio-Média), du milieu HT (Sigma) et de l’aminoptérine dans un volume final de
190 ml. Le milieu de fusion complet contenant les cellules a été aliquoté dans
900 puits en fractions de 200 µL. Les surnageants ont été testés par ELISA
dans des plaques contenant la protéine FMR1 tronquée à une concentration de
5 µg/mL. Nous avons confirmé, par immunobuvardage, la spécificité des
hybridomes positifs. Les hybridomes sélectionnés ont ensuite été clonés deux
fois par dilution limite et leur spécificité reconfirmée par immunobuvardage tel
qu’effectué pour la vérification des liquides péritonéaux.
2.6 Caractérisation des anticorps
Pour la production d’anticorps, nous avons cultivé les hybridomes dans le RPMI
1640 enrichi avec 10 % de sérum de veau foetal à 37oC dans un atmosphère de
5% CO2. Une fois la “confluence” atteinte, une ou deux boîtes de culture sont
diluées 1:10 avec du milieu frais et remises en culture. Les autres boîtes
servant à la production d’anticorps sont conservées en culture pour deux
semaines supplémentaires jusqu’à la mort cellulaire complète. Le surnageant
contenant les anticorps est récupéré à la suite de la centrifugation de la
culture. Nous avons déterminé la classe et la sous-classe des anticorps avec le
75
kit IsoStrip Mouse Monoclonal Isotyping kit (Roche) qui permet aussi de
déterminer la chaîne légère de l’anticorps (λ ou κ).
2.6.1 Purification des anticorps
Une fois les chaînes légères identifiées, nous avons débuté la purification des
différents anticorps. Pour cela, nous avons préparé des colonnes d’affinité en
déposant 700 µL de résine agarose-protéine-L dans une seringue 1CC dont le
bout avait été bouché avec de la laine de verre. Le surnageant des hybridomes
a été dilué 1:1 avec du PBS 2X, stérilisé sur un filtre 0.22 µm puis passé sur la
colonne. Les protéines liées de façon non-spécifique ont été lavées avec 10 mL
de PBS 1X. Les anticorps sont ensuite élués avec une solution 0.1 M glycine-
HCl pH 2.0 et l’éluat est neutralisé avec du Tris 1M pH 8.8 (pH final aux
environs de 7.5). Les différentes fractions ont été déposées sur 2 mini-gels
d’acrylamide 8%. Un des gels a été coloré au bleu de Coomassie et l’autre a été
transféré pour effectuer un immunobuvardage (l’anticorps GAM-HRP a été
utilisé pour la détection).
Nous avons choisi d’utiliser la protéine-L pour faire la colonne d’affinité car
celle-ci, contrairement aux protéines G et A, ne possède pas d’affinité pour les
anticorps bovins. Ainsi, nous pouvons purifier nos anticorps à partir d’un
milieu de culture contenant du sérum de veau fétal (ce qui facilite la croissance
des hybridomes) sans danger de contamination avec les anticorps bovins.
2.6.2 Spécificité
76
Afin de vérifier si les anticorps produits par les hybridomes reconnaissaient les
protéines FMR1 endogènes, nous les avons utilisés en immunobuvardage sur
des extraits de lignées lymphoblastiques normale (875 A) et X-fragile (GM
09145) (Fig. 15 p.92). Les résultats obtenus nous ont donné des informations
quant à la spécificité des anticorps. Nous avons ensuite vérifié si le plus
spécifique de nos anticorps (mAc 14D3) détectait aussi les protéines
homologues FRX1/FXR2 par immunobuvardage. Nous avons choisi d’étudier
des homogénats de cerveau et de testicules d’une souris normale car c’est dans
ces tissus que l’on retrouve le plus de protéines FRM1. De plus, nous avons
aussi vérifiés des homogénats de muscles squelettiques et cardiaques d’une
souris normale puisque l’absence de protéines FMR1 permet de visualiser la
réaction croisée avec FXR1P qui s’y trouve en grande quantité. Finalement, les
mêmes tissus provenant d’une souris knock-out ont été étudiés simultanément
pour confirmer l’absence de réactions croisées qui pourraient être voilées par la
présence des bandes correspondant aux protéines FMR1. Nous avons aussi
utilisé l’anticorps 1C3 sur les mêmes échantillons afin de vérifier la réaction
croisée de ce dernier.
2.6.3 Immunoprécipitation
Le principe de l’immunoprécipitation repose sur la création d’un réseau
protéique en utilisant des anticorps spécifiques comme agent de liaison. Le
premier anticorps se lie aux protéines à précipiter et un anticorps secondaire
(tel un anti-souris de chèvre) permet de relier les anticorps primaires en réseau.
Il en résulte un complexe de poids moléculaire élevé qui peut être précipité par
centrifugation. Une autre stratégie consiste à utiliser un composé
reconnaissant l’anticorps primaire (ou secondaire) et qui est suffisamment
lourd à lui seul (tel la protéine L-agarose) pour permettre la précipitation du
complexe par centrifugation.
77
Nous avons tenté l’isolement de la protéine FMR1 endogène par
immunoprécipitation à partir de lysats de cellules HeLa et de cellules de la
lignée lymphoblastique normale 875 A. Quatre tampons de lyse différents ont
été utilisés soient les tampons RIPA avec et sans SDS, le TBS/1% SDS et le
TBS/1% Triton X-100. Nous avons testé le surnageant d’hybridome de 14D3 et
l’anticorps sous sa forme purifiée.
Pour la préparation des homogénats, environ 106 cellules ont été lysées dans 2
mL des différents tampons puis laissées 1 heure (ou toute la nuit) à 4 oC. Le
lysat a ensuite été centrifugé à 13000 RPM pendant 5 minutes et le surnageant
récupéré. Nous avons éliminé les protéines se liant de façon non-spécifique à la
protéine-L ou à l’agarose. Pour cela nous avons ajouté la matrice protéine-L
agarose à raison de 25 µL (1-2 mg/mL) par mL de lysat et incubé à 4 oC en
rotation continue pendant 1 heure. La matrice est récupérée suite à une
centrifugation de 5 minutes à 3000 RPM puis conservée pour son analyse.
En plus des différents tampons de lyse utilisés, nous avons testé les points
suivants afin de vérifier leur influence sur la quantité de protéine FMR1
immunoprécipitées:
- La quantité de lysat utilisé (dilué avec du PBS ou du TBS lorsque
nécessaire). Si on augmente le volume de lysat pour
l’immunoprécipitation, on augmente la quantité de protéine FMR1 et de
protéines contaminantes. Il faut donc trouver un équilibre entre ces deux
paramètres.
- La quantité de surnageant d’hybridome 14D3 ou d’anticorps purifiés.
Lors de l’immunoprécipitation, il faut s’assurer d’utiliser une quantité
adéquate d’anticorps. S’il y a un excès d’anticorps, ceux qui sont libres se
78
lieront de façon non-spécifique et des protéines contaminantes seront
précipitées.
- L’incubation de l’anticorps seul dans le lysat avant l’ajout de la protéine-
L, l’incubation des deux simultanément dans le lysat ou les deux
simultanément mais ayant été incubés ensemble avant leur ajout au
lysat .
- La quantité de protéine-L agarose utilisé peut aussi jouer un rôle. Cette
matrice peut lier d’autres protéines que les IgG, c’est pourquoi il est
nécessaire de faire une immunoprécipitation non-spécifique (clear up)
avec la protéine L-agarose avant. Cependant, si cette dernière est en
excès lors de l’immunoprécipitation proprement dite, il est possible
qu’elle précipite des protéines contaminantes.
- Le temps d’incubation: soit une heure ou toute la nuit à 4 oC.
Suite à l’incubation, le complexe a été récupéré par centrifugation à 3000 RPM
pendant 5 minutes. Le surnageant est conservé pour analyse et le culot est lavé
avec le tampon de lyse ou du PBS. Le culot est ensuite repris dans 100 µL de
tampon Laemmli 1X. Les lavages sont aussi conservés pour analyse. Un
échantillon de chaque étape est dénaturé à 100 oC, séparé par SDS-PAGE et
analysé par immunobuvardage avec l’anticorps 1C3.
2.6.4 Immunofluorescence
L’immunofluorescence est une technique permettant de visualiser la position
intracellulaire d’une protéine en utilisant un anticorps primaire spécifique et un
79
anticorps secondaire couplé à un fluorophore tel le FITC ou la rhodamine. Le
fluorophore est excité à une longueur d’onde distincte et la réémission est
observé avec un microscope à fluorescence. Puisque les cellules sont fixées au
support solide, il est possible de prendre un “instantané” de la position des
protéines dans la cellule. Cette technique permet aussi d’étudier la
colocalisation de plusieurs protéines en utilisant différents fluorophores.
Pour l’immunofluorescence que nous avons effectué, des cellules HeLa ont été
cultivées dans des plaques 6-puits au fond desquelles nous avions
préalablement déposé une lamelle. Deux millilitres de milieu DMEM (Dulbeco
Modified Eagle Medium) contenant 3x105 cellules HeLa ont été déposés dans les
puits. Les cellules ont été mises en culture à 37oC jusqu’à ce qu’elles atteignent
la confluence (24-48 heures). Pour fixer les cellules, les lamelles ont été
immergées dans une solution 4% paraformaldéhyde/0.1 % Triton X-100
pendant 10 minutes puis lavées 3 fois avec du PBS.
La perméabilisation des cellules a été effectuée dans une solution 0.1 % citrate
de sodium/0.1 % Triton X-100 pendant 2 minutes sur la glace. Nous avons lavé
les lamelles 2 fois avec du PBS. Une fois le PBS aspiré, 500 µL des surnageants
d’hybridomes 1C3 et 14D3 ont été déposés sur les cellules puis incubés toute la
nuit à 4 oC dans une boîte de Pétri contenant du coton mouillé afin d’éviter
l’assèchement des cellules. Le lendemain, les cellules ont été lavées 2 fois avec
une solution de PBS/Tween-20 0.1 % pendant 10 minutes.
Dans le noir, 500 µL d’anticorps secondaire GAM-FITC (Jackson lab.) dilué
1:100 dans le PBS/BSA 1 % ont été déposé sur les lamelles et laissée pendant
30 minutes à la température de la pièce. Le tout a été aspiré et les cellules
lavées 2 fois 10 minutes avec du PBS/Tween-20–0.1 %. Nous avons ensuite
couvert les lamelles d’une solution empêchant l’atténuation du signal
fluorescent (DAKO fluorescent mounting medium) et permettant de fixer les
lamelles sur des lames. Les images ont observées sur un microscope Olympus
80
BX60 à 40X et 100X et leur saisie effectuée à l’aide du logiciel Isis (In Situ
Imaging System) de Metasystem.
2.6.5 Immunohistochimie
L’immunohistochimie est un procédé permettant de visualiser la distribution
tissulaire d’une protéine sur des coupes de tissu fixées à un support solide.
Cette technique permet aussi de déterminer si la protéine est cytoplasmique ou
nucléaire. La détection se fait habituellement avec un substrat chromogénique
mais la fluorescence peut aussi être utilisé si le bruit de fond n’est pas trop
élevé. Nous avons utilisé un substrat chromogénique.
Des sections de tissus (5 µm) scellées dans la paraffine ont été déposées sur des
lames prétraitées (VWR Superfrost®plus) et laissées à sécher pendant 24
heures à 37 oC. Après la dissolution de la paraffine dans le toluène, les tissus
ont été réhydratés graduellement dans des solutions d’éthanol (100 %, 95 %,
75 % et 50 %) puis dans l’eau uniquement. L’élimination de l’activité des
peroxydases endogènes a été effectuée en trempant les lames pendant 30
minutes dans une solution PBS-0.3% H2O2. Les déterminants antigéniques des
protéines sont exposés en chauffant les coupes 3 fois 5 minutes au micro-onde
dans une solution de citrate 10 mM pH 6.0. Le blocage des anticorps endogènes
s’effectue avec la solution de blocage du kit Histomouse™ (Zymed) en suivant
les instructions du manufacturier. Les anticorps primaires ont été incubés
toute la nuit à 4 oC. Le lendemain, les lames ont été nettoyées (3 lavages de 2
minutes) avec du PBS 1X. La détection des monoclonaux est effectuée à l’aide
d’un anti-IgG de souris biotinylé qui est déposé sur les coupes et incubé
pendant 30 minutes à la température de la pièce. Les lames ont été nettoyées
tel que décrit précédemment. Un conjugué streptavidine-peroxydase (HRP) a été
laissé sur les coupes pendant 30 minutes. L’excédant a été rincé puis nous
81
avons ajouté le substrat AEC provenant du kit et l’avons laissé sur les lames
pendant 10 minutes. Lors de la détection des protéines, le substrat devient
rouge. Le tout est rincé à l’eau. Certaines lames ont été contre-colorées avec
l’hematoxylin (permet de visualiser le noyau en colorant l’ADN(bleu)) pendant
30 secondes avant le montage final avec les lamelles. Les images ont été prises
avec un appareil Orthomate sur un microscope Leica DMRB à 40X et 100X.
2.6.6 Cartographie des épitopes
Une des étapes importantes de la caractérisation d’un anticorps consiste à
identifier la portion de la protéine qui est reconnue par celui-ci. Pour la
cartographie des épitopes de nos anticorps, nous avons amplifié par PCR des
portions du gène FMR1 à partir du vecteur pQE31/FMR1 (ayant servi à la
production de la protéine tronquée). Ces produits PCR ont été cloné dans le
vecteur pQE31 et les peptides produits tel que décrit à la section 2.2.8 (p. 60).
Le mélange pour l’amplification PCR des fragments contenait 5 ng de vecteur
pQE31/FMR1, 1,25 µM de chaques amorces (Tableau 2 p.79), 200 µM de
dNTPs, la solution Q, le tampon PCR et 2 unités de la polymérase Taq de
Qiagen dans un volume final de 40 µL. Pour chacun des fragments amplifiés, 5
tubes ayant 40 µL de mélange PCR ont été préparés. L’amplification a été
vérifiée en déposant 30 µL sur un gel d’agarose 1 % et la migration a été
effectuée à 100 volts pendant 1 heure dans le TAE. Le gel était ensuite coloré
au BrEt et le produit PCR visualisé sur un transilluminateur UV.
Nous avons inséré un site de restriction Pst I ou Hind III dans chacune des
amorces de manière à pouvoir cloner le fragment PCR dans le vecteur pQE31
digéré par l’enzyme correspondant. À la suite de l’amplification, le produit PCR
restant (170 µL) a été digéré toute la nuit à 37 oC dans un mélange contenant
100 unités de PstI ou HindIII (New England Biolabs), le tampon suggéré par le
82
manufacturier et de la BSA à 100 µg/mL (PstI). Le lendemain, 100 unités
supplémentaires d’enzyme ont été ajoutées au mélange et la digestion prolongée
de quelques heures.
2.6.6.1 Purification phénol/chloroforme des digestions
Suite à la digestion, il est nécessaire d’éliminer les enzymes avant d’effectuer la
ligation. Le fait que les protéines soient solubles dans les solvants organiques
alors que les acides nucléiques ne le sont pas peut être exploité. En utilisant un
mélange eau/phénol, les enzymes et l’ADN digéré peuvent être séparé. Les
phases sont séparées par centrifugation et l’ADN se retrouve dans la phase
aqueuse. Le reste du phénol est éliminé par l’extraction avec du chloroforme
qui n’est pas miscible avec la phase aqueuse.
La purification des digestions à débuté en ajoutant 1 volume (500 µL) de
phénol/chloroforme puis en vortexant jusqu’à la formation d’une émulsion. Les
tubes ont été centrifugés à 15 000 RPM pendant 3 minutes avant de récupérer
la phase aqueuse (supérieure). L’extraction a été répétée une seconde fois.
Ensuite, nous avons ajouté 1 volume de chloroforme et le tout était vortexé
jusqu’à émulsion. Le tube ont été centrifugé à 15 000 RPM pendant 3 minutes
et la phase aqueuse récupérée.
2.6.6.2 Précipitations à l’alcool
La concentration en sel de la phase aqueuse a été augmentée à 0.25 M afin
d’augmenter la force inonique. Ceci a pour effet de diminuer la solubilité de
l’ADN. Par la suite, 2 volumes d’éthanol absolu froid ont été ajoutés. Le mélange
est laissé à –20 oC pendant 1 heure puis centrifugé pendant 30 minutes à 14
83
000 RPM à 4 oC. Le surnageant a été éliminé par décantation et le culot lavé à
l’éthanol 70 % froid. À la suite d’une centrifugation à 14 000 RPM, l’éthanol a
été décanté et le culot laissé à sécher. Le culot d’ADN a été repris dans 30 µL
d’eau ultrapure et laissé à 37 oC pendant 20 minutes pour permettre sa
dissolution.
La ligation du produit PCR digéré est effectuée dans un mélange contenant le
vecteur pQE31 digéré avec l’enzyme correspondante (puis déphosphorylé avec
la phosphatase d’intestin de veau), 3 µL de fragments PCR, le tampon de
ligation recommandé par le manufacturier (NEB) et 400 unités de T4 ligase
dans un volume final de 20 µL. Le mélange est incubé toute la nuit à 16 oC
dans un thermocycleur Perkin-Elmer. Le lendemain, les ligations ont été
purifiées sur microcon-100 (Amicon) selon les instructions du manufacturier.
La transformation de cellules XL1Blue avec les vecteurs contenant les inserts a
été effectuée tel que décrit précédemment dans la section “Transformation par
électroporation”. L’orientation et la taille de l’insert ont été vérifiées par PCR en
utilisant l’amorce PBF (dans le vecteur) et l’amorce inverse utilisée lors de
l’amplification PCR du fragment à partir du vecteur (Tableau 2). Le mélange et
les conditions de PCR sont identiques à ce qui a été décrit précédemment dans
cette section. Les plasmides ont ensuite été produits, purifiés et reclonés dans
la souche M15 pour la production des fragments peptidiques (Figure 28 et 29
p.111-112).
Les différents fragments peptidiques ont été produits tel que décrit dans la
section 2.2.8 (p. 60). Cependant, les peptides n’ont pas été purifiés, le culot de
cellules ayant été repris directement dans le tampon Laemmli puis séparé par
SDS-PAGE. Les échantillons ont été transférés sur une membrane de
nitrocellulose tel que décrit précédemment. Un immunobuvardage a été effectué
84
pour chacun des 22 hybridome conservés. Le surnageant constituait la source
d’anticorps primaires.
Tableau 2: Amorces utilisées pour l’amplification de fragments PCR pour la production de peptides servant à la cartographie des épitopes. Les sites de restriction Pst I et Hind III ont été ajoutés aux amorces pour le clonage des fragments dans pQE31.
Fragments Séquen ces des amorces Nucléotides amplifiés 31R1 IF : GCATCTGCAGATGGAGGAGCTGGTGGTGG
XR : ACGTCTGGCAGCCTTCTTCTTGTGGAACAT 0-828
(Exons 1 à 8) 3.5 XVF: ACGTAAGCTTCAGAGACGAACTCAGTGATTGG
XVIIR: GCATAAGCTTAGGGTACTCCATTCACGAGTGG 513-632
(Exons 15 à 17) 10.8 IF
XR : ACGTCTGGCAGCCTTCTTCTTGTGGAACAT 0-990
(Exons 1 à 10) D1.6 IIIF : ACTGCTGCAGGAAAGTGATGAAGTTGAG
XIIR : CTGACTGCAGCTGCCAAGCCTTGAGTTC 180-1183
(Exons 3 à 12) 13B.5 IF
XIIIBR : CTGACTGCAGCCTTTAAATAGTTCAGGTG 0-1275
(Exons 1 à 13) 14.1 IF
XIVR : CTGACTGCAGCTAGCTCCAATCTGTCGCAAC 0-1341
(Exons 1 à 14) D4.5 IF
XVF : ACGTCTGCAGCCAATCACTGAGTTCGTCTCTG 0-1539
(Exons 1 à 15) PB PBF : CGGATAACAATTTCACACAG
PBR : GTTCTGAGGTCATTACTGG 0-1899
(Exons 1 à 17)
2.6.7 ELISA
Une fois les épitopes identifiés, nous avons sélectionné deux anticorps
reconnaissant des régions ne se chevauchant pas afin de mettre au point un
ELISA-sandwich. Cette technique consiste à fixer un anticorps spécifique aux
puits d’une plaque ELISA, de bloquer les sites de liaison restants et d’incuber
l’antigène (purifié ou dans un homogénat cellulaire) que l’on désire détecter.
85
Ensuite, le second anticorps (couplé à une enzyme, à la biotine ou marqué
radioactivement) est déposé dans les puits et la présence de la protéine est
détectée (par un changement de couleur ou par l’émission de radioactivité).
Puisque le premier anticorps (le plus spécifique) est en excès, le signal obtenu
est proportionel à la quantité d’antigène. Ainsi, en effectuant une courbe
standard avec l’antigène purifié, il est possible de quantifier simultanément
l’antigène dans des échantillons où sa concentration est inconnue.
Comme premier anticorps, nous avons choisi 14D3 puisqu’il est celui
présentant la plus grande spécificité. Celui-ci est adsorbé à la paroi des puits
en l’incubant toute la nuit à 4 oC dans un tampon carbonate pH 9.6 à une
concentration de 4 µg/mL. Le lendemain, les puits sont nettoyés avec du
PBS/Tween-20 0.1 % (3 lavages). Les puits sont ensuite bloqués avec du
Superblock™ dans le PBS (Pierce) pendant 1 heure à 37oC. Les puits sont lavés
tel que décrit plus haut avant l’ajout de l’inconnu et de la protéine FMR1
tronquée (quantité variant entre 0 et 8 ng). Celle-ci est incubée à la température
de la pièce pendant une heure en agitant à 200 RPM et les protéines libres sont
lavées. L’anticorps secondaire (11F7-biotine, biotinylé avec le kit EZ-Link™
Sulfo-NHS-Biotin de Pierce) est ajouté à une concentration de 1 µg/mL à raison
de 100 µL par puits. Il est incubé à la température de la pièce pendant 1 heure
en agitant suivi de 3 lavages. Finalement, le conjugué streptavidine-HRP (100
ng/puit) est incubé pour 30 minutes à la température de la pièce et les
conjugués non-liés sont éliminés au cours des lavages. Le substrat TMB (TMB
peroxydase de Bio-Rad) est ajouté (100 µL par puits) et nous laissons la
coloration se développer pendant 5 minutes (plus ou moins selon l’intensité de
la coloration) avant d’arrêter la réaction en ajoutant 50 µL d’acide sulphurique
1M (H2SO4). La coloration passe du bleu au jaune et la densité optique est lue à
450 nm sur un lecteur de plaque Bio-Rad. Une correction à 650 nm peut être
effectuée.
86
2.7 Composition des tampons
Tampon TAE
40 mM. Tris-base, 25 mM EDTA (Acide éthylenediamine tetraacétique)
20 mM acide acétique.
Milieu LB
1 % tryptone, 0.5 % d’extrait de levure et 1 % NaCl. 1.5 % de bacto-agar est
ajouté si l’on veut faire des Pétris.
Milieu 2XTY
1.6 % tryptone, 1 % d’extrait de levure et 0.5 % NaCl . 1.5 % de bacto-agar est
ajouté si l’on veut faire des Pétris.
Tampon Laemmli 3X
200 mM Tris 1M pH 6.9, 45 % glycérol, 6 % SDS , 6 % µL β-mercaptoéthanol et
0.03 % de bleu de bromophénol.
Tampon d’électrophorèse pour gel de protéine SDS-PAGE
0.1 % SDS, 100 mM Tris-base et 750 mM de glycine, pH 8.3.
Tampon de transfert pour immunobuvardage
100 mM Tris-base, 750 mM de glycine et 25% méthanol (pH > 8.0).
Solution de coloration Coomassie
0.04 % Brilliant blue Coomassie, 40 % méthanol, 10 % acide acétique.
87
Solution de décoloration
40 % acide acétique et 25 % méthanol .
Tampon phosphate salin (PBS)
137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 et 2 mM KH2PO4, pH 8.0.
Tampons d’immunoprécipitations
RIPA
1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 % DOC, 0.1 % SDS (ou non), 150 mM NaCl,
50 mM Tris-HCl pH 7.25 et du PMSF 1mM.
TBS
1 % Triton X-100 (ou un 0.1 % SDS), 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.4, 2 mM
EDTA, 2 mM EGTA, 1 % NP-40, 1 % DOC et du PMSF 1mM.
Tampons d’extraction et de purification de protéines (The
Qiaexpressionnist)
Tampon “natif”
50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH ajusté à 8.0 avec du
NaOH.
Tampon dénaturant “urée”
8 M urée, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, pH ajusté à 8.0 avec du NaOH.
88
Tampon dénaturant “guanidine”
6 M guanidine-HCl, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, pH ajusté à 8.0 avec du
NaOH.
Tampon d’élution
8 M urée, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-Cl, 500 mM imidazole, pH ajusté à 8.0
avec du NaOH ou PBS-500 mM imidazole.
3 Résultats
90
3.1 Production de la protéine et test de solubilité
L’utilisation de la banque de scFvs Griffin.1 nécessite l’antigène sous une forme
pure ou presque. Nous avons donc produit, dans un système bactérien, la
protéine FMR1 fusionnée à un tag hexa-histidine. Ce dernier permet, dans un
premier temps, de détecter si la protéine est produite à l’aide d’un anticorps
anti-hexa histidine, et permet aussi de purifier la protéine à l’aide d’une matrice
Ni-NTA.
Une fois le gène cloné dans la souche d’E. coli, la première étape consistait à
étudier l’expression de la protéine en fonction du temps. Tel que démontré sur
le gel à la figure 11, le maximum d’expression est atteint 4 heures après
l’induction à l’IPTG (Échantillons 6). On retrouve une forme mineure à 80 kDa
et une forme majeure à 60 kDa qui pourrait résulter de la dégradation de celle
de 80 kDa.
L’étape suivante consistait à déterminer dans quel tampon de lyse la protéine
était soluble puisque ce n’est que sous cette forme qu’elle peut être purifié sur
la matrice Ni-NTA. Nous avons donc vérifié les trois tampons recommandés par
le manufacturier soit le tampon “natif”, qui permet de purifier la protéine tout
en conservant la structure adoptée dans la cellule, et les tampons “urée” et
“guanidine” qui sont tous deux dénaturants. Dans le tampon natif, seule une
faible proportion de la protéine FMR1 était soluble (Figure 11, échantillon 9)
alors que le reste se retrouvait dans le culot à la suite de la centrifugation
(Échantillon 10). Cela est probablement dû au fait que la protéine est
séquestrée dans des corps d’inclusion lors de sa production dans le contexte
cellulaire bactérien. Par contre, la protéine FMR1 recombinante était soluble
dans les deux tampons dénaturants et la totalité ou presque se retrouvait dans
les surnageants (Échantillons 11 et 13).
91
80 kDa
60 kDa
8 M 6 7 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5
Figure 11: Cinétique de la production de la protéine FMR1 dans la souche M15 sur une période de 6 heures suivant l’induction à l’IPTG et test de solubilité dans différents tampons de lyse. Échantillons séparés par SDS-PAGE 8%. Gel coloré au bleu de Coomassie. 1: Échantillon non-induit, 2: 30 minutes après induction (a.i.), 3: 60 min. a.i., 4: 120 min. a.i., 5: 180 min. a.i., 6: 240 min. a.i., 7: 300 min. a.i., 8: 360 min. a.i., M: marqueur de poids moléculaire (Flèches rouges: 205 kDa, 115 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa) 9: Surnageant et 10: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “natif”, 11: Surnageant et 12: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “urée” , 13: Surnageant et 14: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “guanidine”. Les flèches noires à la gauche de la figure représentent la forme complète et la forme tronquée de la protéine FMR1 qui sont produites.
La production de la protéine étant fonctionnelle, nous devions nous assurer que
celle-ci était bien FMR1. Nous avons donc effectué un immunobuvardage (avec
l’anticorps 1C3 comme anticorps primaire) sur l’extrait bactérien obtenu 6
heures après l’induction. Nous avons déposé différentes dilutions de cet extrait
(Figure 12, échantillons 2 à 5) et nous avons comparé l’intensité du signal avec
celui de l’extrait avant l’induction (Figure 12, échantillon 1) afin de vérifier
l’efficacité de la production protéique.
92
69 kDa
80 kDa
1 2 3 4 5 6
Figure 12: Immunobuvardage avec l’anticorps 1C3 sur différentes dilutions d’un lysat de cellules produisant la protéine FMR1 recombinante. Échantillons séparés par SDS-PAGE 8%. Puit 1: Échantillon non-induit, 2: Éch. Induit, 3: Éch. induit dilué 10X, 4: Éch. induit dilué 100X, 5: Éch. induit dilué 1000X, 6: Éch. induit dilué 10 000X. La position des marqueurs est indiquée à la gauche de la figure.
En comparant lՎchantillon non-induit aux dilutions de lӎchantillon induit,
nous avons évalué que l’induction augmentait la production de deux à trois
ordres de grandeur. On peut voir que la forme à 60 kDa est majoritaire et est
peut-être un produit de dégradation de la forme à 80 kDa. Des tests de
production dans des milieux de culture contenant des inhibiteurs de protéase
n’ont pas permis d’obtenir une plus grande proportion de protéines de 80 kDa
ni de diminuer les produits de dégradation de moins de 60 kDa. Ces résultats
démontrent que les deux formes produites (à 80 kDa et 60 kDa) sont
effectivement des protéines FMR1.
3.2 Purification de la protéine recombinante
Le tag hexa-histidine permet de purifier la protéine en utilisant une matrice Ni-
NTA. Compte tenu du volume nécessaire pour produire plusieurs milligrammes
de la protéine, nous avons décidé d’utiliser la résine agarose-Ni-NTA qui permet
93
d’extraire les protéines produites à plus grande échelle. L’élution des protéines
est effectuée en mélangeant la matrice Ni-NTA à un tampon à pH acide ou un
tampon contenant de l’imidazole. Cette molécule fait compétition à l’histidine
pour la liaison aux ions de nickel.
Lors de nos expérimentations, nous avons remarqué que l’élution à pH acide
affectait l’intégrité de la protéine. Nous avons décidé d’utiliser un tampon PBS
contenant 500 mM d’imidazole (au lieu des 250 mM recommandés) permettant
ainsi d’éluer les protéines dans un plus petit volume. Cependant, plusieurs
autres protéines s’accrochent à la matrice Ni-NTA et sont éluées avec les
protéines FMR1. Une partie de ces protéines ont été éliminées de différentes
manières:
Tout d’abord, une bonne proportion des protéines bactériennes sont solubles
dans le tampon natif. En lysant les cellules dans ce tampon, ces protéines se
retrouvaient dans le surnageant (Voir Figure 11, échantillon 9, p. 86). Les
protéines insolubles (dont la protéine FMR1) se retrouvaient dans le culot après
la centrifugation puis étaient solubilisées dans le tampon “urée”.
En second lieu, nous avons ajusté la quantité de résine Ni-NTA de manière à ce
qu’il n’y en aie que très peu de libre une fois toutes les protéines FMR1
accrochées. Cela permettait de limiter la quantité de protéines se liant à la
matrice de façon non-spécifique.
Finalement, nous avons éliminé une partie des protéines contaminante en
ajustant la quantité d’imidazole lors des lavages. En ajoutant 20 mM
d’imidazole lors des lavages, les protéines contaminantes fixées faiblement
décrochaient alors que les protéines ayant le tag histidine restaient liées.
Malgré tout, il restait toujours des protéines contaminantes (Échantillon 1 de la
Figure 13). Une partie de ces contaminations sont des produits de dégradation
94
de la protéine FMR1 ayant le tag hexa-histidine. La manière la plus simple de
purifier presque complètement la protéine majeure (60 kDa) consistait à
séparer l’élution sur un gel d’acrylamide préparatif puis de découper la bande
correspondant à la protéine. Nous avons ensuite électroélué les protéines du
gel, obtenant ainsi une forme très enrichie de la protéine FMR1 tronquée.
(Figure 13, échantillons 2 à 5) La mise au point des conditions de production de
la protéine FMR1 recombinante tronquée et de sa purification ont pris près de 6
mois à réaliser.
60 kDa
80 kDa
1 2 3 4 5
Figure 13: Résultat de la purification des protéines recombinantes par électroélution. Échantillons séparés sur SDS-PAGE 8%. Gel coloré au bleu de Coomassie. Échantillon 1: Protéines éluées à la suite de la purification sur matrice Ni-NTA. Échantillons 2 à 5: Fractions recueillies dans le bas des carottes après l’électroélution (Figure 10).
3.3 Phage display
Avec la forme purifiée de la protéine FMR1 tronquée, nous avions tout le
nécessaire pour débuter l’utilisation de la banque Griffin.1. Après
l’amplification de la banque, nous avons mesuré le titre et celui-ci était de 1.2
x 1014 phages dans un millilitre. La diversité de la banque étant de 1010 clones
cela signifie que si chacun des clones s’est reproduit de manière équivalente,
nous avons près de 10 000 copies de chaque phage. Le protocole indique qu’il
95
faut utiliser 1012-1013 phages, impliquant que nous pouvions faire au moins 10
sélections en utilisant 1013 phages. Plusieurs essais de sélection ont été
effectués avec la protéine purifiée et bien que nous observions une
augmentation du nombre de phages élués après chaque tour de sélection,
aucun scFv ou phage spécifique à la protéine FMR1 n’a pu être isolé.
Nous avons envisagé que l’adsorption de la protéine tronquée au support solide
(immunotube) pouvait être limitée par l’encombrement stérique. C’est pourquoi
nous avons décidé d’utilisé un peptide pour les sélections. Cela nous permettait
de mettre beaucoup plus de peptides dans l’immunotube et la région reconnue
parles scFvs était restreinte. Nous avons d’abord tenté une sélection sur des
peptides uniques à la protéine homologue FXR1 afin de vérifier si les sélections
fonctionnaient avec des antigènes de moins de 20 acides aminés. Ceux-ci ont
été généreusement fournis par le Dr. Edouard W. Khandjian qui s’en était
préalablement servi pour immuniser des lapins et des souris (Khandjian et al.
1998). Bien que nous obtenions un enrichissement similaire aux sélections
effectuées avec la protéine FMR1 tronquée, dans ce cas-ci nous avons réussi à
obtenir des scFvs qui reconnaissaient la protéine FXR1 en immunobuvardage
(Figure 14 A). Le signal obtenu était très faible et nous avons tenté de produire
une plus grande quantité de scFvs afin d’augmenter le signal.
Malheureusement, nous n’avons pas réussi à faire produire les fragments
d’anticorps solubles par les bactéries non-suppressives lors des cultures
subséquentes. Nous n’avons pas été en mesure de reproduire les résultats
exposés dans la figure 14A.
Puisque la sélection avec des peptides avait donné des résultats encourageants,
nous avons décidé d’utiliser un peptide de 15 acides aminés se situant en C-
terminal de la protéine FMR1. Encore une fois, nous avons obtenu un certain
enrichissement lors des sélections et nous avons infecté la souche non-
suppressive (HB2151) avec les phages issus de la 4e sélection. Une faible
quantité de scFvs ont été produits et ceux-ci ont été testés par
96
immunobuvardage. Le résultat est présenté en B de la Figure 14. Nous avons
obtenu un signal très faible uniquement avec la protéine FMR1 recombinante
purifiée (forme de 60 kDa). Encore une fois la production de fragments solubles
était en cause et nous n’avons pas réussi à obtenir une production satisfaisante
pour détecter la protéine endogène. Nous avons effectué un cinquième tour de
sélection puis avons infecté la même souche avec les phages élués mais sans
obtenir de scFvs. Ces phages ont aussi été utilisés pour infecter une souche
TG1. La production de ces phages a permis de mesurer la proportion de phage
ayant à leur surface des scFvs. Cette proportion atteint au maximum 10 %.
Pour obtenir les résultats de la figure 14B, il nous fallait exposer plus de 20
minutes afin d’observer un signal comparativement à une dizaine de secondes
avec l’anticorps #830. Les fragments d’anticorps ne pouvant être produits de
façon soluble en grande quantité, nous avons décidé de concentrer nos efforts
sur la production d’anticorps monoclonaux malgré le fait que près de 16 mois
aient été consacrés à la technique du “phage display”.
Nous avons utilisé une des ressources du Réseau Canadien des Maladies
Génétiques pour créer de nouvelles lignées d’hybridomes. Cette partie du projet
a débuté par la production et la purification de près de 10 mg de protéine FMR1
recombinante sous sa forme tronquée. Le processus d’immunisation a nécessité
près de 5 mois et dans l’intervalle nous avons continuer à travailler sur la
sélection de nouveaux scFvs avec la banque Griffin.1 mais sans obtenir de
meilleurs résultats.
97
scFv Anti-FXR1
Anticorps #830
B A
1 minute d’exposition
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
15 minutes d’exposition
C
25 minutes d’exposition
1 2 3 4
Figure 14: Immunobuvardages avec les scFvs obtenus après la sélection avec les peptides issus des protéines FXR1 et FMR1. A: Ac anti-FXR1P (#830 dilués 1:2000 avec du Blotto 5%) B: ScFvs anti-FXR1P (dilués 1:2 avec du Blotto 10%) Puits 1: Protéines FMR1 purifiées, 2: Lysat de bactéries produisant FXR1 recombinant 3: Lysat dilué 1:10, 4: Lysat dilué 1:100, 5: Lysat de bactéries non-induites. C: ScFvs anti-FMRP (dilués 1:2 avec du Blotto 10%) Puits 1: BSA (1 µg), 2: Lysat de cellules HeLa, 3: Protéine FMR1 tronquée enrichie (1 µg), 4: Lysat de bactéries produisant FMR1. Les temps d’exposition sont inscrits à la gauche des figures.
98
3.4 Anticorps monoclonaux
3.4.1 Immunisation des souris Balb C femelles
Les souris ont été immunisées avec la protéine FMR1 recombinante tronquée
en présence d’un adjuvant. Après la troisième injection, nous avons testé les
liquides péritonéaux des souris par immunobuvardage sur des homogénats de
lignées lymphoblastiques normale et X-fragile et seulement une des quatre
souris produisait des anticorps dirigés contre la protéine FMR1. À la suite d’une
réinjection, cette souris à été sacrifiée et les cellules de sa rate ont servi à la
production des hybridomes. Lors du premier criblage, 59 clones positifs ont été
identifiés par ELISA. De ce nombre, 22 reconnaissaient la protéine endogène et
des clones ont été obtenus par dilution limite puis testés à nouveau par
immunobuvardage sur les lignées mentionnées ci-haut. Ceci nous a permis de
vérifier si les anticorps monoclonaux reconnaissaient toujours la protéine
endogène et nous a donné une idée de leur spécificité (Figure 15). Seulement
quatre lignées produisaient des anticorps spécifiques à la protéine FMR1 et
l’anticorps 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant.
Tous les surnageants d’hybridomes ont été testés sur des homogénats totaux
des deux mêmes lignées cellulaires. Nous avons obtenu 4 patrons de détection
différents mais 12B10 est le seul représentant de sa catégorie. Ainsi, lorsque
nous parlerons d’anticorps tels 14D3, 11F7 ou 1C10, nous ferons référence aux
patrons de détections observés sur les immunobuvardages de la figure 15.
Aucun anticorps ne semble être différent des 4 types mentionnés ci-dessus et la
cartographie des épitopes permettra d’appuyer cette hypothèse.
99
N N X X 83 83 A B
62 62
42.5 42.5
N N X X
83 C D
83
62
62
Figure 15: Résultats du criblage des anticorps sur des extraits de lignées de cellules normales et X-fragile effectué par immunobuvardage.
Échantillons séprarés par SDS-PAGE 8%. Lignées lymphoblastiques utilisées: N (Normale) = 875 A et X (X-fragile) = GM 09145. Anticorps: A: Surnageant d’hybridome 14D3 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, B: Surnageant d’hybridome 12B10 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, C: Surnageant d’hybridome 11F7 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, D: Surnageant d’hybridome 1C10 dilué 1:2 avec du Blotto 10%. Les flèches en C et D indiquent la position des protéines FMR1 endogènes. Les positions des marqueurs de poids moléculaires (en kDa) sont indiqués par les tirets.
100
3.4.2 Caractérisation des anticorps
3.4.2.1 Spécificité
Le test de spécificité pour 14D3 a été effectué sur des homogénats totaux de
cerveau, de testicules, de muscles squelettiques et de coeur de souris normale
et knock-out. Ce test a été effectué avec l’anticorps 14D3 qui est le seul à
présenter une bonne spécificité ainsi qu’avec l’anticorps 1C3 pour montrer la
réaction croisée avec la protéine FXR1.
Dans la Figure 16 A (Échantillons 1 et 2) on peut voir que l’anticorps 14D3
détecte uniquement la protéine FMR1 dans le cerveau et les testicules de souris
normales alors que pour les muscles squelettiques, le coeur et les tissus k-o il
n’y a aucun signal observé. Les échantillons présentent un peu de dégradation
mais les résultats montrent bien que cet anticorps est spécifique. L’anticorps
1C3 reconnaît bien la protéine FMR1 dans le cerveau et les testicules (Figure 16
B échantillons 1 et 2) mais on peut voir qu’il détecte simultanément la protéine
FXR1. Ceci est en accord avec l’hypothèse que la protéine FXR1 pourrait
contribuer au signal de FMR1 en immunobuvardage. On observe aussi cette
réaction croisée dans les extraits de cerveau et de testicules de la souris knock-
out. Lorsque l’on surexpose le film (Fig. 16 C), on peut aussi voir que l’anticorps
1C3 détecte les superformes de la protéine FXR1 (81-83 kDa) dans les
échantillons de muscle et de coeur (de souris normale et knock-out).
Évidemment, lorsque la protéine FMR1 est absente ou en faible quantité il est
plus aisé d’observer la réaction croisée.
101
Normale Knock-out
A
1 2 3 4 5 6 7 8 M
B
1 2 3 4 5 6 7 8 M
C
Figure 16: Immunobuvardage démontrant la spécificité des anticorpset 1C3. Les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE 8% A: Anticorps 14D3 pule Blotto 5%, B: Surnageant d’hybridome 1C3 dilué 1:2 dans le Blotto 10d’un blot équivalent à celui en B mais sans le contrôle d’actine. Les homogénats totaux lysés dans le tampon Laemlli, triturés physiquement, spendant 10 minutes à 100oC. 1: Cerveau de souris sauvage, 2: TesticulesMuscles squelettiques de souris sauvage, 4: Coeur de souris sauvage, 5: CeTesticules de souris k-o, 7: Muscles squelettiques de souris k-o, 8: Coeposition des marqueurs de poids moléculaire est inscrite à la droite des figuet B indiquent la position du contrôle d’actine. Anti-actine: Ac JLA20 (DHybridoma Bank at the University of Iowa).
82
62
47.5
%
r
82
47.5
62
r
éodvu
e
82
47.5
62
monoclonaux 14D3
ifié dilué 1:100 dans , C: Surexposition
chantillons sont des niqués puis chauffés e souris sauvage, 3: eau de souris k-o, 6: r de souris k-o. La
res. Les flèches en A velopmental Studies
102
3.4.2.2 Classe
Nous avons ensuite déterminé la classe, la sous-classe et la chaine légère des
anticorps les plus intéressants nous permettant de déterminer lesquels
pourraient être purifiés avec la matrice protéine-L-agarose. Les résultats sont
rapportés dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3: Résultats de l’isotypage des anticorps. L’isotypage a été effectué directement sur les surnageants des hybridomes avec le kit Isostrip Mouse Monoclonal Isotyping de Roche selon les instructions du manufacturier. Nous avons vérifiés un représentant de chaque type d’anticorps décrit à la figure 15.
Anticorps Sous-classe Chaîne légère Purification
1C3 IgG1 Kappa Peu 14D3 IgG2b Kappa Oui 11F7 IgG2a Kappa Oui
12B10 IgG1 Kappa Oui 15G9 IgG1 Kappa Non
3.4.2.3 Immunobuvardage
Nous avons effectué un immunobuvardage avec des homogénats de tissus
totaux afin de vérifier lesquels produisaient la protéine FMR1. L’expérience
démontre bien que la protéine FMR1 n’est pas exprimée dans les mucles et le
coeur (puits 1 et 2). On retrouve un certain niveau d’expression dans tous les
organes à l’exception du foie (puit 5) qui produit peu de protéines FMR1. Les
extraits de cerveau et de testicules ont été dilué (10X et 5X respectivement)
pour cet immunobuvardage afin de ne pas masquer les signaux environnants.
103
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figure 17: Immunobuvardage sur des extraits de tissus murins sauvages. Les extraits ont été séparés par SDS-PAGE 8% et le temps d’exposition de la membrane est de 15 minutes. L’anticorps utilisés est le mAc 14D3 purifié dilué 1:100 dans le Blotto 5%. Les échantillons sont des homogénats totaux de différents tissus d’une souris normale préparés tels que décrit à la figure 16. 1: Muscles squeletttiques, 2: Coeur, 3: Cerveau, 4: Testicules, 5: Foie, 6: Rate, 7: Estomac, 8: Intestin, 9: Rein, 10: Poumon, 11: Marqueur de poids moléculaires (82 kDa, 63 kDa, 42.5 kDa et 32.5 kDa) 12: Extrait de cellules HeLa. La quantité de protéines totales de chaque échantillons a été vérifiée par coloration au bleu de Coomassie d’un gel équivalent à celui transféré pour l’immunobuvardage. La quantité de protéines totales est similaire pour tous les tissus à l’exception du cerveau et des testicules qui ont été dilué 10X et 5X respectivement. 3.4.2.4 Production et purification d’anticorps
Théoriquement, tous les anticorps énumérés dans le tableau 3 pouvaient être
purifiés avec la protéine-L puisqu’ils ont tous une chaîne légère kappa. Nous
avons donc préparé des colonnes d’affinité avec l’agarose protéine-L et nous y
avons passé les surnageants des hybridomes mentionné dans le tableau 3. La
purification n’a pas très bien fonctionné pour l’anticorps 1C3. Cependant, celles
des anticorps 14D3, 12B10 et 11F7 ont donné d’excellents résultats alors que
la purification de l’anticorps 15G9 n’a pas fonctionné. Le résultat de la
purification de 14D3 est montré à la figure 18.
104
A
M 1 2 3 4 5 6 7
B 62
48
Figure 18: Résultat de la purification des anticorps 14D3 sur colonne de protéine-L agarose. Les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE 8%. A: Gel coloré au bleu de Coomassie. B: Immunobuvardage effectué avec l’anticorps GAM-HRP dilution 1:1000. M: Marqueurs de poids moléculaires (173 kDa, 83 kDa, 62 kDa, 48 kDa et 33 kDa) Puits 1: Sunageant d’hybridomes avant purification, 2: Éluat, 3: Lavage #1, 4: Lavage #6, 5: Élution (premier mL), 6: Élution (deuxième mL), 7: Élution (troisième mL). Tampon d’élution: 0.1 M Glycine-HCl pH 2.0.
On peut voir à la Figure 18A que la purification est fonctionnelle. Le peu de
contaminants se trouvant dans la colonne sont éliminés lors des deux premiers
lavages comme le confirme l’absence de protéines dans le dernier lavage (Fig.
18A, échantillon 4). Compte tenu que la presque totalité des anticorps des 50
ml de surnageant se retrouvent dans environ 1 mL, nous évaluons le facteur de
concentration à au moins 40X si l’on compte les pertes encourues lors des
lavages et le peu qui se retrouve dans la deuxième et troisième élutions (Figure
18 B, échantillons 6 et 7).
105
3.4.2.5 Immunoprécipitation
L’isolement de la protéine FMR1 endogène a été tenté par immunoprécipitation
à partir de lysats de cellules HeLa et de cellules de la lignée lymphoblastique
875A. Différents tampons de lyse ont été utilisés et une multitude de
paramètres ont été modifiés afin d’améliorer les résultats obtenus. Tel que
montré dans la Figure 19D (échantillon 2), nous avons réussi à précipiter une
faible proportion des protéines FMR1 endogènes en utilisant 500 µL de lysat de
cellules 875A dans le tampon TBS-1% Triton X-100. On ne retrouve aucune
protéine FMR1 endogène dans les culots obtenus lors des
immunoprécipitations non-spécifiques (Fig. 19A, IPNS) et nous n’avons observé
que très peu de perte lors des lavages (Fig. 19B). Avec les autres conditions
utilisées, la quantité de protéines FMR1 récupérées était de beaucoup inférieure
à ce qui est obtenu avec les 500 µL de lysat dans le tampon TBS-1% Triton X-
100. Ce résultat a pu être reproduit mais jamais nous n’avons réussi à
récupérer autant de protéine FMR1 endogène en une seule
immunoprécipitation.
106
A
B 80 80
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 C D
80 80
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7
Figure 19: Immunoprécipitation de la protéine FMR1 endogène avec l’anticorps 14D3. Les échantillons ont été séparé par SDS-PAGE 8%. La source d’anticorps primaires pour les immunobuvardages était le surnageant d’hybridome 1C3 dilué 1:2 avec du Blotto 10%. Deux tampons Tris-NaCl ont été utilisés pour la lyse des cellules 875A, soient un tampon salin avec 1% Triton X-100 (TBS) et l’autre avec 1% SDS (SDS). Les lysats ont été centrifugés avant leur utilisation afin d’éliminer les débris cellulaires restant. Différentes quantités de lysats ont été utilisé lors de l’immunoprécipitation. Le volume de lysat utilisé (en µL) est indiqué entre parenthèse. Le volume total pour l’immunoprécipitaion était de 500 µL. 50 µL de protéine L-agarose ont été utilisés (1-2 mg/ml). A: Surnageants et IPNS (immunoprécipitation non-spécifique). Échantillons 1: Surnageant TBS avant immunoprécipitation (IP), 2: IP non-spécifique TBS (100), 3: IP non-spécifique TBS (500), 4: Surnageant SDS avant IP, 5: IP non-spécifique SDS (100), 6: IP non-spécifique SDS (200), 7: IP non-spécifique SDS (300), 8: IP non-spécifique SDS (400), 9: IP non-spécifique SDS (500). B: Lavages des billes avant IP. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (500), 3: SDS (100), 4: SDS (200), 5: SDS (300), 6: SDS (400), 7: SDS (500). C: Surnageants après IP. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (200), 3: Marqueurs de poids moléculaire (69 kDa et 45 kDa) 4: SDS (100), 5: SDS (400), 6: SDS (200), 7: SDS (300) 8: SDS (500). D: Immunoprécipitations. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (500), 3: SDS (100), 4: SDS (200), 5: SDS (300), 6: SDS (400) 7: SDS (500). Les bandes dans le bas du gel sont les anticorps 14D3 utilisés pour l’immunoprécipitation. La position du marqueur de 80 kDa (position de la protéine FMR1 endogène) est inscrit du côté extérieur de chaque figure.
107
3.4.2.6 Immunofluorescence La caractérisation de l’anticorps 14D3 comme outil cellullaire a débuté avec son
utilisation en immunofluorescence sur des cultures de cellules HeLa. Nous
avons utilisé le surnageant d’hybridome 14D3 et les anticorps purifiés dans des
conditions identiques et il n’y avait pas de différences entre les résultats
observés. Les images obtenues, en utilisant le surnageant de 14D3 comme
source d’anticorps primaires, sont exposées à la Figure 20. Nous avons aussi
tenté l’immunofluorescence avec les autres surnageants d’hybridomes.
Cependant, leur plus faible spécificité résultait en une augmentation du bruit
de fond et une diminution du signal spécifique.
108
B A
C D
Figure 20: Immunofluorescence sur des cellules HeLa. Toutes les images sont prises à un grossissement de 400X. A: Anticorps 14D3 purifiés dilués 1:100 dans le PBS-1% BSA et contre-coloration au DAPI. B: Anticorps 14D3 purifiés dilués 1:100 dans le PBS-1% BSA. C: Surnageant 1C3 dilué 1:2 dans le PBS-1% BSA et contre-coloration au DAPI. D: Contrôle négatif, coloration au DAPI. Anticorps secondaire : GAM-FITC (Jackson lab.) Vert = FITC, Bleu = DAPI.
109
Les résultats présentés à la figure 20 montrent que l’anticorps 14D3 convient à
l’étude des cellules en immunofluorescence. On peut très bien voir que la
protéine FMR1 se trouve au niveau périnucléaire dans le cytoplasme des
cellules HeLa (Figure 20, A et B) et ceci est observé sur la majorité des cellules
que nous avons étudiées (> 90%). La détection de la protéine FMR1 avec
l’anticorps 1C3 dans les cellules HeLa montre plutôt une répartition cellulaire
plus homogène (Figure 20 C). Il est possible que cela soit dû au fait que
l’anticorps reconnaît la protéine FXR1 aussi présente dans les cellules HeLa.
Comme le démontre le contrôle, le signal obtenu est bien le fait des anticorps
utilisés et non pas une liaison non-spécifique de l’anticorps couplé la
fluorescéine (FITC).
3.4.2.7 Immunohistochimie
Nous avons vérifié l’efficacité de cet anticorps en immunohistochimie sur des
coupes de différents tissus de souris normales. Le cerveau étant le tissus
produisant le plus de protéines FMR1, nous avons débuté par celui-ci. Puisque
les testicules produisent aussi la protéine FMR1 en grande quantité, ainsi que
les deux protéines homologues FXR1P et FXR2P, ils constituaient un tissu de
choix pour confirmer l’efficacité et la spécificité de l’anticorps 14D3 en
immunohistochimie.
Comme il a été montré précédemment dans les publications, la protéine FMR1
se retrouve dans le cytoplasme des neurones du cortex et de l’hippocampe
(Figure 21, A et B). Dans le cervelet, la protéine est exprimée dans les cellules
de Purkinje à la jonction de la couche granulaire et moléculaire. (Figure 21, C et
D) L’anticorps 14D3 est un outil immunohistochimique qui semble répondre
aux attentes tant sous forme de surnageant d’hybridome que sous sa forme
purifiée. Les immunohistochimies présentées dans les figures 21 à 26 ont été
effectuées avec les anticorps purifiés.
110
A B
C
H
C CE D
P
Figure 21: Immunohistochimies sur des coupes de cerveau de souris sauvages avec l’anticorps 14D3 purifié.
A: Cortex (C) et hippocampe (H) à un grossissement de 100X, B: Neurones du cortex à un grossissement de 400X, C: Cervelet (Ce) à un grossissement de 100X et D: Cellules de Purkinje (P) dans le cervelet à un grossissement de 400X. La coloration correspondant à la protéine FMR1 est rouge. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline (mauve) (Figures 21 à 27). Dilution utilisée 1:100.
111
A B
S
C D
S S
Figure 22: Immunohistochimies sur des coupes de testicules de souris normales. A: Anticorps 14D3 purifiés (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA), grossissement 100X, B: Anticorps 14D3 purifiés (dil. 1:100), grossissement 400X, C: Surnageant 1C3 (dil. 1:2), grossissement 400X et D: Anticorps 3FX (dil. 1:2000), grossissement 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline. (S=spermatogonies)
112
B A
G
C D G
F E
Figure 23: Immunohistochimies sur des coupes d’intestin, de colon et de poumon de souris normales. Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Intestin à un grossissement de 100X, B: Intestin à un grossissement de 400X, C: Côlon à un grossissement de 100X, D: Côlon à un grossissement de 400X, E: Poumon à un grossissement de 100X et F: Poumon à un grossissement de 100X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline. (G= cellules Goblets)
113
B A
C D
F E
Figure 24: Immunohistochimies sur des coupes de rein, de foie et de rate de souris normales.
Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Rein à un grossissement de 100X, B: Rein à un grossissement de 400X, C: Foie à un grossissement de 100X, D: Foie à un grossissement de 400X, E: Rate à un grossissement de 100X et F: Rate à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.
114
B A
C D
Figure 25: Immunohistochimies sur des coupes d’œsophage et d’estomac de souris normales. Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA) A: Œsophage à un grossissement de 100X, B: Œsophage à un grossissement de 400X, C: Estomac à un grossissement de 100X et D: Estomac à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.
115
B A
C D
Figure 26: Immunohistochimies sur des coupes de coeur et de muscles squelettiques de souris normales. Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Coeur à un grossissement de 100X, B: Coeur à un grossissement de 400X, C: Muscles squelettiques à un grossissement de 100X et D: Muscles squelettiques à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.
116
B A
C D
Figure 27: Contrôles négatifs des immunohistochimies sur des tissus de souris normales.
Anticorps GAM-biotine du kit HistoMouse™. A: Cervelet, B: Côlon, C: Foie et D: Poumon. Toutes les images ont été prises à 100X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.
117
Dans les testicules, on peut voir que l’anticorps reconnaît bien la protéine
FMR1 qui est exprimée uniquement à la périphérie des tubules séminifères
dans le cytoplasme des spermatogonies (Figures 22, A et B, p.104). Cependant,
en utilisant les mêmes conditions, nous n’avons pas été en mesure de
reproduire ce résultat avec l’anticorps 1C3. Tel que démontré en C de la Figure
22 ci-dessus, 1C3 détecte la protéine dans les cellules en périphérie mais
reconnaît aussi les cellules plus matures au centre des tubules. Plusieurs
essais ont été effectués mais tous donnaient le même résultat. Ce dernier est
probablement du à la réaction croisée entre l’anticorps 1C3 et la protéine FXR1.
Une immunohistochimie avec l’anticorps 3FX, dirigé contre la protéine FXR1,
montre que cette protéine est exprimée uniquement dans les cellules plus
matures au centre des tubules séminifères (Figure 22 D).
Les immunohistochimies sur l’intestin (Figures 23, A et B, p.105), le côlon
(Figures 23, C et D) et le poumon (Figures 23, E et F) ont permis de montrer
que la protéine FMR1 est fortement exprimée dans des structures
s’apparentant aux cellules Goblets. Au niveau du tractus intestinal, ces cellules
se retrouvent dans les villosités alors que dans les poumons nous observons
une coloration de la paroi des bronchioles.
Dans le rein (Figures 24 A et B, p.106), le foie (Figures 24, C et D), la rate
(Figures 24, E et F), l’ œsophage (Figures 25, A et B, p.107) et l’estomac
(Figures 25, C et D) nous retrouvons une coloration homogène des tissus. Les
taches rouges observées à la Figure 24E sont des artéfacts. Aucune cellule de
ces tissus exprime fortement la protéine FMR1. Cependant, nous ne pouvons
exclure que cette coloration corresponde au bruit de fond de la réaction tel
qu’observé dans le coeur (Figures 26, A et B, p.108) et le muscle (Figures 26, C
et D) ou dans les contrôles négatifs (Figures 27, A à D, p.109).
118
3.4.2.8 Cartographie des épitopes
Afin de cartographier les épitopes reconnus par nos anticorps, nous avons
amplifié des portions du gène FMR1 à partir du vecteur pQE31/FMR1 en
utilisant les paires d’amorces énumérées dans le tableau 2 (p. 78). Les produits
PCR ont été clonés dans le vecteur pQE31 (Figure 9, p. 53) pour la production
de peptides recombinants (tag hexa-histidine). Ce tag nous permettait
d’observer si le peptide était produit par immunobuvardage avant de tester nos
anticorps sur ces extraits. Les fragments utilisés pour la cartographie des
épitopes sont schématisés à la figure 28, et les résultats des
immunobuvardages sont présentés à la figure 29.
3 4 6 9 1
11F7 1C3
RGGNES NLS KH2KH1
0
1C131R1 (32) 3.5 (16)
10.8 (40)
D1.6 (40)
13B.5 (50)
14.1 (52)
D4.5 (60)
PB (70 )
Figure 28: Représentation schématique des fragments utilisés pour la cartographie des épitopes. Les boîtes avec les chiffres représentent les exons et les domaines fonctionnels pour lesquels ils codent sont représentés dessous. Les encadrés de couleur représentent les portions reconnues par
C
N14D3
2
5 8 10 11 12 13 14 15 16 17 7
119
les 22 anticorps monoclonaux vérifiés. Les flèches représentent les fragments peptidiques. Le poids moéculaire des fragments, en kDa, est inscrit entre parenthèses.
14D3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M D
Anti-His
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
A
C
32.5 25
175 83 62 47.5
B
11F7 1C10
Figure 29: Résultats de la cartographie des épitopes par immunobuvardage. Les différents fragments ont été séparés par SDS-PAGE 8%. A: Anticorps anti-hexa-histidine (dil 1:1000 avec du Blotto 5%). B: Surnageant 14D3 (dil. 1:2 avec du Blotto 10%). C: Surnageant 11F7 (dil. 1:2 avec du Blotto 10%). D: Surnageant 1C10 (dil. 1:2 avec du Blotto 5%). Fragments: 1: 3.5, 2: 31R1, 3: 10.8, 4: D1.6, 5: 13B. 5, 6: 14.1, 7: D4.5, 8: PB et 9: Vecteur pQE31 vide, (Voir la figure 28 pour la position des fragments).
Nous avons identifié 3 épitopes et les anticorps les reconnaissant sont
énumérés dans le tableau 4. Il y a les anticorps comme 14D3 qui sont très
spécifiques et qui reconnaissent un épitope localisé dans l’exon 14. Cependant,
il y a un autre anticorps, 12B10, qui détecte un épitope dans l’exon 14 mais qui
est nécessairement différent de celui reconnu par les anticorps tel 14D3
(Résultat identique à 14D3 (Figure 29 B). En effet, 12B10 détecte une protéine
supplémentaire dans les lignées lymphobloastoïdes (Figure 15, p.93). La
120
seconde catégorie, les anticorps tel 11F7 (la majorité), reconnaissent un épitope
situé près ou à l’intérieur du domaine KH2. Finalement, il y a les anticorps
comme 1C10 qui semblent reconnaître un épitope chevauchant la portion
amino-terminale du tag et le début de la protéine (voir Figures 28 et 29) car ils
reconnaissent peu la protéine endogène et pas du tout les fragments 3.5 et
D1.6 mais détectent pourtant toutes les constructions comprenant le tag et le
début de la protéine.
Tableau 4: Résultats de la cartographie des épitopes des 22 hybridomes.
Hybridomes Région reconnue
12B10 14D3 15G9 1G11
EXON 14
11F7 14E11 7F11 3D2 2C7 6E8
14E10 13F7 4F5
14E2 2E7
12E3 12D3 9G5
DOMAINE KH2
EXON 9 ET 10
1C10 4B10
JONTION ENTRE LE TAG HIS
ET LE BOUT N-TERMINAL
10G11 4B5
AUCUNE CONCLUSION
121
3.4.2.9 ELISA
Une fois les épitopes caractérisés, nous avons choisi deux anticorps dont les
épitopes ne se chevauchaient pas afin de mettre au point un test de
quantification de la protéine FMR1 par ELISA-sandwich. En utilisant le
monoclonal 14D3 comme anticorps “capturant”, nous voulions nous assurer
que seules les protéines FMR1 (contenant l’exon 14) seraient retenues dans les
puits. Ensuite, nous avons utilisé l’anticorps 11F7 couplé à la biotine pour
fermer le sandwich puis un conjugué streptavidine-HRP pour la détection et qui
permet une amplification du signal.
Nous avons mis au point le test ELISA avec la protéine tronquée (purifiée)
puisqu’elle sera utilisée pour la courbe standard. Après la mise au point des
conditions, nous avons effectué une dizaine d’essais avec la protéine purifiée et
nous obtenions une bonne reproductibilité. Le coefficient de régression linéaire
(R2) a toujours été supérieur à 0.98 ce qui est suffisamment précis pour être
utilisé comme outil de quantification. La Figure 30 est un exemple d’une courbe
standard constituée de quatre expérimentations effectuées indépendamment.
Le coefficient de régression linéraire est excellent (0.9878). Cependant, l’écart-
type au niveau des ratios obtenus avec les quantités de protéines FMR1 de 4 et
8 ng est assez grand ce qui suggère que nous devrons peut-être restreindre la
courbe à des quantités de protéines variant entre 250 pg et 2 ng par puit.
Nous avons débuté des essais préliminaires tout d’abord avec des homogénats
de leucocytes extraits de sang puis à partir de lysat de cellules
lymphoblastiques normales et X-fragile. Il semble qu’il y ait une reconnaissance
non-spécifique dans ces lysats et un test par immunobuvardage a révélé qu’il y
avait une protéine dans les homogénats de lymphoblastes (normal et X-fragile)
qui lie la streptavidine et pourrait être responsable de ce signal parasite.
Quelques essais ont été effectués pour éliminer ce signal parasite mais au
moment du dépôt de cette thèse nous tentions toujours de régler ce problème.
122
Tableau 5: Ratio de la densité optique (D.O.) à 450 nm de l’échantillon divisé par la D.O. du 0 en fonction de la quantité de protéine FMR1 recombinante (forme tronquée). (Résultats de 4 ELISA-sandwich indépendants avec les anticorps monoclonaux 14D3 et 11F7(biotinylé).
Ratio D.O. de l’échantillon / D.O. du 0
FMR1 (pg) Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Moyenne Écart-type
0 1 1 1 1 1 0
250 1.63 1.12 1.49 1.31 1.39 0.23
500 1.86 1.58 1.46 1.52 1.61 0.18
1000 2.5 1.91 1.74 1.67 1.96 0.38
2000 3.5 2.78 2.44 2.31 2.76 0.53
4000 4.78 3.45 3.16 2.68 3.52 0.90
80000 7.86 5.64 5.11 4.74 5.84 1.4
Ratio D.O échantillon/D.O. 0 en fonction de la quantité de protéine FMR1
y = 0.0006x + 1.2841R2 = 0.9878
012345678
0 2000 4000 6000 8000 10000
Quantité de protéines FMR1 (pg)
Figure 30: Courbe standard pour la quantification de la protéine FMR1 tronquée par ELISA-sandwich. La courbe standard a été construite à partir des résultats compilés dans les sections moyenne et écart-type du tableau 5. La forme tronquée de la protéine FMR1 a été utilisée.
123
4 DISCUSSION
124
Après la découverte du gène FMR1 en 1991, les recherches ont porté
principalement sur les mécanismes mutationnels et sur la fonction de la
protéine produite par le gène. Plusieurs croyaient que les secrets de cette
maladie monogénique seraient mis à jour rapidement mais une décennie plus
tard, la fonction exacte de la protéine FMR1 reste toujours un mystère.
L’anticorps monoclonal 1C3 a été utilisé pour la majorité des études effectuées
sur la protéine. En 1998, Khandjian et al ont montré que l’anticorps 1C3
détectait aussi la protéine homologue FXR1 dans les extraits de muscles
squelettiques et soulevaient la possibilité que cette protéine contribuait au
signal observé avec l’anticorps 1C3 dans d’autres extraits cellulaires (Khandjian
et al. 1998). Lorsque ce projet de doctorat a débuté en 1999, aucun nouvel
anticorps monoclonal n’était disponible. La compagnie Santa Cruz a mis en
vente récemment un anticorps dirigé contre la protéine FMR1. Cependant, les
résultats obtenus en immunobuvardage montrent que cet anticorps est moins
spécifique que le monoclonal 1C3 (Tests effectués par l’équipe du Dr.
Khandjian). L’équipe du Dr. Stephen T. Warren (Emory University, Atlanta)
affirme depuis deux ans avoir en sa possession des anticorps monoclonaux
spécifiques. Cependant, aucun résultat avec ces anticorps n’ont été publié
jusqu’à maintenant.
La faible immunogénicité de la protéine ainsi que la forte homologie entre la
séquence protéique murine et humaine sont possiblement à l’origine de la
difficulté à produire de bons anticorps monoclonaux. C’est pourquoi nous
avons entrepris d’utiliser la technologie du “phage display” pour contourner ce
problème. La première étape du projet consistait donc à obtenir une forme
purifiée de la protéine FMR1.
125
4.1 Production de la protéine
La production de la protéine FMR1 dans un système bactérien constituait le
premier défi technique que nous avons rencontré. La principale raison est que
la protéine semble être toxique lorsqu’elle est surexprimée dans les bactéries.
Cette toxicité est peut-être causée par la capacité de liaison à l’ARNm et
l’inhibition de la traduction qu’elle pourrait entrainer. C’est pourquoi la souche
M15 d’E.coli de Qiagen constitue un excellent système de production car il n’y a
que très peu de fuite (Figure 11, puit 1, p.86). L’expression du gène est sous le
contrôle du promoteur fort T5 mais l’expression est bloquée par la présence de
deux opérons lac en amont du gène. Le répresseur lac I est produit de façon
constitutive par le vecteur pREP4 déjà présent dans la souche M15. Seule
l’induction à l’IPTG permet de lever cette inhibition. Plusieurs souches
bactériennes ont été utilisées par notre équipe pour la production de la protéine
FMR1 au cours des dernières années. Cependant, c’est uniquement avec ce
système que nous avons réussi à produire des quantités de protéines dépassant
le milligramme.
Le système ne nous a pas permis de purifier les protéines sous leur formes
natives car les protéines produites se retrouvaient dans des corps d’inclusion.
L’interaction entre les domaines hydrophobes lors du repliement pourrait jouer
un rôle dans la formation de ces corps d’inclusion. Une autre explication est
que des ponts disulfures inappropriés se sont formés lors du repliement et
auraient pu entraîner la formation d’aggrégats et amener ainsi la création de
corps d’inclusion. Cette hypothèse est plausible pour la protéine FMR1 puisque
l’on retrouve 6 cystéines dans sa séquence protéique.
Lors de la production de la protéine, nous avons obtenu une forme mineure à
80 kDa et une forme majeure à 60 kDa. Le fait que l’anticorps 1C3 soit capable
de reconnaître les deux formes était une première indication que le bout
126
manquant se trouvait en C-terminal. Nous avons produit différents fragments
pour la cartographie des épitopes et selon la grandeur des peptides exprimés, la
portion manquante de la forme à 60 kDa incluerait les trois derniers exons
(Figures 28 et 29). Croyant que la forme tronquée était produite par la
dégradation protéolytique de la protéine de 80 kDa, nous avons abaissé la
température d’incubation à 30oC espèrant ainsi réduire l’activité des protéases.
Malheureusement, ceci ne fit que diminuer la quantité de protéine de 60 kDa
sans augmenter la quantité de celle à 80 kDa. Nous avons aussi ajouté des
mélanges d’inhibiteurs de protéases mais sans succès. Ces statégies ont
fonctionné pour Laggerbauer et al (2001) qui ont effectué la production de la
protéine à la température de la pièce (23 oC) en présence d’inhibiteurs de
protéases mais ils ont utilisés la souche BL21 Gold cells (Stratagene).
Une explication alternative à la forme tronquée pourrait être l’utilisation des
codons par certaines souches d’Eschérichia coli. En effet, les codons arginine
AGG et AGA sont les moins utilisés chez E. coli et les tRNAs les reconnaissant
sont donc les moins abondants. Les codons AGG et AGA consécutifs peuvent
entraîner l’arrêt de la traduction ou des changements de cadre de lecture
(Rosenberg et al. 1993). Dans l’exon 15 de la protéine FMR1 se trouve une boîte
RGG qui est composée d’arginine et de glycine. Parmi les codons utilisés dans
la séquence codante de la boîte RGG, on retrouve trois codons AGA répartis sur
50 paires de base. Il est plausible que la présence de ces trois codons soit
responsable de l’arrêt prématuré de la traduction dans la majorité des
protéines. Cela expliquerait pourquoi seulement une faible proportion des
protéines sont complètes. Il est possible que la souche BL21 possède les ARNt
nécessaires pour traverser efficacement la région AGG/AGA riche ce qui
expliquerait la réussite de Laggerbauer et al (2001). Il est aussi possible que le
fait de ralentir la croissance en effectuant la culture à la température de la
pièce est suffisant pour permettre aux rares ARNt d’atteindre la machinerie de
traduction.
127
4.2 Phage display Les premiers essais de production de scFvs dirigés contre la protéine FMR1 se
sont soldés par des échecs malgré l’enrichissement des phages élués après
chaque tour de sélection. Nous avons tenté de vérifier la proportion de protéine
restant accrochée dans le tube et celle-ci n’était même pas quantifiable. Deux
peptides synthétiques dont les séquences sont uniques à la protéine FXR1
étaient disponibles dans le laboratoire du Dr. Khandjian. Nous avons donc
décidé de les utiliser séparément pour effectuer des sélections avec la banque.
Après quelques essais, nous avons réussi à sélectionner des scFvs que nous
avons utilisés comme anticorps primaires en immunobuvardage sur des
extraits de bactéries produisant la protéine FXR1. Le résultat était concluant,
les scFvs produits reconnaissaient la protéine FXR1 comme le démontrait
l’immunobuvardage effectué en parallèle avec l’anticorps #830 sur les mêmes
extraits bactériens. Les scFvs semblaient cependant moins spécifiques que les
anticorps puisque l’on pouvait apercevoir des bandes supplémentaires à celles
correspondant à FXR1. Le signal obtenu était très faible, et l’attribuant à la
faible quantité de scFvs, nous avons tenté d’en produire plus. Les conditions
décrites dans le protocole n’ont pas permis de produire les scFvs solubles. La
modification des conditions de culture et d’induction n’ont pas entrainé une
augmentation de la production des fragments d’anticorps.
Malgré tout, nous avons décidé de tenter la sélection avec un peptide en faisant
d’une longueur de 15 acides aminés provenant de la portion C-terminale de la
protéine FMR1. Tout d’abord, nous avons ciblé les séquences protéiques
possèdant peu d’homologie avec les protéines FXR1 et FXR2 ainsi qu’avec les
séquences protéiques dans les banques de données informatique afin d’éviter
toute réaction croisée. Ensuite, nous avons sélectionné la séquence protéique
présentant la plus forte hydrophilicité augmentant ainsi les chances que
l’épitope se trouve en surface de la structure adoptée par la protéine dans la
cellule. Ce peptide est constitué des acides aminés 555 à 570
128
(DHSRTDNRPRNPREA). Encore une fois, après plusieurs essais et de multiples
sélections avec le peptide, nous avons réussi à obtenir des scFvs dirigés contre
la protéine FMR1 recombinante de 60 kDa. Cependant, les scFvs ne
reconnaissaient ni la protéine endogène dans les cellules HeLa, ni la forme
recombinante dans les extraits bactériens, mais uniquement la protéine
purifiée. Les scFvs n’ont toutefois pas détecté la BSA présente en quantité
similaire à la protéine FMR1. Comme précédemment, le signal était très faible
comparé à ce qui est normalement obtenu avec les anticorps: 20 minutes
d’exposition alors que moins de 5 secondes sont suffisant avec 1C3. Encore une
fois, il semble que la faible production de scFvs était en cause. A ce moment
nous avons investi beaucoup de temps pour tenter de mettre au point des
conditions permettant de produire les scFvs en quantité suffisante mais aucun
de nos essais n’ont permis d’augmenter de façon détectable la production de
scFvs.
Au lieu d’utiliser les scFvs comme anticorps primaire, nous avons décidé
d’essayer directement les phages obtenus à la suite d’un cinquième tour de
sélection. Le signal obtenu était aussi très faible. Par Dot-blot, nous avons
vérifié la proportion de phage exprimant les scFvs à leur surface pour nous
rendre compte qu’elle ne dépassait pas 10 %. D’ailleurs, il a été rapporté que
seulement 1 à 10 % des phages exprimaient les fragments d’anticorps lorsque
la banque est construite avec un promoteur faible (Lowman et al. 1991). Nous
avons entrepris des démarches auprès du Dr. Peter Model (Rakonjac et al.
1997) afin d’obtenir un phage auxiliaire dont la protéine g3p est délétée. Son
utilisation pour la co-infection nous aurait assuré que tous les phages produits
exprimeraient des scFvs à leur surface. Malgré un premier contact avec le Dr.
Model, les tentatives subséquentes pour obtenir les phages sont restées vaines.
Nous avons contacté deux autres équipes ayant utilisé la banque Griffin.1, et
chacune est restée bloquée à l’étape de la production des fragments d’anticorps
solubles. Récemment, une des équipes tentait de contourner le problème de
129
production en sélectionnant les phages produisant les scFvs d’intérêt pour
ensuite recloner les fragments variables dans un vecteur pET.
Plusieurs fois nous avons tenté de contacter le Dr. Winter et son équipe pour
obtenir de l’aide mais sans succès. Après 15 mois de travail sur ce projet, nous
sommes venu à la conclusion que nous devions concentrer nos efforts sur la
production de nouveaux hybridomes et nous avons contacté le Dr. John
Wilkins (CGDN immunoprobe core facility, Université du Manitoba) pour
l’immunisation des souris. A notre grand étonnement, l’équipe du Dr. Wilkins
travaillait aussi avec la banque Griffin.1 et leur essais sont aussi restés vains
quand venait le moment de faire sécréter les scFvs. L’isolement de ces derniers
à partir du périplasme foncionnait mais les fragments d’anticorps obtenus
possèdaient une faible affinité pour les antigènes utilisés lors des sélections. En
attendant l’arrivée des hybridomes nous avons continué les essais de
production sans toutefois obtenir de résultats encourageants.
Finalement, au cours d’une discussion informelle avec un participant au
congrès du Réseau Canadien sur les Maladies Génétiques (CGDN) de 2002,
j’appris que la banque Griffin.1 lui avait aussi causé des problèmes alors qu’il
travaillait en Europe. Le directeur de recherche s’est résolu à envoyer une
étudiante pour parfaire la technique dans les laboratoires du Dr. Winter.
Étonnament (ou non), le protocole avec lequel l’étudiante revint était
complètement différent de celui publié sur le site internet auquel ils font
référence lorsque l’on demande la banque. De plus, lorsque je pris
connaissance de l’existence de la banque via l’internet, les auteurs
mentionnaient que des protocoles seraient bientôt disponibles sur le site pour
l’utilisation des scFvs. Trois ans plus tard ces protocoles ne sont toujours pas
disponibles. Seulement une équipe a publié des résultats en utilisant la banque
Griffin.1 et encore une fois on retrouve certaines différences lorsque l’on
compare les protocoles. (De Lorenzo et al. 2002).
130
Tout d’abord, ils ont effectué les sélections directement sur des cellules
présentant à sa surface un haut niveau de la protéine contre laquelle ils
voulaient obtenir les fragments d’aticorps.
Tout comme nous, ils n’ont pas réussi à faire sécréter les scFvs alors ils les ont
purifié directement à partir d’extraits de périplasmes en utilisant des colones
Ni-NTA. Toutefois, ils ne mentionnet pas le rendement de la production des
fragments d’anticorps.
Finalement, la souche E. coli utilisée pour la production (SF110, Meerman and
Geourgiou (1994)) n’est pas celle qui était fournie avec la banque. C’est une
souche dont les loci affectant la stabilité des protéines sécrétées ont été délétées
du génome de la bactéries. Dans le cas de la production de scFv, cela à
probablement eu pour effet d’augementer la production de façon remarquable.
En somme, la technique du phage display est pleine d’avenir mais son
utilisation nécessite une connaissance que seule l’expérience peut apporter. La
banque Griffin.1 n’est pas encore suffisamment au point pour permettre aux
novices de l’utiliser sans le soutien d’une personne maîtrisant les différents
paramètres nécessaires à son bon fonctionnement. Malgré tout, cette technique
présente des aspects intéressants et son utilisation pour la sélection de
plusieurs types de molécules tels des récepteurs nucléaires ou des peptides
substrats fonctionne très bien. Ce n’est probablement qu’une question de
temps avant que la technique soit optimisée pour la sélection de fragments
dérivés d’anticorps.
131
4.3 Production d’anticorps monoclonaux
À la suite de l’utilisation du “phage display”, nous avons fait injecter 4 souris
avec la protéine recombinante purifiée dans l’espoir d’obtenir des anticorps
monoclonaux. Une seule souris à produit des anti-FMR1 et elle fut sacrifiée
pour la préparation des hybridomes. Parmi les 23 clones obtenus, nous avons
détecté 4 types d’anticorps différents (Figure 15, p.93) dont un très
intéressant, le monoclonal 14D3. Nous l’avons mentionné précédemment,
l’anticorps le plus utilisé pour les études sur la protéine FMR1 est le
monoclonal 1C3 mais tel que démontré avec les extraits de muscles de souris
normales et les tissus de souris knock-out, il reconnaît les différentes formes de
la protéine FXR1. Cette réaction croisée serait due au fait que l’anticorps 1C3
reconnaît un épitope dans la portion N-terminale de la protéine qui est bien
conservée dans les homologues. Au contraire, le monoclonal 14D3 reconnaît un
épitope se situant dans l’exon 14, une portion beaucoup moins conservé de la
protéine FMR1, ce qui pourrait expliquer la meilleure spécificité de notre
anticorps.
Un anticorps ne produisant pas de réaction croisée est attrayant puisqu’il peut
être utilisé pour l’étude de la protéine FMR1 dans des tissus exprimant
fortement les homologues. De plus, les études précédentes démontrent que la
protéine FMR1 n’est pas exprimée dans les muscles et le coeur. Or, 1C3 y
détecte les superformes de FXR1 ce qui peut masquer la détection de la
protéine FMR1. Sur certains immunobuvardages effectués avec 14D3 pour la
vérification de la spécificité nous avons observé des bandes correspondant à
deux isoformes de FMR1. Les bandes observées étaient de poids moléculaires
inférieurs aux superformes de FXR1 normalement retrouvées dans les muscles
(Khandjian et al. 1995). Croyant que la protéine pouvait provenir du sang resté
dans les extraits de muscles, nous avons effectué une autre préparation de
muscles squelettiques mais les bandes étaient parfois visibles après
132
surexposition mais pas toujours. Ces bandes n’apparaissent pas sur
l’immunobuvardage effectué pour vérifier la présence de la protéine FMR1 dans
les tissus (Figure 17, p.96) ni sur celui servant à vérifier la spécificité de
l’anticorps 14D3 (Figure 16, p.95). Évidemment, lorsque nous surexposons le
film nous pouvons voir quelques bandes non-spécifiques mais nous pouvons
les éliminer en diminuant la quantité d’anticorps sans vraiment affecter le
signal des protéines FMR1.
4.4 Immunofluorescence
Par immunofluorescence avec l’anticorps 1C3, le patron de distribution de la
protéine FMR1 apparaît homogène dans toute la cellule alors qu’avec 14D3,
nous observons une localisation périnucléaire dans la plupart des cellules.
Cette différence pourrait résulter de la réaction croisée entre 1C3 et les
protéines FXR1. Ceci pourrait signifier qu’une partie des protéines FXR1 ne
sont pas dans le même complexe que FMR1. D’un autre côté, nous pouvons
émettre l’hypothèse que les protéines qui ne sont pas périnucléaires sont celles
dont l’exon 14 a été épissé. Mais cela ne serait pas compatible avec le fait que
les protéines ayant perdu leur NES devraient se retrouver dans le noyau.
Khandjian et al ont montré que la protéine FMR1 se trouvait dans les mRNPs
associées aux polysomes et non pas libre dans la cellule ou associée aux
ribosomes seuls (Corbin et al 1997). Selon les résultats obtenus avec notre
anticorps, la protéine FMR1 semble située au niveau du réticulum
endoplasmique, probablement dans les structures associées aux ribosomes en
traduction active (Réticulum endoplasmique rugueux).
133
4.5 Immunohistochimie
Une différence est aussi observée dans les études immunohistochimiques que
nous avons effectuées sur des coupes de testicules de souris. Les études
d’expression d’ARNm ont montré que le gène FMR1 est exprimé uniquement
dans les spermatogonies à la périphérie des tubules séminifères. On peut
retrouver dans la littérature des immunohistochimies effectuées avec
l’anticorps 1C3 montrant la protéine dans ces spermatogonies. Toutefois, en
aucun cas nous avons obtenu ce type de résultat avec l’anticorps 1C3. A
chacun des essais, l’anticorps réagissait avec les protéines FXR1 dans les
cellules au centre des tubules et un peu moins fortement avec les
spermatogonies. La présence de FXR1 au centre des tubules a été confirmée
par l’utilisation de l’anticorps 3FX pour lequel nous avons utilisé le même
protocole qu’avec 1C3. Ces conditions sont aussi celles que nous avons utilisé
avec le monoclonal 14D3 et pourtant nous détectons la protéine FMR1
uniquement dans le cytoplasme des spermatogonies. Une autre preuve
éloquente de la spécificité de notre anticorps.
Nous avons tenté l’immunohistochimie sur des coupes de tissus musculaires et
de coeur et la faible coloration observée semble être due au bruit de fond plus
qu’à une détection de la protéine FMR1 puisque la protéine n’est pas observée
dans ces tissus par immunobuvardage. Dans tous les autres tissus testés
(estomac, intestin, côlon, rate, rein, foie et œsophage), nous avons observé une
coloration homogène légèrement plus forte que celle des tissus musculaires.
Est-ce que la coloration réflète le niveau basal d’expression observé en
immunobuvardage dans les tissus autres que musculaire? Il est difficile de
l’affirmer avec certitude. L’immunohistochimie est une technique moins
sensible que l’immunobuvardage pour la détection d’un niveau de production
protéique basal. Il est donc possible que l’immunohistochimie ne permette pas
134
la détection de la protéine dans certains tissus et que le signal observé
corresponde au bruit de fond.
La présence d’une forte expression de la protéine FMR1 dans les cellules
Goblets dans les poumons, l’intestin et le côlon nous a d’abord intrigué. Nous
aurions attribuée cette expression au fait que ces cellules produisent un mucus
qui pourraient avoir entraîné l’adhésion des anticorps s’il n’avait pas été
mentionné précédemment que les cellules de l’épithélium simple cylindrique de
l’intestin (comprenant les cellules Goblets et les cellules responsables de
l’absorption) exprimaient l’ARNm de FMR1 (Hinds et al. 1993).
Les cellules Goblets sont les cellules qui sécrètent le mucus qui protège et
lubrifie l’intérieur du tractus intestinal. Ces sécrétions sont composées de sels
inorganiques et de polymères de protéines nommées mucines. Le mucus est
sécrété continuellement mais sa production augmente rapidement suite à
certain stimulus. Puisque la protéine FMR1 fait partie intégrante de la
machinerie de traduction, il est plausible que la production constitutive ou
massive de mucus implique la présence de la protéine FMR1. On peut émettre
l’hypothèse que la protéine FMR1 soit nécessaire lors de la production de base
des mucines. Cependant, il est aussi envisageable que les protéines FMR1
servent à inhiber la traduction des ARNm codant pour les mucines. Elles
servent ainsi de séquestrateurs d’ARNm en attendant leur traduction suite à
certains stimulus tel l’attaque par des agents pathogènes. Ces hypothèses
pourraient être vérifiées, par exemple, en utilisant des colonnes composées
d’ADNc de la mucine afin de voir si la protéine FMR1 est associée, d’une
manière ou d’une autre, à l’ARNm de la mucine.
135
4.6 Cartographie des épitopes
Tel que mentionné précédemment, la cartographie des épitopes a révélé que
l’anticorps 14D3 et ses semblables reconnaissent une région se situant à
l’intérieur de l’exon 14. Ces anticorps présentent le patron de détection le plus
spécifique puisque seules les protéines FMR1 sont reconnues. En fait, seule
l’isoforme dont l’exon 14 est épissé ne peut être reconnue par ces anticorps.
Ceci revêt une certaine importance car l’épissage de l’exon 14 résulte en la
localisation nucléaire de la protéine et une affinité pour l’ARN qui est modifiée,
ce qui pourrait impliquer un rôle différent pour cette isoforme.
Des gels préparatifs nous ont permis de séparer les différentes isoformes à un
point tel que nous détections 7 bandes par immunobuvardage au lieu des 6
précédemment publiées. Le doublet observé à 80 kDa est en fait un triplet et
ceci est appuyé par le gel en deux dimensions effectués par Khandjian et al
(1995) qui a détecté 10 isoformes distinctes. La comparaison des
immunobuvardages effectués avec les anticorps 1C3 et 14D3 sur des extraits
de lignées lymphoblastiques suggère que la forme sans l’exon 14 est soit très
peu ou pas exprimée dans la lignée utilisée. Il est possible que cette isoforme,
bien qu’exprimée de façon quasi-ubiquiste au niveau de l’ARNm, ne soit
traduite que dans certains tissus.
L’anticorps 12B10 fait cavalier seul dans sa catégorie. Il reconnaît un épitope
dans l’exon 14 mais nos données suggèrent que ce n’est pas le même que les
anticorps tels 14D3. En effet, en immunobuvardage, 12B10 reconnaît une
protéine supplémentaire dans les lignées lymphoblastiques en plus de
reconnaître les différentes isoformes de la protéine FMR1 (Figure 15, p.93). Cet
anticorps présente une meilleure spécificité que 11F7 mais la proximité de son
épitope par rapport à celui de 14D3 écarte son utilisation en ELISA-sandwich.
136
L’anticorps 11F7 et ses semblables détectent un épitope dans le domaine KH2
ou en N-terminal de ce dernier. Les domaines KH sont très conservés et cela
pourrait expliquer pourquoi ces anticorps présentent tant de réactions croisées
(7-8 protéines reconnues de façon non-spécifiques). Le monoclonal 11F7 peut
être purifié par colonne de protéine–L ce qui a permis de le coupler par la suite
à la biotine (et éventuellement à un autre marqueur). Puisque son épitope est
suffisament éloigné de celui de 14D3, nous pouvons utiliser ces deux anticorps
simultanément pour détecter la protéine FMR1 dans le contexte d’un ELISA-
sandwich.
Les anticorps tels 1C10, ne reconnaissent pas ou peu la protéine FMR1
endogène, ce qui limite leur utilité. Cependant, puisque l’anticorps reconnaît la
jonction entre FMR1 et le tag histidine, il pourrait servir à détecter la protéine
recombinante dans un contexte cellulaire tout en évitant un réaction croisée
avec la protéine endogène. Il agit comme le ferait un anticorps dirigé
directement contre le tag.
Finalement, nous avons caractérisé l’épitope de l’anticorps 1C3 comme contrôle
et nous avons restreint la région de reconnaissance aux 60 premiers acides
aminés. Cet anticorps pourrait aussi constituer un excellent candidat potentiel
comme anticorps secondaire dans un ELISA-sandwich. Nous avons tenté de le
purifier sur colonne de protéine-L mais nous n’avons pas obtenu un bon
enrichissement malgré le fait qu’il soit composé d’une chaîne légère kappa.
Cependant, il est mentionné dans le feuillet de la compagnie Actigen que la
protéine-L lie moins fortement la chaîne κ V et pas du tout la chaîne κ II.
L’anticorps 1C3 pourrait bien être constitué de l’une de ces deux chaînes,
logiquement de la chaîne V puisqu’une petite partie des anticorps s’accroche à
la colonne de protéine-L.
137
4.7 ELISA-sandwich et diagnostic
Le principe de l’ELISA-sandwich consite à capturer un antigène entre deux
anticorps pour le quantifier. Afin d’éviter toute interférence et obtenir la mesure
la plus précise possible, l’un des deux anticorps doit être parfaitement
spécifique. Lors de l’ELISA, une courbe standard est effectuée avec l’antigène
purifié de façon concomitante permettant de quantifier l’antigène dans
l’inconnu.
Le syndrome X-fragile est actuellement diagnostiqué par buvardage Southern,
une technique longue et onéreuse. Des techniques se basant sur la détection de
la protéine ont été mises au point au cours des dernières années et un
laboratoire dans les Pays-Bas les utilise présentement pour le diagnostic du
syndrome X-fragile (Eramus Laboratory: www.eur.nl/fgg/ch1/fragx/). Selon les
données recueillies, la quantification de la protéine FMR1 pourrait être une
excellente méthode diagnostique pour la maladie.
Le problème avec les tests de détection présentement utilisés, c’est qu’ils sont
qualitatifs ou semi-quantitatifs. Or, les femmes atteintes du syndrome X-fragile
produisent une certaine quantité de protéine FMR1 tout comme les hommes
mosaïques (de taille ou de méthylation). Leur taux de production est
probablement inférieur à celui des personnes normales mais les test de
dépistage publiés récemment ne font pas la distinction entre certaines femmes
X-fragile et les normales. Ces tests ne permettaient pas non plus de
diagnostiquer avec certitude les mâles mosaïques.
De récentes études mentionnent que les porteurs(euses) de prémutations
auraient une expression réduite de la protéine (Tassone et al. 2000a; Tassone et
al. 2000b). Ainsi, un test de dépistage quantitatif aurait l’avantage de pouvoir
détecter les hommes et les femmes atteints du syndrome en plus, dans certains
138
cas, de permettre le dépistage de porteurs de prémutation. La confirmation de
ces porteurs pourrait ensuite s’effectuer par PCR.
La cartographie des épitopes reconnus et l’obtention d’anticorps purifiés
couplés à la biotine a été fastidieuse ce qui fait que les premiers tests de
quantification de la protéine n’ont débuté que tout récemment. Puisqu’une
courbe standard était nécessaire à la réalisation du projet, nous avons débuté
nos essais avec la protéine purifiée. Une fois les conditions mises au point,
nous avons obtenu des courbes standards suffisamment précises (R2> 0.98)
pour être utilisées dans la quantification de la protéine FMR1 dans des extraits
de leucocytes Figure 30, p.115). Le test permet de détecter la protéine purifiée
à des quantités aussi infime que 250 pg (7.5 fmol) par puit.
Nous avons extrait les leucocytes d’un prélèvement de sang puis mesuré leur
nombre à l’aide d’un compteur de cellules (Coulter). En comparant l’intensité
obtenue par immunobuvardage sur des extraits de leucocytes et la protéine
purifiée, nous avons évalué la quantité de protéines FMR1 à 5.6 pg par cellule.
À raison de 26 millions de leucocytes dans 20 mL de sang, il ne faudrait qu’un
peu de sang pour détecter la protéine FMR1 chez une personne normale. La
sensibilité du test serait peut-être suffisante pour détecter les variations entre
les individus normaux et les personnes atteintes ou mosaïques.
Un des problèmes rencontrés dans la mise au point de ce système de détection
est que nos anticorps ne reconnaissent que la forme dénaturée de la protéine
FMR1. Il nous faut donc utiliser des tampons de lyse fortement dénaturants
pour dissocier le complexe dans lequel se retrouve la protéine et pour dénaturer
la protéine complètement. Nous avons utilisé divers agents dénaturants, dont le
DTT et le déoxycholate, qui ne convenaient pas. Ils ont été utilisés à des doses
aussi faibles que 10 mM et 1 % respectivement mais leur pouvoir dénaturant
affectait les anticorps fixés au puit. Le SDS et l’urée peuvent être utilisés
jusqu’à des concentration de 1 % et 8 % respectivement.
139
Nous avons donc débuté des tests préliminaires sur des extraits de leucocytes
fraichement extraits de sang ainsi qu’avec des extraits de lignées cellulaires
normale (875 A) et X-fragile (GM 09145). Cependant, les tests sont
présentement bloqués à ce stade car il semble que nous ayons une réaction
non-spécifique entre le conjugué streptavidine-HRP et une protéine de l’extrait
cellulaire. Nous avons confirmé cette réaction par immunobuvardage effectué
sur les extraits cellulaires mentionnés ci-dessus. En utilisant uniquement la
streptavidine-HRP comme moyen de détection, nous avons observé une
bande.(Résultats non montré) Ceci démontre bien qu’une protéine cellulaire,
dans sa forme dénaturée, est en mesure de lier la streptavidine ou la
peroxydase. Nous étudions présentement la possibilité de passer le lysat sur
des colonnes de streptavidine afin de vérifier si le signal parasite sera éliminé.
Une alternative serait d’ajouter une solution de streptavidine dans le puit aprés
l’ajout du lysat de cellules afin de bloquer les sites liant la streptavidine.
4.8 Perspectives
Les données de la littérature soulèvent la possibilité que les protéines de la
famille FMR/FXR se retrouvent dans les mêmes complexes
ribonucléoprotéiques. Cependant, leur association n’est pas toujours nécessaire
à leur fonction puisque dans certains types cellulaires tels les muscles on ne
retrouve qu’une des trois protéines. Il est probable que ces protéines ne soient
pas toujours dans les mêmes structures et des études de co-localisation avec
14D3 permettraient de résoudre la question. Ces études pourraient être menées
avec l’anticorps 1C3 mais la réaction croisée avec la protéine FXR1 pourrait
mener à la conclusion que la protéine FXR1 co-localise toujours avec FMR1.
Les résultats que nous avons obtenus en immunofluorescence avec 1C3 et
14D3 sur les cellules HeLa étant légèrement différents, cela suggère que la
réaction croisée est peut-être observable en immunofluorescence.
140
Il serait donc intéressant de faire des études de co-localisation avec l’anticorps
14D3 et les anticorps polyclonaux #830 afin de voir si les protéines FMR1 et
FXR1 se situent dans les mêmes structures dans la cellule. D’un autre côté,
nous pourrions effectuer des études d’expression différentielle sur plusieurs
types cellulaires avec les anticorps 14D3 et α1076 (ou α734: anticorps
polyclonaux, voir Figure 3, p.33). L’absence du signal de 14D3 suggèrerait que
la forme sans l’exon 14 est présente dans ces cellules.
Des tests avec la leptomycine B, une drogue qui bloquerait l’exportation de la
protéine FMR1 vers le noyau, pourrait aussi permettre de démontrer si les
isoformes restant prises dans le noyau sont réellement celles dont l’exon 14 est
épissé ou si même celles possèdant le NES peuvent réintégrer le noyau.
Une autre façon de déterminer si l’isoforme sans l’exon 14 est traduite serait
d’effectuer une série de gels en 2 dimensions sur différents tissus et de faire des
immunobuvardages avec les anticorps 1C3 et 14D3. En comparant les deux
immunobuvardages, il serait possible d’identifier la forme sans l’exon 14
puisque le signal serait absent de l’immunobuvardage effectué avec l’anticorps
14D3.
Les anticorps obtenus ne sont pas tous spécifiques ce qui signifie que certaines
protéines partagent des séquences communes avec la protéine FMR1. Dans le
cas de l’anticorps 12B10, une autre protéine de poids moléculaire supérieur à
80 kDa est détectée. Puisque 12B10 reconnaît un épitope dans l’exon 14, il
serait intéressant de purifier et séquencer cette protéine afin de vérifier si elle
partage d’autres séquences avec la protéine FMR1. Cet exercice pourrait aussi
être appliqué aux autres protéines reconnues par l’anticorps 11F7. Parmi
celles-ci se retrouvent très certainement les protéines homologues FXR1 et
FXR2 puisque la région comprenant l’épitope de 11F7 est très conservée chez
ces protéines surtout dans le domaine KH ou le taux d’homologie atteint plus
141
de 80 %. Il est possible que les autres protéines reconnues possèdent elles
aussi un domaine KH.
Dans les perspectives au niveau du test de quantification de la protéine FMR1,
nous espérons pouvoir mettre au point le test sur les extraits de lignées
cellulaires (normale et X-fragile) et sur les leucocytes purifiés d’ici la fin du
printemps 2003. Cette étape franchie, il ne resterait qu’à valider le test sur les
leucocytes extraits du sang de personnes normales et X-fragiles.
Dans la mesure ou le test serait suffisamment sensible, il serait finalement
possible de répondre à la question portant sur le taux de production de la
protéine par les hommes porteurs d’une prémutation. Il serait aussi possible
de vérifier la corrélation entre le taux de production de la protéine et la sévérité
du phénotype observé et principalement le degré de retard mental.
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