La rvlation en chromatographieLarvlationenchromatographiesurcouchemince

Est elle un art?Estelleunart?

Paul KleePaulKlee

tudiant pharmacognosietudiantpharmacognosie

UNIVERSITEFRANCOISRABELAISTOURS

JolleDorat*.MichellePinault**. Jacques Pothier*JacquesPothier laboratoireNutrition,CroissanceetCancerdel i I U921 d l f l dlquipeInsermU921delafacultdemdecinedeTOURS

LaboratoiredepharmacognosieA M 37200 t AvenueMonge37200tours

R l ti D i ti tiRvlation,Drivatization

Laphasedelachromatographiecouchemincemalmatrise.

EvaluationqualitativeR l ti l i ti Rvlationparpulvrisation

Rvlationparimmersion Rvlationbiologique Evaluation sous lampe UV et vidoEvaluationsouslampeUVetvido

Les plaques sans rvlationLesplaquessansrvlation

l l i i di fl laplaquecontientunindicateurfluorescent :onsoumetlaplaqueunrayonnementUVetles

t l f d t hcomposssontrvlssousformedetachessombres.

lesUV(254nm) :enexposantlaplaqueunesourcederadiationUV,certainscomposs(systmesconjugusouaromatiques)apparaissentsousformedetachesbrillantes.

L iode un grand classiqueLiodeungrandclassique

liode :onplongelaplaquedansunbocalcontenantunfonddiodebroy.Lescompossy papparaissentsousformedetachesbruntres.

Les piges de la rvlationLespigesdelarvlation

Mauvaisschageavantlarvlation Mauvais chauffage aprs application duMauvaischauffageaprsapplicationdurvlateur

IMPORTANCEDUSECHAGEPREALABLEPREALABLE

il dpend des composs isoler et des luants

i ll t t id b i il f t hsi lluant est acide ou basique il faut un schagepralable avec chauffage pour viter une ractionl ant r late r luant rvlateur

Exemples alcalodes de l opiumExemplesalcalodesdelopiumOpium par AMD au DragendorffLaboratoire de pharmacognosie Tours

Dragendorff 1 sansschage,2 schage,3 schageplusacideformique

opiumavecluantalcalin

2 3

1

Opiumiodoplatinate ractifpeuacidenondestructifdelamolcule

1mauvaisschage2bonschage

1 2

IMPORTANCE DU SECHAGE PREALABLEIMPORTANCEDUSECHAGEPREALABLE

sionchromatographiedesproduitsvolatilescommeleshuilesessentiellesviterbienvidemmentunschagetropchaud

Laisser par exemple svaporer lluant de la Laisserparexemples vaporerl luantdelaplaquesouslahotteaspirante

Rvlation puis chauffageRvlationpuischauffage

La plaque chauffanteLaplaquechauffanteestprfrableltuvepour: Unemeilleurehomognitdelatempraturetemprature.

Unemeilleursuividelarvlation.

A viter ( proscrire)Aviter(proscrire)

h ff b Lechauffagecow boyboy

L h ff bLe chauffage bonne maman

PulvrisationPulvrisation

Imprgnationdelacoucheparpulvrisationdunesubstanceractive.

Reproductibilitdifficiletrslieloprateur puissance de pulvrisationpuissancedepulvrisation distanced re dure

balayage,homognitdufonddeplaque

PulvrisateursPulvrisateurs

Rvlation par vaporisationRvlationparvaporisation Lavaporisationdunractifsurlaplaquencessiteunminimum

d i t i t t d ti t tdquipement,maissurtoutdesprcautionspourseprotgeretprotgerlenvironnementdesvapeurstoxiques,etunemthodebienmatrisepourlimiterlemanquedereproductibilitetlebruitdefond.

Schmadevaporisation

Rvlation par immersionRvlationparimmersion Larvlationpar

immersion de la plaqueimmersion delaplaquedanslasolutionderactifsestdeloinlameilleuresolution(nonpolluante,

d tibl tit ti )reproductible,quantitative)maisattentionauxexcsd chantillonsurlaplaque,et aux rvlations Plaquedestrodesetauxrvlationsmultiples. rvlsauractif

phosphomolybdique

Chromatogrammestablissantunecomparaisonentrepulvrisationettrempage

d H h D i t daprsHahnDeinstrop

Mthodes de DrivationMthodesdeDrivation

UV254et366nm Pulvrisation Trempage Exposition aux vapeurs Expositionauxvapeurs Ractifsdanslesolvant Ractifdansladsorbant

Ractifs non spcifiquesRactifsnonspcifiques

Acidesulfuriquepluschauffage Vanillinesulfuriquepluschauffage Acidephosphomolybdiquepluschauffage Anisaldhyde sulfurique plus chauffage Anisaldhydesulfuriquepluschauffage SeldeBleusolideB

Ractifs Gnraux des AlcalodesRactifsGnrauxdesAlcalodes

Dragendorff Actique (selon Munier et Macheboeuf)Actique(selonMunieretMacheboeuf) Chlorhydrique(basespuriques)(C l ti d f d d l(Colorationduorangeaurougesurfonddeplaquejaune)

Iodoplatinate depotassium(Couleursallantduroseaubleuintenseen(passantparleviolet)

R tif d Ht id fl iRactifsdesHtrosidesflavoniques

Potassealcoolique Ractif au chlorure ferrique Ractifauchlorureferrique Ractifautrichloruredaluminium RactifdeNEU(NP/PEG)

McanismeractionnelavecleRactifdeNEU

O+

O

OH

BNH2O

OH2 NO

BCH2CH2HO

+

-

- +

-

OHB2

ChromatogrammesdeGinkgobilobaDaprsWagner

Ractifs les plus couramment utilissRactifslespluscourammentutiliss

V Vapeurs Iode AmmoniaqueAmmoniaque

Dragendorffactiqueouchlorhydrique(alcalodes) Iodoplatinate (alcalodes) Aniline(carbohydrates) AcideDiphnylborique (Flavones) Acide Phosphomolybdique + chauffage (strodes phnols ) AcidePhosphomolybdique +chauffage(strodes,phnols) Acidesulfurique+chauffage(substancesorganiques) Anisaldhyde sulfurique ou actique + chauffageAnisaldhyde sulfuriqueouactique chauffage

(sapognines,huilesessentielles)

Ractifs les plus couramment utilissRactifslespluscourammentutiliss

Di hl i 4 hl i id (Ph l i d l ) Dichloroquinone4chlorimide(Phnols,indoles) SeldeBleuSolideB(cannabinodes,phnols,tannins) Rctif de Neu (NP/PEG) (Flavones)RctifdeNeu(NP/PEG) (Flavones) Vanillinesulfurique(Strodes,saponineshuilesessentielles) TrichloruredAntimoine(terpnes,strodes,sapognines) Acidetrichloractique+chloramineT(H.cardiotoniques) Dinitrophnylhydrazine(Aldhydesetctones) PDAB Para dimthylaminobenzaldhyde (Indoles) PDAB=Paradimthylaminobenzaldhyde(Indoles) Acidechlorhydrique acideactique

Des rvlateurs trs utilissDesrvlateurstrsutiliss Anisaldhyde sulfurique1cannabis2 opium3ginkgo4ginseng

acidephosphomolybdique

1cannabis2ginkgo3ginseng

Diffrencesentredeuxrvlationslavanilline chlorhydrique et sulfuriquevanillinechlorhydriqueetsulfurique

Huileessentielleextraitdecranberry

Choix de la plaqueChoixdelaplaque

Expriencercente Ne pas changer de fournisseur de plaqueNepaschangerdefournisseurdeplaque

Ne pas changer de fournisseurNepaschangerdefournisseur

Plaquemerck

Plaque xPlaquex

Mmeluantmmervlation

glycolipidesglycolipides

Exempledemiseaupointdunemthodedervlation

Diffrentsrvlateursutilissettestssurdesglycolipidesglycolipides.

CesmanipulationsonttralisesdanslelaboratoireNutrition,CroissanceetCancerdelquipeInsermU921delafacultdemdecine de TOURS avec laide de lquipe demdecinedeTOURS,avecl aidedel quipedeMonsieurBernardSavarydulaboratoireCamag et les conseils de Monsieur JacquesCamagetlesconseilsdeMonsieurJacquesPothier

DeuxmolculesAetB, drivsglycolipidiquesdiffrentparunesubstitutionensn3.p

(Ractifs :Primuline,Berbrinesulfatedecuivre avec acide ortho phosphorique Acidecuivre avecacideorthophosphorique,Acidesulfuriquediffrentsdosages.

Acidesulfurique10%danslthanol :20mLdacidesulfuriqueavec180mLdthanol.Lesplaquessontchauffes130Cpendant5min.

ImageavecplaquedriveenWRT

R tif l lf t d i 20 d lf t d i di d 200 L dRactifaveclesulfatedecuivre :20gdesulfatedecuivredissousdans200mLdemthanolauquelonajoute8mLdacidesulfuriqueet8mLdacideorthophosphorique(85%).Lesplaquessontchauffes140Cpendant30min.

UV 366

BerbrineBerbrine

Test la primuline sur molcule cTestlaprimuline surmolculec

Les ractifs retenusLesractifsretenus

RemerciementsLes tudiants en pharmacognosieLestudiantsenpharmacognosie

MichellePinault

Joelle Dorat

Paul KleePaulKlee

Nicolasdestael

Nicolas de StalNicolasdeStal

Nous vous remercions pourremercions pour votre coute

Acidesulfurique10%danslthanol :20mLdacidesulfuriqueavec180mLdthanol.Lesplaquessontchauffes130Cpendant5min.

ImageavecplaquedriveenWRT

R tif l lf t d i 20 d lf t d i di d 200 L dRactifaveclesulfatedecuivre :20gdesulfatedecuivredissousdans200mLdemthanolauquelonajoute8mLdacidesulfuriqueet8mLdacideorthophosphorique(85%).Lesplaquessontchauffes140Cpendant30min.

.Les2ractifsensemblesontappropris.Les2molculesAetBsontsparesmaisilfaudraitunemeilleureposition,ellesrestentbassessurlaplaque.

Lervlateurpeuttreutilis.

Test primuline sur molcule cTestprimuline surmolculec