Influence de la nanostructuration énergétique des substrats

dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules

neuronales modèles PC12

Guillaume Lamour

Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui

24/06/2010

Soutenance de thèse

Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal

2

Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?

Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?

Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?

Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?

Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?

Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?

neurite

corps cellulaire (soma)

noyau

Interactions [neurones/surfaces biocompatibles]

cône de croissance

3

Le cône de croissance : structure et fonctions

chimio-répulsionchimio-attraction

microtubule

filament d’actine

faisceau de filaments d’actine

filopode

lamellipode

axone cône de croissance

4

Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?

Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?

Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?

Interactions [neurones/surfaces biocompatibles]

Adhésion cellulaire et différenciation neuronale : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?

Distribution de l’énergiede surface

?

1 µm 1 µm

ΔE

Deux paramètres :

Nanorugosité Gradients locaux

FAdhésion

surface

E3E1

E2 E4E5

5

Partie I

Influence de la distribution des énergies

d’adhésion sur la neuritogénèse

6

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion 7

Technique de modification du verre

8

Stratégies de modification du verre par diverses molécules

PLL

n

EDA

9

Les cellules PC12 :sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencient sous traitement au NGF.

Cellule PC12 - 6 joursCellules PC12 - à l’ensemencement

Les cellules PC12 :sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.

Cellule PC12 NGF 6 jours

Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale

10

Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF

sans NGF

6 jours

avec NGF

6 jours

11

6 jours

verre/EDA

Sur PLL : Sur EDA :

Neuritogénèse induite par effet de surface

sans NGF sans NGF

6 jours 6 jours

12Gradients locaux dans les énergies d’adhésion

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion 13

Expression du marqueur neuronal : MAP1B

14

verre/PLL

sans NGF

témoin négatif

verre/

PLLavec

NGF

témoin positif

verre/EDA

sans NGF

Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture)

15

avec NGF

50 µm

sans NGF

PEDA : 6 jours

PEDA : 6 jours (sans NGF)

Expression du marqueur neuronal : Tau

50 µm 25 µm

50 µm

actine

Tau

ADN

16

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion17

CH3

NH2

NH3+

NH2

Influence de la nature des terminaisons

Biopolymères (acides aminés) Alkylsiloxanes

peu ou pas de neuritogénèse neuritogénèse élevée

PLL EDA

PLO HTMS

18

PL

LE

DA

HT

MS

PL

OMicroscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50)

10 µm

19

Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères

Conditions de culture pas optimales

Multiplicité des paramètres :

mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité

chimique

Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques

Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères

Conditions de culture pas optimales

Multiplicité des paramètres :

mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité

chimique

Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques

Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères

Conditions de culture pas optimales

Multiplicité des paramètres :

mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité

chimique

Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques

Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères

Conditions de culture pas optimales

Multiplicité des paramètres :

mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité

chimique

Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques

Conclusions

Influence de facteurs externes

Limites

Neuritogénèse obtenue par effet de surface

Expression de marqueurs neuronaux

Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion

Reproduction de l’effet du NGF

20

Partie II

Identification des paramètres de surfaces

critiques à la réponse cellulaire

21

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion 22

Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes

très ordonnéeconformation all-trans

Classe 1

partiellement ordonnée perte des liaisons latérales

Classe 2

très désordonnéehétérogénéité chimique accrue

Classe 3 23

Spectroscopie vibrationnelle :

génération de fréquence somme (SFG)

Techniques de caractérisation des surfaces modifiées

Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides :

substratÉtat vibrationnel excité

ωIR

ωVis ωSFG

État fondamental

État virtuel

modèle Owens-Wendt

composantesdispersive/apolaire

énergie d’adhésion solide-liquide

composantes non-dispersive/polaire

24

Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H)

25

Spectres SFG des substrats dans la région C-H

ODMS1 ; ODMS2 ; HTMSM :

Formation d’une monocouche désordonnée

Classe 2

& Classe 3

OTS (θ = 110°)

ODMS1 (θ = 77°)

HTMSH (θ = 104°)

HTMSM (θ = 56°)

ODMS2 (θ = 96°)

Classe 1OTS ; HTMSH :

Formation d’une monocouche très ordonnée

26

modèle Owens-Wendt

Techniques de caractérisation des surfaces modifiées

Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides :

Spectroscopie vibrationnelle :

génération de fréquence somme (SFG)

composantesdispersive/apolaire

énergie d’adhésion solide-liquide

composantes non-dispersive/polaire

substratÉtat vibrationnel excité

ωIR

ωVis ωSFG

État fondamental

État virtuel

27

Estimation des énergies libres de surface

Classe 2 (▲) :

présence de gradients locaux dans les Eadhésion

Classe 3 (#) :

hétérogénéités chimiques accrues 28

Classe 1 (¤) :

Distribution homogène de l’énergie (s ≈ d )

pas d’adhésion

agrégats cellulaires flottant

adhésion limitée

quelques neurites

200 µm

Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher)

Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfacesaprès 48h de culture sans NGF

200 µm200 µm

classe 1 classe 2 classe 3

adhésion renforcée

forte croissance neuritique

surface très ordonnée surface (dés)ordonnée surface très désordonnée

29

Identification du facteur critique :

hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques

Eadhésion (classe 3) > Eadhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γs ?

Identification du facteur critique :

hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques

Eadhésion (classe 3) > Eadhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γs ?

Conclusions

30

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion 31

Modification du verre par des aminosilanes

Classe 2 Classe ???

État ordonné

État désordonné

ADMS APTMS EDA

DETA PEDAMonométhoxy-silane Triméthoxy-silanes

32

EDA PEDA

ADMS APTMSeda & peda :

très hétérogènes (Classe 3)

adms & aptms :

plus homogènes (Classe 2)

deta : ???

Analyses des surfaces NH2 : théorie de Zisman

Liquides tests

énergies critiques γc

± 2 mN m-1

33

ADMS APTMS

Analyses des surfaces NH2 : théorie de Owens – Wendt

Liquides tests

énergies critiques γc

34

eda & peda :

très hétérogènes (Classe 3)

adms & aptms :

plus homogènes (Classe 2)

deta : ???

± 2 mN m-1

Cellules en culture sur les surfaces NH2/OHaprès 24h de culture sans NGF

classe 2

différenciation : +

cas particulier du deta

classe 2

classe 3

différenciation : ++++35

La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.

L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.

Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le

degré d’affinité chimique des cellules au substrat,

et la différenciation n’est pas stimulée.

Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de

groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,

et la différenciation est fortement stimulée.

La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.

L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.

Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le

degré d’affinité chimique des cellules au substrat,

et la différenciation n’est pas stimulée.

Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de

groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,

et la différenciation est fortement stimulée.

La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.

L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.

Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le

degré d’affinité chimique des cellules au substrat,

et la différenciation n’est pas stimulée.

Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de

groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,

et la différenciation est fortement stimulée.

Conclusions

36

Plan de l’exposé

Introduction

Partie I

Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse

Stratégies de modification des surfaces de verre

Caractérisation de l’état de différenciation

Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat

Partie II

Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  »

Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »

Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule

Conclusion 37

AFM : cellules PC12 sur verre/EDA.

150 nm

38

Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B.

témoin

[cytochalasine] = 5 µM

39

Conclusion générale.

40

Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies

d’adhésion ?

Investigation de la dynamique des filaments d’actine

A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la

réponse cellulaire ?

Création de gradients contrôlés via des nanoplots

Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?

Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies

d’adhésion ?

Investigation de la dynamique des filaments d’actine

A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la

réponse cellulaire ?

Création de gradients contrôlés via des nanoplots

Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?

Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies

d’adhésion ?

Investigation de la dynamique des filaments d’actine

A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la

réponse cellulaire ?

Création de gradients contrôlés via des nanoplots

Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?

Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies

d’adhésion ?

Investigation de la dynamique des filaments d’actine

A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la

réponse cellulaire ?

Création de gradients contrôlés via des nanoplots

Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?

Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

Perspectives

41

Conclusion générale.

Distribution de l’énergiede surface

Distribution de l’énergiede surface

?

42