26/01/2017

1

HLA et greffe d’organe :

Groupage, anticorps et crossmatch

JL TAUPIN

INSERM U1160 - Centre Hayem

Lab of Immunology and Histocompatibility

Hôpital Saint-Louis APHP

University Paris-Diderot

Découverte du HLA

Leuco-agglutination

MAC = HLA-A2

26/01/2017

2

Gènes et protéines du HLA

Polygénisme du système HLA

systèmepolygénique

26/01/2017

3

CO

L11A

2

DP

B2

DP

A2

DP

B1

DP

A1

DM

AD

MB

LMP

2

TAP

1

TAP

2

DQ

B3

DQ

A1

DR

B1

DR

B2,

6 o

u 7

DR

B3,

4, 5

ou

rien

DR

B8

ou r

ien

100 kb

centromère télomère

DP DM DQ DR

CO

L11A

2

DP

B2

DP

A2

DP

B1

DP

A1

DM

AD

MB

LMP

2

TAP

1

TAP

2

DQ

B2

DQ

A1

DR

B1

DR

B2,

6 o

u 7

DR

B3,

4, 5

ou

rien

DR

B8

ou r

ien

100 kb

centromère télomère

les gènes ne sont pas représentés à l’échelle, seules les distances les séparant le sont.

en noir: gènes HLA II exprimésen hachuré: pseudogènes HLAen blanc: gènes associés au HLA

DP DM DQ DR

Organisation de la région HLA de classe II

DQ

A2

DQ

B3

DO

B

DO

A

en noir: gènes exprimésen hachuré: pseudogènespour tous les haplotypes, l’allèle DRA exprimé est l’allèle DRA*0101 (il en existe un second, rare)

Impossible …

DRADRB9DRB1 DRB6 DRB5haplotype DR51

DRB1*15DRB1*16

DRB5*01 à *02

Impossible

d'afficher l'i

DRADRB9DRB1 DRB2 DRB3haplotype DR52

DRB1*03DRB1*11DRB1*12DRB1*13DRB1*14

DRB3*01 à *03

Impossible d'afficher l'i

DRADRB9DRB1haplotype DR8

DRB1*08

Impossible d'afficher l'ima… Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur

Impossible d'afficher l'i

DRADRB9DRB1 DRB7 DRB8 DRB4haplotype DR53

DRB1*04DRB1*07DRB1*09

DRB4*01 à *03

DRADRB9DRB1 DRB6haplotype DR1

DRB1*01DRB1*10

Impossible d'afficher l'i

Impossible d'afficher

l'image. Votre ordinateur

Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur

Impossible d'afficher l'ima…

Représentation schématique des cinq haplotypes DR

26/01/2017

4

Exon n° 1 2 3 4 5 6 7 8PS αααα1 αααα2 αααα3 TM CYT

PS αααα1 ou ββββ1 αααα2 ou ββββ2 TM CYT

Exon n° 1 2 3 4 5 6

CMH I

CMH II

Structure schématique des molécules HLA

Sillon d’ancragedu peptide

Structure tridimensionnelle des molécules HLA de cl asse I

26/01/2017

5

Molécule HLA de classe I présentant un peptide

sillon profond aux extrémités ferméespeptide court (8 à 12 acides aminés)

Molécule HLA de classe II présentant un peptide

sillon aux extrémités ouvertes : le peptide peut dé passerpeptide long (16 à 25 acides aminés)

26/01/2017

6

liaison avec le TCR

209 (>5.1011) peptides de 9 AAdans la nature

Présentation et reconnaissance

(Garboczi et al, Nature 1996)

liaison avec la moléculeHLA de classe I

le polymorphisme est principalement localisédans la région qui forme la poche

26/01/2017

7

La fréquence des LyT alloréactifs

• 1 LyT sur 10 5 à 106 reconnaît un peptide viral en l’absencede tout contact antérieur

• mais 1 à 10% des LyT circulants sont alloréactifs, chez unindividu qui n’a jamais été en contact avec un all o-antigène

Pourquoi ?????

Les CMH du Soi et du non-Soiexposent

des surfaces très proches

Le TCR peut donc reconnaîtrele CMH allogénique(sauf exception ?)

Le répertoire de peptidesprésenté par le CMH allo

est différent

Les peptides présents chez le Soi(mais non présentables par le Soi)sont considérés comme étrangers

l’alloréactivité est donc une conséquence directede la réactivité croisée du TCR

… parce que la présentation et la reconnaissancede l’antigène sont des mécanismes très subtils

Limitation possible à considérer : les contraintes potentiellement imposées par leco-récepteur CD4 ou CD8 dans l’orientation du TCR et du pCMH dans le complexe

26/01/2017

8

Le polymorphisme du HLA

Nomenclature du système HLA

Historique de la classification

Notion de « super-type »Notion de « sous-type » ou spécificitéNotion d’allèle

(Cesbron-Gautier et al, EMC, hématologie, 2007)

26/01/2017

9

Hülsmeyer et al. J Biol Chem 2005, 280 : 2972-80

Un anticorps est beaucoup plus gros qu’une molécule HLA

Un anticorps ne « voit » que lesvariations de surface de la moléculeHLA et pas la région la plus variable, l’intérieur de la poche

Le polymorphisme HLA

Octobre 2015:>10500 allèles de classe I>3000 allèles de classe IIno

mbr

e d’

allè

les

conn

us

année

systèmepolyallélique

26/01/2017

10

Classe I

Octobre 2015 :>7300 protéines de classe I>2500 protéines de classe II

Le répertoire peptidiqueprésentable varie avecla composition de la poche

Le polymorphisme HLAno

mbr

e d’

allè

les

conn

us

année

nombre d’allèles HLA connus (au 01/10/2015)

HLA Class I Alleles 10297 HLA Class II Alleles 3543 HLA Alleles 13840

Gene A B C E F GAlleles 3285 4077 2801 18 22 51 Proteins 2313 3011 1985 7 4 17 Nulls 153 128 93 1 0 2

Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOBAlleles 7 1932 54 876 42 587 7 13 12 13 Proteins 2 1412 32 595 21 480 4 7 3 5 Nulls 0 47 1 22 0 15 0 0 1 0

Gene DRB1 DRB3 DRB4 DRB5Alleles 1825 60 17 22 Proteins 1335 48 10 19

Nulls 41 1 3 2

Classe I

Classe II

26/01/2017

11

Nomenclature du système HLA

classe I: HLA- A *02:01classe II: HLA- DRB1*01:01

complexe HLA

locus:gène codant pour la molécule A gène codant pour la chaîne ββββ de lapremière molécule DR

série allélique qui correspondà une spécificité sérologique,

ici A2 et DR1

numéro de l’allèledans la série allélique

Allèles particuliers:

HLA-A*02:01N : indique un allèle nul (non exprimé à la surface cellulaire: non produit ou soluble)HLA-A*02:01:02 : indique un allèle qui diffère de HLA-A*0201 par une mutation synonymeHLA-A*02:01:01:02 : indique un allèle qui contient une mutation en dehors de la région codanteHLA-A*02:01:01:02L : indique un allèle peu exprimé (« low ») qui contient une mutation en dehors de la région codante

HLA-A*02:01S : indique un allèle produit uniquement sous une forme sécrétée

HLA-A*02:01Q : indique un allèle dont le niveau d’expression est encore à confirmer (« questionable »)

mais tous les allèles ne sont pas présentsà la même fréquence dans la population

26/01/2017

12

Expressionco-dominante

une cellule « normale :classe I seulementdonc 2 molécules A + 2 B + 2 C

une cellule présentatrice de l’antigène :classe Iet deux molécules DR (gène DRB1)et 0 à 2 autres molécules DR (gènes DRB3/4/5)et 4 DQ et 4 DP

car : DQA et DQB polymorphesDPA et DPB polymorphes(mais DRA monomorphe)

le polymorphisme d’expression en classe II est > à la classe I

Combien de molécules HLA différentesune cellule exprime-t-elle ?

“Seen” byA2,A68;B27,B44

“Seen” byA2,A24;B7,B8

“Seen” byA2,A68;B35,B44

Polymorphic Residues on B51

Structural Basis of a HLA-B51 Mismatch(for antibodies)

26/01/2017

13

Groupage HLA

Groupage HLA de basse résolution: groupage génériqu e

= identifier super-types et sous-types���� sérologie (anticorps) (ex: A2, DR4)���� biologie moléculaire (ex: A*02, DRB1*04)

PCR-SSPPCR-SSO

Groupage HLA de haute résolution: groupage alléliqu e

= identifier les allèles à la base près���� biologie moléculaire (ex: A*02:01, DRB1*04:01)

PCR-SSPséquençage classique et NGS

Entre les deux: résolution intermédiaire���� biologie moléculaire sauf NGS

(ex: A*02:01/05/10, DRB1*04:01/09)

Groupage HLA

26/01/2017

14

1- Typage HLA par lymphocytotoxicité dépendante du Complément

molécule HLAreconnue

C’

Bromured’éthidium (rouge)

molécule HLAnon reconnue

C’

Acridineorange (vert)

Classe I

Classe II

les plaques de typages en « LCT » :

26/01/2017

15

Modification avec biotinylation d’une des amorces d e la PCR

2- Typage HLA en PCR-SSO-Reverse type « innolipa »

SSP = Sequence-Specific Primer

en 1992

une PCR par allèle ou par groupe d’allèlesavec une ou deux amorce(s) spécifique(s)

dépôt

ADN génomique

contrôle interne

bande spécifique

3- Typage HLA en PCR-SSP

� analyse du profil de bandes

26/01/2017

16

4- Typage HLA par NGS ( Next Generation Sequencing )

Principe général

- séquençage par synthèse après immobilisation de la matrice

Rizzo et alCancer Res Prev Rev2012

- multiplexage : plusieurs patients mélangés, indexation des amorces PCR

Amplification HLA par PCR « long range » > 5 kb

Alignement des « reads » pour définir la « couverture » de la région étudiéeet en déduire la séquence sans ambiguïté

26/01/2017

17

Anticorps anti-HLA et Crossmatch

la page « CRISTAL-immunologie » d’un patient en attente

TGI : nb de donneursincompatibles (=présenced’un Ac) sur5 ans en France

26/01/2017

18

1- Origine des anticorps anti-HLA

1- ne sont normalement pas présents sans évènementimmunisant allogénique

= anticorps immuns

2- causes:transfusions de culots globulaires

contaminants leucocytairesAc anti-classe I et/ou II

transfusions plaquettairesAc anti-classe I

grossesse10% après une grossesse, 60% après 3Ac anti-classe I et/ou II

transplantation antérieureAc anti-classe I et/ou II

2- Effets pathogènes

� Ac d’isotype IgG, IgA et/ou IgM

� les IgM ne sont pas en général pas pathogènes ; IgA ?

� impliqués dans:rejet hyperaigu :

Ac circulants préexistantsdans les minutes suivant la greffe

rejet aigurejet chronique

� mécanismes:activation du Complémentmobilisation des cellules phagocytaires

destruction cellulaire, inflammation

prolifération endothélium (rejet chronique)

26/01/2017

19

1969 : l’immunisation anti-donneur impose de procéd erà un crossmatch avant toute transplantation pour év iterle rejet hyperaigu (Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)

���� DSA pour « Donor Specific Antibody »

En 40 ans, l’identification du donneur compatible a évolué ++ :- meilleure sensibilité du crossmatch

- tests de recherche/identification des anticorpsLCT < ELISA < Luminex

amélioration de sensibilitéspécificitérésolution

La dernière idée à la mode, très « XXI e siècle » := le crossmatch virtuel

Le contexte

1- évolution des techniques de crossmatch

26/01/2017

20

Virtual crossmatch

The history

Is it possible to get rid of cell-based assays ?

Kidney : « NO ! »

Lung, Heart : CDC XM is usually retrospective

Liver : « what is a DSA ? »Eurotransplant

e.g. USAFrance

1- Technique historique: microlymphocytotoxicité (LCT)

HLA-B 1HLA-B 2

HLA-Cw 1HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

C ’

sérum à tester (Ac)

cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)

� principe

sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG

= technique de référence (LCT type « NIH »)(Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)

résultat en score : 1, 2, 4, 6, 8

26/01/2017

21

Mise en évidence de rejets rapides à XM négatif

besoin de techniques plus sensibles

- XM LCT avec lavage (1970)(Amos et al, Transplantation 1970, 7: 220)

- XM LCT sur LyT sensibilisé à l’anti-globuline (1972)(Johnson et al, Tissue Antigens, 1972, 2: 215)

- XM LCT sur LyB sensibilisé à l’anti-globuline (1984)(Gebel et al, Tissue Antigens, 1984, 23: 135)

- XM en cytométrie en flux (1983)(Garavoy et al, Transplant Proc, 1983, 15: 1939)

sensibilité(/ LCT)

1

X 10-30

X 100-300

2- Microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)

HLA-B 1HLA-B 2

HLA-Cw 1HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

C ’

sérum à tester (Ac)

cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)

� principe

Antiglobuline (anti-IgG humaine polyclonale)

C ’

En plus :

- isotypes n’activant pas le Complément- anticorps en trop faible concentration

(système d’amplification du signal)

26/01/2017

22

3- Cytométrie en flux (CMF)

HLA

cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)

sérum à tester (Ac)

Antiglobuline fluorescente (anti-IgG ou IgM humaine polyclonale)

Anti-CD3 (LyT) ou CD19 (LyB)

Anti-CD45 (leucocytes)

amplification du signal ++++

+/- pré-traitement Pronase (digère les RFc des LyB)

2- évolution des techniquesd’identification des anticorps anti-HLA

26/01/2017

23

1- microlymphocytotoxicité (LCT)

HLA-B 1HLA-B 2

HLA-Cw 1

HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

C ’

identifier la(es) molécule(s)HLA reconnue(s)

sérum à tester (Ac)

cellule cible(phénotype HLA connu)

panel de 30 à 60 cellulesrecouvrant les spécificités HLA

rencontrées localementprivilégiant les associations HLA rares

estimer le degré d’immunisationvis à vis de la population générale

panel représentatif de la répartition HLAcalcul du PRA % (panel reactive antibody)

hyperimmunisé: PRA>80%

sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG

2- microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)

HLA-B 1HLA-B 2

HLA-Cw 1HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

C ’

sérum à tester (Ac)

cellule cible(phénotype HLA connu)

� principe

Antiglobuline (anti-IgG humaine)

Comme avec la LCT-NIH, pour identifier les anti-classe II sur LyB,il faut au préalable adsorber les anti-classe I sur pools de plaquettes(très lourd !!!!)

C ’

26/01/2017

24

3- ELISA et Luminex sur panel

HLA-B 1

HLA-B 2

HLA-Cw 1

HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

cellule de phénotype HLA connu

purification des molécules HLA

Principe de l’ELISA Principe du Luminex

sérum à tester (Ac)

coloration

Ac anti-IgG humaines

fluorescence

� principe1 cellule par puits/bille

Appareil Luminex

26/01/2017

25

� modalités d’application

Screening ou dépistage : réponse + ou –tous les antigènes mélangésséparément classe I et classe II

Identification sur panel : 50 à 60 billes ou puits en classe Ienviron 30 en classe IIcorrespond au panel LCT1 « cellule » par bille ou puitscalcul d’un PRAsensibilité > au dépistage

Identification sur antigènes séparés : « single antigen »sensibilité > au panelpas de PRA

26/01/2017

26

Mr MAR Groupe : A3 A30 B35 B391er rein : A1 A2 B35 en 1982

A2

A28

score 8score 6

sc. 4

sérum du 30/11/04

en panel luminex :

PRA = 22/56 = 40%

4- Techniques de haute résolution ou « single antigen »� principe

HLA-B 1

HLA-B 2

HLA-Cw 1

HLA-Cw 2

HLA-A 2

HLA-A 1

cellule de phénotype HLA connu

purification séparée des molécules HLA(ou molécules recombinantes)

Principe de l’ELISA Principe du Luminex

sérum à tester (Ac)

coloration

Ac anti-IgG humaines

fluorescence

1 antigène par puits/bille

26/01/2017

27

� modalités d’application

Application récente :

apparition en France en 2000 en classe I en ELISAen 2004 en classe I en Luminexen 2005 en classe II en Luminex

Développement progressif :

gamme Luminex complète en classe I et II depuis fin 2007 seulementA, B et Cw en classe IDR, DQ et DP en classe IIchaîne α et β pour DQavec les allèles qui couvrent > 95% de la pop.

couverture épitopique très proche de 100 %

single antigen, analyse « baseline »

groupe : A1,2 ; B44,57 (Bw4)

Mme REA… (0 greffe, 0 transfusion, 2 grossesses) : suspicion anti-Bw6

� profil d’immunisation classe I en « single antigen » luminex

26/01/2017

28

LCT ELISA / Luminex

Isotypes détectables IgG et IgM IgG

Fonctionnalité Ac cytotoxiques Tous les anticorps

Ag cibles HLA et autres Ag HLA

Sensibilité + ++ à +++

Distinction cl I/cl II non(ads sur plaquettes) oui

Automatisation non oui

Avantages / Inconvénients des différentes techniques

Test de dépistage non oui

• 189 patients (119 XM + and 70 XM -)• XM : AHG-CDC and FCM• sum DSA (class I + class II)

26/01/2017

29

(-) XMFXMCS < 300

T- AHG-CDC (+)

FXMCS > 300

no DSA sMFI DSA<5000

sMFI DSA 5k - 10k

sMFI DSA> 10k

(-) XM

FXMCS < 300FXMCS > 300T-AHG-CDC (+) sMFI DSA > 10k

sMFI DSA (5k - 10k)sMFI DSA < 5000

no DSA

AMR-free patients

Allograft survival

AAMR

No AAMR

MFI of immunodominant DSA

AAMR risk increases with DSA strength (not consens ual)

26/01/2017

30

3- la notion de réactivité croisée d’un anticorps anti-HLA

1- les molécules HLA sont proches en séquence et en conformation spatiale

2- il existe des épitopes communs à plusieurs molécules HLA: épitopes publicset des épitopes spécifiques d’une molécule HLA: épitopes privés

3- les molécules HLA sont regroupées d’après leur réactivité antigénique en:

spécificités larges Bw4 et Bw6 (pour le HLA-B)

CREG (groupes de réactions croisées)

super-types

sous-types

allèles

La notion de réactivité croisée

public

privé

26/01/2017

31

CREG A1A1A3A11A36

CREG A2A2A28A68(28)A69(28)

CREG A9A9A23(9)A24(9)

CREG A10A10A25(10)A26(10)A34(10)A43A66(10)

CREG A19A19A29(19)A30(19)A31(19)A32(19)A33(19)A74(19)

CREG B7B7B13B22B27B37B40B41B42B47B48B54(22)B55(22)B56(22)B60(40)B61(40)B67B81

CREG B5B5B18B35B51(5)B52(5)B53B70B71(70)B72(70)

CREG B15B15B17B62(15)B63(15)B75(15)B76(15)B77(15)B57(17)B58(17)

CREG B12B12B21B44(12)B45(12)B49(21)B50(21)

CREG B8B8B14B16B38(16)B39(16)B64(14)B65(14)

B59 B73 B78

A80

les CREG (Cross-REacting Groups )

B46

36 1 11 3

24

2403

23

69203 2

9

210 68

28

26

66

34

10

25

80

33

32 74

43

29

31 30

19

Forte réaction croisée

Réaction croisée

CREG

3- Les Groupes de REactivité Croisée (CREG)

HLA-A

26/01/2017

32

HLA-B

4005

12

5045

44 49

21

57 58

62 6376

17

15

777572

70

71

78 51

35 53

52

51035102

18

5

656414

46

8

59 67

39

38

16

3901

3902

55

56 54

13

2708

27

47

41

60

7

42

703

61

48

81

40

22

73

Forte réaction croisée

Réaction croisée

CREG

37

60 70 80 90 100B*070201 CDVGPDGRLL RGHDQYAYDG KDYIALNEDL RSWTAADTAA QITQRKWEAAB*070202 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*070203 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*070204 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0703 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0704 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0705 ---------- ---N------ ---------- ---------- ----------

B*2701 ---------- --E---C--K ---Y--N--T ALR------- ------N---B*2702 ---------- --E---C--K ------N--I ALR------- ------N---B*2703 --------H- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2704 ---------- --E---C--K ---------T -LR------- ------N---B*270502 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270503 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270504 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270505 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270506 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2706 ---------- --E---C--K ---------T -LR------- ------N---B*2707 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ----------B*2708 ---------- --E---C--K ---------- ---------- ------N---B*2709 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2710 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---

domaine αααα1

épitope Bw6

épitope Bw4

La complexité des réactions croisées

TALR

IALR

TLLR

26/01/2017

33

Position de l’épitope Bw4/Bw6

�

Mr MAR Groupe : A3 A30 B35 B391er rein : A1 A2 B35 en 1982

A2

A28

score 8score 6

sc. 4

sérum du 30/11/04

en panel luminex :

en LCT (LyT, +DTT) : PRA = 26/56 = 47% (sc4+6+8)23/23 A2, 1/5 A68, 2/28 autre

PRA = 22/56 = 40%

26/01/2017

34

RECIPIENT : A11,33 ; B39,51 ; DR11,17 ; DR52 ; DQ2,7

LIVER DONOR: A2,29 ; B7,18 ; DR11,15 ; DR51,52 ; DQ6,7

epitope 127K or #19 : restricted to A2, A23, A24, A68 and A69epitope 62G or #17: restricted to A2, B57 and B58.

In situ in a liver transplanted patient (1)

Biopsy eluates

(Neau-Cransac et al, 2015)

Serum class I DSA are negative or close to, while b iopsies are strongly positive

Serum class II DSA levels are more stable (less tra pping ?)

In situ in a liver transplanted patient (3)

Serum

26/01/2017

35

4- faux amis et vrais ennemis

104 sérums de patients en attente rein, avec Ac ant i-DQ

71% ont des Ac reconnaissant au moins une bille por tant le DQdu patient lui-même

49% = DQββββ Soi associé à DQ αααα non-Soi90% = DQαααα Soi associé à DQ ββββ non-Soi

Anti-DQalpha

26/01/2017

36

Dissociations Ac anti-DQ en SAg : ex de DQ2 (DQB1*02)

Transplantation 2013

chaîne beta chaîne alpha chaîne alpha+ beta

PI = anti-DQ2PII = anti-DQA1*02:01PIII = association DQB1*03:01 et DQA1*05:05

26/01/2017

37

bille allèle ββββ allèle αααα groupe ASSOCIE DQB1 DQA129 DQB1*0201 DQA1*0301 DQ2 DQ2 47Q39 DQB1*0301 DQA1*0301 DQ7 à DR 4 DQ7 47Q42 DQB1*0302 DQA1*0301 DQ8 à DR 4 DQ8 47Q44 DQB1*0303 DQA1*0301 DQ9 à DR 9 DQ9 47Q68 DQB1*0302 DQA1*0302 DQ8 à DR 4 DQ8 47Q69 DQB1*0303 DQA1*0302 DQ9 à DR 9 DQ9 47Q70 DQB1*0401 DQA1*0303 DQ4 à DR 4 DQ4 47Q28 DQB1*0201 DQA1*0201 DQ2 à DR 7 DQ2 47K31 DQB1*0202 DQA1*0201 DQ2 à DR 7 DQ2 47K32 DQB1*0401 DQA1*0201 DQ4 DQ4 47K33 DQB1*0402 DQA1*0201 DQ4 DQ4 47K40 DQB1*0301 DQA1*0201 DQ7 DQ7 47K45 DQB1*0303 DQA1*0201 DQ9 à DR 7 DQ9 47K82 DQB1*0302 DQA1*0201 DQ8 DQ8 47K30 DQB1*0201 DQA1*0501 DQ2 à DR17 DQ2 40G+47C34 DQB1*0402 DQA1*0401 DQ4 à DR 8,18 DQ4 40G+47C41 DQB1*0301 DQA1*0601 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C65 DQB1*0201 DQA1*0401 DQ2 DQ2 40G+47C66 DQB1*0301 DQA1*0503 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C67 DQB1*0301 DQA1*0505 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C

Anti-DQα : jouer sur les associations DR/DQ pour interdire l’Ag adéquat

C1qrs

IgG

Cécile BordesCours P2

fixé à la cibleinactivé en C4d stable : marquage C4d (biopsie, SA luminex)

IgM>> IgGIgM>> IgGIgM>> IgGIgM>> IgG3333 > IgG> IgG> IgG> IgG1111>> IgG>> IgG>> IgG>> IgG2222

2 molécules d’IgG minimum

Anticorps fixantle C (C1q ou C3d)

en luminex

26/01/2017

38

Complement interference : prevalence

CLASSE I

253 sera

29 with C-interference = 11.5%

mean 15.1 beads/serum

ROC : MFI threshold = 14001

CLASSE II

258 sera

42 with C-interference = 16.3%

mean 12.3 beads/serum

ROC : MFI threshold = 16295

+ EDTA + EDTA

no

ED

TA

no

ED

TA

Guidicelli et al,

unpublished

(Loupy, Lefaucheur et al, NEJM, 2013)

Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (1)

n = 1016 kidney recipients

26/01/2017

39

Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (3)

Sicard et al, JASN 2014

Lyon Bordeaux

kidney

Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (4)

C1q+ serum DSA is close to, but does not reach significance

Only one study, two different SAFB kits from different vendors

26/01/2017

40

Ciurea et al, BBMT 2015

Le test C1q détecte les DSA cliniquement actifs en greffe de CSH aussi

n=73 sera

single antigen revealedfor IgG or C1q

Ab strength very stronglycorrelates with IgG MFI :

C1q+ Threshold = 14000

C1q assay and antibody strength

26/01/2017

41

Guidicelli/Guerville et al

Les DSA C1q- seraient aussi délétères que

les DSA C1q+ mais à plus long terme

2013

very often >1 isotype

almost always IgG1 (+/- IgG3)

IgG subclasses for anti-HLA antibodies

26/01/2017

42

IgG subclasses for anti-HLA antibodies

Lefaucheur et al,

5/104 n’ontni G1 ni G3

iDSA préformé chez 78% des patientsiDSA défini par la MFI la plus forteen test pan-IgG � sous-classe iDSA

C1q iDSA

Correlations are antigen-dependent

Anticorps anti-HLAde classe I

dit « dénaturé »

(Visentin et al,Transplantation 2016)

26/01/2017

43

39% of sera

N DM

FI (

x10

-3)

0

5

10

15

20

not with every Ag

23% 22% 21

%

21

%

0% 0% 0% 1%

% are for D >1.2N, among

the n cases with MFI>1000

in non-denaturing

condition

Visentin et al, Transplantation 2014

N D

MF

I (x1

0-3

)

0

5

10

15

20

kind of targetHLA epitope

Native 100% acid-sensitive

Acid-denatured

Bead-denatured acid-resistantor

+/- +/- +/-

native or , but partlyacid-sensitiveor +

The reality couldbe more subtle…

26/01/2017

44

85% of

FCXM+

p<0.0001

21% of

FCXM+

threshold for positivity = 50 MCS

64 different donor cells

225 FCXM tests

1 class I Ag mismatch

with SAFB MFI>2000

anti-dHLA :

n=71 tests

for 12 A, 14 B and 1 Cw

with 39 serum samples

antianti--nHLA :nHLA :

n=154 tests

for 13 A, 21 B and 1 Cw

with 84 serum samples

A few examples

80 ERN = native

#5024 (66I+70Q)

= cryptic

161D = native

26/01/2017

45

A major gain in transplant access

for many patients with

« basal » cPRA below 60%

cPRA decreased for 96/323 patients

cPRA estimated after removal

of the Ab against denatured

Ag (D>1.2N)

5- les stratégies possibles au laboratoire HLA

26/01/2017

46

2- Anticorps en LCT et crossmatch en cytométrie

3- Anticorps en technique sensible et crossmatch en LCT

4- Le « tout Fluo » : anticorps et crossmatch en techn iques sensibles

1- Le « tout LCT » : anticorps et crossmatch

Peu de sélection immunologique D/RCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable

Sélection immunologique D/R +++, mais au moment de l’urgenceIncohérence du raisonnement: sensibilité maximale au dernier moment

Sélection immunologique D/R +++, en amont de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité maximale en amontMais crossmatch peu sensible

Sélection immunologique D/R +++, en amont et au moment de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable

5- Le « tout Fluo » sans crossmatch réel (crossmatch v irtuel)

Remplacer le crossmatch par un « single antigen » du sérum du jour

Conclusions

26/01/2017

47

single antigen, baselineTests XM CMF

Ag Bw6 nb donneurs résultat (x bt de fd)

B39 1 1,5 sur T et 3 sur B

1- Définir au cas par cas le seuil d’interdiction d’ un Ag HLA ?

DSA faible, crossmatch faible,… Mais s’il s’agit d’un donneur vivant ?

- définir le risque acceptable pour chaque patient immunisé :crossmatch sensible positif toléré ?anticorps faiblement positif non contre-indiqué ?

� à voir en fonction de l’accès à la greffe (FAG, TGI)

voir aussi Gebel et al, Am J Transplant 2003,3: 1488-500et Bray et al, Curr Op Organ Transplant 2009, 14: 392-7

- gestion au cas par cas au laboratoire HLA (CRISTAL)en accord avec l’équipe de greffe

2- stratifier le risque immunologique

(Taylor et al, Hum Immunol, 2009 ; 70: 563)

26/01/2017

48

non immunisé LCT négative

immunisation

XM

LCT positive (LyT ou totaux)

Force de l’Ac anti-HLA

pasde

greffe

greffe

Il y a 40 ans (Terasaki, NEJM 1969) :

Ac anti-HLA

XM

immunisation faible

non immunisé

immunisation moyenne

immunisation forte

Force de l’Ac anti-HLA

pasde

greffe

greffe sans

risque immuno

greffeà

risqueimmuno

Ag permis

XM LCTpositif

MFI 500

XM B CMF+

>250 MCS

XM B CMF+

<250 MCS

greffe avant le

résultat du XM

REIN:* désinterdire1) MFI <3000 pour TGI>60% inscrit >2 ans2) Ag <5000 5 ans pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis>5 ans pour tous

*avec prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...

Aujourd’hui :

26/01/2017

49

Ac anti-HLA

XM

immunisation faible

non immunisé

immunisation moyenne

immunisation forte

Force de l’Ac anti-HLA

pasde

greffe

greffe sans

risque immuno

greffeà

risqueimmuno

Ag permis

XM LCTpositif

MFI 500

XM B CMF+

>250 MCS

XM B CMF+

<250 MCS

greffe avant le

résultat du XM

REIN:* désinterdire1) MFI<3000 (dernier sérum) pour TGI>60% inscrit >2 ans2) MFI<5000 (dernier sérum) pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis >5 ans pour tous immunisés

*prenant en compte prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...

Aujourd’hui (ex CHU de Bordeaux):

- logiciel HLA Matchmaker et la notion d’éplet(travaux de René Duquesnoy)

pas de consensus entre les études surl’influence du nombre d’épitopes apportés au receveuret le risque de rejet

- autre approche (charge électrique, hydrophobicité….)

3- raisonner autrement : en épitopes

26/01/2017

50

Merci de votre attention