HPTLC: vers la connaissance d’extraits végétaux d ... · ” Phytochimie approfondie ou recherche d’identification structurale ̈ Rechercher des caractéristiques spécifiques

HPTLC: vers la connaissance moléculaire d’extraits végétaux d’application cosmétique

Sylvie DarnaultCCCM – 23 Octobre 2008 -Lyon

SDARNAULT - CCCM – 23/10/08

2

1 – LE DEPARTEMENT I NNOVATI ON ACTI FS ET LA PHYTOCHI MI E

2 - LA DI VERSI TE POUR UN CHOI X DE MATI ERES VEGETALES

3 - METHODOLOGI E PAR HPTLC3a - Phytochimie Globale3b - Phytochimie Approfondie

4 – APPLI CATI ON A QUELQUES ACTI FS DEVELOPPES

5 – SUPPORT AU DEVELOPPEMENT

6 – I MPLI CATI ON ET AVENI R DE L’HPTLC AU DI A


PLAN

3

Missions

” Recherche d’actifs à partir de végétaux” Valorisation de plantes

Connaissance moléculaire

Connaissance des activités biologiques Mise en forme d’un extrait pour formulation future

Outils” Bibliographiques (connaissance ethnobotanique), chromatographiques,

d’extraction et à visée biologique.

1 - Le Département I nnovation Actifs


4

Département I nnovation Actifs

Extraction

Extrait standard

CriblageBiologique

Activité potentielleen cosmétique

Procédé d’extractionRendement, couleur, odeur,

solubilité

Criblage PhytochimiqueHPTLCHPTLC (isocratique, AMD,

densitométrie,…), HPLC,GC..

Marqueurs potentiels

phytochimiqueset/ou biologiques

Purification

Identification de Molécules/Marqueurs biologiquesHPLC, OPLC,

Partage L/L, HPLC prép., GC, GC/MS…

Procédé industriel

Ingrédient actif

EthnobotaniqueSélection plantesÉcorces, feuilles, fleurs, graines,…


5

La Phytochimie

Missions:” Sur les extraits végétaux

Mettre en évidence des molécules caractéristiques Orienter vers des marqueurs spécifiques et/ou biologiques Assurer un suivi de développement pour valider un procédé d’obtention de l’extrait final Etudier la stabilité des extraits via les marqueurs trouvés et identifiés

Méthode:” Screening Phytochimique ou approche globale

Etablir une cartographie moléculaire des extraits étudiés Rechercher différentes familles chimiques pour évaluer leur présence ou absence

” Phytochimie approfondie ou recherche d’identification structurale Rechercher des caractéristiques spécifiques aux familles et/ou composés propres

aux extraits Développement de techniques analytiques complémentaires


6

2 – Biodiversité végétale et moléculaire

DiversitDiversit éévvééggéétaletale

FougFougèèresres

AlguesAlgues

MoussesMousses......

fleur

s

feui

lles

écor

ces

frui

tsgr

aine

s

raci

nes

totu

m

Partie de la plante Biodiversitémoléculaire

Lipides…

VVééggéétaux taux supsupéérieursrieurs

ArbresArbres

bour

geon

s

Glucides

Acides Aminés

Composés colorés


Lipides…

Terpénoïdes…

Polyphénols

Composés colorés

7

3 - Outil de Connaissance de l’approche globaleH

P T

L C

H P

T L

C

O Hex/diethyl ether/formic ac.60 : 30 : 0.2

PhenolicCompounds

n Extracts 6 ou 8 standards

ACN/H O/HCOOH50 : 50 : 5

Neu + PEG

VANILLNE HCl

Folin-Ciocalteu

Iodine / HCl

Dragendorff

Molich

Ninhydrin

MolybdenumBlue

Visible + Rf

Chlorosulfonicacid

Amino acids/ Peptides

Carbohydrates/ Heterosides

Primary Metabolites

Phospholipids

Pigments Chlorophylls, Carotenoids

Triglycerides/FFA

Secondary Metabolites

Alkaloïdsexcept puric base

Alkaloïds

Triterpenoids

Phytosterols

Flavonoids

Phenolic acids

Condensed tannins

Hydrolysable tannins

Anthocyanins

UV 365 nm Visible + Rf

Anisaldehyde

without elution

Sampling Points

Primulin +Chlorosulfonic acid

+ Rf

Silice

10 Extracts 6 ou 8 standards

½Î

Silice

Silice

C18

15 : 20 : 15 : 1EtOAc /PrOH -1/H O/CH3COOH2

CHCl /MeOH/H90 : 20 : 1.5

23

2

Triterpenoids / SterolsFree fatty acids/

Alkans / AlkensGlycolipids

Triglycerids

FeCl 3 SterolsFolin-Ciocalteu + UV (254 nm,

366 nm)

Neu + PEG

70 : 30 : 1

10 Extracts 6 ou 8 standards

Silice

C6H14/(C2H5)2O/CH3COOH


8

3a - Carte d’identité Moléculaire

( (

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

A. U.

Plante 1Famille 1)

Plante 2Famille 2)

Plante 3(Famille 3)

Profils moléculaires de plantes d’origine diverse

Sucres et dérivés

Acides aminés et dérivés

Composés polyphénoliques

Terpénoïdes

Lipides

Chlorophylles

PH

EN

OLS

PH

EN

OLS

Conditions:

Phase Stationnaire: RP18F254s - Phase Mobile: ACN/H2O/HCOOH - 50/50/5

Révélation: Neu + Peg


9

Un Organe, différentes plantes

Coleus aromaticus(Lamiaceae)

Embeliaribes(Myrsinaceae)

Piper betle(Piperaceae)

00.5

1

1.5

22.5

3

4A. U.

3.5 C a rb o h y d ra te s

A m in o a c id s

P o ly p h e n o lic s

T e rp e n o id s

L ip id s

C h lo ro p h y lls

Une Plante, différents organes

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Feuilles Fruit

Carbohydrates

Amino acids

Polyphenolics

Terpenoids

Lipids

Chlorophylls


FEUI LLES

Embelia ribes

10SDARNAULT - CCCM – 23/10/08

espèce 1(Rutaceae )

espèce 2(Rutaceae)

espèce 3(Rutaceae)

00.5

1

1.5

22.5

3

3.5

4A. U.

Chaque extrait végétal est unique…avec sa propre carte d’identité

Profils spécifiques à chaque extrait pour conditions données

(famille, genre, espèce, organe)

Même organe – même famille – même genre

ESPECE DI FFERENTE

Carbohydrates

Amino acids

Polyphenolics

Terpenoids

Lipids

Chlorophylls

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Du screening vers l’ingrédient Actif

I ngrédient Actif pour Cosmétique” Cibler les molécules à risque

Coumarines (spectres UV,..), alcaloïdes (révélation complémentaire,..),..

” Cibler les molécules d’interférence Pour les tests biologiques (tanins, polymères,…)

Cas de détection par le screening” Statut sur le devenir de l’extrait abandon?” Elimination de ces composés par obtention d’un autre extrait?

” Permet anticipation d’un procédé pour l’ingrédient final


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But: 1ères orientations et hypothèses d’identifications de marqueurs à partir d’extraits et de fractions

” HPTLC – AMD

” HPLC/DAD

” GC et GC/MS

” (RMN)

3b – Phytochimie ApprofondieSur une famille d’intérêt

Autres conditions (élution, révélation, Gradient automatisé,…)Densitométrie (spectres UV-Visible, Recherche de molécules par longueur d’onde,1ères estimations quantitatives)

Confirmation des informations obtenues pardensitométrieMise au point de méthode analytique et Quantification (étalon choisi)

Analyse de génines natives et/ou après hydrolyseAnalyse de marqueurs spécifiques(acides gras, terpènes, …)

Confirmation des hypothèses structuralesdes marqueurs spécifiques


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I ntérêt de la densitométrie et AMD

HPTLC HPTLC –– C 18C 18

Éluant : ACN/H2O/HCOOH:

40/60/5

Révélateur :

Neu + Peg – 366 nm

AMD AMD –– DiolDiol

Éluant :gradient optimisépour phénols

Révélateur :Neu + Peg – 366 nm

Densitogramme natif

à 250 nmSpectre UV extrait Spectre UV extrait

dd’’un picun pic

Densitogramme natif

à 250 nm


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Autre exemple d’application AMD


Complémentarités de techniques

Heptane/ éther - (30/ 70) (v/ v) - silice

permet de voir les terpènes et AG

Extrait Aa TMS

Extrait Aa :

GC/FID

Gradient AMD optimisé - silice

permet de séparer alcènes et esters de stérols

Spectre EI d’Aframodial

GC/MS

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4 - Leontopodium alpinum développé au DI A

HPTLC HPTLC –– C 18C 18

Éluant: ACN/H2O/HCOOH:

40/60/5

Révélateur:

Neu + Peg – 366 nm

OH O

OH

OH

O

OH

OHOO

OH

OH

O

O

O

O

O

OH

OHO

CH3

DensitogrammeDensitogramme natif natif àà 330 nm330 nm Spectre UV extrait dSpectre UV extrait d’’un pic/un pic/ éétalontalon

Structure identifiStructure identifiééee

Acide chlorogénique

Marqueur extrait

Acide Léontopodique

SDARNAULT - CCCM – 23/10/08+ HPLC, purification solide liquide (SPE)

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Anogeissus leiocarpus développé au DI A

min5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=360,4 Ref=off (030326\037-0102.D)

8.4

52

11.

257

14.

345

17.

149

24.

369

O

O

O

H

H

4’’

O

H C3

O

O

O

O

O

O

O

CH3

HO

H

3

4

5 6

7

2

1 1’

2’ 3’

4’

5’6’

7’

1’’2’’

3’’

5’’

H

H5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000rt2

100

%

22.002

42.045

Scan EI+ TIC

1.01e7RT

FIV(1)2

40.6 min

75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500m/z0

100

%

73.21

414.30

75.20214.81

384.24354.22

474.40

475.42

760FR1A 1062 (41.907) Cm (1061:1063-1053) Scan EI+ 8.66e4

GC/MS

8.1673.459

21.752

20.83518.418

17.33516.585

25.08527.294 29.877

38.086

(min)

207.40192.23

184.6577.19 315.24

244.24

444.36

477.43

Restek: RTX 65 TGHe: 2.5 ml/min - T°inj 300°CT°: 80°C >320°CEI+: 70eV

[M +•

]


HPLC

Acide 3,3 ’-di-O-methyl-ellagique-4-ß-xylopyranoside

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5 - Support au DéveloppementAframomum Aframomum angustifoliumangustifolium

Screening d’échantillons issus de différents procédés d’extractiondans un domaine ‘Apolaire’

Conditions: Silice – Heptane/Ether éthylique – 30/70 – v/v

Révélation: lecture sous 254 nm Révélation: Anisaldéhyde - visible

Légende:

1 – MGDG 10 - Marubiin

2 – Fraction Heptane 05/10 11 - 05/05

3 – Squalène 12 - Thymol

4 – β sitostérol/cholestérol palmitate 13 - Hécogénine

5 – 05/11 14 - 05/27

6 – Sclaréol 15 – α amyrine

7 – acide ursolique 16 - β ecdysone

8 – 05/04 17 - 04/347

9 – C18:3 18 - Tristéarine


Marqueur commun et majoritaire

Structure caractéristique identifiée par GC/MS

Moléculeavec insaturation (254 nm)

Labdane diterpène(proche de l’étalon marubiin)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

18

Support au Développement

Screening d’échantillons issus de différents procédés d’extraction

KniphofiaKniphofia uvariauvaria

Conditions: Silice – Heptane/Ether éthylique – 30/70 – v/v


Deux Marqueurs communs –différenciation en terme de

concentration

Différenciation moléculaire plus spécifique pour deux extraits

Investigations spectrales via la densitométrie en cours

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6 - I mplication et avenir de l’HPTLC au DI A

I mplication” Obtention d’une cartographie globale d’un grand nombre de familles moléculaires” Mise en évidence rapide de molécules (à risques, d’interférence)” Connaissance de l’environnement moléculaire de la famille d’intérêt pour élaborer un

procédé” Contribution à l’identification structurale des molécules d’intérêt


Recherche de marqueurs phytochimiques et biologiques

” Permet un suivi des marqueurs et profil caractéristique d’un extrait au cours d’un développement

” Traçabilité matière (origine plante, lieu , temps de récolte,…)

Reproductibilité résultats biologiques et validation matière végétale

Choix des lots de matières premières, analyse des premiers pilotes,…

Mise en valeur justifiée au sein de LVMH

Avenir” HPTLC: Outil de RechercheRecherche ET outil de DDééveloppementveloppement” Traçabilité matière à développer” Travail en couplage?” Détection par bioluminescence?

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Merci de votre attentionMerci de votre attentionMerci de votre attentionMerci de votre attention


Plumeria acutifolia

Documents

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