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1
Huitièmes Journées Scientifiques du
Réseau Français de
Métabolomique et Fluxomique
19-21 Mai 2014
Université Claude Bernard Lyon 1
UFR des Sciences
Domaine Scientifique de la Doua - Bâtiment La Rotonde,
14-16 avenue des arts, 69100 Villeurbanne
Le Comité d'Organisation
Comité Local Lyonnais
Marie-Geneviève DIJOUX-FRANCA Anne-Emmanuelle HAY Isabelle KERZAON LEM-CESN - Lyon Guillaume MEIFFREN Serge MICHALET Marjolaine REY BF2i - Villeurbanne
Agneta KISS Gilles RAUTUREAU ISA - Villeurbanne Gabriel BAVEREL SFR santé Lyon Est - Lyon
Augustin SCALBERT IARC - Lyon
Comité National INRA Bordeaux
Catherine DEBORDE, Muriel GAUTHIER, Alain GIRARD, Florence LARTIGAUT, Marie-Lou LOMBARD,
Dominique ROLIN
2
Le Comité Scientifique
Comité Local Lyonnais
Floriant BELLVERT Gilles COMTE LEM-CESN - Lyon Laurent LEGENDRE Marie-Laure BAYLE Bruno COMBOURIEU Rovaltain Pôle Ecotox - Alixan Augustin SCALBERT IARC - Lyon
Marie-France SAGOT LBBE - Villeurbanne
Florence FAUVELLE GIN-IRmaGe - Grenoble
Cécile CREN ISA - Villeurbanne Bénédicte ELENA-HERRMANN ISA-CRMN - Villeurbanne Gabriel BAVEREL SFR santé Lyon Est - Lyon
Michel LAGARDE IMBL INSA - Villeurbanne
Conseil d'Administration du RFMF
Serge AKOKA CEISAM, Nantes Fabien JOURDAN UMR Toxalim & MetaboHUB -
Toulouse
Alain BOUCHEREAU Corsaire Biogenouest & UMR
Igepp, Le Rheu Christophe JUNOT
DSV/iBiTec-S/SPI &
IDF-MetaboHUB CEA Saclay
Frédérique COURANT UMR Hydrosciences,
Montpellier 1 Marie-Lou LOMBARD
MetaboHUB et UMR1332 BFP -
Bordeaux
Catherine DEBORDE
Dominique ROLIN
PF Métabolome
Bordeaux-MetaboHUB &
UMR1332 BFP - Bordeaux
Jean-Charles MARTIN UMR NORT - Marseille
Eric GONTIER BIOPI UPJV- Amiens Estelle PUJOS-GUILLOT PFEM- MetaboHUB
Clermont-Ferrand
Représentants du Club RFMF Junior
Hyacinthe Le GALL BIOPI UPJV - Amiens Nacima AIDOUD UMR NORT - Marseille
3
Table des matières
Partenaires des 8èmes Journées Scientifiques du RFMF………………….…4
Séminaires industriels……………………………………………………….………..9
Programme détaillé…………………………………………………………………..12
Résumés des Communications orales (O1-O32) …………………………..21
Résumés des Communications orales Juniors (OJ1-OJ8) ………………..54
Résumés des Communications Flashs (F1-F15) ……………….…………..62
Résumés des Communications par affiche (P1-P80)……………………..76
Ateliers et Tables-Rondes……………………………….………………………..141
Liste des participants…………………………………………….………………..146
Plan du site des 8 JS RFMF Lyon 2014…………………….3ème de couverture
4
Partenaires des huitièmes Journées Scientifiques
Ministère de l’Éducation Nationale, de
l'Enseignement Supérieur et de la
Recherche
Direction générale pour la recherche et l'innovation (DGRI)
1, rue Descartes
F-75231 Paris Cedex 05
Site web : www.enseignementsup-recherche.gouv.fr
Institut national de la recherche
agronomique
147 rue de l'Université
F-75338 Paris Cedex 07
Site web: www.inra.fr
Département Biologie et Amélioration
des Plantes
GIS IBiSA
Site web: www.ibisa.net
Cancéropôle Lyon Auvergne
Rhône-Alpes
321 Avenue Jean Jaurès
F-69007 Lyon
Site web: www.canceropole-clara.com
5
INSA de Lyon
20, avenue Albert Einstein
F-69621 Villeurbanne cedex
Site web : www.insa-lyon.fr
Université Claude Bernard Lyon 1
43, boulevard du 11 novembre 1918
F- 69622 Villeurbanne cedex
Site web: www.univ-lyon1.fr
ENS Lyon
15 parvis René Descartes
F- 69007 Lyon
Site web: www.ens-lyon.eu/ecole-normale-superieure-de-lyon-accueil-77247.kjsp
Faculté des Sciences et Technologies de
l’UCBL
Université Claude Bernard Lyon1 Bâtiment Lippmann, 16 rue Enrico Fermi
F- 69622 Villeurbanne cedex
Site web: http://sciences.univ-lyon1.fr
Conseil Régional du Rhône
1 esplanade François Mitterrand,
F-69269 Lyon cedex 02
Site web: www.rhonealpes.fr
6
Metabolomics Society
Site Web : www.metabolomicssociety.org/
Rovaltain
1 avenue de la gare
Bâtiment Rhovalparc - Entrée B- 2ème
étage
F-26300 Alixan
Site web: http://pole-ecotox.com/
Thermo Fisher Scientific
16 avenue du Québec - Silic 765
Villebon-sur-Yvette
F-91963 Courtaboeuf cedex
Site web : www.thermoscientific.com/
STAN
D
+ Sé
min
aire
Bruker BioSpin S.A.
34, rue de l'industrie - BP 10002
F-67166 Wissembourg cedex
Site web : www.bruker.fr
STAN
D
+ Sé
min
aire
7
Waters
5 rue Jacques Monod
F-78280 Guyancourt
Site web : www.waters.com/
STAN
D
+ Sé
min
aire
AGILENT TECHNOLOGIES
33 rue du Dr Georges Levy
Parc/Club du moulin à vent
69693 Vénissieux
Site web : www.agilent.com
STAN
D
+ Sé
min
aire
Advanced Chemistry Development
(ACD/Labs)
3 quai Kléber, Tour Sébastopol,
F-67000 Strasbourg
Site web: www.acdlabs.com/home/
STAN
D
+ Sé
min
aire
Euriso-Top
Parc des Algorithmes ,Bâtiment Homère
Route de l'Orme
F-91194 Saint Aubin
Site web: www.eurisotop.com/
STAN
D
8
LECO France
ZAC Les Doucettes 22 avenue des Morillons
BP 70074 F-95144 Garges-Les-Gonesse cedex
Site web: www.lecofrance.com/
STAN
D
Chenomx
4350 – 10230 Jasper Ave. NW Edmonton, AB, Canada T5J 4P6
Site web: www.chenomx.com
STAN
D
+ Sé
min
aire
SIGMA PLUS
6 rue Collange
F-92300 Levallois-Perret
Site web: www.sigmaplus.fr
STAN
D
CortecNet
15 Rue des Tilleuls
F-78960 Voisins le Bretonneux
Site web : www.cortecnet.com
STAN
D
Nonlinear Dynamics
Keel House - Garth Heads
NE 12 JE - Newcastle Upon Tyne
Royaume-Uni
Site web : www.nonlinear.com
STAN
D (W
aters)
9
Séminaires industriels des 8èmes JS RFMF
Séminaire ACD/Labs - Mardi 20 mai Amphi Rotonde 12h45-13h15
ACD/Labs the new Metabolomic NMR solution and the IntelliXtract algorithm to process more effectively the LC/MS data
Matteo Stocchero, S-IN Soluzioni Informatiche, Vicenza, Italie
Yves Lorrain, ACD-Labs, France
Séminaire WATERS et Nonlinear Dynamics - Mardi 20 mai Amphi Rotonde 13h20-13h50
Solutions globales de Waters en métabolomique impliquant l'instrumentation, le
consommable, le logiciel et l'approche applicative
David Lascoux, Waters Corporation, Saint-Quentin-en-Yvelines cedex, France,
Agnès Corbin Nonlinear Dynamics, Newcastle Upon Tyne, Royaume-Uni
10
Séminaire Thermo Scientific - Mardi 20 mai salle René Char 12h45-13h15
mzCloud and Mass Frontier: a key conceptual shift to understand “who’s who” in untargeted
metabolomics.
Robert Mistrik , HighChem, Slovaquie
Séminaire Chenomx - Mardi 20 mai salle René Char 13h20-13h50
Quantitative NMR software for metabolomics.
Neil Taylor, Chenomx, Edmonton, Canada
Debora Paris, Institute of Biomolecular Chemistry, CNR, Naples, Italie
11
Séminaire BRUKER - Mercredi 21 mai Amphi Rotonde 12h45-13h15
Sabine Jourdain et Alexandre Verdu
Séminaire AGILENT Technologies - Mercredi 21 mai Amphi Rotonde 13h20-13h50
CRAFT: a new way to process your NMR spectra and to extract frequency and
amplitude information.
Dimitris Argyropoulos, Agilent Technologies, Royaume-Uni
Mobilité ionique par Agilent ou comment gagner en efficacité de séparation
Luc Arnaud, Agilent Technologies , France
12
Programme des 8 JS RFMF
lundi 19 mai 2014 10:00 - 13:00 : Atelier Galaxy
Initiation au traitement et à l'analyse des données métabolomiques sur la plateforme Galaxy IFB-MetaboHUB. (sur inscription préalable validée)
12:00 - 14:00 : Accueil des participants - Buffet
Accueil des participants 13h - 14h : Buffet
14:00 - 14:15 : Allocution de Bienvenue
Michel Lagarde, Vice-Président de l'INSA de Lyon.
14:15 - 14:30 : Introduction aux 8 Journées Scientifiques
Floriant Bellvert et Anne-Emmanuelle Hay du Comité d'Organisation des 8 JS RFMF et Dominique Rolin du Réseau Français de Métabolomique et Fluxomique.
14:30 - 14:45 : Développements méthodologiques en bioinformatique / traitements
statistiques 14h30 - 14h45 : MetExplore 2.0: handling genome scale metabolic networks online.
Fabien Jourdan, Toulouse, France 01
14:50 - 15:05 : Session Flash 14h50 Metabolic profile of limbic brain structures in microtubule-associated proteins
MAP6 Knockdown mice.
Florence Fauvelle, Grenoble, France. F1-P1
14h55 Evaluation de la précision et de la justesse de méthodes RMN 2D pour la
quantification d'isotopomères.
Christophe Thibaudeau, Amiens, France. F2-P2
15h00 Urinary metabolic profiling of rats treated with curcumin using HPLC-MS.
Matteo Stocchero, Vicenza, Italie. F3-P3
15:05 - 15:10 : Pause 15:10 - 16:10 : Développements méthodologiques en métabolomique, fluxomique,
lipidomique... Session parallèle A – Amphi Rotonde
Session Dévelopements Méthodologiques en Métabolomique et Fluxomique
15h10 - 15h25 : SYSMETAB : calcul rapide du gradient pour l'identification des flux metaboliques à partir d'expériences de marquage isotopique
13
stationnaires et non-stationnaires.
Stéphane Mottelet, Compiègne, France. 02
15h30 - 15h45 : Statistical approaches to study the physiological variability of the urinary metabolome.
Etienne Thévenot, Saclay, France. 03
15h50 - 16h05 : Analyse isotopique et métabolomique dans les cellules mammaires humaines : vers un nouvel outil de diagnostic du cancer du sein.
Illa Téa, Nantes, France. 04
Session parallèle B – Amphi Lespinasse Chairwoman : Nathalie Bernoud-Hubac, Lyon, France
Session Lipidomique
15h10 - 15h25 : Lipidomics of mono- and dihydroxylated fatty acids.
Michel Guichardant, Lyon, France. 05
15h30 - 15h45 : LC-MS and GC-MS in lipidomics research: Methodology and
Applications.
Hector Gallart-Ayala, Nantes, France. 06
15h50 - 16h05 : Lipidomic analysis of spinocerebellar ataxia plasma samples.
Alexandre Seyer, Boulogne Billancourt, France. 07
16:10 - 16:35 : Pause - Echanges informels 16:35 - 16:50 : Session Flash - Amphi Lespinasse
16h35 NMR metabolomics in young endurance horses.
Margaux Luck, Evry, France. F4-P4
16h40 La Métabolomique appliquée à l’étude d’un stress thermique sur le corail
scléractiniaire Stylophora pistillata.
Isabelle Bonnard, Perpignan, France F5-P5
16h45 Waters.
David Lascoux, Saint-Quentin en Yvelines, France F6
16:50 - 17:05 : Développements méthodologiques en bioinformatique / traitements statistiques
16h50 - 17h05 : A consensus OPLS-DA strategy for multiblock data fusion: Application
to plant metabolomics.
Julien Boccard, Genève, Suisse. 08
14
17:10 - 17:25 : Session Flash - Amphi Lespinasse
17h10 Agilent. F7 17h15 NMR based Metabolomics for the diagnosis of thyroid cancer.
Lamya Rezig, Marseille, France. F8-P8
17h20 Chenomx.
Neil Taylor, Edmonton, Canada F9
17:25 - 18:05 : Conférence invitée - Amphi Lespinasse
17h25 - 18h05 : Towards mechanism-based toxicity testing in Daphnia utilising metabolomics approaches.
Mark R. Viant, Birmingham, Royaume-Uni. 09
18:10 - 18:20 : Pause 18:20 - 19:20 : Assemblée Générale du RFMF - Amphi Lespinasse
Ouverte à tous les participants des 8 JS RFMF et aux membres du RFMF
19:30 - 20:30 : Cocktail d'accueil - Barnum Rotonde
Cocktail d'accueil - Echanges informels
Mardi 20 mai 2014 08:30 - 09:10 : Conférence invitée
8h30 - 9h10 : Cell culture NMR metabolomics and its many applications.
Miroslava Cuperlovic-Culf, Moncton, Canada. 010
09:15 - 09:30 : Session Flash
9h15 ProbMetab: an R package for Bayesian probabilistic annotation of LC-MS based
metabolomics.
Ricardo R. Silva, Sao Paulo, Ribeirao Preto, Brésil F10-P10
9h20 Targeting the halogenated metabolome of marine-derived fungi using
LC-HRMS/MS tools.
Yann Guitton, Nantes, France. F11-P11
9h25 Thermo Scientific. F12
09:30 - 09:35 : Pause
15
09:35 - 10:10 : Sessions Santé Cancer & RFMF Junior Session parallèle A – Amphi Rotonde
Session Cancer
9h35 - 9h50 : NMR Metabonomics Reveals Molecular Markers of Hepatocellular
Carcinoma in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) Cohort.
Bénédicte Elena-Herrmann, Lyon, France. 011
9h55 - 10h10 : Altérations métaboliques dans la voie de synthèse du cholestérol, une
authentique voie oncogénique.
Laurent Corcos, Brest, France. 012
Session parallèle B – Amphi Lespinasse
Session RFMF Junior
Plantes et Agroressources 9h35 - 9h45 : NMR metabolomic approach to study cold acclimation on three genotypes
of Miscanthus.
Hyacinthe Le Gall, Amiens, France 0J1
9h50 - 10h00 : 1H-NMR HRMAS study of maize ( Zea mays ) roots exposed to
organochlorines pesticides.
Claire Blondel, Grenoble, France. 0J2
10:10 - 10:40 : Pause - Echanges informels
10:40 - 12:00 : Sessions Santé & RFMF Junior Session parallèle A – Amphi Rotonde
Session Cancer (Suite)
10h40 - 10h55 : Exposome-Explorer, a new database on biomarkers of exposures for cancer risk factors.
Vanessa Neveu, Lyon, France. 013 Session Santé
11h00 - 11h15 : Metabolomic study of Kleine-Levin syndrome.
Farid Ichou, Paris, France. 014
11h20 - 11h35 : New Insight into Age-related Macular Degeneration: A Metabolomics
Approach.
Pascal de Tullio, Liège, Belgique. ANNULE 015
11h40 - 11h55 : Etude de l’effet de la vinclozoline sur le métabolome testiculaire des
rats Sprague-Dawley par approche métabonomique sur une plateforme LC-QqToF.
Agneta Kiss, Lyon, France. 016
16
Session parallèle B – Amphi Lespinasse Session RFMF Junior
Plantes et Agroressources
10h40 - 10h50 : Caractérisation et traçabilité des matrices riches en triacylglycérols par
une approche Isotopomique.
Noëlle Merchak, Nantes, France. 0J3
Santé 10h55 - 11h05 : LC-HRMS and data mining tools for the combined metabolomic and
lipidomic serum profiling of human cohorts.
Samia Boudah, Gif-Sur-Yvette, France. 0J4
11h10 - 11h20 : Targeted, LC-MS/MS-based metabolomics for quantitative analysis of
Plasmodium falciparum phospholipid metabolism.
Salma Ghezal, Montpellier, France. 0J5
11h25 - 11h35 : Etude non ciblée d’empreintes métaboliques de tumeurs mammaires
analysées sur une plateforme UHPLC-QqToF.
Sandra Coronado, Villeurbanne, France. 0J6
11h40 - 11h50 : Untargeted metabolomics approach for the urine analysis of autistic
patients using LC-HRMS, 1H-NMR and 1H-13C-HSQC NMR.
Binta Diémé, Tours, France. 0J7
12:00 - 14:00 : Buffet
12:45 - 13:50 : Session Séminaires Industriels
Amphi Rotonde
Chairman: , Lyon, France
Salle René Char
Chairman: , Lyon, France 12h45 - 13h15
ACD/Labs the new Metabolomic NMR solution and the IntelliXtract algorithm to process more effectively the LC/MS data
Matteo Stocchero, S-IN Soluzioni Informatiche, Vicenza, Italie
et Yves Lorrain, ACD/Labs, France
Thermo Scientific
mzCloud and Mass Frontier: a key conceptual shift to understand “who’s who” in untargeted metabolomics.
Robert Mistrik , HighChem, Slovaquie
13h20 - 13h50 :
WATERS et Nonlinear Dynamics .
David Lascoux, Waters, France, et Agnès Corbin, Nonlinear Dynamics, Royaume-Uni
Quantitative NMR software for metabolomics.
Neil Taylor, Chenomx Canada, et Debora Paris, Italie
17
14:00 - 14:40 : Conférence invitée 14h00 - 14h40 : A metabolomics-centered view on the defensive chemistry of native
tobacco species to insect attack.
Emmanuel Gaquerel, Heidelberg, Allemagne 017
14:45 - 15:00 : Session Flash
14h45 Metabolic indicators of olive oil ageing. Multiblock analysis by ACOMDIM
treatment.
Nathalie Dupuy, Marseille, France F13-P13
14h50 Sphingolipidomique par spectrométrie de masse : approche basse résolution
versus haute résolution.
Justine Bertrand-Michel, Toulouse, France F14-P14
14h55 Bruker F15
15:00 - 15:05 : Pause
15:05 - 16:05 : Sessions Microbiologie-Biotechnologie & Plantes - Agroressources
Session parallèle A – Amphi Rotonde
Session Microbiologie-Biotechnologie 15h05 - 15h20 : Development of an LC-HRMS-based metabolomic approach to study
methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Sandrine Aros-Calt, Saclay, France. 018
15h25 - 15h40 : Approche combinée de profilage métabolique par LC-MS et RMN
d’extraits de micromycètes d’origine marine.
Julie Lalande-Martin, Nantes, France. 019
15h45 - 16h00 : Unraveling the glucose/Acetate transition in Escherichia coli by a
combination of 13C-MFA and metabolomics strategies.
Fabien Létisse, Toulouse, France. 020
Session parallèle B – Amphi Lespinasse
Session Plantes-Agroressources
15h05 - 15h20 : Sélection variétale traditionnelle et diversité chimique des plantes à
racines et tubercules au Vanuatu.
Laurent Legendre, Lyon, France. 021
15h25 - 15h40 : Using developmental and diurnal compositional changes of tomato to
study metabolism.
Annick Moing, Bordeaux, France. 022
15h45 - 16h00 : Integrating metabolomic data from multiple analytical platforms for a
comprehensive characterisation of lemon essential oils.
18
Florence Mehl, Genève, Suisse. 023
16:05 - 16:10 : Pause
16:10 - 16:40 : Session Etudiants Master Amiens 0J8 EM1: Etude bibliographique : métabolomique et graines.
Marie-Aude Tribalat, Nice, France EM2 : La métabolomique dans le cursus pharmaceutique à l'Université de Picardie
Jules Verne. Olivier Varennes, Amiens, France
EM3 : Métabolomique et agro-ressources à l'Université de Picardie Jules Verne.
Sylvain Lecomte, Amiens, France
16:45 - 17:15 : Pause - Echanges informels
17:15 - 18:25 : Session Posters
18:30 - 18:40 : Départ Abbaye de Collonge Départ en car pour l'Abbaye de Collonge (Repas de Gala)
Mercredi 21 mai 2014 08:30 - 09:25 : Assemblée Générale RFMF Junior - Amphi Rotonde 09:25 - 09:30 : Pause 09:30 - 10:10 : Conférence invitée
9h30 - 10h10 : Genetic variation of metabolic diseases and metabolomics.
Thomas Illig, Hanovre, Allemagne 024
10:15 - 10:20 : Pause
10:20 - 11:00 : Sessions Environnement & Nutrition
Session parallèle A – Amphi Rotonde Session Environnement
10h20 - 10h35 : L'approche métabolomique identifie une réponse biologique à la
contamination chronique à de faibles doses d'uranium naturel dans l'urine.
Gaëlle Favé, Marseille, France. 025
10h40 - 10h55 : Cloud metabolomics - a stress biomarkers story.
Cyril Jousse, Clermont-Ferrand, France. 026
19
Session parallèle B – Amphi Lespinasse
Session Nutrition
10h20 - 10h35 : The polyphenol metabolome and dietary biomarkers in the European
Prospective Investigation on Cancer and Nutrition (EPIC) cohort.
Augustin Scalbert, Lyon, France. 027
10h40 - 10h55 : Identification des AGPI w3 en position sn1 des phosphaditylcholines
chez des sujets hypertriglycéridémiques après supplémentation en AGPI w3 : activation de la LCAT.
Véronique Ferchaud Roucher, Nantes, France. 028
11:00 - 11:20 : Pause - Echanges informels
11:20 - 12:00 : Sessions Environnement, Nutrition & Authentification
Session parallèle A – Amphi Rotonde Session Environnement
11h20 - 11h35 : HRMAS NMR-based Metabolomics for the study of Al(III) nanoparticle
toxic effects on P. brassicacearum bacteria.
Laetitia Shintu, Marseille, France. 029
11h40 - 11h55 : Empreintes métaboliques de stress abiotiques chez des Brassicacées
modèles et cultivées France.
Alain Bouchereau, Rennes, France. 030
Session parallèle B – Amphi Lespinasse
Session Nutrition (Suite)
11h20 - 11h35 : Trajectoires métaboliques chez le miniporc lors des adaptations du métabolisme à des challenges nutritionnels : le cas du régime riche en lipides.
Sergio Polakof, Clermont-Ferrand, France. 031
Session Authentification 11h40 - 11h55 : Metabolomic approach to authenticate plant extracts used in fragrance
and flavour: application to violet extracts.
Laure Saint-Lary, Nice, France. 032
12:00 - 12:10 : Clotûre des 8 JS RFMF - Amphi La Rotonde
20
12:10 - 14:00 : Buffet
12:45 - 13:50 : Session Séminaires Industriels
Amphi Rotonde
Chairman: , Lyon, France 12h45 - 13h15
Bruker :
Sabine Jourdain et Alexandre Verdu, Bruker , France
13h20 - 13h50 : Agilent technologies :
CRAFT: a new way to process your NMR spectra and to extract frequency and amplitude information..
Dimitris Argyropoulos, Agilent Technologies , Royaume-Uni
Mobilité ionique par Agilent ou comment gagner en efficacité de séparation
Luc Arnaud, Agilent Technologies , France 14:00 - 17:00 : Tables Rondes et Atelier Amphi La Rotonde
14h - 15h : Table ronde 2 : Preparation of blood samples for metabolomic analyses. 15h - 17h : Table ronde 3 : High resolution mass spectrometry and metabolomics – Looking
for best solutions to three major hurdles.
14:00 - 16:00 : Atelier MetaboLights & CosMos
Salle informatique 14h - 16h : Atelier 4 : Hands on data submission to MetaboLights using ISATools. AND
Maximizing ‘-Omics’ interoperability by promoting metabolomics open standards data exchange formats: The biologist view.
21
Résumés
Communications Orales
22
O1
MetExplore 2.0: handling genome scale metabolic networks online
Ludovic Cottret1,2
, Florence Vinson3, Yoann Gloaguen
4, Benjamin Merlet
3, Stéphanie Heux
5*, Karl
Burgess4, Daniel Zalko
3, Marie-France Sagot
6,7, Jean-Charles Portais
5*, Michael P. Barrett
4 and Fabien
Jourdan3*
1 INRA, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM), UMR441, Castanet-Tolosan, F-31326, France 2 CNRS, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes (LIPM), UMR2594, Castanet-Tolosan, F-31326, France
3 INRA UMR1331 - Toxalim, Toulouse, France 4 Glasgow Polyomics, University of Glasgow, 120 University Place, Glasgow G12 8TA
5 LISBP, UMR CNRS 5504 - INRA 792, Toulouse, France 6 Bamboo Team, INRIA Grenoble-Rhône-Alpes, 38330 Montbonnot Saint-Martin
7 Université de Lyon, F-69000, Lyon; Université Lyon 1; CNRS, UMR555 8 Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive, F-69622, Villeurbanne, France
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Since 2009 the MetExplore web server has offered access to more than 200 metabolic networks representing a large variety of organisms. A key feature of MetExplore is its provision of a single framework that allows analysis of metabolomics datasets within the context of these networks. We have recently changed the architecture of the server, creating a fully online interface (from data import to network visualization) thus eliminating any need for software installation and file exchanges. Most original functions were kept in version 2.0, including graph modelling, SBML file import and Cytoscape exports. Flux Balance Analysis methods, available in version 1, are also being transferred to the new release. Flux computation on in silico engineered models is possible through computation in a newly developed Java framework (FlexFlux).Many new features have been added to the online release, as we move to integrate metabolomics data within a more polyomics based context, offering organism-specific metabolome alongside genome, transcriptome and proteome centered information. Omics data regarding each of these elements can be imported, from Excel spreadsheets, processed then visualized within an interactive webpage. MetExplore 2.0 is offered as a freely accessible web service to the community.MetExplore is capable of extracting a variety of sub-networks from within the larger network, based on individual pathways, or modules responding to environmental challenge. MetExplore tackles sub-network identification in two ways. A first approach filters for selected features e.g. certain metabolites either known to be involved in particular responses, or inferred to be involved through association with others that are. Secondly, application of graph algorithms to the network structure can identify metabolic paths between identified metabolites.The MetExplore 2.0 architecture allows a flexible analysis of integrated polyomics data within the context of metabolic networks. It has been successfully used to interpret metabolomics data obtained from a range of research areas including microbiology, pharmacology, food toxicology and parasitology. MetExplore 1 and 2.0 can be accessed at http://www.metexplore.fr Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Metabolic networks, genome scale models, graphs, flux
23
O2
SYSMETAB : calcul rapide du gradient pour l'identification des flux metaboliques à partir d'expériences de marquage isotopique stationnaires et non-stationnaires
Stéphane Mottelet
1, Georges Sadaka
1, Pierre Villon
2
1 laboratoire de mathématiques appliquées (EA2222), Université de Technologie de Compiègne 2 laboratoire Roberval (UMR7337), Université de Technologie de Compiègne
Le logiciel SYSMETAB permet, à partir de réseaux métaboliques et des données d’une expérience de marquage isotopique, décrits dans un format standard (SBML, FLUXML ou FTBL), de générer un programme (en langage Scilab) réalisant l’identification des flux métaboliques du réseau, en utilisant la méthode des moindres carrés et une technique originale de calcul du gradient. Le modèle mathématique permettant de faire la simulation directe est bien connu et la technique utilisée pour calculer les flux est elle aussi connue mais les détails d’implémentation et les méthodes numériques utilisées (optimisation, régularisation) varient suivant les logiciels, qui sont donc plus ou moins capables de traiter de grands réseaux. La méthode des moindres carrés telle qu’implémentée dans SYSMETAB est basée sur un calcul du gradient avec la méthode de l’état adjoint, qui à notre connaissance n’est utilisée par aucun des logiciels concurrents. Cette méthode permet de calculer le gradient pour un coût identique à une simulation directe, alors que dans les autres logiciels, cela est fait avec un coût p fois plus grand, où p est le nombre de flux à identifier. Cette approche adjointe permet d’accélérer le processus d’identification des flux dans le cas isotopique stationnaire, et permet aussi d’envisager la résolution du problème d’identification dans le cas isotopique non-stationnaire avec un temps de calcul et une complexité raisonnables. Nous présentons des résultats de validation sur les données de la littérature, en particulier sur le métabolisme central de E.coli. Ce travail a été réalisé, en partenariat avec la SAS PIVERT, dans le cadre de l’institut pour la Transition Energétique (ITE) P.I.V.E.R.T. (www.institut-pivert.com/fr) retenu parmi les Investissements d’avenir. Ce travail a bénéficié d’une aide de l’état au titre du programme d’investissements d’avenir portant la référence ANR-001-01. Références bibliographiques G. Chavent : Identification of function parameters in partial differential equations, in: R. Goodson, N.-Y. Polis (Eds.), Identification of
parameter distributed systems, ASME, 1974. S. Mottelet : Fast computation of gradient and sentitivity in 13C metabolic flux analysis instationary experiments using the adjoint method,
2012, http://arxiv.org/abs/1206.5072 Quek, L.-E. et al. (2009) : OpenFLUX: efficient modelling software for 13C-based metabolic flux analysis. Microb. Cell Fact., 8, 25. Sokol, S. et al.: influx_s: increasing numerical stability and precision for metabolic flux analysis in isotope labelling experiments,
Bioinformatics, Vol. 28, n°5, pp. 687-693, 2013 Weitzel, M. et al. : 13CFLUX2—high-performance software suite for 13C-metabolic flux analysis, Bioinformatics, Vol. 29, n°1, pp.
143-145, 2013
Mots-clés Flux métaboliques, marquage isotopique, Etat adjoint, XML, Scilab
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O3
Statistical approaches to study the physiological variability of the urinary metabolome (Communication orale)
Etienne A. Thévenot
1*, Aurélie Roux
2, Ying Xu
2, Natacha Lenuzza
1*, and Christophe Junot
2*
1 Laboratoire d’Intégration des Systèmes et des Technologies (LIST) et
2 Laboratoire d’étude du Métabolisme des Médicaments (LEMM), CEA, Gif-sur-Yvette, France * MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Metabolomics shows promising results for the diagnostics of diseases such as cancer, Alzheimer_disease, or diabetes. One of the major threats to biomarker discovery approaches is bias resulting from confounding factors: it is thus of primary importance that physiological variations of metabolites be precisely described in order to avoid false positives. We therefore conducted a high-resolution LC-MS metabolomics study of individual urines from volunteers to describe the physiological concentration variations associated to age, body mass index (bmi) and gender. Large LC-MS cohort studies usually require multiple analytical runs (batches) because of source contamination which can decrease the sensitivity of the instrument over time. As a consequence, a normalization methodology for correcting both analytical drifts and batch effects is of paramount importance for MS studies. In the present cohort study, we analyzed 189 urine samples in three runs (one and two batches for the positive and negative ionization modes, respectively) and use the same pooled sample as quality control. We compared the linear and loess modeling of QC intensities for feature-based signal correction. In addition, we investigated the concatenation of the sample profiles from the positive and negative ionization modes to facilitate and increase the power of subsequent statistical analyzes. Metabolite selection is generally performed by either univariate statistical hypothesis testing or multivariate modeling (e.g. by using variable importance in projection after building a PLS model). On the one hand, univariate tests provide a statistically convenient endpoint (the p-value) for subsequent thresholding. On the other hand, multivariate approaches may highlight discriminant metabolites as a group, although none of them is significant on its own. We thus developed an R module to perform (O)PLS(-DA) and compared the metabolites selected by the univariate and multivariate approaches. Batch normalization and concatenation resulted in a single dataset of 189 samples × 187 fully or partially identified metabolites. A total of 59, 11, and 82 metabolites were found significant by univariate statistical testing with age, bmi, and gender factors, respectively. These results were confirmed by OPLS(-DA) modeling of age and gender metabolite variations. Almost all gender-specific metabolites detected had higher concentrations in males compared to females, and included steroid hormones (e.g. testosterone) and the energy metabolism (lipids, dipeptides, and nucleosides). A decrease of metabolism with age was observed (steroid hormones, amino acids, nucleoside derivatives), with the exception of exogenous metabolites such as caffeine. Altogether these results provide a critical comparison of statistical approaches for biomarker discovery applied to the characterization of the human urinary metabolome. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Biostatistics, Univariate analysis, OPLS, cohort study, urine metabolome, LC-MS
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O4
Analyse isotopique et métabolomique dans les cellules mammaires humaines: vers un nouvel outil de diagnostic du cancer du sein.
Illa TEA
1, Estelle Martineau
1, Julie Lalande
1, Ingrid Antheaume
2, Sophie Barillé
3, Guillaume Tcherkez
4
1Laboratoire CEISAM UMR CNRS 6230, Université de Nantes, Faculté des Sciences, BP92208, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes
Cedex 2 Laboratoire de Géologié de Lyon : Terre, Planète, Environnement UMR CNRS 5276 (CNRS, ENS, Université Lyon1), Université Claude
Bernard, Lyon1, Campus de la Doua, bât. GEODE, 2, rue Raphaël Dubois, 69622 Villeurbanne Cedex 3 CRCNA – INSERM U892, 8 Quai Moncousu - BP 70721, 44007 Nantes Cedex 1
4 Institut de Biologie des Plantes, Université Paris-Sud 11, 91405 Orsay cedex
Aujourd’hui, le diagnostic définitif des tumeurs cancéreuses repose sur des analyses histologiques réalisées dans un premier temps sur des biopsies mammaires dont la réalisation a un impact économique et psychologique non négligeable et dans un second temps sur la pièce d’exérèse chirurgicale. Cependant, ces méthodes sont longues à mettre en œuvre, coûteuses et parfois insuffisantes voire non informatives. De plus, des résultats erronés liés aux limites techniques inhérentes aux approches utilisées ont été décrits, (surdiagnostic, faux négatifs), et peuvent mener à des chirurgies non appropriées ou des chimiothérapies inadéquates. Nous avons récemment développé un procédé simple, rapide et peu coûteux permettant de différencier plusieurs types de tumeurs mammaires humaines
1. Ce procédé bio-analytique consiste à déterminer une
« empreinte isotopique » pour chaque type de tumeur par un système de Spectromètre de Masse de Rapports Isotopiques couplé à un Analyseur Elémentaire (AE-SMRI, ou EA-IRMS en anglais). Globalement, la technique est basée sur la distinction entre des cellules cancéreuses et des cellules saines par une
différence significative du couple {d13C; d15N}, c’est-à-dire des compositions isotopiques naturelles en 13
C et 15
N. Des « effets isotopiques 2» peuvent se produire lors de l’utilisation des molécules organiques au cours du
métabolisme et laisser leur trace dans la composition isotopique cellulaire ou tumorale (autrement dit, causer une variation de la composition isotopique en
13C et
15N par rapport aux molécules sources utilisées par les
cellules). Les molécules impliquées dans ce fractionnement isotopique doivent être identifiées et isolées par des approches métabolomiques, afin de comprendre leur implication dans les mécanismes d’oncogénèse : la prédominance ou l’absence de certains métabolites naturellement enrichis ou appauvris en
13C ou
15N peut
causer la différence isotopique constatée. Références bibliographiques :
1 I. Tea, E. Martineau, P. Giraudeau, S. Akoka, S. Barillé-Nion. Méthode pour caractériser l’origine et/ou l’état de cellules pathologiques ou saines et ses applications en biologie WO 2012/123886(A1) (SATT Ouest Valorisation, Université de Nantes), 2012
2 On désigne par « effet isotopique » un comportement inégal des espèces isotopiques dans les
phénomènes physico-chimiques ou biologiques. Par exemple, une molécule comportant un 14
N réagit plus vite qu’une molécule comportant un
15N. Le rapport de vitesse entre les deux espèces isotopiques
est généralement entre 1,005 et 1,05. On dira alors que le « fractionnement isotopique » est de 5 et 50‰, respectivement.
Mots-clés : cancer, effet isotopique, métabolisme
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O5
Lipidomics of mono- and dihydroxylated fatty acids.
M. Guichardant, N. Bernoud-Hubac, B. Fourmaux, and M. Lagarde
Université de Lyon, UMR 1060 INSERM (CarMeN), IMBL / INSA-Lyon, Villeurbanne, France
Lipidomics research requires the identification and quantification of thousands lipid molecular species. However, taking into account the huge diversity of lipids especially in terms of polarity and isomerism, such a purpose seems unrealistic. Lipidomics should be divided into different parts according to specific lipids having in common similar physical properties. As an example, this presentation will be focused on the analysis of lipid mediators and especially on the analysis of mono and dihydroxylated compound synthesized from polyunsaturated fatty acids.The analysis of these oxygenated fatty acid derivatives is relatively complex due to the numerous isomers potentially formed enzymatically and/or non-enzymatically from different polyunsaturated fatty acids. Moreover, such compounds are present in very small amount in biological system, and last but not least, they are very sensitive to oxidation.Solid phase extraction, in presence of suitable internal standards labelled with stable isotopes, is the most relevant technique to concentrate these metabolites before their analysis via LC-MS/MS. Their separation can be successfully achieved by UPLC using a C18 micro column coupled with a Q Trap mass spectrometer. Their determination is performed by negative electrospray ionization mode according to their retention time and their m/z daughter ion.The prior characterization of the stereochemistry of their hydroxyl group is achieved using chiral chromatography and the hydroxyl group position on the chain by gas chromatography coupled with mass spectrometry after hydrogenation of the molecule and derivatization into methyl ester and trimethylsilyl ether. The configuration of the double bond is done by high field NMR in collaboration by high field NMR.Such an approach allows analyzing lipoxygenase and cyclooxygenase end-product with a great sensitivity and specificity. Références bibliographiques 1. Lagarde et al. 2013. Lipidomics of essential fatty acids and oxygenated metabolites. Mol. Nutr. Food Res. 57:1347-1358. 2. Lefils-Lacourtablaise et al. 2013. The eicosapentaenoic acid metabolite 15-Deoxy-D12,14-prostaglandin J3 increases adiponectin
secretion by adipocytes partly via a PPARg-dependent mechanism. PLOS ONE 8:e63997. 3. Lagarde et al. 2012. Expanding the horizons of lipidomics. Towards fluxolipidomics. Mol Membr Biol. 29:222-8. Review. 4.Guichardant et al.2011. Functional lipidomics of oxidized products from polyunsaturated fatty acids. Chem Phys Lipids.164:544-8.
Review. 5.Lefils et al. 2010. Dietary DHA: time course of tissue uptake and effects on cytokine secretion in mice. Br J Nutr. 104:1304-12. 6.Chen et al. 2009. Full characterization of PDX, a neuroprotectin/protectin D1 isomer which inhibits blood platelet aggregation. FEBS
Lett. 583:3478-3484. 7. Chen et al. 2011. Poxytrins, a class of oxygenated products from polyunsaturated fatty acids, potently inhibit blood platelet
aggregation. FASEB J. 25:382-388. 8.Bernoud-Hubac N et al. 2009. Low concentrations of reactive gamma-ketoaldehydes prime thromboxane-dependent human platelet
aggregation via p38-MAPK activation. Biochim Biophys Acta. 1791:307-13. 9.Bacot et al. 2007. Evidence for in situ ethanolamine phospholipid adducts with hydroxy-alkenals. J Lipid Res. 48:816-25. 10.Bacot et al. 2003. Covalent binding of hydroxy-alkenals, 4-HDDE, 4-HHE and 4-HNE to ethanolamine phospholipid subclasses. J
Lipid Res. 44:917-926.
Mots-clés lipidomics, LC-MS/MS, GC-MS, mono and dihydroxylated fatty acids analysis
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O6
LC-MS and GC-MS in lipidomics research: Methodology and Applications
H. Gallart-Ayala, J. Kouassi Nzoughet, A. Ripoche, S. Severe, G. Dervilly-Pinel, J.-P. Antignac, B. Le Bizec
LUNAM Université, Oniris, Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), Nantes, F-44307, France
Lipids exhibit an essential role in cell structure and organization, signaling events, protein regulations, and metabolic transformations and trafficking. However, the analysis of this family of compounds is an analytical challenge because their structural diversity and complexity. Following the classification proposed by LIPID MAPS, lipids can be classically divided in eight categories (fatty acyls, glycerolipids, glycerophospholipids, sphingolipids, sterol lipids, prenol lipids, saccharolipids and polyketides). Furthermore, each of these categories encompass itself distinct classes and sub-classes increasing the complexity of this family of compounds. Actually, two different approaches exist for the mass spectrometry based identification. The first approach and the most commonly use is the comprehensive lipidomics analysis by extraction and chromatographic separation prior to the mass spectrometry analysis. While the second strategy also termed shot-gun lipidomics, omits chromatographic separation using direct infusion mass spectrometry (DIMS) analysis. In this work a comprehensive lipids profile by separation simplification have been developed using both liquid chromatography and gas chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS and GC-MS). Two complementary liquid chromatography – high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) methods based on reversed phase lipid separation and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) have been developed for lipid speciation and lipid classes separation. While for fatty acids profile the use of GC-MS with both electronic impact (EI) and negative chemical ionization (NCI) have been also evaluated improving the separation of isomeric fatty acids. In addition, a non-selective high resolution tandem mass spectrometry (HRMS/MS) methodology using an Exactive-Orbitrap instrument in combination with polarity switching ESI ionization have been developed for lipid identification when reversed phase liquid chromatography is used. Finally, the developed methodology was successfully applied in different research studies: i) lipid phenotyping of tumor samples collected from pet dogs developing spontaneous malignant mammary tumors and benign tumors, and ii) Global serum lipidomics profile in the study of growth promoting cattle practices. Références bibliographiques H. Gallart-Ayala et al. Analytica Chimica Acta 2013, 796, 75-83 C. Da Costa Jacob et al., 2013. Metabolomics DOI 10.1007/s11306-013-0604-z. C. Da Costa Jacob et al., submitted to Metabolomics.
Mots-clés LC-MS, GC-MS, Lipidomics
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O7
Lipidomic analysis of spinocerebellar ataxia plasma samples
A. Seyer1, S. Boudah
2, S. Broudin
1, C. Ducruix
1, B. Corman
1, F. Mochel
3, C. Junot
2* and B. Colsch
2*
1 Profilomic SA, Boulogne Billancourt, France.
2 Commissariat à l’Energie Atomique, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM, F-91191 Gif-sur-Yvette. France.
3 Unité Fonctionnelle Neurométabolique, Hôpital La Salpêtrière, Paris, France
* MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Lipids are essential constituents of mammalian cells involved in energy storage, cell signaling and membrane constitution. Their implication in a large number of heterogeneous diseases such as cancer, diabetes, neurological or inherited metabolic diseases has already been established. Abnormal concentrations of lipids are observed in several neurodegenerative diseases such as Alzheimer or Parkinson diseases, in addition to neurometabolic diseases. They could thus be valuable candidates for biomarkers discovery. An analytical method based on liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) was conducted to profile and compare endogenous lipid species in biofluids samples using untargeted approaches. Reliable data processing tools were developed to handle LC-HRMS data sets. They include automatic peak detection and alignment, annotation based on exact mass, retention time, the presence of the
13C isotope and the relative isotopic abundance. When applied to human plasma, more than
700 unique lipid species from the 5 major lipid families are identified, including glycerophospholipids, glycerolipids, sphingolipids, free fatty acids, sterols and derivates. This lipidomic approach was applied to the comparison of 101 plasma samples from patients with different progressive forms of spinocerebellar ataxia (SCA1, 2, 3 and 7), obtained from the FP7 European project Neuromics partners. SCA 1, 2, 3 and 7 belong to the group of polyglutamine expansion rare diseases (repetition of coding CAG), as is Huntington disease, and share common symptoms which include effects on balance, movement, coordination, and speech. The importance of establishing biomarkers of polyglutamine expansion SCA is related to the high disease heterogeneity and lack of characteristic symptoms that leads to diagnostic, prognostic challenges and difficulties in making therapy decisions. From the 725 unique lipid species identified in these plasma samples, several belonging to the same class were found increased in the SCA 3. Furthermore, a good correlation has been highlighted in subgroups between the clinical score of severity (SARA) and areas of lipids identified as gangliosides species. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés metabolomic, Lipidomic, spinocerebellar ataxia, rare neurometabolic disease
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O8
A consensus OPLS-DA strategy for multiblock data fusion: Application to plant metabolomics
Julien Boccard
a, Douglas N. Rutledge
b, Serge Rudaz
a
a School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, Switzerland b AgroParisTech, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, Paris, France
Metabolomics has proven its value to provide a broad monitoring of biological systems. However, despite the wealth of data generated by modern analytical platforms, the analysis of a single dataset is still limited and insufficient to reveal the full biochemical complexity of biological matrices or biofluids. The fusion of information from several data sources constitutes therefore a decisive issue to assess metabolic events comprehensively. Inherent problems encountered when analysing single tables are amplified with the generation of multiblock datasets and finding the relationships between data layers of increasing complexity constitutes a challenging task. For that purpose, a generic methodology is proposed by combining the strengths of established data analysis strategies, i.e. the multiblock approaches and the OPLS-DA framework to offer an efficient tool for the fusion of metabolomic data obtained from multiple sources [1]. A real case study from plant science illustrates the potential of the method for the fusion of mass spectrometry-based metabolomic data acquired in both negative and positive electrospray ionisation modes. Ultra-high pressure liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-TOF/MS) experiments were achieved with a rapid chromatographic gradient (<7 min) for evaluating the metabolic effects of wounding in leaves from wild type specimens of the model plant A. thaliana (ecotype Col-0) and a lesion mimic mutant that exhibits spontaneous spreading cell death, i.e. accelerated cell death acd2-2 [2]. OPLS-DA multiblock models allowed relevant biomarkers to be highlighted and the results lead to new insights into the modulation of plant defence reaction. The consensus OPLS-DA method was demonstrated as a relevant and widely applicable alternative to handle efficiently the inherent characteristics of multiple metabolomic data, such as very large numbers of noisy collinear variables. Références bibliographiques [1] J. Boccard, D.N. Rutledge, Anal. Chim. Acta 769 (2013) 30-39. [2] J.T. Greenberg, A.L. Guo, D.F. Klessig, F.M. Ausubel, Cell 77 (1994) 551–563.
Mots-clés data fusion, multiblock analysis, consensus OPLS-DA, UHPLC-TOF/MS, plant defence reaction
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O9 - Conférence invitée
Towards mechanism-based toxicity testing in Daphnia utilising metabolomics approaches
Mark R. Viant
School of Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni.
Daphnia (water fleas) are long established model species in both ecology and regulatory toxicology, the former due to their wide geographic distribution and central role in freshwater food webs, and the latter through their important role in determining regulatory criteria by international organisations (i.e. OECD). This freshwater crustacean represents 8% of all experimental data for aquatic animals within the toxicological databases (Denslow et al. 2007). However the depth of knowledge gained from, for example, OECD acute toxicity and chronic reproductive toxicity tests remains suboptimal, revealing little about mechanisms of toxicity. Recently, transformative opportunities have arisen from the development of genomic resources for this organism, in particular the discovery of the ecoresponsive genome of Daphnia pulex (Colbourne et al. 2011). In addition, other “omics” approaches including transcriptomics, metabolomics and lipidomics have improved our understanding of chemical toxicity. This talk will introduce Daphnia spp. and then describe my lab’s efforts to develop, demonstrate and ultimately exploit the potential of metabolomics to discover predictive molecular markers of toxic stress, both in the fields of chemical toxicology and nanotoxicology. This will include our recent discovery that ZnO nanoparticles can alter the sulfated lipid kairomones excreted by Daphnia, subsequently modulating the morphology of their algal prey, and representing a ‘toxic effect’ that spans two trophic levels. The talk will also incorporate examples of novel computational approaches that are helping to drive forward this environmental metabolomics research program. Références bibliographiques N Denslow et al. (2007) In Genomic Approaches for Cross-Species Extrapolation in Toxicology (Eds DiGiulio and Benson). JK Colbourne et al. (2011) Science 331, 555-561.
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O10 - Conférence invitée
Cell culture NMR metabolomics and its many applications
Miroslava Cuperlovic-Culf
National Research Council 100 des Aboiteaux Street, Suite 1100, Moncton, N.B., E1A 7R1, Canada
Telephone: 506-861-0952 e-mail: [email protected]
Detailed and non-biased analyses of metabolic changes within cells and in extracellular medium can greatly
enhance molecular level analysis of cell cultures undergoing variety of treatments. Metabolite concentrations
are sensitive markers of genomic characteristics as well as cellular responses to external stimuli. Effects of
drugs or toxins on cell cultures can be observed through the changes in metabolite concentrations. When cell
cultures are used for the production of biomolecules, metabolomics can aid in optimization of cell growth
through routine monitoring of metabolic changes in real time measurements.
Methods for quantitative NMR metabolomics and combined transcriptomics and metabolomics analysis of cell
cultures that were developed in our groups have been extensively used in cancer phenotype analysis, drug
testing as well as cell culture growth and applications optimization. In the presentation I will show applications
in glioblastoma subtype determination, testing of the effects of drugs targeting several metabolic and
epigenetic pathways and finally NMR metabolomics based optimization of vaccine production in cell cultures.
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O11
NMR Metabonomics Reveals Molecular Markers of Hepatocellular Carcinoma in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) Cohort
Bénédicte Elena-Herrmann
1, Anne Fages
1, Talita Duarte-Salles
2, Magdalena Stepien
2, Pietro Ferrari
2,
Clément Pontoizeau1, Veronika Fedirko
2, Mazda Jenab
2, on behalf of the EPIC group.
1 Université de Lyon (CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon 1), Institut des Sciences Analytiques, Centre de RMN à très hauts champs, 5 rue de la
Doua, 69100 Villeurbanne, France. 2 International Agency for Research in Cancer (IARC-WHO), 150 Cours Albert Thomas, 69372 Lyon Cedex 08, France.
Hepatocellular carcinoma (HCC), ranked sixth in incidence and third in cancer-related mortality worldwide, is the major form of liver cancer. It is usually diagnosed at late stages, with poor prognosis and limited treatment options, which accentuates the need for identification of early diagnostic molecular. The detection of metabolic imbalances, associated to obesity, diabetes, or lifestyle habits may play a central role in HCC etiology. A NMR metabonomic investigation was undertaken in a case-control study nested within EPIC, a large prospective cohort of over 520,000 subjects from 10 Western European countries, on serum samples from healthy participants at the time of enrolment and blood collection. After an average of 7.6 years of follow-up, 125 HCC cases with available blood samples were identified. For each case, two controls were selected by incidence density sampling from all cohort members alive and free of cancer (except non-melanoma skin cancer), and matched by age at blood collection (±1 year), sex, study center, date and time of the day at blood collection, and fasting status at blood collection. Women were additionally matched by menopausal status and hormone replacement therapy use at time of blood collection. Participants with missing blood sample or failed laboratory assay for HBV/HCV or NMR analyses were excluded (n=13). Proton one-dimensional NOESY and CPMG profiles were therefore recorded for a total of 336 human serum samples (112 cases, 224 controls) at high NMR field (800 MHz). An untargeted metabonomic analysis was then pursued to explore for biomarkers that may be relevant either to early diagnosis of HCC or indicative of etiologically relevant exposures. We first show a statistical method that was developed based on Principal Component and Partial R
2 analyses
to highlight the main sources of variability in our metabolomic data. The method assessed the contribution of age, sex, body mass index, country of origin, as well as smoking, self-reported diabetes status at baseline, fasting status at blood collection, alongside factors related to sample processing to variability of the metabolomic profiles. From this analysis, country was found to display the largest variance contribution (8.0%). We then identify, using supervised multivariate statistical modeling (O-PLS) of the NMR data, metabonomic fingerprints capable of discriminating between matched cases and controls, and further stratify the analysis by time of follow-up from blood collection to diagnosis, or sex. We use conditional logistic regression models to assess relevant association of individual metabolic markers to HCC risk. Models adjusted for diabetic status, smoking status, BMI, age at recruitment, alcoholic pattern, liver functionality or hepatitis infection status are also described to evaluate these possible confounders. The potential of this prospective study to identify diagnostic and etiologic biomarkers may have relevant public health implications and lead to an enhanced understanding of HCC development. Mots-clés NMR, liver cancer, HCC, epidemiology
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O12
Altérations métaboliques dans la voie de synthèse du cholestérol, une authentique voie oncogénique
Catherine Le Jossic-Corcos
1, Danièle Arzur
1, Mikael Croyal
2, Christelle Gouin
1, Stéphanie
Crossouard2, Séverine Commet
1, Danièle Lucas
1, Yolande Amet
1, Véronique Ferchaud-Roucher
2,
Laurent Corcos1
1UMR 1078 INSERM-UBO, SFR ScInBioS, Plate-forme Corsaire-Biogenouest, Faculté de médecine, 22 avenue Camille Desmoulins,
29200, Brest 2UMR 1280 PhAN, CHU Nantes, CRNH, Plate-forme Corsaire-Biogenouest, Institut de Recherche en Santé-Université de Nantes, 8 quai
Moncousu, 44007, Nantes
Les statines sont des médicaments hypocholestérolémiants utilisés de longue date pour réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. Elles agissent en tant qu’inhibiteurs compétitifs de L’hydroxy méthyl glutaryl coenzyme A réductase (HMGCR), ce qui bloque la synthèse de mévalonate, dans une étape « rate-limiting » de la voie. Néanmoins, de nombreuses études expérimentales suggèrent qu’elles pourraient apporter un réel bénéfice dans la prise en charge du cancer, en association avec des anticancéreux. En effet, les statines peuvent induire efficacement l’apoptose des cellules cancéreuses, une réduction de la croissance tumorale et de la survenue de métastases. En outre, de nombreux essais cliniques sont programmés ou en cours pour évaluer leur efficacité antitumorale - essentiellement en association - par comparaison aux thérapeutiques de référence. Les mécanismes par lesquels les statines induisent l’apoptose mettent en évidence un rôle central de certains métabolites lipidiques générés le long de la voie de synthèse du cholestérol, en particulier le farnésyl pyrophosphate (FPP) et le géranylgéranyl pyrophosphate (GGPP). Ces chaines carbonées en C15 et C20, respectivement, sont adjointes à un petit répertoire de protéines, les petites protéines G, impliquées dans les voies d’activation de la prolifération et de la motilité cellulaires induites par l’exposition aux facteurs de croissance comme l’Epidermal Growth Factor. Cependant, le rôle des métabolites produits en aval est essentiellement inconnu. Afin de caractériser, dans des cellules cancéreuses digestives humaines, l’activité de la voie de synthèse du cholestérol en réponse à la lovastatine, nous avons analysé les activités de 4 enzymes : l’HMGCR, la mévalonate kinase (MVK), la farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS) et la squalène synthase, intervenant séquentiellement dans cet ordre, ainsi que les taux des métabolites produits en amont de la squalène synthase (FPP et GGPP), et en aval, le lanostérol, le zymostérol, le 7alpha-hydroxycholestérol et le cholestérol, par HPLC-UV et GC-MS. Ce profilage enzymatique et métabolomique, ainsi que des analyses de supplémentation cellulaire indiquent que le FPP, et surtout le GGPP, jouent un rôle majeur dans le contrôle de l’apoptose induite par la lovastatine. Mots clés : Métabolisme du cholestérol, profilage enzymatique et métabolomique ciblé, cancer, statines.
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O13
Exposome-Explorer, a new database on biomarkers of exposures for cancer risk factors
Vanessa Neveu, Héloïse Rouaix, Augustin Scalbert
Centre International de Recherche sur le Cancer,( International Agency for Research in Cancer IARC-WHO).
150 Cours Albert Thomas, 69372 Lyon Cedex 08, France
Exposome-Explorer is a new database on biomarkers of exposures for cancer risk factors measured in population studies. Most often researchers have measured single or small sets of biomarkers. However cancer aetiology results from complex exposures to highly diverse risk factors and chemicals, which constitute altogether the exposome. Exposome-Explorer will provide more comprehensive data with information on all known biomarkers of exposures to the diet, pollutants and contaminants measured in populations. Highly detailed information on populations, subjects, samples, compounds, analytical methods, concentrations, and correlations with external exposures is systematically and manually collected from the scientific literature and stored in the database. Nearly 300 publications with information on 253 biomarkers have been analyzed so far. Key information for biomarker validation such as dose-response relationship and reliability over time will also be compiled. The database and a web interface are developed in MySQL and Ruby on Rails. The website will be freely accessible and making various queries will be possible. Exposome-Explorer can be used to select or compare different biomarkers of exposure for disease risk factors. It can also be used for selecting sets of biomarkers for targeted metabolomic analyses in epidemiological studies on disease outcomes. Mots-clés Biomarkers; Exposome; Cancer
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O14
Metabolomic study of Kleine-Levin syndrome
F. Ichou1, S. Lavault
2, E. Flamand-roze
1,3, B. Colsch
4*, C. Junot
4*, I. Arnulf
2, F. Mochel
1,5,6
1 Institut du cerveau et de la moelle épinière (ICM), Paris, France
2 Unité des Pathologies du Sommeil, Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris, France 3 Département de Neurologie, Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris, France
4 Laboratoire d’étude du métabolisme et du médicament, DSV/iBiTec-SPI, CEA, Gif-sur-Yvette, 5 FranceDépartement de Génétique, Hôpital Pitié-Salpêtrière, France
6 Université Pierre et Marie Curie, Paris, France * MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
The central framework of a metabolomics strategy is to work on the concept of homeostasis. The homeostasis disturbance results in the alteration of many metabolic pathways and the apparition of a disease state. Many works demonstrate that the metabolite concentrations are matrix-specific but also disease-specific. Thus, the identification of altered metabolites in the cellular regulatory process may not only help us in characterization of a novel biomarker but also aid in the understanding of the biological system. The brain and spine institute (ICM, Hôpital Pitié-Salpétrière, Paris) in collaboration with the drug metabolism research laboratory (LEMM, CEA, Saclay) join their knowledge for studying and gaining insight into some brain diseases such as the Kleine-Levin Syndrome (KLS). The KLS is a rare and particular neurological disease of unknown origins. The KLS is the worst form of hypersomnia disease where the sleep duration can reach 20 hours per day. This disease has a prevalence of one case per one million with higher rates of incidence in young people and men’s. KLS involves distinct crisis cycles of some days to some weeks where the patients suffer mainly of hypersomnia symptoms, cognitive trouble, hyperphagia and hypersexuality. Concomitantly, episode of hypersomnia crisis appears randomly and there are no disease signs between crisis periods or early symptoms for the future disease onset. Thus, the diagnosis of KLS is difficult. Further, except clinical diagnosis, no genetic diagnosis is available up till recent times. Some studies have tried to decipher factors responsible for the origin of the disease onset without success. Indeed, no signs of any inflammatory activity either in the cerebellar spinal fluids and/or elevation of the protein C-reactive concentration are observed in the disease state making the diagnosis of the KLS much more difficult. Our work aimed to detect and identify varied set of metabolites specifically altered in the diseases state (KLS) using a untargeted metabolomics approach by Liquid Chromatography and High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS), for the same CSF samples of 7 patients with KLS, and 23 patients with symptoms of narcolepsy, hypersomnia and psychogenic were investigated using the developed strategy based on the use of two separative columns (C8 and HILIC stationary phase) combined to Exactive mass spectrometers in order to screen a large number of metabolites in CSF samples. The data were processed with a workflow using bioinformatics tools for data-mining and peak integration, automated annotation and statistical analysis. Multi-filtering step was also included in order to reduce the number of confounding variables and to create a robust statistical model. Preliminary data of our study highlighted a prominent decrease in the concentration of various metabolites in the CSF from patients with KLS. The PCA plot from narcoleptic, hypersomnia and patients with Kleine-Levin also suggested that there may be a metabolic profile associated with sleep disorders. Further analyses will be done in order to validate our findings. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés LC-HRMS, Kleine-Levin, brain disease, metabolites
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O15 - ANNULE
New Insight into Age-related Macular Degeneration: A Metabolomics Approach
V. Lambert1,2
, S. Hansen2, B. Govaerts
3, B. Pirotte
4, J.-M. Rakic
1, A. Noël
2, P. de Tullio
4.
1 Department of Ophthalmology, University Hospital, Sart-Tilman, B-4000 Liège, Belgium.
2 Laboratory of Tumor and Development Biology, GIGA-Cancer, University of Liège, Pathology Tower (B23), Sart-Tilman, B-4000 Liège, Belgium;
3 Statistic Institute, Catholic University of Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium 4 CIRM, Center for Interdisciplinary Research on Medicines, University of Liège, Pharmacy Tower (B36), Sart-Tilman, B-4000 Liège,
Belgium.
Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of vision loss in the western world among people aged 50 or older
1. 90% of all vision loss due to AMD result from the exudative form, which is characterized by
choroidal neovascularization (CNV). Age-related changes that induce pathologic CNV are incompletely understood. A successful application of anti-VEGF approaches in the clinic is obviously a turning point in AMD treatment
2. Nevertheless, despite such important advances, critical issues remain to be addressed. To
better understand the etiology of this pathology, we have used and improved a model of laser-induced murine choroidal neovascularization. As none is known about the metabolic changes in patients with AMD, we decided to apply a
1H NMR metabolomics approach on AMD patients and on a mice CNV experimental model
3.
These experiments provide unique challenges to fulfill the goal of improving the current status of physiological information related to metabolome and in general to functional genomics.For this purpose, sera from control and AMD patients, induced and non-induced mice have been collected and the metabolic profiles of these samples were determined by
1H NMR. After post-processing treatments, the different spectra were analyzed
by statistical discriminant methodologies (PCA, ICA, PLS-DA). This approach allows the differentiation between control and AMD patients and between laser-induced mice and the control mice group. Moreover, the same discriminating spectral zones, lactate and lipoproteins profiles, have been identified in human and mice model, leading to the emergence of different putative biomarkers. In mice model of laser-induced CNV, normalization of circulating lactate by dichloroacetate, decreases CNV development. These first interesting results open new way in the study of the AMD etiology and validate the use of
1H NMR and CNV model for the understanding of Age-related Macular Degeneration.
Références bibliographiques 1. Resnikoff, S. et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization 82, 844-51 (2004). 2. Noel, A., Jost, M., Lambert, V., Lecomte, J. & Rakic, J.M. Anti-angiogenic therapy of exudative age-related macular degeneration:
current progress and emerging concepts. Trends Mol Med 13, 345-52 (2007). 3. Lambert, V. et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nature
protocols 8, 2197-211 (2013).
Mots-clés AMD, NMR, metabolomics
37
O16
Etude de l’effet de la vinclozoline sur le métabolome testiculaire des rats Sprague-Dawley par approche métabonomique sur une plateforme LC-QqToF
Agneta Kiss
1, Nadia Quignot
2, Audrey Buleté
1, Emmanuel Lemazurier
2, Cécile CREN
1
1Equipe TRACES, ISA UMR 5280, 5 rue de la Doua, Villeurbanne, France
2INERIS DRC VIVA TOXI, F-60550 Verneuil En Halatte, France
L’exposome vise à mettre en évidence et à quantifier « l’exposition et la réponse d’un organisme vivant aux facteurs environnementaux tout au long de son existence ». Pour ce faire, il est nécessaire de mettre au point, entres autres, des stratégies analytiques compréhensives capables de mesurer un nombre important de composées endogènes et exogènes ayant des propriétés physico-chimiques différentes et des gammes de concentration très larges dans des matrices biologiques complexes. Dans ce contexte, notre étude a eu pour objectif l’évaluation de l’impact de la vinclozoline sur le métabolome d’organes de reproduction de rats et s’inscrit dans une démarche d’évaluation de risques et de création de modèles mathématiques pour la prédiction des effets de perturbateurs endocriniens sur la santé. Cette stratégie a été mise en place sur une plateforme LC-QqToF et comporte deux étapes principales : (i) une étape de screening visant les métabolites de la vinclozoline ainsi qu’une liste de stéroïdes et (ii) une étude métabonomique basée sur la comparaison d’empreintes moléculaires par des approches chimiométriques. Cette étude vise à illustrer les apports et les limites de la spectrométrie de masse à travers une stratégie basée sur des notions spécifiques à cette plateforme technique, à savoir la mesure de la masse monoisotopique exacte, le défaut de masse et le profil isotopique. Pour cette étude, nous avons retenu 4 groupes composés de 5 échantillons: un groupe de contrôle (1), un groupe de rats exposés à la vinclozoline pendant 14 jours (2), un groupe de rats traités et sacrifiés après une période de récupération de 56 jours (3) et un dernier groupe de rats de contrôle sacrifiés après la période de récupération (4). Ainsi, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence la composition de la matrice analysée par l’annotation d’un grand nombre de signaux détectés. Plus précisément, les modes positif et négatif comptent respectivement 142 et 85 composés annotés et placés sur des voies métaboliques. Ensuite, l’étape de screening mise en place dans le cadre de cette étude nous a permis d’obtenir la signature des métabolites et/ou des fragments chlorés appartenant à la vinclozoline. Et enfin, l’approche métabonomique a abouti à la sélection des potentiels biomarqueurs d’exposition à la vinclozoline appartenant à différentes familles : stéroïdes, acides gras et prostaglandines. Mots-clés : exposome, vinclozoline, LC-QqToF
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O17 - Conférence invitée
A metabolomics-centered view on the defensive chemistry of native tobacco species
to insect attack
Emmanuel Gaquerel
Center for Organismal Studies, Plant Defense Metabolism Group, University of Heidelberg, Im
Neuenheimer Feld 360, 69120 Heidelberg, Allemagne
Department of Molecular Ecology, Max Planck Institute for Chemical Ecology, Hans-Knoell-Str. 8,
07745 Jena, Allemagne
Plant cells are capable of producing an incredibly large spectrum of functionally diverse
metabolites, of which many specialized or secondary metabolites have still unknown functions.
Research in my group aims at combining high-resolution mass spectrometry (MS)-based
metabolomics and genomics resources to explore adjustments in specialized metabolic pathways
during plants’ interaction with insects. The model plant we investigate, Nicotiana attenuata, is a wild
tobacco species native from the Great Basin Desert in the USA. This pioneering plant germinates in
post-fire habitat and as a consequence represents one of the essential nutritional sources for insect
herbivores which re-colonize the ecosystem after fires. By directly “asking the plant” through
metabolomics combined with statistical analyses, we discovered and validated the antiherbivore
functions of acyclic diterpene glycosides, phenolic-amine derivatives and trichome-based O-acyl
sugars, whose biosynthesis is restricted to certain lineages of the Solanaceae. Using multifactorial
analysis of integrated transcriptomics-metabolomics time series and self-organizing maps, we
developed a novel method to explore transient tissue-specific gene-metabolite co-dynamics during
insect herbivory that are activated as signaling spreads throughout the plant. I will present a series
of pathway-specific studies in which this method of combining metabolomics and transcriptomics
helped in removing much of the guesswork from the process of gene discovery. Some of these
significant advances concern the elucidation of the biosynthesis of phenolic-amine derivatives
which are produced by diversion of the phenylpropanoid flux and conjugation to spermidine and
putrescine backbones. I will finally discuss novel high-resolution MS/MS methods for navigating into
natural variation patterns in the defensive metabolism of natural population of wild tobacco.
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O18
Development of an LC-HRMS-based metabolomic approach to study methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Sandrine AROS-CALT1,2
, Bruno MULLER1,2
, Céline DUCRUIX1,2
, Samia BOUDAH1,3
, Guillaume L’HOSTIS
1,2, Gaspard GERVASI
2, Christophe JUNOT
1*, François FENAILLE
1
1 Commissariat à l’Energie Atomique, DSV / IBiTec-S / SPI, Laboratoire d’Etude du Métabolisme du Médicament, 91191 Gif-sur-Yvette,
France 2 bioMérieux S.A, Chemin de l’Orme, 69280, Marcy l’Etoile, France
3 GlaxoSmithKline - Centre de recherche F.Hyafil, Villebon-sur-Yvette, France. * MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Introduction. Antibiotic resistance often appears shortly after the introduction of a new drug as a direct consequence of its intensive use. Moreover, we are now running out of treatment options for many infections. Sometimes, confident identification of resistant strains can be difficult using conventional diagnostic techniques due to the lack of robust biomarkers of antibiotic resistance. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus represents a major cause of hospital- and community-acquired bacterial infections. Furthermore, most of these bacteria have also developed resistance to multiple drug classes. In this context, we have evaluated the usefulness of metabolomics as an approach to differentiate methicillin-resistant from susceptible S. aureus strains (MRSA and MSSA, respectively), and also to potentially highlight markers of antibiotic resistance for further detection purposes. Method. Two isogenic strains as well as a set of clinically relevant MRSA and MSSA strains were chosen for this proof-of-concept study. A three-step sample preparation protocol was developed and consisted in a filter-based bacteria sampling, and a rapid quenching step followed by a rather harsh but artifact-free extraction procedure. Metabolomic analysis were performed by a robust liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) platform using an Exactive instrument (R=50,000 at m/z 200). Automatic peak detection was performed using the XCMS software, while compound identification was achieved using in-house databases. Finally, multivariate data analysis was used to highlight potential differences existing between resistant and susceptible strains. Preliminary data. Little is known about intracellular metabolite pools in pathogens such as Staphylococcus aureus. So, an efficient and robust method was developed to measure the intracellular metabolites of S. aureus, and further extended the study to MRSA and MSSA strains.In that aim, a specific sample preparation was designed and carefully optimized to obtain a reliable snapshot of bacterial metabolism. The quality of this development was monitored by the assessment of the Adenylate Energy Charge (AEC) corresponding to the quantification of AMP, ADP and ATP nucleotides using LC-HRMS and isotope dilution. In addition, both hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and pentafluorophenyl propyl (PFPP) columns were chosen for their complementarity and used to get the most exhaustive view of S. aureus metabolome by LC-HRMS.This LC-MS-based global metabolomics approach was first applied to isogenic strains to define the best experimental conditions for S. aureus metabolome study and also to potentially distinguish MRSA from MSSA strains. Thus, the metabolite pools of these strains were studied at different growth stages (early-, mid- and late-exponential growth phases) without any antibiotic exposure, which revealed a distinct behavior of resistant strains along the exponential growth phase. A few metabolites responsible for this discrimination were further identified using in-house metabolite databases. Of note, among these compounds, some corresponded to cell wall precursors.These very promising results were further confirmed and reinforced by the analysis a set of clinically relevant MRSA and MSSA strains, performed under optimized conditions and by taking into account their respective growth rate.To the best of our knowledge, this preliminary study is the first one providing clear evidence that metabolomics can differentiate clinically relevant MRSA and MSSA strains without antibiotic exposure, but under well-defined conditions. This proof-of-concept study will be extended to other resistant bacteria, with less studied resistance mechanisms. Novel Aspect. LC-HRMS-based metabolomics enabled the distinction of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from other methicillin-susceptible strains. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés : Staphylococcus aureus, antibioresistance, LC-HRMS, metabolomics, biomarkers
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O19
Approche combinée de profilage métabolique par LC-MS et RMN d’extraits de micromycètes d’origine marine
Lalande-Martin Julie
3, Guitton Yann
1,2, Fernand Maherizo Tiandrainy Gedice
4, Raheriniaina Christian
4, Tea Illa
3 , Ruiz Nicolas
1, Roullier Catherine
1
1 Ifremer, Laboratoire Phycotoxines, Centre Atlantique, 44311 Nantes Cedex, France
2 MMS EA2160, Faculté de Pharmacie, LUNAM, Université de Nantes, 44035 Nantes, France
3 CNRS, Chimie et Interdisciplinarité: Synthèse, Analyse, Modélisation (CEISAM), UMR 6230, Faculté des Sciences, Université de
Nantes, BP 92208, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes Cedex 03, France 4 Université de Tuléar, Institut Halieutique et des Sciences Marines, Madagascar
Les études traditionnelles de métabolomique font généralement appel à la LC-MS ou à la RMN, afin d’identifier des métabolites d’intérêts (marqueurs, signaux, …etc) au sein d’organismes vivants. Le laboratoire MMS s’intéresse plus particulièrement aux micromycètes d’origine marine qui sont parfois suspectés d’être à l’origine de toxicités atypiques, notamment lors de la consommation de « fruits de mer » (Geiger et al., 2013). Ces organismes ont l’avantage de pouvoir se cultiver selon diverses conditions, afin d’identifier des métabolites produits différentiellement selon les milieux de culture. Cette approche nommée OSMAC (One Strain, MAny Compounds) utilise différentes sources nutritives pour une même souche permettant d’activer différentes voies du métabolisme secondaire et d’accéder à une diversité plus importante de composés (Bode et al., 2002) L’objectif de notre étude était donc de mettre en place les outils nécessaires au profilage métabolique de ces micromycètes d’origine marine cultivés selon l’approche OSMAC en combinant deux technologies de la métabolomique : la LC-MS haute résolution et la RMN. Pour cela, une souche de micromycète (Aspergillus niger) isolés de crustacés de Madagascar a été mise en culture sur 7 milieux gélosés différents, selon l’approche OSMAC. Les empreintes métaboliques de 21 échantillons de la souche d’Aspergillus niger ont été analysées par LC-MS haute résolution (IT-ToF Shimdazu) et par RMN
1H 1D (500 MHz, Bruker). Les
variables discriminantes ont été mises en évidence par l’utilisation de scripts R incluant les packages XCMS et CAMERA pour la LC-HRMS et AMIX, R et SIMCA-P pour la RMN.
Cette étude a permis de mettre en avant la complémentarité de l’approche conjointe RMN, LC-HRMS dans le cadre d’études de ce type.
Remerciements : Biogenouest, CORSAIRE, ThalassOMICS Références bibliographiques Geiger, M. et al., Letters in Applied Microbiology (2013), 57, 385-392. Bode, H. B. et al., ChemBioChem (2002), 3, 619-627.
Mots clés : métabolomique, champignons marins, RMN 1H 1D, LC-HRMS, OSMAC
41
O20
Unraveling the glucose/acetate transition in Escherichia coli by a combination of
13C-MFA and metabolomics strategies
Brice Enjalbert1,2,3
, Pierre Millard1,2,3,4,5
, Jean-Charles Portais1,2,3*
, Fabien Létisse1,2,3*
1: Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France 2: INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France
3: CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France 4: Manchester Center for Interative Systems Biology, University of Manchester, M1 7DN Manchester, United Kingdom
5: School of Computer Science, University of Manchester, M1 7DN Manchester, United Kingdom * MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
It is well described that the enterobacterium Escherichia coli produces acetate when growing on glucose. When glucose is exhausted, E. coli reorganizes its metabolism to consume this acetate. The resulting glucose/acetate transition (and hence, the switch from glycolysis to gluconeogenesis) is a natural model to study dynamic adaptation. Exponential growths on glucose and on acetate as the only substrate have been well described in the literature. However, experimental data and knowledge are scarce about the acetate metabolism during and after the growth on glucose. Here,
13C-metabolic flux analysis (
13C-MFA) and quantitative metabolomics approaches combined with
quantitative transcriptomics were used to unravel the physiological and molecular properties of the acetate metabolism during the different stages of the glucose/acetate transition. We first demonstrated that during the glucose consumption phase, the acetate accumulation resulted from both a constant flux of acetate production and an adjustable flux of acetate consumption. Second, the transition was proved to be a fast process, with the metabolite and transcriptional patterns being set up in minutes after glucose exhaustion. Third, acetate consumption is rapidly observed after glucose exhaustion but this metabolism is catabolic without biomass formation. The presentation will cover the biological interpretation of the experimental datasets and the detailed description of
13C-MFA and metabolomics strategies used in this work.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés 13
C-Metabolic Flux Analysis, Quantitaive Metabolomics, Escherichia coli, Physiologie Microbienne
42
O21
Sélection variétale traditionnelle et diversité chimique des plantes à racines et tubercules au Vanuatu
Ismael Muñoz1, Vincent Lebot
2, Laurent Legendre
1
1 CNRS, UMR 5557, Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, F-69622 Villeurbanne Cedex, France
2 CIRAD UR 75, P.O. Box 946, Port-Vila, Vanuatu
Avec 727 millions de tonnes produites en 2010, les plantes à racines et tubercules constituent une des principales sources d’amidon au sein de la zone intertropicale. Leur culture offre également aux populations locales une meilleure sécurité alimentaire que les céréales du fait de leur rendement agronomique élevé, leur faible consommation d’intrants, leur résilience aux catastrophes climatiques et leurs richesses métaboliques. Avec l’augmentation de la pression anthropique, l’intensification de leur culture est donc recommandée. La rareté de documentation de leur composition chimique représente cependant un frein aux efforts de développements variétaux. Un échantillonnage de 353 variétés de taro (Colocasia esculenta (L.) Schott), grande igname (Dioscorea alata L) et manioc (Manihot esculenta Crantz), représentatif des variétés cultivées au Vanuatu (archipel volcanique du Pacifique sud où ces plantes constituent la principale source d’amidon) et des variétés internationales a été assemblé, cultivé sur un même site puis soumis à des analyses de compositions chimiques. Il en ressort que les sélections traditionnelles favorisent de fortes teneurs en amidon et de faibles teneurs en cellulose et sucres simples, deux groupes de composés dont les teneurs sont d’ailleurs inversement corrélées [1]. Toutes les variétés possédaient de fortes teneurs en acides organiques, et notamment en acide citrique, et de faibles teneurs en acides gras. La dispersion des teneurs en composés antinutritionnels comme l’acide oxalique et l’acide malonique était étonnamment importante. Finalement, contrairement aux études qui ont montré une faible diversité génétique des variétés cultivées en accord avec le caractère insulaire de ces iles et la rareté des évènements d’introduction de génotypes [2,3], nous avons observé une grande diversité de composés phénoliques [4] et caroténoïdes [5] dont plusieurs sont colorés ou présentent des intérêts pour la santé. La dispersion des teneurs souvent faibles de ces composés était particulièrement remarquable. Ces résultats indiquent que les sélections variétales traditionnelles ont généré une large diversité phénotypique et chimiotypique sur une faible base génétique. Ils élargissent considérablement la connaissance sur la composition chimique de ces plantes et ouvrent de nouvelles perspectives pour leur biofortification [6]. Références bibliographiques [1] Champagne A, Legendre L and Lebot V (2009) Chemotype profiling to guide breeders and explore traditional selection of tropical root
crops in Vanuatu, South Pacific. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 57: 10363-10370 [2] Kreike CM, Van Eck HJ and Lebot V (2004) Genetic diversity of taro, Colocasia esculenta (L.) Schott, in Southeast Asia and the
Pacific. Theoretical and Applied Genetics.109: 761-768 [3] Malapa R, Arnau G, Noyer JL and Lebot V (2005) Genetic diversity of the greater yam (Dioscorea alata L.) and relatedness to D.
nummularia Lam. and D. transversa Br. as revealed with AFLP Markers. Genetic Resources and Crop Evolution. 52: 919-929 [4] Champagne A, Hilbert G, Legendre L and Lebot V (2011) Diversity of anthocyanins and other phenolic compounds among tropical
root crops from Vanuatu, South Pacific. Journal of Food Composition and Analysis. 24: 315-325 [5] Champagne A, Bernillon S, Moing A, Rolin D, Legendre L and Lebot V (2010) Carotenoid profiling of tropical root crop chemotypes
from Vanuatu, South Pacific. Journal of Food Composition and Analysis. 23: 763-771 [6] Champagne A, Legendre L and Lebot V (2013) Biofortification of taro (Colocasia esculenta) through breeding for increased contents in carotenoids and anthocyanins. Euphytica. 194: 125-136
Mots-clés acides organiques, agroressources, biofortification, composés phénoliques, caroténoïdes, igname, manioc, sélection variétale, taro
43
O22
Using developmental and diurnal compositional changes of tomato to study
metabolism
Camille Bénard1,2
, Stéphane Bernillon2,3*
, Benoît Biais2, Sonia Osorio-Algar
4, Mickaël Maucourt
3,5*,
Patricia Ballias2,3*
, Catherine Deborde2,3*
, Sophie Colombié2*
, Cécile Cabasson3,5*
, Daniel Jacob2,3*
, Gilles Vercambre
1, Hélène Gautier
1, Dominique Rolin
3,5*, Michel Génard
1, Alisdair Fernie
4, Yves
Gibon2,3*
, Annick Moing2,3*
1 INRA UR 1115 Plantes et Systèmes de culture Horticoles, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon, France 2 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
3 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France * Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard
Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France 4 Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 14476 Potsdam-Golm, Germany
The Fruit Integrative Modelling project is an Eranet EraSysBio+ project which aims at describing and modelling the influence of environmental factors on tomato fruit central metabolism during its development. In this project, high-throughput biochemical phenotyping, MS and NMR spectrometry have been used to characterise fruit or leaf metabolites and estimate their levels for tomato plants (Solanum lycopersicum cv Moneymaker) cultivated in a greenhouse. Within this frame, one experiment focussed on the effect of the stage of fruit development, and another one on the effect of harvest time throughout a day and night cycle, on tissue composition. First, pericarp compositional changes were characterized at different stages of fruit development, from 8 days post-anthesis to red-ripe stage, and their data combined with the data of activity of 36 enzymes of central metabolism (Biais et al. 2014). Second, expanding fruits, and the mature leaves close to the harvested fruit cluster, were harvested on two different representative days and analyses of pericarp tissue and foliar limb were performed. Metabolite data were processed using univariate, multivariate and clustering analyses. Fruit and leaf, or metabolite and enzyme profiling data, were combined and visualized using networks that renewed our vision of source-sink relationships or metabolism regulation. Référence bibliographique Biais B et al. 2014. Remarkable reproducibility of enzyme activity profiles in tomato fruits grown under contrasting environments provides
a roadmap for studies of fruit metabolism. Plant Physiology 164, 1204-1221
Remerciements: FP7 Eranet EraSysBio+ FRIM project and MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Solanum lycopersicum, fruit metabolism,
1H-NMR, MS, metabolomics
44
O23
Integrating metabolomic data from multiple analytical platforms for a comprehensive characterisation of lemon essential oils.
Florence Mehl
1, Guillaume Marti
1, Philippe Merle
2, Estelle Delort
2, Lucie Baroux
2, Horst Sommer
2,
Jean-Luc Wolfender1, Serge Rudaz
1, Julien Boccard
1
1 School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva, University of Lausanne, 20, Bd d’Yvoy, 1211 Geneva 4, Switzerland
2 Firmenich, Corporate Research, Geneva, Switzerland
Natural products, such as vegetal and essential oils, wines, fruits, or cheese, are complex matrices composed of volatile and semi-volatile compounds. Characterising their chemical complexity in a holistic perspective constitutes a potent way to relate specific compounds to organoleptic properties of interest and assess their quality. With that end in view, a complete characterisation using untargeted metabolomics constitutes an analytical challenge. As no single analytical technique is sufficient to cover the physicochemical complexity of these mixtures of compounds, several approaches, including separative or spectral methods, have to be used in combination to address specific compartments depending on the nature of the metabolites. The integration of data generated gives rise to new challenges and questions for the combination of heterogeneous signals. Establishing links between variables from different sources with respect to a given experimental setup is a major challenge in the perspective of holistic metabolomics. The present study takes advantage of multiblock data modelling to integrate signals collected from GC-FID,
1H-NMR, UHPLC-TOF-MS- and UHPLC-TOF-MS+
platforms for the analysis of 64 samples of cold pressed lemon oil from 3 different geographic origins (Argentina, Italy and Spain), obtained from 5 extraction processes (Sfumatrice, FMC, BOE, Pelatrice and FMC + Pelatrice). Two levels of data fusion were investigated, high-level, i.e. combining OPLS-DA model outputs obtained from the independent processing and analysis of each data table and low-level, i.e. associating the sources at the data level with a Consensus OPLS-DA modelling strategy [1]. High level data fusion strategy was able to differentiate samples according to major source of variability (geographic origin) while the multiblock approach allowed minor variation related to extraction process to be highlighted [2]. Références bibliographiques 1. Boccard J, Rutledge DN (2013) A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) strategy for multiblock
Omics data fusion. Anal Chim Acta 769 (0):30-39. 2. Mehl F, Marti G, Boccard J, Debrus B, Merle P, Delort E, Baroux L, Raymo V, Velazco MI, Sommer H, Wolfender J-L, Rudaz S (2014)
Differentiation of lemon essential oil based on volatile and non-volatile fractions with various analytical techniques: a metabolomic approach. Food Chemistry 143 (0):325-335.
Mots-clés OPLS-DA, citrus essential oil, data fusion, multiblock analysis
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O24 - Conférence invitée
Genetic variation of metabolic diseases and metabolomics
Thomas Illig,
Hannover Medical School, Hannover Unified Biobank, Hannover, Allemagne
Metabolic diseases like obesity or type 2 diabetes are common complex diseases with several different environmental as well as genetic factors involved. This lecture gives a short overview of the genetic characteristics of metabolic diseases. Moreover connections between metabolite-gene associations and their role in metabolic diseases will be presented.
Serum metabolite concentrations allow a direct readout of biological processes and association of specific metabolomic signatures with complex diseases. These metabolites can rather easily be measured in large biobanks. Genome-wide association studies (GWAS) have identified many risk loci for complex diseases, but effect sizes are typically small and information on the underlying biological processes is often lacking. Associations with metabolic traits as functional intermediates can overcome these problems and potentially inform individualized therapy. We identified different genetic loci associated with blood metabolite concentrations, of which many exhibit effect sizes that are unusually high for GWAS and account for 10-60% of metabolite levels per allele copy. Our associations provide new functional insights for many disease-related associations that have been reported in previous studies, including cardiovascular and kidney disorders, type 2 diabetes and obesity. Our studies advance our knowledge of the genetic basis of metabolic individuality in humans and generate many new hypotheses for biomedical and pharmaceutical research.
46
O25
L'approche métabolomique identifie une réponse biologique à la contamination chronique à de faibles doses d'uranium naturel dans l'urine
Stéphane Grison
1, Gaëlle Favé
2,3,4, Matthieu Maillot
2,3,4, Line Manens
1, Olivia Delissen
1, Éric
Blanchardon5, Nathalie Banzet
2,3,4, Catherine Defoort
2,3,4, Romain Bott
2,3,4, Isabelle Dublineau
1,
Jocelyne Aigueperse6, Patrick Gourmelon
6, Jean-Charles Martin
2,3,4, Maâmar Souidi
1.
1 Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), PRP-HOM, SRBE, LRTOX, 92260 Fontenay-aux-Roses, France
2 Aix Marseille Université (AMU), NORT, 13005 Marseille, France 3 Inserm, UMR_S 1062, 13005 Marseille, France 4 Inra, UMR_INRA 1260, 13005 Marseille, France
5 Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), PRP-HOM, SDI, LEDI, 92260 Fontenay-aux-Roses, France 6 Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), PRP-HOM, 92260 Fontenay-aux-Roses, France
La présence d’uranium dans l’environnement peut conduire à une contamination de la chaîne alimentaire et/ou des eaux de boisson, soulevant de nombreuses interrogations scientifiques et sociétales quant à ses conséquences à long terme sur la santé des populations. Les effets biologiques d’une exposition chronique à de faibles doses d’uranium sont en effet encore peu connus, bien que des études récentes décrivent des modifications d’ordre moléculaire dans un certain nombre de métabolismes majeurs de l’organisme. Le but de cette étude était d’utiliser une approche Omics plus pertinente, la métabolomique, afin d’évaluer chez le rat les modifications biologiques induites par l’ingestion chronique de boisson contaminée à l’uranium naturel durant 9 mois [40 mg/l (2,7 mg/kg de rat) soit 3 fois la concentration maximale mesurées dans certains puits finlandais], et d’identifier des biomarqueurs potentiellement associés à cette exposition interne. Suite à la contamination, aucune pathologie n’a été observée et les tests cliniques standards n’ont pas permis de distinguer les rats contrôles des rats contaminés. En revanche, l’analyse métabolomique en LC-MS (déconvolution avec CAMERA dans R, et analyse statistique par PCA et PLS-DA dans SIMCA-P+) a montré que l’urine était un fluide biologique approprié pour la discrimination des groupes expérimentaux. Sur les 1 376 variables détectées dans l’urine, les plus discriminantes étaient des métabolites impliqués dans les voies métaboliques du tryptophane, du nicotinate et du nicotinamide. En particulier, le N-méthylnicotinamide, dont le taux était 7 fois plus bas chez les rats contaminés que chez les rats contrôles, présentait le meilleur pouvoir discriminant. Ces résultats novateurs établissent une preuve de principe pour l’utilisation de l proche métabolomique pour étudier l’impact in vivo d’une contamination chronique à de faibles doses d’uranium naturel. Ils ouvrent des perspectives intéressantes pour la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents et pour la conception d’un test de diagnostique clinique dans le cadre de la radiotoxicologie des faibles doses [1]. Références bibliographiques [1] Metabolomics identifies a biological response to chronic low-dose natural uranium contamination in urine samples. Grison S, Favé G, Maillot M, Manens L, Delissen O, Blanchardon E, Banzet N, Defoort C, Bott R, Dublineau I, Aigueperse J, Gourmelon P, Martin JC, and Souidi M. Metabolomics 2013, 9(6):1168-1180.
Mots-clés Uranium; Low dose; Chronic; Metabolomics; Urine; N-methylnicotinamide
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O26
Cloud metabolomics - a stress biomarkers story
Cyril Jousse
1,3*, Céline Dalle
1, Isabelle Canet
1, Marie Lagrée
3*, Mounir Traïkia
1,3* et Anne-Marie Delort
1,2*
[1] Clermont Université, Université Blaise Pascal, Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, BP 10448, 63000 Clermont-Ferrand, France
[2] CNRS, UMR 6296, ICCF, BP 80026, 63171 Aubière, France [3] Plateforme d’exploration du métabolisme-MetaboHUB, Université Blaise Pascal, BP 80026, 63171 Aubière, France
http://www.metabohub.fr/
Microorganisms have been known for a long time as important actors in aquatic and terrestrial ecosystems. Their discovery is rather recent in the atmosphere and more particularly in clouds (1). Our team has isolated around 700 microbial strains from cloud waters at the puy de Dôme summit during the last ten years, among them, Pseudomonas is one of the major encountered genus (2). Atmosphere is a really specific and versatile compartment on earth where microorganisms are facing various stresses including dryness, pH, UV, cold shocks…etc. Then, a key question is to understand how microorganisms can resist to such stresses and survive under such harsh conditions.In this work, we have selected a Pseudomonas syringae strain, isolated from cloud waters to study the influence of temperature and identify cold shock biomarkers through metabolomics experiments.This strain was incubated at 5°C and 17°C, these temperatures correspond respectively to the annual and the summer temperature means. Bacterial extracts were analyzed using a LC/MS-NMR facility (Metabolic Profiler), and multivariate analyses (PCA, PLS-DA). We highlighted different groups of relevant biomarkers. Some of them have been already described for cold shock stress: they include trehalose, betaïne, carnitine (cryoprotection), organic acids, ATP, sugars (energetic metabolism), insaturated lipids (membrane fluidity) and gluthatione (oxidative stress metabolism) (3-8). Surprisingly, we also found short peptides described for the first time as cold shock biomarkers.
Références bibliographiques (1) Delort et al., Atmos. Res., 2010, 98, 249-260. (2) Vaitilingom et al., Atmos. Environ., 2012, 56, 88-100. (3) Shivaji & Prakash, Arch. Microbiol., 2010, 192: 85–95. (4) Boroujerdi et al. , Environ. Sci. Technol., 2009, 43: 7658-7664. (5) Ye et al., J. Proteome Res., 2012, 11 (4): 2559–2566. (6) Singh et al., Int. J. Food Microbiol., 2011, 148: 107-114 (7) Jozefczuk et al., Mol. Syst.Biol., 2010, 6: 364. (8) Dalmasso et al., PLoS One, 2012, 7:e29083.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Cloud, bacteria, cold shock, Metabolic Profiler, stress, metabolomics, Pseudomonas
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O27
The polyphenol metabolome and dietary biomarkers in the European Prospective
Investigation on Cancer and Nutrition (EPIC) cohort
Will Edmands, Dinesh Kumar, Vanessa Neveu, Nadia Slimani, Pietro Ferrari, Sabina Rinaldi, Augustin Scalbert
International Agency for Research on Cancer (IARC), Nutrition and Metabolism Section, Biomarkers Group, F-69372 Lyon, France
Dietary biomarkers are increasingly used for validation of dietary measurements and as a more objective assessment of methods based on questionnaires to study associations between diet and disease risk. This biomarker approach utilizes the huge diversity of constituents commonly found in foods and after digestive transformation in human biofluids. Metabolomics of urine samples within the European Prospective Investigation into Cancer and nutrition cohort (EPIC) should allow identification of novel dietary markers. A cross-sectional study nested within EPIC was conducted on 481 subjects for which detailed 24-hr dietary recalls (24HDRs) and 24-hr urine samples were available for analysis. Urine concentrations were first normalized by dilution to the same specific gravity. Data were acquired using a high-resolution UPLC-QTof mass spectrometer. An optimised data processing workflow was developed in the R language which included peak-picking, QC based signal drift correction/filtration (feature RSD <30%), automated multivariate analysis, data-dependent MS/MS accurate mass matching and the monoisotopic mass identification through the screening of on-line and customized databases. Additionally the workflow allowed automated outlier removal and application of iterative regression and/or discriminant analysis methods to each Y-variable (i.e. dietary category) returning putative biomarkers above user-defined thresholds. Integrated hierarchical clustering of metabolomic, food intake and food constituent data was then used to examine metabolite-metabolite and metabolite-diet associations. Data were first screened to identify 82 dietary polyphenols and their phase II and microbial metabolites associated to intake of six different polyphenol-rich foods (coffee, tea, red wine, citrus fruit, apple and pear, cocoa) using the Phenol-Explorer database. These biomarkers matched confidence criteria for correlation to the consumption of a variety of specific foods rich in polyphenols. This unique approach will be extended to the rest of the food metabolome (>27,000 known food constituents in the FooDB database) to identify a variety of biomarkers for different dietary exposures. This biomarker identification approach will be implemented in future metabolome-wide association studies in the EPIC or similar cohorts. Acknowledgment. This research is supported by the European Union (NutriTech FP7-KBBE-2011-5 Grant #289511, EUROCAN FP7-KBBE-2010.2.4.1-2 Grant #260791). Mots-clés Dietary biomarkers, polyphenols, urine, untargeted metabolomics, mass spectrometry, epidemiology
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O28
Identification des AGPI w3 en position sn1 des phosphaditylcholines chez des sujets hypertriglycéridémiques après supplémentation en AGPI w3 : activation de la LCAT
Véronique Ferchaud-Roucher, Mikaël Croyal, Sarah Boulassel, Michel Krempf, Khadija Ouguerram
UMR 1280 PhAN, CHU Nantes, CRNH, Plate-forme Corsaire-Biogenouest, SFR UMS016, Institut de Recherche en Santé-Université de
Nantes, 8 quai Moncousu, 44007, Nantes
La lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT), enzyme responsable de l’estérification du cholestérol plasmatique, joue un rôle crucial dans la première étape du transport inverse du cholestérol, en facilitant l’élimination de l’excès de cholestérol des tissus périphériques vers le foie pour y être ensuite éliminé. L’activité de la LCAT est liée à la concentration des HDL plasmatiques. Un déficit en LCAT diminue la concentration des HDL entrainant le développement de maladies cardiovasculaires comme l’athérosclérose. Dans le plasma humain, la LCAT permet la formation de la majorité des esters de cholestérol (CE) par hydrolyse et transfert d’un acide gras (AG) en position sn2 de la phosphatidylcholine et la formation de la lysophosphatidylcholine (LPC) en sn1. Toutefois, il est reporté que la position préférentielle des AG de très longues chaines d’AGPI (> 20 carbones) se situe en sn2 des PC aboutissant à une action de la LCAT en position sn1 (1) suivie d’une isomérisation de l’AG en sn2 vers sn1 de la LPC formée (2). Parallèlement, la présence des AGPI en position sn1 reste minoritaire, dépendante des tissus et fluides biologiques. Le DHA en position sn1des PC (PC(22:6/16:0)) a été reporté chez les murins dans le cerveau, le poumon et la rétine (3,4). Dans le plasma humain, seule la présence de DHA en sn2 des PC (PC(16:0/22:6)) a été mise en évidence chez des volontaires sains après supplémentation en DHA (1). Ainsi, des études mesurant ces biomarqueurs de l’activité et de la modulation de la LCAT in vivo manquent crucialement. L’objectif de la présente étude était de montrer si une supplémentation en AGPI ω3 chronique chez des sujets hypertriglycéridémiants (HTG), permettait leur incorporation dans les PC en position sn1? Et dans ce cas, quelle était la conséquence sur l’activité de la LCAT évaluée par la mesure parallèle des LPC en sn1 ? Afin de répondre à ces questions, une stratégie lipidomique utilisant le couplage UPLC-ESI-IMS-MSE a été développée pour identifier ces biomarqueurs et appliquée à des sujets HTG avant et après traitement aux AGPI ω3 (EPA(20:5) 1,08g/j et DHA(22:6) 1,44g/j) pendant 8 semaines.Comme attendu, ce traitement nutritionnel a entrainé un enrichissement des lipides (LPC, PC, TG, CE) en EPA et DHA ainsi qu’une diminution de ces lipides contenant des AG saturés et AGPI ω6 considérés comme pro-inflammatoires et pro-athérogènes. L’utilisation de la mobilité ionique (IMS) a permis d’identifier l’EPA et le DHA en position sn1 des PC (PC(20:5/16:0) et PC(22:6/16:0)). La supplémentation en AGPI ω3 a entrainé une augmentation significative de ces PC (+137 et + 29%, p<0.05) ainsi que des LPC20:5 et 22:6 directement en sn1 (+ 92 et +44%, p<0.05). Ce résultat était renforcé par la forte corrélation mesurée entre les PC(20:5/16:0) et LPC20:5 et les PC(22:6/16:0) et LPC22:6 (r=0.91, p<0.001 et r=0.77, p<0.001). En conclusion, notre étude a permis d’identifier, pour la première fois dans le plasma humain des PC contenant des AGPI w3 en sn1. L’augmentation de ces biomarqueurs de la LCAT, PC et LPC correspondants, en présence d’AGPI w3, suggère une plus forte activité de la LCAT et donc une protection accrue contre le risque cardiovasculaire. Références bibliographiques 1-Subbaiah et al. JLR. 2004 2-Croset et al. JBiochem 2000 3-Nakanishi et al. JBiochem 2010 4-Nakanishi et al. JBiol Chem 2006
Mots-clés : Lipidomique, Mobilité Ionique (IMS), AGPI w3, LCAT, Risque Cardiovasculaire
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O29
HRMAS NMR-based Metabolomics for the study of Al(III) nanoparticle toxic effects
on P. brassicacearum bacteria
Laetitia Shintu1, Jima Nambiath Chandran
1,2, Wafa Achouak
3, Mélanie Auffan
4, Catherine Santaella
3,
Armand Masion4
1 Aix Marseille Université, iSm2 UMR CNRS 7313, Marseille, France
2 Current address : Max Planck Institute for Chemical Ecology, Research Group Biosynthesis / NMR, Jena, Allemagne 3 IBEB/ LEMiRE UMR 6191 - CEA - CNRS- Aix Marseille Université, Cadarache, France
4 CEREGE UMR 7330 CNRS Aix Marseille Université, Aix-en-Provence, France
The importance of manufactured nanoparticles has steadily increased for 20 years. Due to their high surface reactivity, they may have negative impacts on the environment or health. In this area, Al nanoparticles (Nps) are used in a wide range of industrial applications and in many commercial materials such as solid rocket fuel, abrasive materials, catalysts, substrate for electronic circuits, cosmetics or ceramics [1]. However, whereas the toxicity of Al(H2O)6
3+ is a well-known issue and has been investigated in many publications [2], the toxicity
of Al Nps remains little studied. In this project, we chose to assess the ecotoxicity of two Al(III) nanoparticles representing two a priori contrasted toxicity situation: the nano-boehmite γ-Al(O)OH for which the macro form is considered as non-toxic, and Al13 (formula AlO4Al12(OH)24(H2O)12) with a ε-Keggin structure, for which significant toxicity has been reported, on a biological model : P. brassicacearum bacteria. Cellular cell viability, cellular growth and respiration of the bacteria were measured after 18h of incubation in presence of the Nps. Although both Nps were toxic for the bacteria, a very low concentration of Al13 Nps (10
-4
M) was enough to slow down their growth, when no noticeable effects were observed with Al(O)OH at the same concentration. However, HRMAS NMR-Metabolomics showed that both Al Nps disturbed the bacterium metabolism and several markers of Nps-induced toxicity were similar to those observed for Al
3+. This involved
an increase level of formic acid, butyric acid, GABA and nucleotides in presence of the toxic substances. Nevertheless, despite these similarities, the involved intoxication processes were toxicant-dependant and led to a unique NMR profile. Finally, in order to further understand the mechanisms involved in the Nps-induced toxicity, ΔGacA P. brassicacearum mutants were also analysed under the same conditions. Références bibliographiques [1] Pailleux M, Boudard D, Pourchez J, Forest V, Grosseau P, Cottier M, 2013, Toxicology in vitro, 27, 1049-1056 [2] Bondy SC, 2014, Toxicology, 315, 1-7
Mots-clés HRMAS NMR metabolomics, Ecotoxicity, Al nanoparticles
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O30
Empreintes métaboliques de stress abiotiques chez des Brassicacées modèles et
cultivées
Raphaël Lugan1,2
, Hugues Renault1,2
, Benjamin Albert1, Marie-Françoise Niogret
1, Françoise Le
Cahérec1, Laurent Leport
1, Carole Deleu
1, David Renault
3, David Gagneul
1,4, Nathalie Marnet
5, Solenne
Berardocco1,5
, Antoine Gravot1,5
et Alain Bouchereau1,5
1 UMR 1349 IGEPP, INRA-Agrocampus Ouest-Université de Rennes 1, Rennes-Le Rheu, France 2 Plateforme Métabolomique IBMP, Institut de Botanique, Strasbourg, France
3 UMR 6553 EcoBio, CNRS-Université de Rennes 1, Rennes, France 4 UMR 1281 SADV, INRA-Université Lille Nord de France, Lille, France
5 Plateau de Profilage Métabolique et de Métabolomique (P2M2), IGEPP, BIA-PRP, Rennes-Le Rheu, France
Les plantes sont assujetties à des fluctuations importantes de leur environnement biotique et abiotique et sont régulièrement confrontées à des épisodes de stress de natures biologique et physico-chimique variées. Les perspectives d’évolution climatique imposent, pour des raisons aussi bien écologiques qu’agronomiques, d’appréhender aussi finement que possible les capacités adaptatives des espèces végétales notamment à des environnements thermiques et hydriques contraignants. Sur le plan agro-écologique, l’emploi plus limité et raisonné d’intrants nécessite, pour assurer les rendements, de considérer avec attention les problématiques d’efficience améliorée d’utilisation de l’eau et des nutriments minéraux par les plantes cultivées. Le métabolisme, aussi bien primaire que secondaire, est très sollicité en réponse aux stress et bon nombre de fonctions essentielles à la tolérance et à l’adaptation (thermoprotection, osmoadapation, absorption, assimilation, transport,…) sont directement ou indirectement supportées par des effecteurs ou des régulateurs métaboliques. Par ailleurs, le phénotype métabolique traduit par l’interaction entre le génotype et l’environnement fournit une empreinte intégrative des régulations opérées en amont sur les gènes et les protéines et peut efficacement révéler des caractéristiques génétiques d’intérêt sur le plan adaptatif.Nos études se concentrent depuis plusieurs années vers la recherche de déterminants génétiques et d’attributs physiologiques et métaboliques de la tolérance aux stress hydriques, thermiques et nutritionnels. Elles sont conduites parallèlement chez des espèces modèles de Brassicacées comme Arabidopsis thaliana et transposées à des espèces apparentées, d’intérêt agronomique, comme le colza. Nous développerons les informations acquises dans le cadre d’études de profilage métabolique et de métabolomique appliquées à la recherche de signatures de stress et de marqueurs ou de déterminants potentiels de la tolérance. Nous illustrerons l’intérêt de procéder au phénotypage métabolique de mutants et de transformants pour préciser l’implication et la fonction potentielles de gènes et de métabolismes dans l’adaptation aux stress abiotiques (stress hydrique, salin, thermique, azoté). Références bibliographiques Renault H., El Amrani A., Berger A., Mouille G., Soubigou-Taconnat L., Bouchereau A., Deleu C., 2013 - γ-Aminobutyric acid
transaminase deficiency impairs central carbon metabolism and leads to cell wall defects during salt stress in Arabidopsis roots. Plant Cell Environ., 36, 1009-1018.
Wagner G., Charton S., Lariagon C., Laperche A., Lugan R., Hopkins J., Frendo P., Bouchereau A., Delourme R., Gravot A., Manzanares-Dauleux MJ., 2012 - Metabotyping: a new approach to investigate rapeseed (Brassica napus L.) genetic diversity in the metabolic response to clubroot infection. Mol Plant Microbe Interact., 25, 1478-91.
Albert B., Le Cahérec F., Niogret MF., Faes P., Avice JC., Leport L., Bouchereau A., 2012 – Nitrogen availability impacts oilseed rape (Brassica napus L.) plant water status and proline production efficiency under water-limited conditions. Planta, 236, 659-676.
Szabados L., Kovacs H., Zilberstein A., Bouchereau A., 2011 – Plants in extreme environments: importance of protective compounds in stress tolerance. Adv. Bot. Res., 57, 105-150.
Lugan R., Niogret MF., Leport L., Guégan JP., Larher F., Savouré A., Kopka J., Bouchereau, A., 2010 - Metabolome and water homeostasis analysis of Thellungiella salsuginea suggests that dehydration tolerance is a key response to osmotic stress in this halophyte. Plant J. 64, 215-229.
Lugan R., Niogret M.F., Kervazo L., Larher F.L., Kopka J., Bouchereau A., 2009 - Metabolome and water status phenotyping of Arabidopsis under abiotic stress cues reveals new insight into ESK1 function. Plant Cell Env., 32, 95–108.
Mots-clés Arabidopsis thaliana, Thellungiella salsuginea, Arabis alpina, Brassica napus, stress abiotiques, GC/LC-MS, 1H-RMN, analyses multivariées.
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O31
Trajectoires métaboliques chez le miniporc lors des adaptations du métabolisme à des challenges nutritionnels : le cas du régime riche en lipides
Sergio Polakof
1,2, Didier Rémond
1,2, Mathieu Rambeau
1,2, Estelle Pujos-Guillot
3*, Jean-Louis
Sébédio1,2
, Dominique Dardevet1,2
, Blandine Comte1,2
, Isabelle Savary-Auzeloux1,2
1 Clermont Université, Université d’Auvergne, Unité de Nutrition Humaine, BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand, France 2 INRA, UMR 1019, UNH, CRNH Auvergne, F-63000 Clermont-Ferrand, France
3 INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme-MetaboHUB, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France http://www.metabohub.fr/
Lors de transitions alimentaires, l’analyse cinétique des dérives du métabolome (trajectoires métabolomiques), avec une approche métabolomique ouverte sans a priori, ouvre de nouvelles perspectives en termes de compréhension des processus d’adaptation et/ou de dysfonctionnement métaboliques. L’objet du présent travail est d’explorer, à travers cette approche des plus novatrices, les conséquences, sur l’évolution des métabolomes plasmatiques et urinaires, de la consommation d’un régime riche en lipides (HF pour ‘high fat’), reconnu pour induire une résistance à l’insuline sur le long terme. Le modèle animal utilisé pour cette étude est le modèle de mini porc, équipé d’un cathéter aortique permanent, permettant un suivi longitudinal des paramètres mesurés. Six miniporcs Yucatan ont ainsi été nourris avec un régime riche en lipides (~10%) en sucres (~10%) (HF) pendant 60 jours. Avant (J0) et après 7, 14, 30 et 60 jours consécutifs de régime HF, des échantillons de sang ont été prélevés sur les miniporcs à jeun, et nourri (2h après le repas). Des échantillons d’urine ont également été récupérés pendant la période postprandiale (0-6h après le repas). Les niveaux circulants plasmatiques de glucose, insuline, triglycérides, lactate et urée ont été mesurés par dosages biochimiques classiques et le métabolome urinaire déterminé par UPLC-QToF.Les données métabolomiques ont été analysées par un modèle multivarié de type OPLS-DA (R2=0.5, Q2=0.2, deux composantes), tandis que les paramètres biochimiques ont été analysés par un test t de Student. Le phénotype métabolique des animaux (ici : métabolome urinaire) est modulé au cours du temps et la trajectoire peut être décrite en deux étapes : Une première phase d’adaptation immédiate au changement de régime, comprise entre J0 et J7, expliqué par la première composante du modèle, suivi d’une deuxième phase située entre J 7 et J14 (deuxième composante du modèle). Cette dernière pourrait être liée à la mise en place des premiers désordres métaboliques potentiellement associés à des altérations du métabolome endogène. Pour les données de la fin de la trajectoire (J30-60), le modèle reste inefficace pour discriminer les points de cinétique, suggérant que les animaux ont atteint un nouvel état d’équilibre (adaptation précédant le développement d’une résistance à l’insuline). Étant donné que les points d’inflexion se situent à J7 et J14, nous avons ciblé des mesures de paramètres plasmatiques sur J0, J7 et J14 afin de déterminer si les paramètres plasmatiques étaient ou non altérés comme constaté dans le métabolome urinaire. Nous n’avons trouvé que peu de différences significatives entre J0 et J7 sur les paramètres mesurés. Après 2 semaines de régime, une hyperglycémie (+50%, J14 vs J0) et une hyperinsulinémie (+276% J14 vs J0) à jeun sont présentes (J14 significativement différent de J0 et J7) ainsi qu’une hypertriglycéridémie postprandiale plus marquée. Cette étude montre que l’analyse des trajectoires métaboliques (en particulier urinaires) peut permettre d’identifier des points d’inflexion spécifiques de changements métaboliques lors de la consommation des régimes riche HF et ouvre la porte à l’identification de biomarqueurs précoces. Des modulations précoces importantes dans le métabolome urinaire ont eu lieu dans notre modèle d’étude et certains de ces changements sont visibles avant même que des paramètres classiques (glucose, triglycérides, insuline…) mesurés au niveau plasmatique ne soient altérés. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés trajectoire métabolique, urine, résistance à l’insuline, miniporc, métabolomique, régime riche en lipides
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O32
Metabolomic approach to authenticate plant extracts used in fragrance and flavour:
application to violet extracts
Laure Saint-Lary1,2,3
, Céline Roy3, Jean-Philippe Paris
2, Jean-François Martin
4, Olivier P. Thomas
1,
Xavier Fernandez1
1 Institut de Chimie de Nice, Université de Nice Sophia-Antipolis, UMR CNRS 7272, Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France
2 PAYAN BERTRAND, 28 Av. Jean XXIII, 06130 Grasse, France 3 EuropeanResearch Institute on Natural Ingredients (ERINI), Espace Jacques-Louis Lions4 Traverse Dupont, 06130 Grasse, France
4 INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme-MetaboHUB, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France http://www.metabohub.fr/
Natural extracts used in perfumery are valuable products. They are subjected to regulations and adulterations are frequent through fraudulent practices and unwitting changes. The so called “Absolutes”, obtained by solvent extraction of plants organs, are important materials for the creation of fragrances. Their volatile fractions have been widely studied, whereas the non volatile ones remain poorly known. Up to now no approach allows the fast detection of adulterations or changes in the non volatile fraction. In this context, we decided to investigate the use of metabolomics. Indeed, metabolomic fingerprinting enables to identify differences between chemical contents without demanding the exact knowledge of the chemical diversity of the samples. Differences could be due to geographical origin (botanical varieties, cultural practices…), but also to adulterations (mixtures with other cheaper plant extracts or addition of specific compounds). UHPLC-ToFMS is already well known as a potent tool for the screening of non volatile compounds by metabolomics allowing the identification of bio-markers. Amongst the most precious ingredients of perfumery, Viola odorata L. leaves absolute was chosen as a model. The extract of this plant releases flowered, earthy, marine and green notes, reminiscent of cucumber. This rare ingredient gives freshness and a vegetable green effect to famous fine fragrances like Fahrenheit® from Dior. The use of metabolomics allows us to distinguish the extracts from Egyptian and French origins, markers from the former were successfully determined. Simulated classical adulterations like addition of methyl linoleate or spinach absolute were also identified thanks to metabolomic approach. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Metabolomics, non-targeted screening, secondary metabolites, absolutes, UHPLC-ToFMS, Viola odorata
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Communications Orales Juniors
OJ1
NMR metabolomic approach to study cold acclimation on three genotypes of Miscanthus
Hyacinthe Le Gall, Jean-Xavier Fontaine, Roland Molinié, Jean-Marc Domon, Jérôme Pelloux,
Catherine Rayon, François Mesnard, Françoise Gillet, Ophélie Fliniaux.
EA 3900-BIOPI, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France.
Highly photosynthetic-efficient C4 grasses, such as Miscanthus, are expected to provide abundant and sustainable resources of lignocellulosic biomass for the production of biofuels (Heaton et al, 2010; Glowacka, 2011). Miscanthus is a tall perennial grass that has been evaluated as a new bioenergy crop in Europe during the past 5-10 years. However, Miscanthus genotypes often produce yields lower than their potential due to late emergence of shoots in the spring or to damage from late frosts when shoots emerge too early (Farrell et al, 2006). The effects of cold acclimation on cell wall composition have been described in Domon et al. (2013). Herein, the effects of cold acclimation on metabolome were investigated in different Miscanthus genotypes: M. sinensis August (AUG, frost tolerent clone), M. sinensis Goliath (GOL, intermediate), M. x giganteus (GIG, frost sensitive clone)(Clifton-Brown & Lewandowski, 2000 ; Farrel et al, 2006). After 28 days of culture in a growth chamber (Zub et al, 2012), the different genotypes were grown under cold acclimation or under control conditions. Aerial parts were harvested before application of cold acclimation (day 0 ; D0) or after 4 days of experiment (D4) and 8 days (D8). Samples were extracted and analysed by
1H NMR. The metabolites were
identified using 1D and 2D NMR spectra. Coupling NMR analysis with multivariate data analysis revealed a clear separation between the different genotypes in standard culture conditions. It also showed differences between cold acclimation and control conditions for each genotype. This method allowed us to obtain following results : (i) the three Miscanthus genotypes at D0 have a different metabolomics profile in particular, AUG showed a higher content in amino acids (asparagine, glycine, proline) than that observed in GIG ; GIG showed a higher content in soluble sugars (raffinose, sucrose) than that observed in AUG ; GIG accumulates betain whereas this metabolite is absent in AUG and GOL ; GOL is similar as AUG for some metabolite content (proline, threonine, valine, and raffinose) and as GIG for others (asparagine, malate) ; (ii) At D4 and D8, the tolerant clone (AUG) and the sensitive clone (GIG) stay different about their metabolic profile. The multivariate data analysis allows separating the two clones (by the first principal component) and acclimated and non-acclimated Miscanthus (by the second principal component). The acclimation induces an increase in alanine, GABA, glutamic acid, raffinose, succinic acid and in trans-aconitic acid content, and a decrease in sucrose, glucose, fructose and in asparagine content, whatever the genotype but with different ratios. References: Clifton-Brown & Lewandowski, 2000. Overwintering problems of newly established Miscanthus plantations can be overcome by
identifying genotypes with improved rhizome cold tolerance. New Phytologist 148 (2), 287–294. Domon et al, 2013. Cell wall compositional modifications of Miscanthus ecotypes in response to cold acclimation. Phytochemistry 85, 51–
61 Farrell et al, 2006. Genotypic variation in cold tolerance influences the yield of Miscanthus. An. Appl Biol 149, 337–345. Glowacka, 2011. A review of the genetic study of the energy crop Miscanthus. Biomass Bioenerg 35, 2445–2454. Heaton et al, 2010. Miscanthus: a promising biomass crop. Advances in Botanical Research, 56(10). Janska et al, 2010. Cold stress and acclimation – what is important for metabolic adjustment? Plant Biology 12, 395–405 Zub et al, 2012. The frost tolerance of Miscanthus at the juvenile stage: differences between clones are influenced by leaf-stage and
acclimation. Eur J Agron 36, 32–40.
Mots-clés Miscanthus, cold acclimation, NMR, metabolomic, multivariate analysis, grasses.
55
OJ2
1H-NMR HRMAS study of maize (Zea mays) roots exposed to organochlorines pesticides
Claire Blondel
a,b, Farid Khelalfa
a,b, Muriel Raveton
a,b, Florence Fauvelle
c,d
a Laboratoire d’Ecologie Alpine, UMR CNRS n°5553, Université Joseph Fourier, BP 53, 38041 Grenoble Cedex 09, France.
b Université de Grenoble - Alpes, France c IRBA, Bretigny sur Orge, France
d GIN-IRMage, 38041 Grenoble Cedex 09, France
Context: Organochlorines pesticides (OCPs), as lindane, are persistent organic pollutants in the environment due to their high lipophilicity and stability. Restoration of polluted ecosystem exists such as the use of plants like maize (Zea mays) to clean up soils (phytoremediation). Objectives: Roots have a key role on the uptake of pesticides by plant; therefore we study the impact of lindane on root cell metabolism. This will allow us to improve the understanding of process involved in plant-OCPs interactions. Methods: For this purpose, maize seedlings were exposed during 7 days with lindane at 7 mg.l
-1 (maximum
water solubility) and 0.7 mg.l-1
(environmentally relevant concentration). We collected root tips. 6 meristems were rinsed with D2O, pooled together in inserts and flash frozen with liquid nitrogen. Samples were analyzed with
1H NMR HRMAS (proton frequency 600.13MHz) at 4°C and spun at 4000 Hz. Spectra from 0.3 to 6.5
ppm were divided into buckets to 10-3 ppm and submitted to multivariate analysis (OPLS-DA) with SIMCA software. Results were visualized with score plots for individuals and “S-line plot” for variables in order to identify metabolites’ changes in presence of lindane. Results: Lindane induced disturbances in maize metabolism. We noticed an increase in lipids and a decrease of carbohydrates in exposed maize roots. Amino acids, as glutamine, GABA and glycine, as well as metabolites of the citric acid cycle were also impacted. Conclusion: Lindane exposure induces modifications on maize root metabolism. Impacts on lipid metabolism are the most important, especially for fatty acid which are classically disturbed in response to biotic and abiotic stresses (Kachroo and Kachroo 2009). Moreover, a significant increase of glutamine, an anti-apoptotic amino acids (Pérez-Maldonado, D az-Barriga et al. 2004), is measured which is in accordance with our previous results showing root cell apoptosis when exposed to lindane. These results improve the knowledge on plant responses to OCP-exposure and validate the use of
1H NMR HRMAS as a tool of great interest to
study plant environmental stress responses. Further analyses are needed to understand in details lipids/lindane interactions. Fundings for this project were provided by a grant from la Région Rhône-Alpes. Références bibliographiques Kachroo, A. and P. Kachroo (2009). Fatty Acid–Derived Signals in Plant Defense. Annual Review of Phytopathology 47(1): 153-176. Pérez-Maldonado, I. N., F. D az-Barriga, et al. (2004). DDT induces apoptosis in human mononuclear cells in vitro and is associated with
increased apoptosis in exposed children. Environmental Research 94(1): 38-46.
Mots-clés Organochlorines pesticides, Maize root metabolome,
1H-NMR HRMAS, Phytoremediation
56
OJ3
Caractérisation et traçabilité des matrices riches en triacylglycérols par une approche Isotopomique
Noëlle Merchak1,2
, Virginie Silvestre1, Julie Lalande
1, Serge Akoka
1, Joseph Bejjani
2
1 - CEISAM, Université de Nantes – CNRS, Nantes, France
2 - LMFI, Université Saint-Joseph, Beyrouth, Liban La sécurité alimentaire est une préoccupation nationale et mondiale qui nécessite de soumettre les produits agroalimentaires à des normes de qualité strictes et d’assurer leur traçabilité du champ à l’assiette. De nos jours, les fraudes, les adultérations et les agents pathogènes n’ont pas de frontières. Pour cela la vérification de l’origine des produits alimentaires à risque doit être assurée par des méthodes fiables et standardisées. Dans ce cadre, la construction de bases de données sur les produits alimentaires, notamment les huiles d’olives, nous fournirait un moyen d’authentification et de classification des produits selon leurs origines géographiques et botaniques afin de protéger à la fois les consommateurs et les producteurs soucieux de qualité. La composition en acides gras et autres lipides dans une huile est très dépendante de la nature de la plante qui l’a produite, mais aussi des conditions géo-climatiques de culture. Et il en est de même pour les teneurs isotopiques des différents sites des molécules constituantes. Le profil des acides gras et leurs rapports isotopiques varient donc en fonction des espèces, de la nature du sol, de l’altitude, de la latitude, de la distance à la mer, du taux de précipitations, de la saison, et d’autres facteurs. Ces paramètres sont également affectés par des facteurs en relation avec les pratiques agricoles adoptées, le degré de maturité à la cueillette, l’irrigation, le traitement du sol, etc. Une campagne d’échantillonnage d’olive (260 échantillons) sur tout le territoire libanais a été réalisée, et les différentes huiles ont été analysées par RMN-
1H, afin notamment de déterminer la composition des huiles en
acides gras. Ces mêmes échantillons sont en cours d’analyse par RMN-13
C en appliquant la séquence INEPT qui nous permet de quantifier les rapports isotopiques et de déterminer la distribution des acides gras sur le glycérol. L’analyse statistique (univariées et multivariées) de l’ensemble de ses résultats met en évidence la variation des paramètres isotopiques de l’huile d’olive en fonction de la variété d’olive, de l’altitude, de la latitude, de la distance de la mer ; ce qui permettra de classifier les huiles. Références bibliographiques Vigli, G., Philippidis, A., Spyros, A., and Dais, P., Classification of edible oils by employing
1H and
31P NMR spectroscopy in combination
with multivariate statistical analysis. A proposal for the detection of seed oil adulteration in virgin olive oils, J. Agric. Food Chem. 51(19):5715-5722 (2003).
Sacco, A., Bresci, M.A., Liuzzi, V., Reniero, F., Guillou, C., Ghelli, S., and van der Meer, P., Characterization of Italian olive oils based on analytical and nuclear magnetic resonance determinations, J. Am. Oil Chem. Soc. 77(6):619-625 (2000).
Mots-clés RMN-1H - RMN-13C - huile d’olive - authenticité - classification
57
OJ4
LC-HRMS and data mining tools for the combined metabolomic and lipidomic serum profiling of human cohorts
Samia Boudah1, 2
; Etienne Thévenot3*
; Alexandre Seyer4; Simon Broudin
4; Lydie Oliveira
1; Florence
Castelli1; Jean-Claude Tabet
5*; Benoit Colsch
1*; Christophe Junot
1*
1 LEMM-CEA-Saclay, Gif-Sur-Yvette, France;
2 GlaxoSmithKline - Centre de recherche F.Hyafil, Villebon-sur-Yvette, France; 3 DRT/LIST/DM2I/LADIS-CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, France;
4 Profilomic SA, Boulogne-Billancourt, France; 5 LCSOB-UPMC, Paris, France
* MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Novel Aspect. Development of complementary LC/HRMS methodologies and data mining tools for metabolomic and lipidomic profiling of large cohort serum samples Introduction. Global profiling of human biofluids is a major bottleneck in metabolomics. Since metabolites display huge differences in their physicochemical properties, complementary methods are required to achieve optimal metabolome coverage. This usually involves the combined use of NMR and MS technologies. However, thanks to its versatility, HRMS can be coupled to several kinds of chromatographic methods, which makes it valuable. Another key concern is to use such untargeted profiling tools for large cohort studies. To this end, dedicated bioinformatics tools (i.e., peak detection and alignment, statistics, data fusion and metabolite identification) are implemented. In this context, we developed LC-HRMS-based methods for human serum metabolomic and lipidomic profiling, then applied them to analyze large human cohort using advanced data mining tools. Methods. Serum samples were obtained from a cohort of 230 subjects working at the French Atomic Energy Commission. Samples were extracted according to a modified Bligh and Dyer method and then analyzed using reverse phase (RP) chromatography coupled to a Q-Exactive Orbitrap instrument for lipidomic analysis. For metabolomic analyses, samples were treated by methanol and analyzed using an ESI-Exactive Orbitrap instrument. Three different chromatographic columns were used: RP, hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), and PentaFluroPhenylPropyl (PFPP) stationary phases. All MS/MS spectra were obtained using a Q-Exactive Orbitrap instrument. Automatic peak detection from raw data was performed using the XCMS software, and dataset annotation was conducted using in house spectral libraries. Univariate statistical analysis and multivariate modeling were performed on R library. Preliminary Data. In this study, we first evaluated the relevance of our LC-HRMS platform to perform a comprehensive study of the human serum metabolome and lipidome. Hundreds to thousands of signals were detected from serum extracts. However major part of this information remained unknown. In this context, in-house spectral libraries were implemented using chemical compounds and purified lipid extracts. MS, MS/MS spectra and retention times of 800 metabolites and 2000 lipid species were recorded in order to ensure LC-HRMS dataset annotation, handle signal redundancy and confirm metabolite identification. Using these tools, the combination of RP, HILIC and PFPP coupled to HRMS resulted in the identification of 266 metabolites in serum samples distributed over 20 chemical classes including 27% of isomeric species. HILIC ensured the greatest metabolome coverage in the negative ionization mode, whereas PFPP was the most effective in the positive one. In addition, more than 900 unique lipid species corresponding to 24 classes and subclasses were identified in RPLC-HRMS lipidomic dataset based on their exact mass-to-charge ratio, retention time and isotopic ratio. As a proof of concept, we combined LC-HRMS profiling along with data processing in both metabolomics and lipidomics experiments. 1200 unique endogenous metabolites and lipids were screened in 230 human serum samples. The influence of BMI, age and gender was evaluated on these identified molecules. In addition, data processing tools were developed to handle large datasets in terms of intra-batch MS signal correction and inter-batch data fusion for 24 datasets. Interestingly lipidomic profile was less influenced by these physiological factors as compared to the metabolic profile. Significant concentration variations in various metabolic pathways were observed as a function of age, BMI and gender. In conclusion our approach is applicable on large series of samples and allows to better identify confounding factors of physiological origin in subsequent clinical studies. Mots-clés LC/HRMS, global profiling approaches, metabolomics, lipidomics, data mining, large human cohort
58
OJ5
Targeted, LC-MS/MS-based metabolomics for quantitative analysis of plasmodium falciparum phospholipid metabolism
S. Ghezal(1)
, M. Maynadier Bienvenu(2)
, S. Wein-Gratraud(2)
, B. Roy(1)
, C. Perigaud(1)
, I. Lefebvre-Tournier
(1), H. Vial
(2).
(1) Institut des Biomolécules Max Mousseron, UMR 5247 CNRS-Universités Montpellier 1 et 2,
Cc1705, Université Montpellier 2, 34095 Montpellier. (2) Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR 5235, Université Montpellier 2.
Plasmodium falciparum, the most virulent of the human malaria parasites causes an estimated 225 million cases of malaria worldwide and more than one million deaths per year. This parasite is transmitted to humans by the bite of infected female Anopheles mosquito and undergoes several developmental stages within its human hosts. The rapid and cyclical multiplication of the parasite in the host red blood cells is responsible for the symptoms and mortality of malaria infection. This rate of production demands high metabolic activity particularly through the increased requirement for novel membrane formation. Membranes of this intracellular parasite are essentially composed of phospholipids. Indeed, infected erythrocytes show a marked increase in phospholipids by approximately six-fold. The field of plasmodium metabolomics is still in its infancy, and most studies so far focus on relative quantitation by comparing cells in two different metabolic states, rather than performing absolute quantitation. In this study, we are interested in the absolute quantitation, by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), of the metabolites involved in the different phospholipids biosynthesis pathways as well as several other metabolites that reflect the metabolic status of the parasite including amino acids, carboxylic acids, energy-related carbohydrates and nucleotides. This metabolomic study offers the potential for discovering new drug targets, or to track the metabolic changes within the parasite caused by treatment with existing drug, with the aim of optimising the compounds or combating drug resistance. For these aims, we developed and validated two liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) methods for the quantification of water-soluble metabolites from P. falciparum parasites and their host cells. A total of 35 compounds were quantified. We have also studied the respective contribution of different phospholipids biosynthesis pathways in P. falciparum by experiments using culture medium supplemented with labelled precursors. Through these experiences, we try to elucidate the dynamics of each pathway (limiting and regulatory steps) and to investigate eventual cross-regulations between metabolic pathways.
Références bibliographiques (a)
Besteiro, S.; Vo Duy, S.; Perigaud, C.; Lefebvre Tournier, I.; Vial, H.J. Parasitology 2010, 137, 1343-1356. (b)
Vo Duy, S.; Besteiro, S.; Berry L.; Bressolle, F.; Vial, H.J.; Lefebvre Tournier, I. Anal. Chim. Acta. 2012, 739, 47-55.
Fragmentation
by MS/MS
1-Preparation of the samples
Quenching and extraction of the
metabolites
Cold m
ethanol
Saponin lysis
Separation of
parasites from
RBC by
centrifugation
Identification
and quantitation
Separation by LC
co
lum
n
2-Analysis of the samples
4°C
-80°C
Fragmentation
by MS/MS
Fragmentation
by MS/MS
1-Preparation of the samples
Quenching and extraction of the
metabolites
Cold m
ethanol
Saponin lysis
Separation of
parasites from
RBC by
centrifugation
Identification
and quantitation
Separation by LC
co
lum
n
2-Analysis of the samples
4°C
-80°C
1-Preparation of the samples
Quenching and extraction of the
metabolites
Cold m
ethanol
Quenching and extraction of the
metabolites
Cold m
ethanol
Saponin lysisSaponin lysis
Separation of
parasites from
RBC by
centrifugation
Separation of
parasites from
RBC by
centrifugation
Identification
and quantitation
Identification
and quantitation
Separation by LC
co
lum
n
2-Analysis of the samples
Separation by LC
co
lum
n
2-Analysis of the samples2-Analysis of the samples
4°C4°C
-80°C-80°C
59
OJ6
Etude non ciblée d’empreintes métaboliques de tumeurs mammaires analysées
sur une plateforme UHPLC-QqToF Sandra Coronado
1,2, Agneta Kiss
1, Aurélie Fildier
1, Charlène Pouech
1, Audrey Buleté
1, Arnaud
Vigneron2, Cécile Cren
1
1Equipe TRACES, ISA UMR 5280, 5 rue de la Doua, Villeurbanne, France
2Inserm UMR 1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 28 rue Laennec, Lyon, France
Le stress oncogénique à l’origine de l’initiation tumorale entraîne un changement important des voies centrales du métabolisme du carbone et de l’azote. L’équipe de recherche du Centre de recherche en cancérologie de Lyon, en partenariat avec l’Institut des Sciences Analytiques de Villeurbanne s’intéresse à la caractérisation métabolique de deux sous-types (basal-A et basal-B) de tumeurs mammaires agressives présentant une faible réponse thérapeutique. Pour ce faire, nous avons développé une stratégie de type métabolomique sur une plateforme UHPLC-QqToF. Cette étude a été réalisée à partir de 4 échantillons de tumeurs mammaires (et leur duplicatas) de taille et poids différents maintenues ex-vivo en souris athymic. Aucune information concernant l’extraction chirurgicale, les traitements médicamenteux suivis par les malades et la traçabilité des tumeurs n’est connue. Avant l’analyse, les tumeurs ont été congelées à l’azote, lyophilisées et broyées afin de procéder à une extraction solide-liquide de type QuEChERS sur des fractions de même poids de chaque tumeur. L’analyse UHPLC-QqToF a été effectuée en mode d’ionisation positif et négatif. Les empreintes métaboliques ainsi obtenues ont été ensuite analysées par des méthodes chimiométriques univariées et multivariées (Analyse en Composantes Principales) dans le but de mettre en évidence des profils discriminants et de classifier les échantillons. Les performances techniques de la plateforme analytique utilisée ont conduit à l’obtention d’empreintes métaboliques riches en information et très qualitatives. L’analyse des profils d’intensité des composés sélectionnés nous a permis de discriminer les tumeurs et de mettre en évidence 3 types qui correspondraient au type basal-A, basal-B et à un type cellulaire hybride A et B. Ensuite, en utilisant un générateur de formules brutes et des outils d’interrogation de bases de données plusieurs composés ont pu être annotés. Les composés discriminants ont des valeurs m/z comprises entre 100 et 900 Da. Les temps de rétention variés obtenus indiquent la présence de quelques composés polaires et surtout d’un grand nombre de composés apolaires correspondant aux lipides du tissu mammaire. On envisage de réaliser un protocole d’extraction qui permettrait d’affiner la recherche en composés polaires. En complément de cette étude, on s’intéressera à la recherche ciblée et à la quantification des métabolites pertinents du point de vue cancérologique sur une plateforme UHPLC-QqQ. Mots-clés : métabolomique, UHPLC-QqToF, caractérisation métabolique de de tumeurs mammaires
60
OJ7
Untargeted metabolomics approach for the urine analysis of autistic patients using LC-HRMS, 1H-NMR and 1H-13C-HSQC NMR.
Binta Diémé
1,2, Sylvie Mavel
1,2, Hélène Blasco
1,2,3, Cinzia Bocca
2, Frédéric Montigny
2,
Frédérique Bonnet-Brilhault1,2,3
, Catherine Barthélémy1,2,3
, Gabriele Tripi3,4
, Christian R Andres1,2,3
, Lydie Nadal-Desbarats
1,2,3, Patrick Emond
1,2,3
1-Inserm U930, Tours, France 2-Université François-Rabelais, Tours, France
3-CHRU de Tours, Tours, France 4-Université de Palermo, Italie
During the latest decades apparent prevalence of Autism has grown and was estimated in 2012 at around 1/110 worldwide. Metabolomics is a promising approach to access biomarkers helpful for the diagnosis or for the pathogenesis understanding of a disease.
Objectives are (i) to compare urine metabolic signatures of autistic patients to normal controls using analytical multimodality platforms and (ii) to identify discriminant metabolites potentially involved in the autism physiopathology.
Urine samples were collected from 29 autistic children and 33 age and sex-matched controls children. Based on data from Liquid Chromatography coupled to High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS), proton Nuclear Magnetic Resonance (
1H-NMR), and Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy (2D
1H-
13C HSQC NMR), we performed a multivariate data analysis (OPLS-DA).
OPLS-DA model obtained with combined data from the three analytical platforms showed enhanced performance compared to models obtained from single analytical platform and is able to classify correctly autistic patients in the internal validation step (R2Y=0.93, Q2=0.77, CVanova=1,24.10
-14). The predictive
abilities of the model indicate the robustness of this combined approach using. This model used 71 features and 28 compounds are currently under identification. GABA, threonine, serine, glutamine, dopamine, tyrosine were found significantly altered between the two groups.
Results from this urinary screening by LC-MS and NMR spectroscopies (1D and 2D) indicate that a metabolomics approach based on complementary analytical methods may be considered as a promising tool to develop for the autism diagnosis and its pathogenesis understanding.
61
OJ8
Communications Etudiants Master Amiens
EM1
Etude bibliographique : métabolomique et graines
Marie-Aude Tribalat
Université de Nice Sophia Antipolis, Institut de Chimie de Nice, UMR 7272 Processus Chimiques et Radiochimiques dans
l'Environnement, Campus Valrose, 28 avenue Valrose, 06108 Nice cedex 2. [email protected]
EM2
La métabolomique dans le cursus pharmaceutique à l'Université de Picardie Jules Verne
Olivier Varennes
Biologie des Plantes et Innovation (BIOPI) EA3900, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens.
EM3
Métabolomique et agro-ressources à l'Université de Picardie Jules Verne
Sylvain Lecomte
Biologie des Plantes et Innovation (BIOPI) EA3900, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens. Linéa - Semences de Lin, 60210 Grandvilliers, France
62
Communications Flashs
F1-P1
Metabolic profile of limbic brain structures in microtubule-associated proteins MAP6 Knockdown mice
Fauvelle F.
1,2,3, Andrieux, A.
1, 4, Deloulme J.C.
1, Gory-Fauré S.
1
1- GIN Grenoble Institut des Neurosciences, INSERM U836/UJF/CHU/CEA, F-38000 Grenoble, France
2- MRI facility, IRMaGe, INSERM US17/UJF/CHU/CEA, F-38000 Grenoble, France 3- IRBA, EBR Department, NMR laboratory, F-91000 Bretigny sur Orge, France
4- CEA, iRTSV-GPC, F-38000 Grenoble, France
Context: Regulation of microtubule dynamics is crucial for axonal growth and guidance during the establishment of neuronal connectivity patterns. Among microtubule associated- proteins (MAPs), MAP6 (STOP) plays an essential role in microtubule stabilisation. Interestingly, MAP6 knockdown mice (MAP6 KO) displayed severe behavioural disorders associated with strong synaptic plasticity impairments, alterations in many neurotransmission systems, reduction of dendritic spines and defects of neuronal tracts belonging to the limbic system1. Behavioural alterations included locomotor activity, a severe social withdrawal, defective sensori-motor gating and cognitive deficits. Most of these behavioural alterations exhibited by MAP6 KO mice, which were evocative of schizophrenia related symptoms, are alleviated by long-term treatments with antipsychotics
1, 2.
However, the origin and the exact cellular and molecular mechanisms of these defects are still unclear. NMR-based metabolomic has a high potential in evaluating neurodegenerative disease, included psychiatric disorders, with respect to therapeutic intervention.
3,4,5
Objectives: In this study, we aimed to evaluate if the behavioural and biological disorders observed in MAP KO mice could be associated to altered brain metabolic profiles using ex vivo
1H HRMAS MRS. Metabolic
profiles of two limbic structures, the hippocampus and the prefrontal cortex, and the cerebellum of MAP6 KO mice were compared to wild type mice (WT). Methods: All experiments were performed on a C57Bl6/129 SvPas-F1 genetic background. All experiments were conducted on female WT (n=10) and MAP6 KO (n=11) littermate mice at 3 months of age. After decapitation, brain was removed and hippocampus (divided in ventral and dorsal), frontal cortex, cerebellum were rapidly dissected out and frozen in liquid nitrogen.
1H HRMAS NMR spectra of 10 mg biopsies were
acquired at 9.4 T using a CPMG pulse sequence and 4 KHz spinning rate. Quantification was performed using the jMRUI software package (http://www.mrui.uab.es/mrui/) that involves a simulated database. A number of 19 metabolites could be quantified: acetate, alanine, ascorbate, aspartate, choline, g-aminobutyric acid (GABA), glutamate, glutamine, glutathione, glycerophosphocholine, glycine, lactate, myo-inositol, N-acetylaspartate, phosphocholine, phosphocreatine, phosphoethanolamine, scyllo-inositol and taurine. PCA and OPLS-DA were performed using SIMCA v13 and quantified data as X variables for multivariate statistical analysis, and student tests for univariate statistical analysis. Results: Data were highly reproducible, both in WT and KO groups. This allowed highlighting several metabolic perturbations in all brain structures of KO mice. Ventral hippocampus was mainly impacted with increased glutamine, taurine and ascorbate and decreased GABA and myo-inositol. Dorsal hippocampus showed the same feature excluded ascorbate and GABA which did not vary. Conclusion: Weak but highly significant metabolic variations have been observed in all brain areas of KO mice relative to wild mice. The relevance of these results has now to be addressed, especially for the study of new treatments that are under investigation.
Références bibliographiques 1 - Andrieux et al. 2002. Genes Dev 16, 2350-2364 2 - Fournet et al. 2012..J Neurochem. 123, 982-996 3- Holmes et al. 2006. NeuroRx 3, 358-72. 4- McLoughlin et al. 2009. J. Prot. Res. 8, 1943-1952. 5- Fauvelle et al. 2012. J. Prot. Res 267, 99–111.
Mots-clés: 1H-RMN HRMAS, OPLS-DA, schizophrenia, microtubule
63
F2-P2
Evaluation de la précision et de la justesse de méthodes RMN 2D pour la
quantification d’isotopomères
Christophe Thibaudeau, Myriam Amari, Isabelle Gosselin et Albrecht Roscher
Unité Génie Enzymatique et Cellulaire FRE-CNRS 3580, Université de Picardie Jules Verne, Amiens, France
Nous avons évalué la précision et la justesse de trois méthodes RMN d’analyse quantitative, i.e. [1H,
1H]-ZQF-TOCSY, JRES et [
13C,
1H]-HSQC, habituellement utilisées pour déterminer les populations
d’isotopomères au sein de mélanges de métabolites marqués au 13
C. Les populations des cumomères auxquelles ces méthodes donnent accès sont nécessaires pour déterminer des flux métaboliques intracellulaires. Les méthodes RMN ont été évaluées à l’aide d’un échantillon de glucose marqué au
13C de
composition isotopomérique connue. (a) Par rapport à la séquence ZQF-TOCSY proposée dans la littérature [1], nous avons conservé les couplages
13C,
1H dans la dimension indirecte [2] et analysé l’effet de la durée du spinlock sur les cumomères
observables. Nous avons en particulier analysé l’effet de la relaxation différentielle sur la justesse des populations obtenues. (b) Pour la séquence JRES [3], nous avons analysé l’apport réel du filtre ZQF et de sa durée, ainsi que l’effet du découplage
13C sur les populations d’isotopomères.
(c) Nous avons enfin évalué justesse et précision des populations obtenues avec une [
13C,
1H]-HSQC [4].
Ces travaux ont permis de formuler des recommandations relatives aux conditions expérimentales optimales d’implémentation de chacune de ces méthodes, et d’évaluer l’erreur systématique des populations calculées, qui peut à son tour être prise en compte dans le cadre de calculs de flux métaboliques. Références bibliographiques [1] Massou, S. et al. Phytochemistry 2007, 68, 2330–2340; Massou, S. et al. Metabolic Engineering 2007, 9, 252–257. [2] Lane, A.N. and Fan, T. W.-M. Metabolomics 2007, 3, 79-86 [3] Cahoreau, E. et al. Analytical Biochemistry 2012, 427, 158–163 [4] (a) Szyperski, T. et al. Journal of Biomolecular NMR 1992, 2, 323-334; (b) Nargund, S. et al. Hal S. Alper (ed.), Systems Metabolic
Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 985, pp 335-351.
Mots-clés RMN 2D quantitative, fluxomique, isotopomères, relaxation
64
F3-P3
ACD/Labs
Urinary metabolic profiling of rats treated with curcumin using HPLC-MS
Matteo Stocchero
1, Stefano Dall’Acqua
2, Elisabetta Schievano
3
1 S-IN Soluzioni Informatiche, Via G. Ferrari 14, 36100, Vicenza, Italy
2 Dipartimento di Scienze del Farmaco, Università di Padova, Via Marzolo, 5, 35131, Italy 3 Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova, Via Marzolo, 1, 35131, Italy
Many epidemiological studies have shown the relationship between good dietary habits and reduced disease risk, indicating the strong impact of food and nutrition on health. Curcumin is one of the most used plant-derived extract to obtain nutraceuticals having antioxidant activity [1,2]. In our study we investigated the changes in urinary composition due to the 25 days oral administration of 80 mg/Kg of dried powder extract to 12 healthy rats by untargeted metabolomics based on HPLC-MS. Untargeted metabolomics usually produces large and complex data sets that can be treated only by using suitable tools [3]. Computer-assisted analysis of LC-MS data sets is possible and actually capable of performing most of the routine analyses. Untargeted metabolomics based on HPLC-MS can benefit from these tools. In this study we show how ACD/IntelliXtract (Advanced Chemistry Development, Inc.) can be used for performing data-pre-treatment in order to obtain raw data componentization and focus the data analysis process on real metabolites. ACD/IntelliXtract is able to remove noise, identify possible neutral losses, evaluate isotope patterns, check
12C/
13C ratios, determine
the molecular weight of different chromatographic components, examine adducts and multimer ions. The data alignment process is discussed and an automatic workflow to produce data sets to submit to statistical data analysis is presented. Also, a new approach based on Projections to Latent Structures (PLS) and orthogonal post-transformation is proposed in order to include the design of the experiment in the data modelling. It is a natural extension of PLS where the total data variation is decomposed into a block related to the treatment and ageing effects and another block uncorrelated to the former by taking into account the design matrix. In this way, we were able to observe a clear difference between the behaviour on time of the metabolic content of the urines collected for treated rats and controls. In our preliminary data analysis we identified interesting metabolites responsible of differentiation of rats.
Références bibliographiques [1] B.B. Aggarwal et al. International Journal of Biochemistry and Cell Biology 41 (2009) 40-59 [2] S.K. Gupta et al. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 27 (2011) 123-130 [3] M. Comisso et al. Computational and Structural Biotechnology Journal 4 (2013)
Mots-clés Longitudinal study, untargeted metabolomics, data extraction
65
F4-P4
NMR metabolomics in young endurance horses
Margaux Luck1, Nadia Bouchemal
2, Mohamed N. Triba
2, Céline Robert
3,4, Eric Barrey
1,3,
Laurence Le Moyec1
1 Unité de Biologie Intégrative et Adaptation à l’Exercice, Inserm U902, Université d’Evry Val D’essonne, Bd François Mitterrand, 91025
Evry, France 2 Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France
3 Génétique Animale et Biologie Intégrative, UMR1313, INRA, 78350 Jouy-en-Josas, France 4 Université Paris Est, École Nationale Vétérinaire d’Alfort, 94704 Maisons-Alfort cedex, France
Despite the constantly evolving knowledge of horse physiology and metabolism during endurance exercises many horses exhibit serious metabolic disorders during the competitions. The growing popularity of this sport increases the demand for evidence-based data in order to ensure a correct management of the athletes’ horses protecting their health and welfare. The first aim was to construct a global view of the metabolome of young horses specializing in endurance during competitive events and in particular to evaluate the effects of long endurance exercise. The second aim was to evaluate the relationships between metabolic profiles and performances.The plasma profiles of the horses were obtained using NOESY and CPMG 1D
1H-NMR
spectroscopy and statistical multivariate analysis on plasma. These methods are well adapted to simultaneously investigate most of the metabolic modifications that occur during endurance races. The plasmas were obtained before exercise (BE) and post exercise (PE) from 160 horses competing in the 6 years old national finals of young horses endurance riding at Uzes (France) between 2011 and 2013. These finals were run in 3 phases of 30 km. At the end of each phase, the competitors were submitted to a veterinary inspection designed to check the health of the horses. Any horse with metabolic or orthopedic disorders was eliminated. Biochemical assays were also performed on the samples. The proton NMR spectra were compared using the supervised orthogonal projection on latent structure (O-PLS) method according to several factors. Among these factors, the effect of the race exercise (sample BE vs PE of same horse) was highly discriminating in unpaired and paired (BE, PE) spectra. This last result was confirmed by the projection of unpaired spectra (only BE or PE sample of different horses). The metabolic profiles showed that protein, energetic and carbohydrates metabolisms are highly affected by the long endurance exercise. Between NOESY and CPMG spectra differences were observed notably in the detection of aromatic amino acids. As a conclusion, the metabolomic profiles of plasmas taken before and after the race provided a better understanding of the high-energy demand notably concerning carbohydrate and protein catabolism pathways that could expose the young horses to metabolic disorders. Moreover, these metabolites are different from those observed in older horses with more training and experience. Référence bibliographique Le Moyec L, Robert C, Triba MN, Billat VL, Mata X, Schibler L, Barrey E (2014) Protein catabolism and high lipid metabolism associated
with long-distance exercise are revealed by plasma NMR metabolomics in endurance horses. To be published 21 March 2014 in PlosOne.
Mots-clés horses, plasma, endurance,1H NMR
66
F5-P5
La Métabolomique appliquée à l’étude d’un stress thermique sur le corail scléractiniaire Stylophora pistillata
Fahoullia MOHAMADI
1, Isabelle BONNARD
1, Mélanie BONHOMME
1,2, Alexandre MERCIERE
1,
Patrick MASANET2, Florence NICOLE
3, Cédric BERTRAND
1, Bernard BANAIGS
1.
1 CRIOBE – USR CNRS – EPHE – UPVD 3278 , Université de Perpignan Via Domitia, 58 avenue Paul Alduy, 66860 Perpignan Cedex,
France. 2 Aquarium de Canet-en-Roussillon, 2 Boulevard de la Jetée, 66140 Canet-en-Roussillon Cedex, France.
3 Laboratoire de Biotechnologies Végétales appliquées aux Plantes Aromatiques et Médicinales (LBVPAM) – EA 3061. Université Jean Monnet, 23 rue Dr Paul Michelon, 42023 Saint-Etienne Cedex 2, France.
Les perturbations environnementales de ces vingt dernières années sont à l’origine d’un phénomène de plus en plus fréquent qui menace l’ensemble des écosystèmes coralliens : le blanchissement des coraux. Ce phénomène est la conséquence de la rupture de la symbiose corallienne [Symbiodinium-polype]
1,2. A ce jour
plus de 50 % des récifs ont été fortement impactés. C’est un phénomène global qui touche tous les récifs et qui demeure mal compris du fait de sa complexité
3.
Nous avons simulé, en aquarium, un épisode de stress thermique sur le corail scléractiniaire Stylophora pistillata. La complexité du modèle d’étude, l’holobionte corallien
4, et le manque d’information disponible sur
le métabolome des coraux durs nous a amenés à considérer la portion la plus large possible de ce dernier 5,6
. Ainsi les empreintes métaboliques (extraits hydroalcoolique et organique) de S. pistillata ont été enregistrées par LC-MS tout au long de la montée en température. Après traitement par XCMS, les profils métaboliques ont été analysés à l’aide de plusieurs outils statistiques (ACP, PLS-DA). Les résultats préliminaires obtenus montrent une discrimination des populations avec la montée en température à un stade relativement précoce. Les variables les plus discriminantes ont été mises en évidence. Références bibliographiques (1) Wooldridge, S. A. Bioessays 2010, 32, 615–625. (2) Wooldridge, S. A. Mar. Freshw. Res. 2009, 60, 483–496. (3) Leggat, W.; Seneca, F.; Wasmund, K.; Ukani, L.; Yellowlees, D.; Ainsworth, T. D. PLoS One 2011, 6. (4) Rohwer, F.; Seguritan, V.; Azam, F.; Knowlton, N. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 2002, 243, 1–10. (5) Doerfler, H.; Lyon, D.; Naegele, T.; Sun, X.; Fragner, L.; Hadacek, F.; Egelhofer, V.; Weckwerth, W. Metabolomics 2013, 9, 564–574. (6) Mohamadi, F.; Bonnard, I.; Bertrand, C.; Nicolé, F.; Wecker, P.; Berteaux-Lecellier, V.; Ferrier-Pagès, C.; Guitton, Y., Banaigs, B.
Ana.l Chem., en préparation.
Mots-clés corail scléractiniaire, Stylophora pistillata, stress thermique, métabolome, LC-MS
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F6
Waters
David Lascoux
F7
Agilent Technologies
Les nouveaux systèmes RMN Agilent.
Michele Zani
Agilent, Les Ullis, France
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F8-P8
NMR based Metabolomics for the diagnosis of thyroid cancer
Lamya Rezig
1, Laetitia Shintu
1, Liborio Torregrossa*, Clara Ugolini*, Fulvio Basolo*, Paolo Miccoli*,
Stefano Caldarelli1
1 Aix Marseille Université, Centrale Marseille, CNRS, iSm2 UMR 7313, 13397, Marseille, France
* Department of Surgery, Division of Pathology, University of Pisa ,56100 Pisa , Italy
The cytological analysis of thyroid lesions, using ultra-sound guided fine-needle aspiration (FNA) technique, enables the clinicians to classify about 60% of all specimens as benign and 5-10% as malignant, i.e. requiring surgical excision [1]. However, for the remaining 10-30% of the thyroid nodules, the cytological analysis leads to an “indeterminate” diagnosis. In those cases, clinicians usually recommend surgical excision for a definitive histological diagnosis, revealing that 85% of these lesions are benign and that surgery was unnecessary for these patients. In a previous study, we showed that
1H HRMAS NMR-based Metabolomics [2] analysis of thyroid biopsies
was able to distinguish benign from malignant thyroid tumors with 77% of prediction efficiency [3,4]. In this presentation, we used Metabolomics to analyze fine-needle aspiration biopsies (FNAB) from patients with benign, malignant or indeterminate tumors. Indeed, these samples, collectable using non-invasive techniques, are commonly taken during the first consultations of the patients and could help in elaborating a pre-operative diagnosis. We show here that the statistical analysis of FNAB led to discrimination between benign and malignant groups. Markers, such as myo-inositol, scyllo-inositol and citrate were shown to be in lower concentration in malignant tumors compared to benign lesions. We demonstrated that this method could help the clinicians in making decisions during pre-operative consultations. Références bibliographiques 1. Mazzaferri E. L. Management of a solitary thyroid nodule. N Engl J Med 1993, 328 (8), 553-9 2. Nicholson J.K., Lindon J.C. Metabonomics. Nature 455, 1054-1056 (23 October 2008) 3. Torregrossa L., Shintu L., Nambiath Chandran J., Tintaru A., Ugolini C., Magalhães A, Basolo F., Miccoli P., Caldarelli S. Toward the
Reliable Diagnosis of Indeterminate Thyroid Lesions: A HRMAS NMR-Based Metabolomics Case of Study. J Proteome Res. 2012, 4. Miccoli, P.,Torregrossa L., Shintu L., et al. Surgery 2012, 152(6):1118-1124
Mots-clés Metabolomics, HRMAS, cancer
69
F9
Chenomx Inc.
Quantitative NMR software for metabolomics.
Neil Taylor
Chenomx 4350, 10230 Jasper Ave.,
Edmonton, AB, Canada T5J 4P6
www.chenomx.com
Chenomx Inc. was one of the first companies to offer software for NMR-based metabolomics. Chenomx continues its innovation in the analysis of NMR spectra for easy, fast and accurate quantitative results and has been described as the gold standard for NMR metabolomics software.
70
F10-P10
ProbMetab: an R package for Bayesian probabilistic annotation of LC-MS based metabolomics
Ricardo R. Silva
1, Fabien Jourdan
2,3*, Diego M. Salvanha
1,4, Fabien Letisse
2,3,5*, Emilien L. Jamin
2,3*,
Simone Guidetti-Gonzalez6, Carlos A. Labate
6,7 and Ricardo Z.N. Vêncio
1
1 LabPIB, Department of Computing and Mathematics FFCLRP-USP, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, Brazil
2 INRA UMR1331, Toxalim, Research Centre in Food Toxicology, Toulouse, France 3 Université de Toulouse, INSA, UPS, INP; LISBP, Toulouse, France
4 Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, USA 5 CNRS, UMR5504, Toulouse, France
6 Department of Genetics ESALQ-USP, University of Sao Paulo, Piracicaba, Brazil 7 Laboratorio Nacional de Ciencia e Tecnologia do Bioetanol CTBE, Campinas, Brazil
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
We will present ProbMetab, an R package which promotes substantial improvement in automatic probabilistic LC-MS based metabolome annotation. The inference engine core is based on a Bayesian model implemented to: (i) allow diverse source of experimental data and metadata to be systematically incorporated into the model with alternative ways to calculate the likelihood function and; (ii) allow sensitive selection of biologically meaningful biochemical reactions databases as Dirichlet-categorical prior distribution. Additionally, to ensure result interpretation by system biologists, we display the annotation in a network where observed mass peaks are connected if their candidate metabolites are substrate/product of known biochemical reactions. This graph can be overlaid with other graph-based analysis, such as partial correlation networks, in a visualization scheme exported to Cytoscape, with web and stand alone versions. ProbMetab was implemented in a modular fashion to fit together with established upstream (xcms, CAMERA, AStream, mzMatch.R, etc) and downstream R package tools (GeneNet, RCytoscape, DiffCorr, etc). ProbMetab, along with extensive documentation and case studies, is freely available under GNU license at: http://labpib.fmrp.usp.br/methods/probmetab/ During this talk the following points will be discussed:
Metabolome boundaries o What is the extension of our knowledge about the metabolome? o The sampling limitations of experimental techniques. o The extension of metabolite databases. o The perspective for new knowledge databases.
From data to knowledge o Main analysis strategies and its contextualization in terms of informational incorporation. o The status of metabolomics preprocessing. o Sources of information on data from a single experiment. o Accounting for expert knowledge on the analysis. o Data integration;
Extending ProbMetab o Briefly working tour explaining the ideas behind the modeling, the main tool features and the
work in progress to its extension. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés LC-MS, metabolite identification, Bayesian method
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F11-P11
TARGETING THE HALOGENATED METABOLOME OF MARINE-DERIVED FUNGI
USING LC-HRMS/MS TOOLS
Catherine Roullier, Yann Guitton, Olivier Grovel, Yves-François Pouchus
University of Nantes, Faculty of Pharmacy, MMS, 44000 Nantes, France
Halogenated compounds are usually regarded as good leads for drug discovery and have provided numerous valuable therapeutic agents. When studying the drugs that have been released to the market over the past 30 years, it appears that more than 15% of them present one or more halogen atoms in their structure, not even taking into account all the halogenated salts.
1 Many of them have been described from natural sources and
they are considered as biologically important metabolites.2 With the abundance of halogen salts in the marine
environment, it’s not surprising that many chlorinated and brominated compounds have been isolated from marine biota. However, turning to marine microorganisms such as fungi and considering the widely studied fungal genus Penicillium, not more than 15 chlorinated compounds have been reported yet.
3 All these
compounds presented interesting biological activities such as the chlorinated sesquiterpene ligerin, which exhibited a selective antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity.
4
This research project aims at targeting the halogenated metabolome of marine-derived fungi, using tools from the metabolomic field. A collection of culture extracts obtained from several marine-derived fungal strains collected on the French Atlantic coast were then investigated by LC-HRMS/MS in order to prospect for halogenated compounds and to identify potentially original ones. To investigate the ability of the strains to produce such compounds, each one was cultured on different media, to elicitate the highest number of metabolic routes and then observe their most representative metabolome. To achieve a fast, automated and efficient data analysis, a bioinformatic tool named MeHaloCoA (Marine Halogenated Compound Analysis) was developed using R scripts. After extraction from the metabolic fingerprints of all the peaks and their associated mass spectra, a mathematical filter based on mass isotopic profiles allowed the selective detection of halogenated molecules. Integrating those scripts into a dereplication approach allowed the identification of known and new halogenated compounds in a challenging amount of time. Subsequent targeted purification and isolation of these last compounds led to the design of a nature-inspired halogenated compound library with an expected bioactive potential. Next to major compounds, this original approach also allowed the detection of trace, minor or transient compounds, which can easily be hidden on a chromatogram and could have been missed on a more traditional method. This investigation also gives some insight into the fungal halogen metabolism. Références bibliographiques 1 Newman, D. J., J. Nat. Prod., 2012, 75, 311-335. 2 Gribble, G. W., J. Chem. Educ., 2004, 81, 1441-1449. 3 The Dictionary of Natural Products online 21.2, 2013, CRC Press. 4 Vansteelandt, M., J. Nat. Prod., 2013, 76, 297–301.
Mots-clés : Halogented compounds, R script, Marine Fungi
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F12
Thermo
73
F13-P13
Metabolic indicators of olive oil ageing. Multiblock analysis by ACOMDIM treatment.
N. Dupuy, R. Korifi, Y. Le Dréau, C. Rebufa
Aix-Marseille Université, LISA EA4672, Equipe METICA, 13397 Marseille, France
The assurance of the stability and quality of olive oil is a matter for producers and consumers. The composition of triglycerides and phenols of olive oil depends among others parameters, of the cultivar and the maturity of olives (Velasco & Dobarganes, 2002; Galtier et al., 2007). They are also to be affected by the oxidation process which occurs during the storage of olive oil. Thus, to estimate the chemical oil quality, the International Olive Council (IOC), the European regulation and the International Organisation for Standardisation (ISO) recommend measuring quality indexes. Free Acidity (FA), (ISO 660, 2009) estimates the free fatty acids, which mainly result from hydrolysis of triglycerides. Peroxide value (PV) (ISO 3960, 2007), is often used to evaluate the degree of oxidation. K232 and K270 indexes (IOC T20-doc 19, 2010) measure respectively the conjugated dienes and trienes formed in oxidation process, from the hydroperoxides of unsaturated fatty acids and their oxidation products (Pristouri et al., 2010). The p-anisidine value (AV) (ISO 6885, 2006), provides a good estimation of aldehydes, main secondary oxidation compounds (Shahidi & Zhong, 2005). The total oxidation value (TOTOX = 2 PV + AV) gives a better estimation of the progressive oxidative deterioration of oils (Poulli et al., 2009). The fatty acid composition (IOC T20-doc 24, 2001) can be tracked by families of compounds (saturated fatty acids, mono unsaturated fatty acids and poly unsaturated fatty acids) (Casal et al., 2010). Phenolic compounds were also often quantified in olive oils (IOC T20-doc 29, 2009) to evaluate their anti-oxidant activity.
Samples of two olive oils (green type and black type) were stored for 24 months under different storage conditions determined using an experimental design to study all together the effects of the main factors (oxygen, light, storage temperature and storage time) that may affect the conservation of oils and the interactions between these different factors. These effects were determined from the monitoring of key quality indexes. To analyse these multivariate data, we propose to interpret the changes in the key quality indexes using AComDim to find variation in the data resulting from the effect of light exposure, oxygen supply storage temperature and storage time. Some recent work showed the efficiency of methods like AComDim for such studies (Bouveresse et al, 2011).The AComDim method is an extension of the ComDim method to study the effect of Factors and Interactions on data acquired according to an experimental design. The ComDim method allows a simultaneous study of several matrices with different variables describing the same samples. Each matrix presents a specific contribution to the definition of each dimension of a common space defined for all data tables. When the AComDim is used, the extracted Common Components (CCs) indicate if variations in the data result from different values relative to the change between two levels of a factor are significantly greater than the residual variability. The AComDim used in this study has shown that the most important factor in the conservation was the nature of the oil, then the presence of oxygen and storage time, with an interaction between these two factors. Références bibliographiques Bouveresse et al. 2011. Identification of significant factors by an extension of ANOVA-PCA based on multi-block analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 106,
173-182. Casal et al. 2010. Olive oil stability under deep-frying conditions. Food and Chemical Toxicology, 48, 2972-2979. Galtier et al. 2007. Geographic origins and compositions of virgin olive oils determinated by chemometric analysis of NIR spectra. Analytical Chimicta Acta, 595, 136-144. ISO (2009). Animal and vegetable fats and oils - Determination of acid value and acidity . ISO standard 660. International Organization for Standardization Geneva, Switzerland. ISO (2007). Animal and vegetable fats and oils - Determination of peroxide value- Iodometric (visual) endpoint determination. ISO standard 3960. International Organization for
Standardization Geneva, Switzerland. ISO (2006). Animal and vegetable fats and oils - Determination of anisidine va lue. ISO standard 6885. International Organization for Standardization Geneva, Switzerland. IOC (2010). Spectrophotometric investigation in the ultraviolet adopted by International Olive Council. IOC/T.20/Doc. no.19. IOC (2009). Determination of biophenols in olive oils by HPLC adopted by International Olive Council. IOC/T.20/Doc. no. 29. IOC (2001). Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil adopted by International Olive Council. IOC/T.20/Doc. no. 24. Poulli et al. 2009. Monitoring olive oil oxidation under thermal and UV stress through synchronous fluorescence spectroscopy and classical assays. Food Chemistry, 117, 499-503. Pristouri et al. 2010. Effect of packaging material headspace, oxygen and light transmission, temperature and storage time on quality characteristics of extra virgin olive oil. Food
Control, 21, 412-418. Shahidi and Zhong. 2005. Lipid Oxidation: Measurement Methods. In F. Shahidi (Eds), Bailey’s Industrial Oil and Fat Products (pp. 357-385). John Wiley &Sons. Velasco and Dobarganes. 2002. Oxidative stability of virgin olive oil, European Journal of Lipid Science and Technology, 104, 661-676.
Mots-clés Olive Oil, ageing, ACOMDIM, Multiblock
74
F14-P14
Sphingolipidomique par spectrométrie de masse : approche basse résolution versus
haute résolution
Pauline LE FAOUDER1, Aude DUPUY
1, Gemma FABRIAS
2, Josefina CASAS
2, Nathalie
ANDRIEU-ABADIE3, Bruno SEGUI
3, Nicole THERVILLE
3, Stéphane CARPENTIER
3, Thierry LEVADE
3,
Justine BERTRAND-MICHEL1*
1 MetaToul-Lipidomique Inserm U1048, Toulouse 2 Department of Biomedicinal Chemistry, iQAC-CSIC, Barcelona
3 Inserm UMR 1037 CRCT, Toulouse * MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/.
Les altérations du métabolisme, et particulièrement du sphingolipidome, sont de mieux en mieux connues en cancérologie, cependant d’énormes progrès restent à accomplir pour apprécier, comprendre et éventuellement cibler à titre diagnostique ou thérapeutique les changements métaboliques des tumeurs
1.
Certains sphingolipides sont aujourd’hui reconnus comme des régulateurs clés du développement tumoral, il est donc essentiel de pouvoir quantifier leurs variations dans des microéchantillons. L’analyse de cette famille lipidique est complexe car elle renferme des structures très diverses, une large gamme de quantités, et peu de standards commerciaux sont disponibles... Il est donc très délicat d’obtenir le sphingolipidome dans son ensemble avec une seule méthode
2. Nous présenterons ici les avantages et inconvénients des différentes
approches utilisées en spectrométrie de masse haute (Exactive) ou basse (triple quadripôle) résolution appliquées à diverses matrices biologiques (plasma, rate, cerveau...). Ces analyses de sphingolipidomique permettront de définir quels événements clés sont associés à la croissance de cellules cancéreuses ou leucémiques, à leurs réponses/résistances aux traitements, et leurs degrés de malignité. De nouveaux biomarqueurs pourront alors être identifiés. (Les auteurs remercient l’ARC, l’Inserm et l’Université P. Sabatier et MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).pour leur soutien) Références bibliographiques 1 BALLEREAU et al, Alteration of ceramide 1-O-functionalization as a promising approach for cancer therapy, Anticancer Agents Med
Chem, 2012, 12(4):316-28. 2 HAYNES et al, Sphingolipidomics : Methods for the comprehensive analysis of sphingolipids, J. Chrom. B Analyt. Technol. Biomed. Life
Sci. 2009, 877(26):2696-708.
Mots-clés Spectrométrie de masse, Sphingolipide, Lipidomique, Quantification, Cancer
75
F15
Bruker
76
Communications Posters
P16
ThalassOMICS: plateau technique d'analyse métabolomique dédié aux micro-organismes marins eucaryotes (micro-algues et micromycètes)
Yann GUITTON
Laboratoire Mer Molécules Santé, Université de NantesLaboratoire Phycotoxines, IFREMER-Centre Atlantique Laboratoire Physiologie
et Biotechnologie des Algues, IFREMER-Centre Atlantique
L’analyse métabolomique de la chimiodiversité marine pour la recherche de nouvelles molécules d’intérêt et l’utilisation d’éco-ressources renouvelables (micro-organismes cultivables en laboratoire à partir de collections) est un enjeu majeur des recherches futures sur les substances naturelles bioactives. Le plateau ThalassOMICS représente un engagement fort de la part des partenaires impliqués de vouloir mutualiser les outils analytiques performants, ainsi que les compétences des chercheurs biochimistes, chimistes et écophysiologistes d’IFREMER (PHYC, PBA) avec celles des chimistes et microbiologistes du laboratoire MMS-Université de Nantes, en vue de se positionner en tant qu’acteur majeur dans ce domaine actuellement peu représenté en France. En effet, ThalassOMICS, premier plateau technique de la Fédération de Recherche CNRS 3473 IUML (Institut Universitaire Mer et Littoral), dispose d’une expertise dans le domaine de la métabolomique de ces micro-organismes marins, en particulier les microalgues (toxiques et non toxiques) et les micromycètes. Outre son potentiel analytique, ThalassOMICS apporte par son expertise dans le domaine des micro-organismes marins eucaryotes, un complément aux thématiques couvertes par les structures existantes. Les savoir-faire du plateau technique ThalassOMICS s’articulent autour des axes suivants :
Caractériser les micro-organismes marins eucaryotes par la description de leur métabolome (chimiotaxonomie).
Détecter les métabolites de micro-algues et de micromycètes afin de pouvoir mettre en évidence le potentiel de production de molécule d’intérêt par les organismes étudiés ainsi que le danger potentiel qu’ils peuvent représenter en termes sanitaires pour la valorisation des produits de la mer.
Annoter les métabolomes des organismes étudiés pour la déréplication des composés connus afin d’optimiser la détection de composés originaux.
Contribuer à la compréhension de la biodiversité marine à travers la diversité chimique des organismes marins.
Répondre aux besoins des industriels quant à la valorisation des molécules marines (entreprises pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaire à base de produits de la mer …) et à la préparation des dossiers administratifs nécessitant un volet analytique.
De plus, ThalassOMICS est également un lieu de formation pour les étudiants en formation initiale (Masters, Doctorants,…) et pour des professionnels en formation continue (industriels, chercheurs, ingénieurs…) qui souhaitent s’initier ou approfondir leurs connaissances en métabolomique. Mots-clés métabolomique, micro-organismes marins eucaryotes
77
P17
Combining MSMS fragmentation, correlation and biochemical reaction networks to improve compound annotation.
Ricardo Silva
1‡, Yann Guitton
2,4‡, Elodie Blanchet
2,3, Marieke Vansteelandt
2,
Catherine Roullier2, Yves François Pouchus
2 and Olivier Grovel
2
1 Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintéticos, Department of Physics and Chemistry, Faculty of Pharmaceutical
Sciences, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil. 2 Faculty of Pharmacy, University of Nantes, F-44035 Nantes, France;
3 ATLANTHERA, 1 rue Gaston Veil, F-44000 Nantes, France; 4 IFREMER, F-44311, Nantes, France ‡These authors contributed equally.
Natural resources, including those from marine environment have the advantage of providing a wide range of structurally different molecules. Fungi belonging to the genus are known to produce many bioactive metabolites from which many are still unknown. Here, a strategy to combine independent experimental information was proposed to improve compound annotation, allowing bioactive metabolite screening. To illustrate this strategy, four marine-derived strains of a new Penicillium have been studied in order to describe their metabolome. They belong to the same new species (P. ligerum) and exhibits clear morphotypic differences linked with biological activities of their culture extracts. A former study of that specie has led to the isolation of ligerin. This chlorinated sesquiterpene derivative of fumagillin exhibited a specific antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity. For that reason, thorough investigations of their metabolic fingerprints have been conducted by LC-HRMS/MS. We have used in house R scripts to incorporate cosine similarity from MSMS data processed with XCMS2 to previous probability raking provided by ProbMetab package. The probability raking was built using KEGG fungi related compound merged to literature and in house Penicillium metabolites, previously described. The probability ranking and MSMS score were then merged with massbank hits and exported as an information overlaid network. The pathways showing the higher number of putative identities were automatically drawn with in house extensions of ProbMetab’s drawing algorithm. The workflow described here enhanced standard compound annotation, using independent experimental information in an informational overlaid graphical summary. It can potentially allow one to identify more compounds by merging previous known pathways such as KEGG_and MS/MS fragmentation, by compound substructure sharing. With the new proposed ProbMetab module we were able to map known biosynthesis pathways from fungi on our LC-MS/MS profiles and by doing so we emphasized interesting networks. As an example, the annotated fumagillin exact mass, was highly correlated to unknown compounds. This mass was also linked to compounds possible sharing substructures, as for example, the linkage to Floctafenic acid, a mass with MSMS with a 0.89 score from mass bank batch search. The simultaneous use of MS1 and MS2 for compound annotation showed to be promising, when information from protonated intact metabolites identities retrieved by exact mass are linked to MS2 similarity identities showing that most likely identifications can help to strength or rule out parallel identifications. This study shows the interest of LC-HRMS/MS analysis of the metabolome of marine-derived fungi for the rapid identification and then the targeted purification of original bioactive secondary metabolites in a chemical series.
Mots-clés
Metabolomic, Marine micro-organisms, natural products, secondary metabolites, LC-HRMS/MS, R,
ProbMetab, xcms, CAMERA
78
P18
Détermination de biomarqueurs de la vigueur germinative chez le colza (Brassica
napus) par profilage métabolique
L. Legoahec
1, G. Wagner
2, M-H. Wagner
3, D. Demilly
3, S. Ducournau
3, C. Dürr
4, K. Kibret
2,
S. Hatzig2, R. Snowdon
2, N. Nesi
1, A. Bouchereau
1
(1) UMR 1349 Institut de Génétique, Environnement et Protection des Plantes, INRA-Agrocampus Ouest-Université Rennes
1, BP 35327, 35650 Le Rheu, France (2) Department of Plant Breeding, IFZ Research Centre for Biosystems, Justus Liebig University, 35392 Giessen, Allemagne (3) GEVES Station Nationale d’Essais des Semences, BP 90024, 49071 Beaucouzé Cedex, France (4) UMR 1345 Institut de Recherche en Horticulture et Semences, INRA-Agrocampus Ouest-Université d’Angers, 49045
Angers Cedex, France
Le colza (Brassica napus) est la principale culture oléagineuse en France et en Europe. Dans de nombreuses zones de production de colza (en particulier en Europe de l’Est), la période entre la récolte des lots de semences et le semis est très réduite et oblige ainsi à utiliser des lots de report ( i.e. récoltés l’année n-1) pour les semis. Dans ces conditions, la vigueur germinative ainsi que le maintien de cette vigueur pendant la période de stockage sont des facteurs clés qui conditionnent la réussite de l’implantation de la culture. Dans le cadre du projet CONVIGOUR (ANR Plant KBBE), nous cherchons à identifier les facteurs génétiques et/ou environnementaux qui impactent la vigueur germinative des lots de graines de colza. En particulier, nous étudions l’effet de la composition de la graine sur sa vigueur germinative.Dans un premier temps, une collection d’accessions de colza à base génétique large a été phénotypée sur la plateforme Phenosem (GEVES-SNES) et des lignées présentant des vigueurs germinatives contrastées sur la base du taux de germination à 36 hrs (GR36, 20°C) ont été identifiées. Les accessions à faible vigueur présentent un GR36 < 52% et les accessions à vigueur élevée présentent un GR36 > 65%. Dans un second temps, les graines des accessions sélectionnées ont été mises à imbiber pendant différents temps (2, 12, 36, 72 heures) et des analyses métaboliques ont été réalisées (plateforme P2M2, INRA Rennes) sur les échantillons en ciblant un profilage des acides aminés libres et des sucres. Les résultats montrent de fortes corrélations entre la vigueur germinative et la teneur en certains sucres ou acides aminés, notamment le glucose et la proline respectivement. Le rôle de ces métabolites comme marqueurs potentiels de la vigueur germinative des graines de colza sera discuté.
Mots-clés
Brassica napus, vigueur germinative, profilage métabolique, acides aminés, sucres
79
P19
Suivi de l’empreinte métabolique urinaire durant les différentes colonisations microbiennes du rumen chez l’agneau
H. Boudra
a, M. Popova
a, Estelle Rathahao-Paris
b,c,d*, J.F Martin
e* & D. P. Morgavi
a
a INRA, UMRH1213 Herbivores, F-63122 Saint-Genès-Champanelle, France
b INRA, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France c AgroParisTech, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France
d CNAM, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France e INRA, UMR1331, Toxalim, F- 31027 Toulouse, France
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Le microbiote ruminal acquis à la naissance peut avoir un effet sur la relation hôte-microbes et sa fonction. Dans ce travail, nous avons exploré l’établissement de la flore microbienne en présence et absence de protozoaires et son influence sur l’empreinte métabolique urinaire. Quatre paires de jumeaux d’agneaux males ont été utilisées dans cette étude : Ils ont été maintenus dans le même environnement depuis leur naissance jusqu’à l’âge de 14 semaines (Période 1, P1). A l’âge de 15 semaines, ils ont été divisés en 2 lots avec un frère dans chaque lot, puis inoculés par voie orale avec du jus de rumen avec et sans protozoaires (P2). En semaine 21 (P3), tous les animaux ont reçu par voie orale pendant 4 semaines une dose quotidienne d’ochratoxine A de 30 µk/kg pv. Enfin, tous les agneaux ont été remis ensemble à partir de la semaine 27 (P4). Une analyse du microbiote ruminal par séquençage haut débit et une empreinte urinaire par LC/ESI-qTof ont été effectuées aux temps 14, 20, 26 et 31 semaines d’âge. La présence ou l’absence de protozoaires est primordiale dans l’établissement de la population microbienne notamment sa diversité. L’analyse multivariée des données obtenues par spectrométrie de masse a montré que les profils métaboliques urinaires ont été fortement influencés par l’inoculation en période 2. L’analyse en PLS-DA montre une séparation claire entre les 2 lots d’animaux (avec et sans protozoaires). La majorité des composés discriminants est impliquée dans les voies métaboliques des acides aminés et des protéines, et plusieurs d’entre eux sont communs aux 3 périodes. Cette discrimination entre les 2 lots d’animaux est restée « stable » après la colonisation par contact (P3) des animaux sans protozoaires, mais aussi après un stress extérieur en semaine 21. En revanche, la colonisation par contact en période 3 a effacé la différence des communautés microbiennes entre les 2 lots d’animaux, suggérant que la signature métabolique peut subsister au-delà des conditions physiologiques ou externes rencontrées durant la vie. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Microbiote ruminal, métabolomique, LC/ESI-qTof, Séquençage haut débit.
80
P20
Are you sure that your blackcurrants are not aronia berries?
E. Dubin1, A.-S. Dumas
1, M. Lees
1, E. Jamin
1, J. Ginet
1, D. N. Rutledge
2
1 Eurofins Analytics France, Rue Pierre Adolphe Bobierre, B.P. 42301, 44323 Nantes Cedex 3, France 2 AgroParisTech, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, 16 rue Claude Bernard, 75005 Paris, France
Over the last few years, several major food incidents of global importance, such as the melamine crisis, have clearly shown the limits of the current approach used for food analysis. At present routine food analyses are based on targeted methods and are not able to address novel fraud or adulteration issues or to tackle unlisted contaminations. Recently, new developments in analytical methods have raised the possibility of using non-targeted fingerprinting methods to ensure food and feed safety. The development of such non-targeted methods for several food commodities is the goal of the Agrifood GPS (Global Protection System) project, a 5-year project started in January 2012 with the financial support of the BPI (Banque Publique d’Investissement). AgriFood GPS aims to create an early warning system, which will highlight non-compliance or unwanted contamination and help food companies to make rapid decisions regarding the acceptance or rejection of a batch. The analytical methods developed are based on a metabolomics approach, initially developed in the health sector: using statistical tools, each new sample is compared with an existing database to check whether or not it falls within the range of the statistical model. If the sample is not compliant with the model, the method makes it possible to highlight markers responsible for its differentiation from the existing database. In this poster, an example of the application of non-targeted methods is presented with the detection of adulteration of blackcurrant concentrate with less expensive aronia berry concentrate. Using a “dilute and shoot” approach, aronia berry and blackcurrant concentrates were analysed using UPLC-TOF-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatography - Time of Flight - Mass Spectrometry). PCA (Principal Components Analysis) and ICA (Independent Components Analysis) analyses were able to differentiate them and to identify polyphenolic markers. The detection level of aronia berry concentrate in blackcurrant concentrate was also determined using the same analytical and statistical methods. Mots-clés UPLC-TOF-MS, non-targeted analysis, warning system, food safety, aronia berry, blackcurrant
81
P21
NMR Metabonomic Investigation of a E3N Matched Case-Control Breast Cancer Prospective Cohort
Elodie Jobard
1, 2, Laure Dossus
3,4, Olivier Trédan
2,
Bénédicte Elena-Herrmann1 and Françoise Clavel Chapelon
3,4
1 Université de Lyon, CNRS/ENS Lyon/UCB-Lyon-1, Institut des Sciences Analytiques, UMR5280, Centre de RMN à Très Hauts
Champs, Villeurbanne, France 2 Université de Lyon, Département d’oncologie médicale, Centre Léon Bérard, Lyon, France
3 INSERM, U1018, Centre for Research in Epidemiology and Population Health (CESP), “Nutrition, Hormones and Women’s Health” Team, Institut Gustave Roussy, F-94805, Villejuif, France
4 Université Paris Sud, UMR 1018, F-94807, Villejuif, France
E3N is an epidemiological cohort study that was initiated in 1990 to investigate factors associated with the most common types of cancer. It involves about 100,000 women living in France who were born between 1925 and 1950 and are covered by a national health insurance plan for teachers and co-workers. Many data were collected from these volunteers: participants completed self-questionnaires every 2 to 3 years on their lifestyle (diet, smoking habits, hormonal treatments, etc) and the evolution of their health. Biological data were also included with a collection of blood samples of 25,000 volunteers before diagnosis and stored for subsequent biological analysis
1. Currently, among 100,000 women in the E3N cohort, 5,455 validated cases
of breast cancer were identified, amongst which approximately 900 had given a blood sample. Using a case-control design, 794 breast cancer prospective cases with available plasma samples were identified and matched with an equal number of control subjects. 1H NMR (Nuclear Magnetic Resonance) investigation of this E3N breast cancer sub-cohort was carried out at
600 MHz on 1,588 plasma samples collected in citrated tubes at inclusion in the study, with the objective to identify early or etiologic biomarkers related to breast cancer occurrence. We present here the first results of the NMR metabonomic analysis. First, we compare technical and clinico-pathological data between cases and controls to exclude potential biases related to patient selection, using a descriptive statistical analysis. To detect true risk factors or early pathological changes for E3N volunteers, we investigate systematic sources of variation in the dataset, including technical parameters (collection center, time before centrifugation, storage time…) and biological factors (BMI, smoking status, menopausal status…) by means of the PC-PR2 method
2. PC-PCR2 results show that one of the main
sources of systematic variation in the E3N metabolomic dataset is related to the collection and preparation of the samples (collection centre, time before centrifugation and fasting status). We then investigate the metabolic discrimination between matched cases and controls from a stratified analysis, and apply conditional logistic regression models to estimate the associations between plasma metabolite concentrations and breast cancer risk. Références bibliographiques (1) Clavel-Chapelon, F. et al. Etude Epidémiologique auprès de femmes de líucation Nationale. Eur J Cancer Prev 1997, 6, 473–478. (2) Fages, A. et al.. Exploring systematic variation in epidemiological based metabolomic studies: the Principal Component Partial
R-square (PC-PR2) method, Metabolomics (in press).
Mots-clés NMR ; Breast Cancer ; Prospective Cohort; E3N
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P22
Targeted isolation of biomarkers highlighted by MS-based metabolomics in fungal co-cultures
Nadine Bohni
1, Olivier Schumpp
2, Florence Mehl
1, Sylvain Schnee
2, Samuel Bertrand
1,
Michel Monod3, Katia Gindro
2, Jean‑Luc Wolfender
1
1 School of Pharmaceutical Sciences, University of Lausanne, University of Geneva, Geneva, Switzerland
2 Mycology group, Agroscope Changins ACW, Nyon, Switzerland 3 Departement of Dermatology and Venereology, Laboratory of Mycology, CHUV, Lausanne, Switzerland
The prevalence of Fusarium spp. as causative agent of onychomycoses is rising and Fusarium spp. as well as other non-dermatophyte fungi appear to be insensitive to systemic standard treatment [1]. Hence, new antifungal agents active against Fusarium spp. are needed. The concept of microorganism co-culture, the combined growth of two or more microorganisms [2], was chosen to uncover possible anti-Fusarium compounds from the Basidiomycete Hohenbuehelia reniformis cultivated with human pathogenic Fusarium solani. The co-culture of both fungi on the same Petri dish strongly induced the release of red pigments in the growth medium and a distinct distance repulsion. A metabolomics study using UHPLC-TOFMS analyses proved to
be efficient to detect up‑regulation of several metabolites. On the other hand, the up‑regulation of pigments
could only be confirmed using a targeted UHPLC-UV analysis. In fact, these compounds were of low abundance in the fungal extract and due to their strong chromophore and weak ionisation, they were well evidenced by LC-UV (500 nm) but hardly detectable in LC-MS. Still, isolation of biomarkers (significant loadings highlighted by statistical analysis (OPLS-DA) of the UHPLC-TOFMS datasets) revealed to be difficult. In many cases, very minor constituents with good ionisability in MS were highlighted by multivariate data analysis but were difficult or impossible to isolate. In addition, extracts of the mycelium of fungi grown on agar contained mainly saccharides as confirmed by NMR. To get around this, prefractionation with the resin HP20SS was successfully applied to separate secondary metabolites from the saccharides that made up for ~70% of extract mass. Thus, ELSD – evaporative light scattering detection, a universal and quantitative detector for LC – was chosen to devise an isolation strategy to purify the biomarkers that are potential fungistatic or fungitoxic compounds that may be responsible for the repulsion observed when both H. reniformis and Fusarium spp. were co-cultivated [3]. This work discusses how to link results obtained from MS-based metabolomics (identification of biomarkers as MS features) and the targeted isolation of such biomarkers for de novo structure elucidation by NMR and assessment of biological activity. Références bibliographiques [1] Baudraz-Rosselet, F., Ruffieux, C., Lurati, M., Bontems, O. and Monod, M., Onychomycosis insensitive to systemic terbinafine and
azole treatments reveals non-dermatophyte moulds as infectious agents. Dermatology, 2010. 220(2): 164-168. [2] Bertrand, S., Bohni, N., Schnee, S., Schumpp, O., Gindro, K. and Wolfender, J.-L., Metabolite induction via microorganism co-culture:
a potential way to enhance chemical diversity for drug discovery. Biotechnology Advances, 2014: Accepted manuscript. [3] Bohni, N., Schumpp, O., Schnee, S., Bertrand, S., Gindro, K. and Wolfender, J.-L., Targeted isolation of induced and bioactive
metabolites from fungal co-cultures. Planta Medica, 2013. 79(13): SL41.
Mots-clés microorganisms, co-culture, metabolomics, OPLS-DA, isolation of natural products
83
P23
Rapid assesment of fish freshness and quality by 1H HRMAS NMR spectroscopy
C. Heude1,2
, E. Lemasson1, K. Elbayed
2, M. Piotto
1,2
1 Bruker BioSpin, Laboratoire d’application RMN, 34 rue de l’industrie, 67166 Wissembourg, France.
2 Strasbourg University, IMIS/ICube Laboratory, 67000 Strasbourg, France
Fresh fish is a product with a very short commercial life and its freshness has a considerable influence on its quality and its commercial value. In the present work, we present a new analytical method to determine fish freshness based on High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS)
1H NMR spectroscopy. The method
allows the reliable and fast determination of two well established indicators of fish freshness: the K-value and the concentration of TMA-N (trimethylamine nitrogen). The K-value is based on the breakdown cycle of ATP molecules in fish muscles after the death of the fish whereas TMA is produced by the enzymatic degradation of TMAO and is responsible for the typical odor of fish. HR-MAS
1H NMR experiments allow measuring
simultaneously the concentration of the different breakdown products of the ATP cycle required to compute the K-value and the concentration of TMAO/TMA molecules by simple integration of the signals on the spectrum. The method is demonstrated on four different species of fish (Sea bream, sea bass, trout and red mullet) stored on ice at 0°C. The results obtained are in full agreement with more cumbersome methods used classically to determine the K-value and the TMA-N concentration. The main advantage of the HR-MAS NMR method is to allow a direct measurement of these two quantities on unprocessed fish sample without using any preliminary extraction and allowing therefore a complete analysis time of 30 minutes per sample. Référence bibliographique Article soumis à FOOD CHEMISTRY le 03/03/2014
Mots-clés HR-MAS NMR, K-value, TMAO, TMA, Fish freshness, Fish quality, ATP breakdown products
84
P24
An advanced clustering approach for assessing the repeatability and statistical relevance of 2D-COSY spectra
Baptiste Feraud
1, Pascal de Tullio
2, Bernadette Govaerts
3, Michel Verleysen
4
1 Université Catholique de Louvain (UCL), Institute of Statistics (ISBA), Belgique
2 CIRM, Chimie Pharmaceutique, Université de Liège (Ulg), Belgique 3 Université Catholique de Louvain (UCL), Institute of Statistics (ISBA), Belgique
4 Université Catholique de Louvain (UCL), Machine Learning Group (MLG), Belgique
NMR techniques are widely used together with multivariate analysis approaches in order to characterize perturbations in metabolic pathways occurring during biological processes. A large amount of recent scientific and statistical works are available concerning 1D spectra (principally ¹H-NMR spectra). More recently, two-dimensional NMR spectroscopy techniques have been investigated: homonuclear (COSY) and heteronuclear ones (HSQC,…). It is commonly accepted by users (biologists, pharmacologists) that the recent introduction of 2D-NMR methods represents a huge qualitative gap for metabolomics investigations in terms of metabolites and biomarkers identifications. Indeed, it seems obvious that additional dimension means more predictive power. But, until now, no statistical study clearly proved this assumption. Therefore, a fundamental question is “Is supplementary information equivalent to relevant and crucial information ?”. In order to extend the statistical properties and tools developed for 1D spectroscopy to the new challenges raised by 2D spectra, a rigorous study of the repeatability of 2D-NMR spectra is needed as a prerequisite. In the context of first homonuclear COSY experiments, we will present a methodology based on accurate multivariate clustering tools. Numerical quality indexes and graphical clustering results will be shown, obtained via binary vectors of positions, via recoded intensity vectors and through different levels of spectral resolution. A second objective is to compare these 2D results with corresponding 1D results (¹H-NMR) obtained in the same conditions. This methodology was applied to two real datasets (peak lists), corresponding to two different experimental designs: first, a 4-mixture cell culture system containing various supervised metabolites, and second, a human serum based design with time repetitions and multiple permutations. Our preliminary results seem already promising: COSY appears to be a statistically robust tool and, furthermore, additional information appears to be relevant. Mots-clés Metabolomics, COSY spectra, Clustering algorithms, Repeatability, Signal-to-noise
85
P25
Reconstruction du réseau métabolique de la tomate
Florence Maurier1*
, Fabien Jourdan2*
, Sophie Colombié1*
1 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France 2 INRA UMR1331 TOXALIM-MeX, 180 Chemin de Tournefeuille, BP 93173 F31027 Toulouse Cedex 3, France
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Le développement de la modélisation métabolique incluant l’analyse de flux sur des réseaux de grande échelle est soutenue par le projet MetaboHUB. Dans ce cadre, nous proposons la reconstruction du réseau métabolique de la tomate (Solanum lycopersicum) dont le génome a été séquencé en 2012 [1]. L’annotation de ce génome a prédit 34 727 gènes codant pour des protéines. L’ensemble de ces données est donc actuellement disponible et utilisable pour la reconstruction du réseau métabolique de la tomate. Des méthodes de reconstruction [2] ont d’ores et déjà été établies et les réseaux métaboliques de plusieurs autres plantes ont déjà été reconstruits. Ainsi, plusieurs modèles sont disponibles en particulier pour la plante modèle Arabidopsis thaliana [3][4][5]. Mais il faut noter que selon les modèles, différents degrés de compartimentation sub-cellulaire sont disponibles. Notre démarche sera dans un premier temps d’obtenir une ébauche du réseau métabolique de la tomate à partir des données disponibles et de plateformes visant à faciliter la reconstruction de réseaux métaboliques (tels que Model SEED, SuBliMinaL et en particulier Pathway Tools). Nous choisirons ensuite quelques reconstructions modèles que nous fusionnerons avec l’ébauche obtenue pour définir la compartimentation et les réactions de transport. Pour cela, nous utiliserons des reconstructions au format SBML[6] (System Biology Markup Language), le format le plus couramment utilisé pour modéliser des processus biologiques. Il faudra alors être en mesure de comparer les métabolites des différentes reconstructions via des identifiants communs. Les InChI, International Chimical Identifiers, se prêtent bien à ce rôle. Une étape de ‘gap filling’ aura ensuite lieu pour compléter les réactions manquantes de notre réseau. Enfin, nous vérifierons l’exactitude de notre reconstruction par des analyses structurelles (EFMs, Elementary Flux Modes analysis) et fonctionnelles (FBA, Flux Balance Analysis). Références bibliographiques [1] The Tomato Genome Consortium. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature 485, 635-641
(2012) [2] Thiele, I., and Palsson, B.Ø. (2010) A protocol for generating a high-quality genome-scale metabolic reconstruction. Nat Protoc 5: 93–
121. [3] Poolman MG, Miguet L, Sweetlove LJ, Fell DA. A genome-scale metabolic model of Arabidopsis and some of its properties. Plant
Physiol 2009, 151:1570-1581 [4] Cristiana Gomes de Oliveira Dal’Molin, Lake-Ee Quek, Robin William Palfreyman, Stevens Michael Brumbley, and Lars Keld Nielsen.
FOCUS ISSUE ON PLANT SYSTEMS BIOLOGY: AraGEM, a Genome-Scale Reconstruction of the Primary Metabolic Network in Arabidopsis Plant Physiol. February 2010 152: 579-589. First Published on December 31, 2009; doi:10.1104/pp.109.148817
[5] Shira Mintz-Oron, Sagit Meir, Sergey Malitsky, Eytan Ruppin, Asaph Aharoni, and Tomer Shlomi. Reconstruction of Arabidopsis metabolic network models accounting for subcellular compartmentalization and tissue-specificity. PNAS 2011 ; published ahead of print December 19, 2011, doi:10.1073/pnas.1100358109
[6] Hucka M, Finney A, Sauro HM, Bolouri H, Doyle JC, Kitano H, Arkin AP, Bornstein BJ, Bray D, Cornish-Bowden A, Cuellar AA, Dronov S, Gilles ED, Ginkel M, Gor V, Goryanin II, Hedley WJ, Hodgman TC, Hofmeyr JH, Hunter PJ, Juty NS, Kasberger JL, Kremling A, Kummer U, Le Novère N, Loew LM, Lucio D, Mendes P, Minch E, Mjolsness ED, Nakayama Y, Nelson MR, Nielsen PF, Sakurada T, Schaff JC, Shapiro BE, Shimizu TS, Spence HD, Stelling J, Takahashi K, Tomita M, Wagner J, Wang J; SBML Forum. The systems biology markup language (SBML): a medium for representation and exchange of biochemical network models. Bioinformatics. 2003 Mar 1;19(4):524-31.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés reconstruction, réseau métabolique, Solanum lycopersicum
86
P26
Caractérisation métabolique par RMN du suivi sérique de patients atteints d’un Carcinome Hépatocellulaire de stade A traités par ablation par radiofréquences
C. Goossens
1, M. Triba
1, L. LeMoyec
2, O. Seror
3, P. Savarin
1, P. Nahon
3
1 Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France
2 Université d’Evry val d’Essonne, UBIAE, INSERM U902, Evry, France
3 Service d’Hépatologie, Université Paris 13, Hôpital Jean Verdier, Bondy, France
Contexte: Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le plus fréquent des cancers primitifs du foie. Les causes de cette atteinte hépatique sont essentiellement les virus de l’hépatite B, C et la consommation excessive d’alcool. Alors que l’ablation par radiofréquence (RFA) est un traitement de plus en plus utilisé, la récurrence tumorale reste de l’ordre de 50% suite à ce traitement. A l’heure actuelle, le pronostic de ces patients est particulièrement délicat à préciser. Les praticiens hospitaliers manquent de marqueurs cliniques et biologiques fiables pour classifier le CHC. C’est pourquoi, la métabolomique apparaît être une technique de choix permettant d’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs. Objectifs: i) Etablir une signature métabolique sérique du suivi post RFA du petit CHC (stade A) de patients viraux et non viraux par RMN. ii) Identifier et déterminer des biomarqueurs susceptibles d’affiner le suivi thérapeutique et le pronostic des patients atteints d’un CHC. Matériel et méthodes: 120 patients présentant un CHC développé sur foie cirrhotique et éligibles pour la RFA ont été présélectionnés. Trois échantillons de sérum correspondant aux temps t0 (jour précédent la RFA), t1 (1 jour après la RFA) et 1<t2<4mois (plus de traces de nodules visibles par IRM) ont été prélevés. Chaque échantillon de sérum est analysé par RMN
1H à 21°C sur un spectromètre Bruker 500 MHz suivant
les séquences d’acquisition NOESY1d et CPMG. Les méthodes statistiques multivariées utilisées sont de type analyse en composantes principales ACP et OPLS. Résultats: L’OPLS a permis d’identifier un profil métabolique sérique différent suivant l’origine virale ou non des patients atteints d’un petit CHC. Les effets de la RFA sont visibles dans le sérum et se traduisent par deux profils différents pour les deux cohortes virale et non virale. Chez les patients viraux, nous avons pu différencier les profils métaboliques sériques de petits CHC et de leur guérison après 1 mois post-RFA. La guérison a été marquée par une augmentation des sucres et diminution des lipides dans le sérum ainsi que par l’influence de certains métabolites tels que : la leucine, l’isoleucine, le glutamate ainsi que la phénylalanine. Conclusion: Actuellement, le praticien clinicien opère à un suivi thérapeutique commun pour l’ensemble des patients atteints d’un petit CHC. L’analyse du sérum par métabolomique a permis de déterminer un profil différent suivant le développement d’un CHC à partir d’une cirrhose virale ou non. Cette constatation mène par conséquent à reconsidérer la nature de la tumeur suivant son étiologie et à envisager différents processus métaboliques. Mots clés : metabolomics, NMR, metabolite profiling, hepatocellular carcinoma, RFA and OPLS.
87
P27
Développement et validation d’une méthode de screening de 565 xénobiotiques par UHPLC-HRMS et application sur une trentaine d’eaux du robinet de la région
parisienne
Jérôme Cotton1,2,3
, Fanny Leroux1,2
, Simon Broudin1,2
, Céline Ducruix1,2
, Bruno Corman1, Christophe
Junot3*
.
1. Profilomic, 31 rue d uesseau, 92100 Boulogne Billancourt, France. 2. Profilomic, CEA Saclay, Bâtiment 136, 91191 Gif-sur-Yvette, France.
3. LEMM/SPI/iBiTec-S, CEA Saclay, Bâtiment 136, 91191 Gif-sur-Yvette, France. * MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
L’état actuel de pollution des eaux environnementales par les rejets industriels, les produits phytosanitaires et les médicaments est une réelle préoccupation. La présence de tous ces composés à des concentrations souvent inconnues dans les ressources naturelles est un véritable problème de santé public. S’il existe aujourd’hui de nombreuses méthodes d’analyses quantitatives développées sur des appareils de type triple quadripolaire pour la détection de pesticides dans l’eau, le nombre de molécules détectées en une seule analyse dépasse rarement la centaine. Par ailleurs, les analyses réglementaires ne se préoccupant peu ou pas des résidus médicamenteux, l’offre dans ce domaine est extrêmement limitée. Nous avons ainsi voulu mettre au point une méthode d’analyse qui permette la détection simultanée de plusieurs centaines de pesticides et résidus médicamenteux parmi les plus couramment retrouvés dans l’environnement. Une approche semi-quantitative ciblée large spectre par couplage de la préconcentration en ligne avec la chromatographie liquide ultra-haute performance et la spectrométrie de masse à ultra haute résolution (SPE-UHPLC-ESI-FTMS) a été développée pour la recherche de 800 contaminants chimiques potentiels dans l’eau en une seule analyse. Le développement de cette méthode a été réalisé en plusieurs étapes : (1) Une sélection de 800 molécules d’intérêt a été effectuée sur la base de documents officiels
1,2,3 et de la littérature
4, puis (2) ces standards ont
été acquis et solubilisés dans des solvants appropriés. (3) Une banque de données a été créée sur la base d’informations obtenues en FIA-HRMS (conditions d’ionisation, ions caractéristiques en MS et MSMS) (4) Des colonnes analytiques et de préconcentration ont été sélectionnées
5,6 et testées sur les 800 composés de
la chimiothèque afin de détecter le plus grand nombre de molécules. Cette nouvelle méthode d’analyse permet de détecter 565 molécules au seuil minimum réglementaire de 0,1 µg/l parmi les 800 de la chimiothèque initiale, dont 257 pesticides et 308 résidus médicamenteux. Une trentaine d’eaux du robinet collectés sur l’ensemble de la région parisienne a permis de mettre évidence plusieurs dizaines de polluants émergents dont un certain nombre échappait aux contrôles réglementaires actuels. Références bibliographiques 1 Rapport de l’ANSES, Évaluation des risques liés aux résidus de pesticides dans l’eau de distribution, Septembre 2013. 2 Rapport de l’ANSES, Étude de l’alimentation totale française 2 (TOME 1 et 2), Juin 2011. 3 Rapport de l’ANSES, Campagne nationale d’occurrence des résidus de médicaments dans les eaux destinées à la consommation
humaine, Mars 2011. 4 Vandenberg et al, Hormones and Endocrine-Disrupting Chemicals: Low-Dose Effects and Nonmonotonic Dose Responses, Endocrine
Reviews, June 2012, 33(3). 5 Nurmi et al, Multiresidue method for the analysis of emerging contaminants in wastewater by ultra performance liquid chromatography–
time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 6712– 6719. 6 Kronstrand et al, A Screening Method for 30 Drugs in Hair Using Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography Time-of-Flight Mass
Spectrometry, TDM 2013 – 35(3) - p 288–295.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés xénobiotique, eaux, pollution environnementale, résidus médicamenteux, pesticides, SPE on line, spectrométrie de masse, UHPLC
88
P28
Metabolic profiling of glioma models using in vivo 1H MRS and ex vivo 1H HRMAS MRS
Nicolas Coquery
1,2, Vasile Stupar
1,2, Régine Farion
2, Séverine Maunoir-Regimbal
3,
Emmanuel Luc Barbier1, Chantal Rémy
1,2 , Florence Fauvelle
1,2,3,
1- GIN Grenoble Institut des Neurosciences, INSERM U836/UJF/CHU/CEA, F-38000 Grenoble, France
2- MRI facility, IRMaGe, INSERM US17/UJF/CHU/CEA, F-38000 Grenoble, France 3- IRBA, EBR Department, NMR laboratory, F-91000 Bretigny sur Orge, France
Context: Among gliomas, glioblastomas (GBM) are the most malignant subtypes and since the protocol from Stupp et al.
1, few improvements have been made regarding therapy outcome in patients. Besides the
development of new therapeutically strategies, efforts are currently made to characterize molecular, microvascular, immunogenic and metabolic subclasses of GBM that, depending on the treatment response for each subclass, might ultimately lead to adapt treatment on personal basis. In preclinical studies, the heterogeneity between the animal models of GBM can be exploited as a source of diversity, which could highlight some features found in human GBM. The C6, F98 and RG2 rat cell lines are considered as reliable models for in vivo study in orthotopic scenario
2.
Objectives: In this study, we aimed to evaluate whether the differences between the 3 glioma models: C6, F98 and RG2, could be distinguished using multivariate statistical analysis of in vivo
1H MRS and ex vivo
1H
HRMAS MRS data. Methods: Tumor cells were inoculated under isoflurane anesthesia in the right caudate of male Wistar (C6) or Fisher (F98-RG2) with a stereotaxic frame. Between 21 and 24 days after tumor implantation, in vivo
1H MRS
spectra were acquired at 7 T in a 3x3x3mm3 volume of interest using a PRESS sequence (TE/TR=20/2500 ms) with water and outer volume suppression. The day after, brains were rapidly isolated after decapitation and both the centre of the entire visible tumor and the contralateral striatum were dissected out and frozen in liquid nitrogen. Ex vivo
1H HRMAS NMR spectra of 15 mg biopsies were acquired at 9.4 T using a CPMG
pulse sequence and 4 KHz spinning rate. Quantification was performed using the jMRUI software package ((http://www.mrui.uab.es/mrui/) that uses a simulated database. 10 and 20 metabolites were quantified respectively in vivo and ex vivo.PCA and OPLS-DA were performed using SIMCA v13 and quantified data as X variables. Paired t-test was used to compare metabolite level in tumor versus contralateral striatum. An ANOVA with Bonferroni posthoc test was performed to compare level of each metabolite between the three tumor models. Results: Both in vivo and ex vivo OPLS-DA models showed different metabolic profiles dependent on glioma models. The C6 model presented the most important differences compared to the other models. The metabolic profiles of each glioma model could be associated to cellular and tissular tumoral characteristics like hypoxia, necrosis, blood volume or invasiveness of the tumor. For example, alanine was higher in F98 and RG2 compared with C6, which is consistent with highest hypoxia level and radioresistance of F983. Conclusion: Depending on technological advances,
1H MRS might yield relevant information for differential
diagnosis and response to treatment in high grade glioma. For this, ex vivo 1H HRMAS MRS performed on
biopsies seems to be currently well suited. Robust OPLS-DA models could be built with 1H HRMAS MRS
quantitative data despite inter-individual variability. The amount of information provided was able to highlight subtle differences between 3 models of glioma in rat.Funding for this project was provided by a grant from foundation ARC. Références bibliographiques 1- Stupp, R. et al. Radiotherapy plus Concomitant and Adjuvant Temozolomide for Glioblastoma. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 987–996. 2- Barth, R. F.; Kaur, B. Rat Brain Tumor Models in Experimental Neuro-Oncology: The C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1
Gliomas. J. Neurooncol. 2009, 94, 299–312. 3- Rousseau, J. et al. Efficacy of Intracerebral Delivery of Carboplatin in Combination with Photon Irradiation for Treatment of F98
Glioma-Bearing Rats. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2009, 73, 530–536.
Mots-clés glioblastoma, tumor model, ex vivo
1H HRMAS MRS, in vivo
1H MRS, OPLS-DA
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P29
Hierachical PLS for lipidomic analysis of french olive oils usinf NIR and MIR spectroscopy
Nathalie Dupuy, Jacques Artaud
Aix-Marseille Université, LISA EA4672, Equipe METICA, 13397 Marseille, France
During the last decade, a lot of progress appeared in the analytic world. The time necessary to obtain analytic data decreased, so far one manufactured product, multiple measurements were done (spectroscopy, chromatography, sensorial analysis ...). The data were considered as independents, the near-infrared (NIR) or the mid-infrared (MIR) data could be used to quantify triacylglycerols in virgin olive oils (VOOs), by using regression methods as PLS regression. Each group of variables, or each matrix, was usually called a block and is measured on the same observations (in rows). It was possible to find complementary information using two different analytic methods. In this case, the analyst could use multiblock predictor and multiblock response. In the literature, several multiblock methods were described. The simplest method was to put the descriptor block into the same matrix and then applied PLS regressions. Sometimes, this methodology gives good results, but the difficulty was to scaling the individual blocks to obtain interpretable results. Another way was to consider each block independently at the beginning. Principal component analysis (PCA) was applied on each block and then the scores obtained in each block were collected together to form a super matrix. This method presented by Tenenhaus and Vinzi [1] was called H-PLS. A few applications could be found in the literature. Among them, Casale et al. [2] work on three analytical methods and chemometric way. Brás et al. [3] present a multiblock approach to compare and to combine NIR and MIR spectra in calibrations of crude protein and moisture in soybean flour. In this paper, these methods were applied to characterization of French virgin olive oils. Previous works have shown that MIR spectroscopy using ATR sampling performed as well as NIR spectroscopy using transmission sampling, for the quantification of triacylglycerols and for the discrimination of the samples in their RDO’s origins [4,5]. The two infrared spectroscopies provided satisfactory results but sometimes the best results are obtained in NIR spectroscopy, and sometimes in the MIR range. The two information could be used as two predictor blocks used separately or together. In that case, the complementary information were used simultaneously in one model. This approach was a new tendency in the analytic word because the number of analyses performed on one sample increase and there is a need of common analysis [6,7]. The aim of this work was to compare and to combine the MIR and the NIR spectroscopies for quantitative and discriminant analysis. Firstly, PLS regression models were built to quantify triacyglycerol rates, using the two spectroscopies separately. Secondly, principal component analysis was performed on the NIR and the MIR ranges and the score variables used to give another matrix into a super block called H-PLS [1]. H-PLS regression models were built to quantify the fatty acids and triacyglycerols, using the scores variables associated to the principal components. The same approach was used for the discrimination of the samples into six RDOs: “Aix-en-Provence”, “Haute-Provence”, “Nice”, “Nîmes”, “Nyons” and “Vallée des Baux de Provence”. Références bibliographiques [1] M. Tenenhaus, V.E. Vinzi, J. Chemometr. 19 (2005) 145–153. [2] M. Casale, C. Casolino, P. Oliveri, M. Forina, Food Chem. 118 (2010) 163–170. [3] L.P. Brás, S.A. Bernardino, J.A. Lopes, J.C. Menezes, Chemometr. Intell. Lab. Syst. 75 (2005) 91–99. [4] O. Galtier, N. Dupuy, Y. Le Dréau, D. Ollivier, C. Pinatel, J. Kister, J. Artaud, Anal. Chim. Acta 595 (2007) 136–144. [5] O. Galtier, N. Dupuy, Y. Le Dréau, D. Ollivier, J. Kister, J. Artaud, Appl. Spectrosc. 62 (2008) 583–590 [6] S. Wold, M. Sjostrom, Chemometr. Intell. Lab. Syst. 44 (1998) 3–14 [7] S. Wold, N. Kettanech, K. Tjessen, J. Chemometr. 10 (1996) 463–482.
Mots-clés Infrared, lipidomic, HPLS, chemometrics
90
P30
ANALYSE METABOLOMIQUE DES GLOBULES ROUGES HUMAINS PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR
LE BIOMARQUAGE D’ETATS PATHOLOGIQUES.
Lydie Oliveira1, Dhouha Darghouth
2, Samia Boudah
3,
*Paul-Henri Roméo
4 et *Christophe Junot
3
1 Laboratoire d’Excellence GR-Ex, Institut Imagine, F-75015 Paris
2 UPMC, UMRS 938, Faculté de médecine de Saint Antoine, F-75012 Paris 3 CEA, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM, F-91191 Gif-sur-Yvette et MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010)
4 CEA, DSV/IRCM, F-92265 Fontenay-aux-Roses *P.-H.R et C.J. contribuent de façon égale à cette étude
Les principales applications des études métabolomiques réalisées dans le domaine de la médecine ou de la toxicologie concernent la découverte de biomarqueurs. La majorité d’entre elles sont basées sur des analyses plasmatiques ou urinaires. Bien que non ou faiblement invasifs, ces biofluides ne permettent pas toujours d’obtenir des résultats biologiquement exploitables, en raison de leur complexité et surtout des faibles concentrations circulantes de métabolites marqueurs de situations pathologiques. Partant de ce constat, nous nous sommes orientés vers l’analyse du métabolome des globules rouges par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS). Ces cellules sont un modèle d’étude simple puisqu’elles sont dépourvues de noyau, circulent dans tous les tissus et ont, chez l’homme, une durée de vie de 120 jours. Grâce au grand nombre de transporteurs de métabolites présents sur leur membrane, elles peuvent piéger et concentrer des métabolites qui pourraient rendre compte de l’état métabolique d’un patient sur la durée de vie du globule rouge (GR).
La première application faite de la méthode LC-HRMS de GR développée a été d’établir une signature métabolique de pathologies érythrocytaires propres. Nous nous sommes intéressés en premier lieu à la drépanocytose. Cette analyse a mis en évidence des modifications métaboliques importantes chez des patients drépanocytaires et a souligné l’intérêt de l’analyse métabolomique dans la compréhension de la physiopathologie de maladies érythrocytaires humaines (Darghouth et coll, Blood 2011). L’objectif d’une analyse métabolomique globale est de détecter le plus de métabolites possible. Ces molécules présentent une grande diversité chimique ce qui rend la combinaison de diverses approches complémentaires nécessaire. Ainsi, dans le but d’élargir la couverture métabolomique du GR, 3 méthodes complémentaires de LC-HRMS (Boudah et coll, J. Chromatogr. B, 2013) ont été utilisées et nous ont permis de caractériser 200 métabolites, soit une centaine de métabolites supplémentaires par rapport aux travaux réalisés antérieurement. Ces métabolites identifiés sont, non seulement produits par les voies métaboliques liées aux fonctions essentielles des GR telles que la glycolyse, le métabolisme des bases puriques et du glutathion, mais également des composés pouvant être captés par les érythrocytes à partir du plasma ou issus de vestiges des mitochondries présentes dans les précurseurs médullaires des GR. Ceci nous permet aujourd’hui de compléter les signatures métaboliques obtenues et de nous orienter vers l’établissement de nouveaux profils métaboliques. Fort de ces résultats, l’analyse métabolomique des GR de patients drépanocytaires continue en collaboration avec l’Hôpital Henri Mondor. Il s’agit de rechercher des biomarqueurs de suivi et de prévention de la crise vaso-occlusive. D’autres analyses portant sur les états physio-pathologiques propres du GR sont également en cours d’analyse, telles l’étude de la phase terminale de maturation du GR (Université Pierre et Marie Curie et AP-HP), l’étude des conditions de conservation des GR (Institut National de la Transfusion Sanguine), l’utilisation de l’analyse métabolomique du GR pour optimiser la culture de parasites érythrocytaires (Institut Pasteur du Cambodge) ou encore la caractérisation du mécanisme de l’hémolyse des GR induite par la ribavirine lors du traitement d’hépatites (Centre Hospitalier et Universitaire d’Amiens). La prochaine étape sera d’étendre l’analyse métabolomique du GR à l’étude de pathologies chroniques telles que les maladies auto-immunes (collaboration initiée avec l’AP-HP). Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés : LC-HRMS, Métabolomique, Globule rouge, Biomarqueurs
91
P31
Metabolomic and gene expression analysis in Vanilla planifolia
Tony L. Palamaa, Isabelle Fock-Bastide
b
a Institut des Sciences Analytiques / CRMN, UMR5280 CNRS/ENS Lyon/UCB-Lyon-1, 5 rue de la Doua, 69100 Villeurbanne, France b Université de La Réunion, UMR Peuplements Végétaux et Bioagresseurs en Milieu Tropical (PVBMT), Pôle de Protection des Plantes,
7 chemin de l’IRAT, Ligne Paradis, 97410 Saint-Pierre, La Réunion, France
Vanilla is one of the most popular flavouring ingredients used in food, beverages, cosmetics, and tobacco. To satisfy the ever-increasing demand for vanilla-flavoured products, industries have begun to substitute natural vanilla extracts with vanillin. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) is the major compound of vanilla flavour and can be produced semi-synthetically by (bio)conversion of related natural products or via synthesis. Nowadays, less than 1% of the global production of vanillin (12 000 tons each year) is derived from vanilla pods (Walton et al., 2003). Indeed, synthesized vanillin is much cheaper (<$15/kg) than vanillin extracted from vanilla pods [estimated between $1200 and $4000 per kg (Walton et al., 2003)]. Nevertheless, there is a distinct difference between the flavour of vanilla extract, which is composed of more than 200 compounds, and that of pure synthesized vanillin (Walton et al., 2003). During vanilla pod development, vanillin precursors mainly accumulate as flavourless glucosidic compounds. Nevertheless, the biosynthesis pathway of vanillin remains a controversial issue (Dixon, 2011; Havkin-Frenkel et al., 1999; Walton et al., 2003). Two main hypotheses have been advanced: the first one, the “ferulate pathway”, involves hydroxylation and methylation steps before chain shortening. The second hypothesis proposes a non-oxidative route with chain shortening as the first stage, followed by hydroxylation and methylation of the aromatic ring (“benzoate pathway”). In order to get clues about the vanillin biosynthetic pathway, we developed a metabolomic and gene expression analysis on vanilla pods. Expression profiling of key phenylpropanoid genes during pod maturation has been discussed in light of accumulation patterns for key phenolic compounds. Major result is, interestingly, that phenylalanine ammonia lyase (VpPAL1) gene expression is positively correlated to maturation and vanillin accumulation. Nevertheless, more genes sequencing of the key enzymes is required for the complete understanding of the vanillin pathway which will be of great help in plant breeding. Références bibliographiques Dixon, R.A., 2011. Vanillin biosynthesis e not as simple as it seems? In: Havkin-Frenkel, D., Belanger, F.C. (Eds.), Handbook of Vanilla
Science and Technology, first ed. Blackwell Publishing Ltd, New York, pp. 292e298. Havkin-Frenkel, D., Podstolski, A., Witkowska, E., Molecki, P., Mikolajczyk, M., 1999. Vanillin biosynthetic pathways: an overview. In: Fu,
et al. (Eds.), Plant Cell and Tissue Culture for the Production of Food Ingredients. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York, pp. 35e43.
Walton, N.J., Mayer, M.J., Narbad, A., 2003. Vanillin. Phytochemistry 63, 505e515.
Mots-clés Vanilla, plant metabolomic, NMR, gene expression
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P32
Challenges in applying PLS to un-targeted serum NMR metabolomic data from a nested case-control study in the EPIC study
N. Assia,b
, V. Viallonc,d ,e
, A. Fagesf, B. Elena-Herrmann
f, M. Jenab
a and P. Ferrari
a
a International Agency for Research on Cancer(IARC), Lyon, France
b Université Claude Bernard Lyon I, Lyon, France
c Université de Lyon, F-69622, Lyon, France
d Université Lyon 1, UMRESTTE, F-69373, Lyon, France
e IFSTTAR, UMRESTTE, F-69675, Bron, France
f Institut des Sciences Analytiques, Centre de RMN à très hauts champs, CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon-1, Villeurbanne, France
With technological developments in analytical chemistry, mainly in the fields of in nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and in mass spectrometry (MS), massive massive sets of data are being generated for metabolomic analyses. The main objective of metabolomic studies is to identify relevant biomarkers or potential metabolite alterations associated with a higher risk of patho-physiological conditions and/or disease onset. With the expansion of the discipline, metabolomics studies are faced with 3 key challenges: i) identifying a large number of metabolites whose signal remains un-resolved , ii) identifying pathways and networks in the metabolism responsible for changes in the metabolite signatures and iii) dealing with big datasets and exploiting appropriate statistical tools to address their inherent complexity. While quantitative statistical methods are available for processing information on metabolomic profiles variability
[1], the analytical strategy to simultaneously relate large sets of data is far from being an obvious one.
In metabolomics, such methods are needed to fully characterize metabolomic profiles by integrating information on individuals’ environmental factors. Partial Least Squares (PLS) regression
[2,3] is a very suitable
multivariate technique for this purpose, as it generalizes features of principal component analysis (PCA) and multiple linear regression (MLR), by maximizing the covariance between two sets of variables, X and Y, known as the predictors and the responses, respectively. PLS iteratively extracts components that explain co-variability in X and Y
[4]. Metabolomic profiles were assessed in a hepato-cellular carcinoma (HCC) nested
case-control study within the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition[5]
, a large prospective investigation with over 520,000 participants in 10 countries, whose design, data collection methods and rationale are detailed and described elsewhere
[5,6]. HCC cases were identified during the study
follow-up among study participants, through examination of relevant histology[7]
. Pre-diagnostic serum samples from 114 HCC cases and 222 matched controls were processed using standard
1H NMR metabolic
profiling protocols. As part of implementing a “meeting-in-the-middle” approach, an analytical strategy was developed to identify the link between lifestyle factors, including dietary habits, physical activity, anthropometry (the X factors) and disease outcome, through metabolomic profiles (the Y factors), possibly highlighting relevant markers of exposure on one hand, and predictive markers of disease outcome, on the other approach [8]
. After removal of the structured noise, metabolomic spectra signals were first processed via an intelligent bucketing procedure, the Statistical Recoupling of Variables (SRV)
[9,10]. This permitted to reduce the number
of NMR variables to 285 cluster variables corresponding to reconstructed peak entities. The food and lifestyle matrix included 16 dietary variables, alcohol at recruitment, body mass index, height, measure of physical activity, smoking status, fasting status, diabetes, hepatitis, level of education, and a score for liver damage. In this study, PLS was used to derive components by relating the Y matrix of NMR variables to the X matrix of lifestyle variables. Each factor was then related to HCC risk in conditional logistic regression models. In this application we dealt with challenges related to i) the scaling of variables and ii) the choice of the optimal number of factors to retain using cross-validation procedures. Overall, X-variables were characterized by level of variability 10
1- to 10
10-fold larger than Y-signals, with a moderate-to-large impact on the findings.
Références bibliographiques [1] Fages A, Ferrari P, Monni S, et al. "Investigating sources of variability in metabolomic data in the EPIC study: the Principal Component Partial R-square (PC-PR2) method". Metabolomics. (in press) (2014). [2] Abdi H. "Partial least squares regression and projection on latent structure regression (PLS Regression)". Wiley Interdiscip. Rev. Comput. Stat. 2, 97–106 (2010). [3] Tenenhaus M. "L’approche PLS". Rev. Stat. appliquée. 2, 5–40 (1999). [4] Tobias RD. An Introduction to Partial Least Squares Regression. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA (1997). [5] Riboli E, Hunt KJ, Slimani N, et al. "European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC): study populations and data collection". Public Health Nutr. 5(6B), 1113–24 (2002). [6] Riboli E, Kaaks R. "The EPIC Project: rationale and study design. European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition". Int. J. Epidemiol. 26 Suppl 1, S6–14 (1997). [7] Trichopoulos D, Bamia C, Lagiou P, et al. "Hepatocellular carcinoma risk factors and disease burden in a European cohort: a nested case-control study". J. Natl. Cancer Inst. 103(22), 1686–95 (2011). [8] Chadeau-Hyam M, Athersuch TJ, Keun HC, et al. "Meeting-in-the-middle using metabolic profiling - a strategy for the identification of intermediate biomarkers in cohort studies". Biomarkers. 16(1), 83–8 (2011). [9] Navratil V, Pontoizeau C, Billoir E, Blaise BJ. "SRV : an opensource toolbox to accelerate the recovery of metabolic biomarkers and correlations from metabolic phenotyping data sets". Bioinformatics. 29(10), 1348–49 (2013). [10] Blaise BJ, Shintu L, Elena B, Emsley L, Dumas M-E, Toulhoat P. "Statistical Recoupling Prior to Significance Testing in Nuclear Resonance Based Metabonomics". Anal. Chem. 81(15), 6242–6251 (2009).
Mots-clés: PLS, metabolomics, scaling, meeting-in-the-middle, hepato-cellular carcinoma
93
P33
Effet de la variété et de la torréfaction sur la composition du produit torréfié de la racine de chicorée industrielle (Cichorium intybus var. sativum)
Honorine Willeman
1, Annick Moing
2,*, Mickaël Maucourt
3,*, Stéphane Bernillon
2,*, Catherine
Deborde2,*, Najia Voedts
1, Nicolas Henry
4, Myriam Janssens
5, Jean-Louis Hilbert
1, Philippe Hance
1
1 Université Lille 1 Sciences et Technologies, UMR 1281, Stress Abiotiques et Différenciation des Végétaux Cultivés, GIS GENOCHIC,
IFR 147, Bâtiment SN2, 59655 Villeneuve d’Ascq, France 2 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
3 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France 4 Florimond Desprez, 3 rue Florimond Desprez, 59242 Cappelle-en-Pévèle, France5 Leroux SAS, 84 rue François Herbo, 59310
Orchies, France * Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard
Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
La chicorée industrielle, Cichorium intybus var. sativum, est cultivée pour sa racine. Une fois récoltée et débitée en lamelles, la « racine fraîche » est séchée. Ce produit intermédiaire, appelé « cossette séchée », est soit broyé finement pour obtenir une mouture commercialisable, soit torréfié pour être concassé en grains, à leur tour désignés « grains torréfiés ». Ces derniers sont aussi extraits à l’eau chaude afin d’obtenir des produits alimentaires sous forme liquide concentré ou enfin, après atomisation, sous forme de poudres solubles. Le produit torréfié est ainsi employé dans notre alimentation comme arôme, colorant ou encore exhausteur de goût. Dans notre étude, l’analyse métabolomique est utilisée pour étudier les effets du génotype de chicorée et de la torréfaction sur la composition des produits. Une sélection de 48 génotypes de chicorée est analysée pour chacun des produits : la racine fraîche, les cossettes séchées et les grains torréfiés. Une analyse ciblée des métabolites solubles, menée par RMN-
1H quantitative d’extraits polaires et LC-DAD d’extraits semi-polaires,
a permis une quantification absolue de 28 métabolites primaires et 8 métabolites secondaires. En parallèle, une analyse non ciblée des spectres RMN-
1H d’extraits polaires et LC-QTOF-MS d’extraits semi-polaires a
permis la quantification relative de plus de 3000 signaux. Le multiplexage technologique combiné aux analyses statistiques met en évidence une différence nette entre les trois produits et un effet génotype plus limité. Les mêmes métabolites ont été détectés dans la racine fraiche et les cossettes séchées. Cependant, la teneur d’une majorité de composés est significativement différente. Les grains torréfiés, diffèrent qualitativement (seuls 44 % de métabolites connus sont identiques à ceux de la racine fraîche et des cossettes séchées) et quantitativement des deux autres produits. Enfin, des ANOVA ont permis de repérer les métabolites pour lesquels une différence quantitative entre les génotypes est significative pour un même produit. Le processus de transformation a tendance à atténuer l’effet génotype, puisque le pourcentage de métabolites et signaux associés à un effet génotype significatif décroit de la racine à la farine puis au produit torréfié. Ces données biochimiques seront associées à de futures données sensorielles. Cette association aura pour but d’identifier une ou des molécule(s) impliquée(s) dans les qualités organoleptiques du produit fini (produit torréfié). Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Chicorée, métabolomique ciblée et non ciblée, sélection végétale, torréfaction
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P34
Métabolomique par micro-détection RMN pour la caractérisation de la diversité des phénotypes associés à un génotype de longévité chez C. elegans
Alexandre Rech, Bénédicte Elena-Herrmann
Université de Lyon (CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon 1), Institut des Sciences Analytiques, Centre de RMN à très hauts champs, 5 rue de la Doua, 69100 Villeurbanne, France
La restriction alimentaire (ou restriction calorique) est reconnue pour ses effets bénéfiques sur la longévité et dans la prévention de maladies dans de nombreuses espèces. Le nématode C. elegans est un organisme modèle tout à fait pertinent pour l’étude de la restriction alimentaire et de ses effets. Plusieurs mutations chez le vers sont associées à une modification de la durée de vie des nématodes, tel que le mutant slcf-1 qui possèdent une espérance de vie 30% supérieure aux vers sauvages. Il a par ailleurs été démontré que cette mutation reproduit tous les effecteurs de la restriction calorique, pour des vers nourris ad libitum
(1). Afin
d’étudier les modifications du métabolisme associées à cette mutation, une approche globale a été proposée reposant sur la technique de RMN HR-MAS (High Resolution Magic-Angle Sample spinning), particulièrement adaptée pour l’analyse des nématodes entiers. Ainsi les profils de vers sauvages et mutants, à deux stades de développement, ont été caractérisés par RMN et ont mis en évidence différentes perturbations des voies métaboliques corrélées à la durée de vie des animaux
(2). Une limitation de cette
approche est la quantité de vers importante (un millier de vers) qui est nécessaire pour chaque échantillon analysé par RMN HR-MAS. L’émergence de la technique MACS (magic-angle coil spinning) nous permet à présent d’atteindre une sensibilité et une résolution excellentes pour des quantités beaucoup plus faibles d’échantillons (une cinquantaine de vers)
(3). Cette approche de micro-détection offre de nouvelles possibilités pour la
métabolomique, basée sur une séparation des vers en fonction de différents phénotypes de longévité observés au sein d’une population synchronisée de nématodes adultes, qui font l’objet du travail présenté. Une étude de métabolomique par RMN HR-MACS est mise en oeuvre pour la caractérisation des phénotypes métaboliques associés aux différents phénotypes de longévités rencontrés au sein d’une population hétérogène de vers mutés pour le gène slcf-1. Les signatures discriminantes de vers sauvages et mutés, pour de jeunes adultes où des adultes de 7 jours, seront également présentées. Références bibliographiques 1. L. Mouchiroud, L. Molin, P. Kasturi, M. N. Triba, M. E. Dumas, M. C. Wilson, A. P. Halestrap, D. Roussel, L. Masse, N. Dalliere et al.,
Pyruvate imbalance mediates metabolic reprogramming and mimics lifespan extension by dietary restriction in Caenorhabditis elegans, Aging Cel, 10(1): 39-54. (2011)
2. C. Pontoizeau, L. Mouchiroud, L. Molin, A. Mergoud-dit-Lamarche, N. Dallière, K. Gieseler, P. Toulhoat, B. Elena and F. Solari, Dietary restriction buffers metabolic changes associated with aging in Caenorhabditis elegans, to be submitted (2014)
3. A. Wong, X. Li and D. Sakellariou, Refined Magic-Angle Coil Spinning Resonator for Nanoliter NMR Spectroscopy: Enhanced Spectral Resolution, Analytical chemistry, 85, 2021−2026 (2013)
Mots-clés C. elegans, restriction alimentaire, longévité, RMN HR-MAS, magic-angle coil spinning
95
P35
Discussion autour de la validation croisée des modèles multivariés en métabolomique.
Mohamed Triba1, Nadia Bouchemal
1, Philippe Savarin
1, Laurence Le Moyec
2
1 Université Paris 13,Chimie Structures Propriétés de Biomatériaux et d’agents Thérapeutiques, Université Paris 13 Sorbonne Paris
Cité-CNRS, Bobigny, France 2 Unité de Biologie Intégrative et Adaptation à l’exercice, Université d’Yvry Val D’Esonne-Inserm, Evry, France
Nous présenterons quelques difficultés rencontrées dans l’utilisation de la validation croisée et quelques moyens de les contourner. Nous montrerons que, bien qu’étant très utile, valeur du paramètre Q2 calculée par des logiciels de type SIMCA-P conduit dans certaines situations particulières à des conclusions arbitraires ou erronées. Des solutions proposées par différents auteurs ainsi que par notre équipe seront présentées. Mots-clés Validation croisée. OPLS.
96
P36
Métabolomique non ciblée pour la recherche de biomarqueurs dans le LCR de patients atteints de maladies du motoneurone.
H Blasco 1,2,3
, L Nadal-Desbarats 1,2,3,4
, PF Pradat5, PH Gordon
5, C Antar
1,2,3, C Veyrat-Durebex
1,2, C
Moreau6, D Devos
6, S M
1,2, P Emond
1,2,3,4, CR Andres
1,2,3, P Corcia
1,2,7
1- Inserm U930, CNRS 2448, Tours, France,
2- Université François-Rabelais, Tours, France, 3-CHRU de Tours, Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Tours, France,
4- PPF, Université François-Rabelais, Tours, France, 5-APHP, Fédération des Maladies du Système Nerveux, Centre Référent Maladie Rare SLA, Hôpital de la Pitié-Salpétrière, Paris,
France, 6- CHRU de Lille, Service de Neurologie, Lille, France,
7- CHRU de Tours, Service de Neurologie, Tours, France
L’objectif de cette étude est d’établir une signature métabolique du LCR dans les atteintes du motoneurone par SRM
1H et d’évaluer la valeur prédictive de ce profil dans une cohorte de validation.
Méthodes : Les échantillons de LCR sont prélevés chez 95 patients atteints de pathologie du motoneurone (MND) principalement de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et 86 contrôles (non MND). La totalité des échantillons sont analysés par SRM
1H et sont divisés selon le ratio 4 :1 en un set d’apprentissage et un set
de validation. Dans un premier temps, les échantillons appartenant au set d’apprentissage permettent d’établir un modèle statistique en OPLS-DA permettant d’avoir une signature métabolomique pour chaque population. Les échantillons appartenant au set de validation permettent de tester la de la signature métabolique précédemment établie. Nous avons répété 10 fois cette procédure avec une répartition aléatoire des sujets dans la cohorte d’apprentissage et de validation, afin d’évaluer la reproductibilité des modèles et ainsi identifier les composés les plus pertinents dans ces 10 essais. Résultats : L’analyse des LCR provenant de 95 patients atteints de MND et de 86 contrôles nous a permis d’établir des modèles statistiques OPLS-DA permettant de séparer les deux populations (R²X>22%, R²Y >93%, Q²>66%). Cette étape étant répétée de façon aléatoire 10 fois, la moyenne des pourcentages de prédiction correcte en validation interne est de 99.31%. Au cours de chacune des 10 étapes d’apprentissage, nous avons appliqué ces modèles aux 10 cohortes de validation correspondantes (environ 19 MND et 17 contrôles, ratio 4 :1). Ce test sur une cohorte indépendante nous permet d’obtenir une moyenne de la sensibilité de 78.9%, une moyenne de la spécificité de 76.5%, une valeur prédictive positive de 78.9% et une valeur prédictive négative de 76.5%. Les métabolites discriminants dans les différents modèles d’OPLS-DA obtenus (thréonine, histidine, et des molécules appartenant au métabolisme des acides aminés branchés) semblent cohérents avec la pathogénèse des MND. Conclusion : Cette étude montre la faisabilité de la validation d’un modèle statistique établissant une signature métabolique par SRM
1H sur une cohorte de validation externe pour les atteintes du motoneurone
avec des performances correctes. Cette approche métabolomique par SRM 1H a permis d’établir une
signature métabolique reproductible. Ainsi les biomarqueurs identifiés pourront être utilisés lors de futures études comme métabolites « candidats ciblés ». Mots-clés atteintes du motoneurone, SLA,
1H-SRM, metabolomique, OPLS-DA, LCR, biomarqueurs
97
P37
L’apport des techniques séparatives et de la spectrométrie de masse haute-résolution et très haute résolution à l’obtention d’empreintes moléculaires à
partir d’échantillons biologiques complexes
Agneta Kiss 1, Marianna Lucio
2, Audrey Buleté
1, Corinne Buisson
3, Françoise Lasne
3,
Philippe Schmitt-Kopplin 2, Cécile Cren-Olivé,*
1
1Equipe TRACES, ISA UMR 5280, 5 rue de la Doua, Villeurbanne, France
2Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Ingolstaedter Landstrasse1, 85764 Neuherberg,
Allemagne 3Agence Française de Lutte contre le Dopage, Département des Analyses, 143, avenue Roger Salengro, 92290 Châtenay-Malabry,
France
Les approches globales font intervenir des matrices d’origine biologique extrêmement complexes. L’utilisation des techniques séparatives en amont de l’étape de détection est donc parfaitement justifiée par (i) le nombre impressionnant de composés présents dans les différentes matrices, (ii) la gamme dynamique très large (iii) la diversité des propriétés physico-chimiques (iv) la présence d’isomères et (v) la nécessité d’avoir une dimension supplémentaire afin de discriminer les signaux ayant des valeurs m/z très proches. Les études métabonomiques emploient souvent des protocoles analytiques rapides afin de maximiser le nombre d’échantillons pouvant être analysés, de limiter la dégradation des composés et de préserver la totalité de l’information biologique contenue dans les échantillons. Les méthodes de préparation des échantillons étant donc simplifiées, l’étape de séparation joue un rôle crucial dans la qualité des empreintes obtenues.
Nous avons choisi d’illustrer les apports des techniques séparatives à travers les résultats obtenus dans quatre études métabonomiques réalisées dans des contextes et sur des matrices différentes. Plus précisément, il s’agit de deux études métabonomiques concernant des échantillons d’urine provenant d’athlètes dopés (tétrahydrocannabinol, salbutamol/budésonide) et d’athlètes non-dopés, une étude sur l’effet de la vinclozoline sur les testicules de rats et, enfin, une étude concernant le métabolisme des abeilles traitées aux pesticides. Toutes ces études, dont l’objectif était des discriminer les différentes groupes et de mettre en évidence des biomarqueurs potentiels, ont été réalisées sur des plateformes alliant les techniques séparatives (chromatographie liquide ou gazeuse) et la spectrométrie de masse haute résolution.
Outre la mise en évidence de potentiels biomarqueurs, le couplage entre les techniques séparatives et la spectrométrie de masse haute résolution a permis une meilleure connaissance des matrices analysées.
Mots-clés : LC-ToF, GC-ToF, FT-ICR, matrice biologique complexe
ETUDES
MÉTABONOMIQUES
Abeilles traitées aux
pesticides
vs.
Abeilles témoins
vs.
Athlètes non-
GC-Tof
Extraits
abeilles
Athlètes dopés au
salbutamol ou à la
budésonide vs.
Athlètes non-dopés
LC-qToF
FT-ICR
Urine
Athlètes dopés au
tétrahydrocannabinol
vs.
Athlètes non-dopés
LC-ToF
Urine
Effet de la
vinclozoline sur le
métabolome des
testicules de rats
LC-qToF
Extraits
testicules
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P38
Lipidomique des micromycètes marins par profilage CLHP-SMn
Matthieu Le Bellec, Samuel Bertrand, Yann Guitton, Emmanuel Gentil, Camila Dias,
Aurélie Couzinet-Mossion & Gaëtane Wielgosz-Collin.
Laboratoire Mer Molécules Santé -EA 2160 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques, Université de Nantes, 9 rue Bias, BP 53508, F-44035 Nantes cedex 1, France.
Depuis de nombreuses décennies, nombres de molécules biologiquement actives ont été découvertes chez les êtres vivants (échinodermes et microorganismes par exemples). Des études ont révélées de nombreux métabolites biologiquement actifs dans des microorganismes tels que les micromycètes marins ; par exemple Sir Alexander Fleming a isolé la Pénicilline G de Penicillium notatum. D’autres métabolites secondaires sont présents chez ces organismes comme les peptaïbols (peptides biologiquement actifs) (Ruiz et al., 2007). Malgré l’engouement pour les micromycètes marins, peu d’études existent sur les lipides produits par ce type d’organismes. Ces derniers se révèlent être de bonnes molécules actives comme par exemple un β-Galactosylceramide (glycolipide) (Farokhi et al., 2013). Certains lipides sont recherchés pour leur caractéristique nutritionnelle, notamment les acides gras poly-insaturés comme l’acide docosahexaénoïque (DHA) ou l’acide eicosapentaénoïque (EPA), tous deux des oméga-3. Afin d’étudier la composition lipidique des micromycètes marins, une méthode de profilage par CLHP-SM
n
haute résolution a été développée (Knittelfelder et al. 2014). Cette méthode basée sur la stratégie métabolomique traditionnelle permet l’identification rapide des lipides présents dans les extraits. Elle tire profit de la détection automatique des pics (XCMS®), l’identification par des bases de données (LipidBlast) ainsi que les similitudes des spectres MS/MS. Cette approche lipidomique appliquée à un grand nombre d’extraits lipidiques de micromycètes marins permettra d’évaluer divers taxons ainsi que leur potentiel dans la cosmétologie, la pharmacologie, l’agroalimentaire et l’énergie. Les premiers résultats obtenus montrent déjà la grande diversité lipidique présente chez différentes souches de champignons. Ceci permet d’envisager l’identification de molécules nouvelles et valorisables. Références bibliographiques : Farokhi F., Grellier P., Clément M., Roussakis C., Loiseau P. M., Genin-Seward E., Kornprobst J.-M., Barnathan G. & Wielgosz-Collin G.
(2013). Antimalarial activity of axidjiferosides, new β-galactosylceramides from the African sponge Axinyssa djiferi. Marine Drugs, 11 : 1304–1315.
Ruiz N., Wielgosz-Collin G., Poirier L., Grovel O., Petit K. E., Mohamed-Benkada M., Robiou du Pont T., Bissett J., Vérité P., Barnathan G. & Pouchus Y.-F. (2007). New trichobrachins, 11-residue peptaibols from a marine strain of Trichoderma longibrachiatum. Peptides, 28(7) : 1351-1358.
Knittelfelder O. L., Weberhofer B. P., Eichmann T. O., Kohlwein S. D. & Rechberger G. N. (2014). A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B, 951-952 : 119–128.
99
P39
Développement d’une méthode d'analyse métabolomique par introduction directe des échantillons biologiques sur un spectromètre de masse à très haute résolution
FTICR-MS
B. Xue1,2,3
; S. Alves4 ; A. Paris
5 ; François Fenaille
6; Benoit Colsch
6 ; J-C. Tabet
4* ; R. B. Cole
4* ;
C. Junot6*
; E. Rathahao-Paris1,2,3*
1 INRA, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France ; 2 AgroParisTech, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France ;
3 CNAM, UMR1145 Ingénierie Procédés Aliments, F-75231 Paris, France ; 4 UPMC, Laboratoire CSOB, Institut Parisien Chimie Moléculaire, F-75252 Paris, France ;
5 UMR7245 MCAM, Muséum National d’Histoire Naturelle, F-75005 Paris, France ; 6 Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments. DSV/iBiTec-S/SPI. CEA-Saclay. F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France
* MetabolomeIDF-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Après la production de données métabolomiques sur un instrument analytique (e.g. MS, RMN), le prétraitement de ces données représente une étape incontournable pour extraire des variables informatives et exploitables pour comprendre le phénomène biologique étudié. Dans notre travail, l’introduction directe des échantillons biologiques dans une source électrospray couplé à un spectromètre de masse à très hautes résolution et exactitude en masse, ESI-FTICR-MS, a été utilisée pour produire des données métabolomiques à haut débit. Ce type d’instrument étant très peu utilisé en routine pour des applications en métabolomique, il n’existe donc aucune méthode décrite pour réaliser le prétraitement des données ainsi produites. Un algorithme a été développé permettant de récupérer des données produites par une série d’analyses sous forme de matrice après correction de la ligne de base des spectres de masse. L’analyse de la fréquence d’apparition des variables dans le jeu de données obtenu a permis de sélectionner des variables informatives les plus largement représentées par les échantillons analysés. Une analyse en composante principale a permis de déterminer le facteur de dilution optimal pour la matrice biologique étudiée. Une évaluation de la linéarité de la réponse à la dilution choisie est réalisée à partir d’ajout de composés standards. Enfin, les signaux ont été annotés à l’aide de la base de données spectrale développée au CEA-Saclay. La mise en place de l’approche de production de données métabolomiques très haute résolution ainsi que de l’outil de prétraitement et de traitement des données FTICR-MS permettra le phénotypage métabolomique à haut débit de cohortes. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés analyse à haut débit, spectrométrie de masse à très haute résolution, phénotypage métabolique
100
P40
Bibliothèques de spectres de RMN 1D et 2D de composés de référence pour la métabolomique végétale
V. Zhendre
1,*, M. Maucourt
2,*, D. Jacob
1,*, A. Moing
1,*, D. Rolin
2,* et C. Deborde
1,*
1 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
2 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France * Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard
Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
Dans une approche de métabolomique, la spectroscopie RMN 1D proton est une méthode de choix pour l’identification et la quantification des métabolites d’un extrait de plantes
[1, 2]. L’identification se fait le plus
couramment en comparant le spectre de RMN de l’échantillon étudié à des spectres de composés purs issus de bases de données (locales ou publiques/commerciales: HMDB, BMRB, Chenomx…) et par observation de co-résonance lors d’ajouts du composés purs (« spiking ») dans l’échantillon
[3]. Les bases de données en
métabolomique de spectres de RMN sont majoritairement orientées vers l’humain. Il existe un manque notable de bases dédiées aux plantes
[2]. Ce type de matrice, et plus particulièrement les fruits, présente des
compositions complexes et nécessite de travailler en milieu tamponné avec des concentrations en sel pouvant aller jusqu’à 400 mM
[1, 3]. Le déplacement chimique étant très sensible à la viscosité, au pH, et à la
force ionique, l’identification des métabolites peut se révéler compliquée si les spectres de RMN des composés standards ne sont pas acquis dans les mêmes conditions
[1,3]. Pour pallier ceci, nous avons décidé
de construire une bibliothèque de spectres de RMN 1D et 2D de composés références dans des conditions requises pour l’analyse des fruits. Nous avons testé cette bibliothèque sur un spectre de RMN d’un extrait polaire de tomate précédemment annoté
[4]. L’acquisition systématique des spectres 2D des composés de
références dans les mêmes conditions de pH et de force ionique que l’extrait permet une annotation plus fine des métabolites permettant d’être conforme aux directives de la Metabolomics Standards Initiative (MSI) concernant l’identification des métabolites
[5, 6]. Nous pouvons dans la plupart des cas nous affranchir de
l’étape de « spiking », ce qui représente un gain de temps non négligeable. Nous avons également mis en évidence des métabolites non visibles en 1D, permettant ainsi une meilleure description de l’échantillon. Cette bibliothèque viendra alimenter une base de données en ligne et enrichir les bases existantes destinées à l’annotation automatique de spectres, d’extraits de fruit et d’autres matrices, via des outils bioinformatiques existants développé au laboratoire
[7] et à venir.
Remerciements : Ce projet est financé par MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Références bibliographiques 1. Rolin, D., et al., Chapter One - High-Resolution 1H-NMR Spectroscopy and Beyond to Explore Plant Metabolome, in Advances in
Botanical Research, R. Dominique, Editor. 2013, Academic Press. p. 1-66. 2. Kim, H.K., Y.H. Choi, and R. Verpoorte, NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends in
Biotechnology, 2011. 29(6): p. 267-275. 3. Allwood, J.W. and R. Goodacre, An introduction to liquid chromatography–mass spectrometry instrumentation applied in plant
metabolomic analyses. Phytochemical analysis, 2010. 21(1): p. 33-47. 4. Pascual, L., et al., Deciphering genetic diversity and inheritance of tomato fruit weight and composition through a systems biology
approach. Journal of Experimental Botany, 2013. 64(18): p. 5737-5752. 5. Summer, L.W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics, 2007. 3(3): p. 211-221.6. 6. Salek, R., et al., The role of reporting standards for metabolite annotation and identification in metabolomic studies. GigaScience,
2013. 2(1): p. 13. 7. Jacob, D., C. Deborde, and A. Moing, An efficient spectra processing method for metabolite identification from 1H-NMR
metabolomics data. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013. 405(15): p. 5049-5061.
Mots-clés Métabolomique, Plantes, RMN, base de données
101
P41
Crossed-effects between temperature and pesticides on fish: a metabolomics approaches
Pierre L. Pardo
ab, Allison J. Gandar
a, Cécile Canlet
c*, Nathalie Marty-Gasset
d, Caroline Molette
d,
Marie Tremblay-Franco c*
, José-Miguel Sanchez-Perez, Pascal Laffaille be
, Séverine Jean e.
a Université de Toulouse; UPS; EcoLab (Laboratoire écologie fonctionnelle et environnement); ENSAT, Avenue de l’Agrobiopole, 31326 Castanet
Tolosan, France. b CNRS; EcoLab; 31326 Castanet Tolosan, France.
c UMR1331 ToxAlim INRA INP, F-31027 Toulouse, France.
d Université de Toulouse; INPT; ENSAT, UMR 1388 GenPhySE (Genetique, Physiologie et Systemes d'Elevage), F-31326 Castanet-Tolosan, France.
e Université de Toulouse; INPT, UPS; EcoLab; ENSAT, Avenue de l’Agrobiopole, 31326 Castanet Tolosan, France.
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Crossed-effects between climate change and pollutions raise many questions, both on wildlife and ecosystems. Climate change – including modifications in temperature, oxygenation and acidity patterns – alter occurrence, behavior and toxicity of pollutants. Inversely, chemical exposures may decrease the resistance of organisms and so their adaptive potential to environmental changes. Aquatic ecosystems are particularly vulnerable to these interactions, as they simultaneously undergo multiple stresses. France is the fourth largest consumer of pesticides, and chronic contamination of surface water is reported by water quality monitoring programs. In field, interactions between contaminants may occur and knowledge lacks about combined effects of these pollutants. In addition, environmental factors such as temperature modify organism’s metabolism and defense systems – and so their sensitiveness to pollutants – and even lead to multiple stress effects if they exceed acclimation limits
1, 2, 3, 4, 5, 6.
The metabolic response acts as a key mechanism in the intermediate stress response of organism 7,8,9
. Resource management and modification of energy pathways modulate and orient the energy to the specific needs of the cells, tissues and organs, at the price of energetic compromises – or trade-off – between defense systems and immune system, locomotion, growth... Deeply influenced by temperature – especially in ectothermic species such as fish – energy metabolism is potentially heavily involved in the combined effects of temperature rising and environmental contaminations.
The study of the metabolic response in aquatic organisms subjected to biotic or abiotic stress is not new, especially in the field of aquaculture. But the evolution of molecular analysis techniques has allowed the emergence in environmental toxicology of "omics" approaches, like metabolomics. The exposure of an organism to its environment modifies its gene and protein expression, and disrupts the concentration and fluxes of endogenous metabolites involved in the pathways of central metabolism. These changes are amplified at the metabolome level. The metabolomics studies may include a higher number of samples and afford to be much more powerful statistically than other methods
10. Metabolomics can detect biomarkers of
stress and describe the modes of action of xenobiotics. It can also help to build prediction model of toxicity 11
. To evaluate crossed-effects between temperature rising and pesticides exposure on fish, goldfish
(Carassius auratus) were exposed during 96 h to a mixture of seven common pesticides at two temperatures (20 and 30 C). Livers were sampled and metabolites extracted following the “two step” method 12. Metabolic response was assessed by nuclear magnetic resonance (NMR), which is one of the main techniques used in untargeted environmental metabolomics. The data were analyzed by multivariate statistical methods (principal component analysis (PCA) and partial least squares regression (PLS)) and nonparametric tests (Kruskal-Wallis and Mann-Withney tests). References: 1- Heugens et al. 2001. A Review of the Effects of Multiple Stressors on Aquatic Organisms and Analysis of Uncertainty Factors for Use in Risk Assessment. Critical Reviews in
Toxicology. 31(3): 247-284. 2- Schiedek et al. 2007. Interactions between climate change and contaminants. Marine Pollution Bulletin. 54:1845–56. 3- Noyes et al. 2009. The toxicology of climate change: environmental contaminants in a warming world. Environment International. 35: 971–986. 4- Holmstrup et al. 2010. Interactions between effects of environmental chemicals and natural stressors: a review. Sci. Total Environ. 408:3746-62. (2010). 5- Laskowski et al. 2010. Interactions between toxic chemicals and natural environmental factors — A meta-analysis and case studies. Science of The Total Environment. 408:
3763-3774. 6- Kennedy and Ross, 2012. Stress syndromes: Heightened bioenergetic costs associated with contaminant exposure at warm temperatures in teleosts. Integrated Environmental
Assessment and Management. 8(1): 202-204. 7- Fry and Hart, 1948. The relation of temperature to oxygen consumption in the Goldfish. The biological bulletin. 94: 66-77. 8- Selye H., 1950. Stress and the General Adaptation Syndrome. British Medical Journal. 1: 1383-1392. 9- Barton B.A., 2002. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42: 517-525. 10- van Ravenzwaay et al. 2012. Metabolomics: a tool for early detection of toxicological effects and an opportunity for biology based grouping of chemicals—from QSAR to QBAR.
Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 746: 144–150. 11- Lankadurai et al. 2013. Environmental metabolomics: an emerging approach to study organism responses to environmental stressors. Environmental Reviews. 21:180–205. 12- Wu et al. 2008. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Analytical Biochemistry. 372:204-12.
Mots-clés : crossed-effects, temperature, pesticides, goldfish, NMR Metabolomics
102
P42
Activity of Hexokinase Is Increased by Its Interaction with Hepatitis C Virus Protein NS5A
Ramière C, Rodriguez J, Enache LS, Lotteau V, André P, Diaz O.
Centre International de Recherche en Infectiologie (CIRI), INSERM U1111 CNRS UMR5308, Université Lyon 1, ENS de Lyon, équipe
"biologie cellulaire de l'infection virale" 21 Avenue Tony Garnier - 69365 Lyon cedex 07, France
The study of cellular central carbon metabolism modulations induced by viruses is an emerging field. Human cytomegalovirus (HCMV), herpes simplex virus (HSV), Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), and hepatitis C virus (HCV) have been shown recently to reprogram cell metabolism to support their replication. During HCV infection the global glucidolipidic metabolism of hepatocytes is highly impacted. It was suggested that HCV might modify glucose uptake and glycolysis to increase fatty acids synthesis, but underlying mechanisms have not been completely elucidated. We thus investigated how HCV may modulate glycolysis. We observed that in infected Huh7.5 cells and in subgenomic replicon-positive Huh9.13 cells, glucose consumption as well as lactate secretion was increased. Using protein complementation assays and coimmunoprecipitation, we identified a direct interaction between the HCV NS5A protein and cellular hexokinase 2 (HK2), the first rate-limiting enzyme of glycolysis. NS5A expression was sufficient to enhance glucose consumption and lactate secretion in Huh7.5 cells. Moreover, determination of HK activity in cell homogenates revealed that addition of exogenous NS5A protein, either the full-length protein or its D2 or D3, but not D1, domain, was sufficient to increase enzyme activity. Finally, determination of recombinant HK2 catalytic parameters (Vmax and Km) in the presence of NS5A identified this viral protein as an activator of the enzyme. In summary, this study describes a direct interaction between HCV NS5A protein and cellular HK2 which is accompanied by an increase in HK2 activity that might contribute to an increased glycolysis rate during HCV infection. Mots-clés hepatitis C, metabolism, glycolysis, hexokinase, NS5A
103
P43
Metabolomic analysis by constraint random walk in genome-scale metabolic networks
Clément Frainay1, Benoit Colsch
2*, Suleiman Attala
2, Christophe Junot
2*, Fabien Jourdan
3*
1 - Université Paul Sabatier, Toulouse, France - Institut national de recherche agronomique (INRA), UMR1331 Toxalim, Toulouse,
France 2 - Commissariat à l’énergie atomique (CEA) et aux énergies alternatives, iBiTec-S, SPI, Laboratoire d’Etude du Métabolisme des
Médicaments (LEMM), Gif-sur-Yvette, France 3 - Institut national de recherche agronomique (INRA), UMR1331 Toxalim, Toulouse, France
* MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Le syndrome de Kearns-Sayre [Hertelendy1998] est une maladie neuromusculaire rare (prévalence estimée entre 1 et 3/100.000) dont l’apparition des symptômes survient chez les moins de 20 ans. Cette maladie est caractérisée par des symptômes oculaires (ophtalmoplégie, ptosis et rétinite pigmentaire) liés à des délétions de l’ADN mitochondrial. La diffusion tissulaire de ces délétions peut entraîner par la suite une surdité, des problèmes cardiaques et cérébraux (notamment ataxie et retard intellectuel), une myopathie des muscles squelettiques, des déficits hormonaux (hypoparathyroïdie, diabète) et une insuffisance rénale. Ces symptômes apparaissent de manière progressive et s’aggravent lentement durant plusieurs dizaines d’années. Le pronostique vital dépend de la diffusion des délétions et des organes touchés. Aucun traitement efficace des anomalies mitochondriales causant la maladie n’existe à ce jour. Le syndrome de CAFSA [Mochel2009] (pour Cerebellar ataxia with elevated cerebrospinal free sialic acid) est une neuropathie récemment identifiée dont l’origine est inconnue, et dont le principal symptôme est l’ataxie cérébrale. Des analyses métabolomiques globales sur des échantillons de liquide encéphalo-rachidien menées par l’équipe du Dr Christophe Junot ont mis en évidence une forte similarité entre les signatures métabolomiques des deux syndromes (résultats non publiés). Afin de mieux comprendre le rôle des métabolites identifiés par ces analyses et le lien entre ces deux maladies, des analyses bioinformatiques sont nécessaires pour confronter ces résultats au réseau métabolique humain complet. La complexité du réseau métabolique humain rend difficile l’identification des liens entre ces métabolites, à titre d’exemple Kuffner et al. [Kuffner2000] ont mis en évidence l’existence de plus de 500 000 voies possibles entre le glucose et le pyruvate, dont la majeure partie sont des artefacts ne reflétant aucune réalité biologique. Certaines méthodes permettent d’extraire des sous-réseaux plus informatifs en évaluant l’importance des composés dans le réseau [Faust2010][Dupont2006][Milreu2014]. Cependant, ces méthodes reposent principalement sur la topologie du réseau et négligent, dans leur application aux réseaux métaboliques, l’importance des critères biologiques et chimiques. Nos travaux proposent une nouvelle méthode d’extraction de sous-réseaux informatifs basée sur la conservation de structure chimique entre substrats et produits d’une réaction. Cette méthode repose sur l’algorithme des k-Walks décrit par Dupont et al. [Dupont2006], employant également une marche aléatoire dans le réseau à partir des métabolites d’intérêt identifiés en métabolomique. Cette marche aléatoire est contrainte par la conservation de la matière afin d’éviter l’emprunt de liens chimiquement aberrants. Références bibliographiques Dupont, P., Callut, J., Dooms, G., Monette, J.-N., & Deville, Y. (2006). Relevant subgraph extraction from random walks in a graph. Faust, K., Dupont, P., Callut, J., & van Helden, J. (2010). Pathway discovery in metabolic networks by subgraph extraction.
Bioinformatics (Oxford, England), 26(9), 1211–8. doi:10.1093/bioinformatics/btq105 Hertelendy, A., Szigeti, Z., Reichard, L., Marek, P., & Sápi, Z. Kearns-Sayre syndrome. , 139 Orvosi hetilap 1913–1916 (1998).
doi:10.1212/WNL.40.1.193 Küffner, R., Zimmer, R., & Lengauer, T. (2000). Pathway analysis in metabolic databases via differential metabolic display (DMD).
Bioinformatics. Milreu, P. V., Klein, C. C., Cottret, L., Acuña, V., Birmelé, E., Borassi, M., … Sagot, M.-F. (2014). Telling metabolic stories to explore
metabolomics data: a case study on the yeast response to cadmium exposure. Bioinformatics (Oxford, England), 30(1), 61–70. doi:10.1093/bioinformatics/btt597
Mochel, F., Sedel, F., Vanderver, A., Engelke, U. F. H., Barritault, J., Yang, B. Z., … Wevers, R. A. (2009). Cerebellar ataxia with elevated cerebrospinal free sialic acid (CAFSA). Brain : A Journal of Neurology, 132(Pt 3), 801–9. doi:10.1093/brain/awn355
Mots-clés: Metabolomic, Metabolic network, Random walk, Markov model, Chemical similarity, Sub-graph extraction, Graph comparison, Kearns syndrome, CAFSA syndrome
104
P44
La RMN 2D Ultrarapide appliquée à l’identification et la quantification de métabolites d’extraits de fruits de tomate au cours d’une cinétique développementale
Tangi Jezequel1,2
, Catherine Deborde2,3
, Mickaël Maucourt2,4
, Vanessa Zhendre2, Annick Moing
2,3,
Patrick Giraudeau1
1 Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230 2 Plateforme Métabolome Bordeaux -MetaboHUB
3 INRA, UMR1332 BFP 4 Université de Bordeaux, UMR1332 BFP
La spectroscopie de RMN bidimensionnelle (RMN 2D) conventionnelle est utilisée depuis longtemps en analyse qualitative pour déterminer la structure d’un composé chimique donné (
1), ou plus récemment pour
l’analyse qualitative de mélanges complexes de métabolites, en raison de sa capacité à mieux séparer les signaux obtenus après acquisition. Cet avantage s’est avéré par la suite d’un grand intérêt d’un point de vue quantitatif, le problème de chevauchement des pics en RMN 1D étant ainsi évité, la quantification peut être facilitée (
2,3). Mais lorsqu’il s’agit d’échantillons biologiques comme des biofluides ou des extraits
métabolomiques d’organes ou de tissus, qui sont souvent des mélanges très complexes, la RMN 2D conventionnelle présente certaines limites : le temps d’acquisition peut atteindre plusieurs dizaines de minutes voire plusieurs heures pour obtenir des spectres exploitables (un bon rapport Signal/Bruit nécessaire pour une bonne précision et une bonne résolution dans la dimension indirecte (
4)). Ces longues durées
d’expérience posent problème au niveau de l’occupation des spectromètres qui représente un coût non négligeable. De plus, elles sont à l’origine d’un bruit t1 en raison d’une plus grande sensibilité aux instabilités de l’appareillage ce qui impacte la précision des mesures quantitatives. La RMN 2D ultrarapide a révolutionné la spectroscopie 2D grâce à l’obtention de spectres en une fraction de seconde (
5). Le problème de la sensibilité et de la résolution des spectres s’est alors posé (
6), surtout pour
des mélanges complexes de métabolites, du fait de la rapidité de l’acquisition. Au cours de ces dernières années, de nombreux progrès ont été réalisés pour pallier ces problèmes(
7) et rendre la RMN 2D ultrarapide
utilisable pour l’analyse quantitative, notamment en utilisant des méthodes hybrides dont la durée d’acquisition est de quelques minutes (
6). Ces méthodes ont été testées lors de la quantification de
métabolites provenant d’extraits cellulaires de lignées de cancer du sein, et les résultats ont démontré une meilleure sensibilité par unité de temps avec la méthode ultrarapide par rapport aux méthodes conventionnelles (
8).
L’objectif de cette étude est d’appliquer cette méthode à une série d’échantillons biologiques d’origine végétale dont la composition dépend de l’évolution biologique et est caractérisée par une forte concentration en sucres. Le but est de quantifier des métabolites présents dans des extraits polaires de péricarpe de fruit de tomate récoltés à différents stades de développement (8 jours, stade de divisions cellulaires, à 55 jours après anthèse, fruit mur), impliquant ainsi une variation de gamme dynamique de 0,05 à 100 mM, et de vérifier que les métabolites quantifiables en RMN 1D le sont aussi en RMN 2D ultrarapide. Pour cela, nous avons mis au point et optimisé une série d’acquisitions hybrides combinant le codage spatial avec une procédure d’entrelacement des données(
9), afin d’optimiser la résolution et la largeur spectrale. Des spectres COSY
permettant de caractériser l’ensemble de la gamme spectrale utile ont été obtenus en 5 minutes seulement avec une résolution et une sensibilité optimale. Sur ce poster, seront présentés les résultats préliminaires obtenus par RMN 2D ultrarapide à 500 et 700 MHz sur ces extraits de tomate. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project). Références bibliographiques 1 F.R.Mc Donald, A.W.Decora, G.L.Cook, Applied Spectroscopy1968, 22:325. 2 P.Giraudeau, Magn. Reson. Chem. 2014, in press.Doi : 10. 1002/ mrc.4068. 3 P.Giraudeau, S.Akoka, Adv. Bot. Res. 2013, 67 :99. 4 S.Akoka, Une introduction à la résonance magnétique nucléaire, chapitre 8 : RMN multidimensionnelle,
www.sciences.univ-nantes.fr: site de l’UFR Sciences et Techniques de l’université de Nantes, consulté le 11 Décembre 2013. 5 Frydman, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99:15858. 6 M. Pathan, S.Akoka, I.Tea, B.Charrier, P.Giraudeau, Analyst 2011, 136 :3157. 7 P.Giraudeau, L.Frydman, Ann. Rev. Anal. Chem. 2014, 7, in press. 8 A.Le Guennec, I.Tea, I.Antheaume, E.Martineau, B.Charrier, M.Pathan, S.Akoka, P.Giraudeau, Anal. Chem. 2012, 84:10831. 9 L.Rouger, B,Charrier, M.Pathan, S.Akoka, P.Giraudeau, J. Magn. Reson. 2014, 238:87.
Mots-clés : RMN 2D ultrarapide, COSY, métabolomique, quantification
105
P45
Evaluation de la RMN du proton pour l’analyse globale des lipides
Aurélien Amiel1, Justine Bertrand-Michel
2, Simon Ducheix
3, Alexandra Montagner
3, Arnaud Polizzi
3,
Hervé Guillou3, Laurent Debrauwer
1, Cécile Canlet
1
1 INRA, UMR 1331 Toxalim, Plateforme MétaToul-AXIOM- MetaboHUB, 180 Chemin de Tournefeuille, 31000 Toulouse
2 Inserm U1048, Plateforme MetaToul-LIPIDOMIQUE-MetaboHUB, 1 avenue J Poulhes, 31000 Toulouse 3 INRA, UMR 1331 Toxalim, Equipe TIM (Toxicologie Intégrative et Métabolisme), 180 chemin de Tournefeuille, 31000 Toulouse
Les lipides constituent une famille de molécules extrêmement complexe. Ils sont habituellement analysés par des méthodes chromatographiques en phase liquide ou gazeuse couplées à la spectrométrie de masse. Ces méthodes sont efficaces et performantes mais sont généralement ciblées et nécessitent des traitements d’échantillons complexes et dépendant de la famille à analyser. Dans ce travail nous avons étudié à partir d’un modèle hépatique le potentiel de la RMN du proton pour l’obtention de profils lipidiques globaux à partir d’un extrait unique. Différentes conditions d’extraction des lipides hépatiques ont été testées et adaptées à l’analyse par RMN. Les différentes classes de lipides ont été quantifiées par des approches de RMN quantitative, et la méthode a été validée par l’analyse de standards en concentrations connues. L’analyse des lipides par RMN a été appliquée à un modèle de souris (C57Bl6J) soumis à un stimulus de type nutritionnel, par l’intermédiaire de régimes variant par la nature des huiles utilisées (régime EFAD déficient en acides gras essentiels et riche en acides gras saturés et régime FISH supplémenté avec 20% d’acides gras oméga 3). Les réponses métaboliques obtenues in vivo varient en fonction des régimes utilisés. D’une part, les lipides hépatiques ont été quantifiés à la fois par RMN du proton et par les méthodes conventionnelles (GC-MS ciblée), afin de comparer les résultats et valider la méthodologie. Les résultats montrent que la RMN du proton permet, à partir d’une seule analyse, d’obtenir un profil quantitatif des lipides les plus abondants (cholestérol libre, cholestérol estérifié, triglycérides, phospholipides totaux, MUFA, PUFA, etc.). D’autre part, les données RMN obtenues à partir des extraits aqueux et lipidiques de foie ont été analysées sans à priori en utilisant des techniques statistiques multivariées, comme l’analyse en composante principales (ACP) ou la PLS-DA (Partial Least Square Discriminant Analysis) permettant de séparer les groupes en fonction des régimes reçus. Les analyses PLS-DA obtenues à partir des spectres RMN des extraits aqueux et lipidiques de foie des souris montrent clairement des empreintes métaboliques spécifiques du régime. Une augmentation significative des acides gras totaux et des triglycerides hépatiques, ainsi qu’une diminution des acides gras insaturés est observée chez les souris nourries avec le régime EFAD par rapport au régime des souris témoins. Chez les souris nourries avec le régime FISH, une augmentation des acides gras insaturés est observée. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Lipidomique, RMN, quantification
106
P46
Etat de l’art de l’étude métabolomique non ciblée d’insuffisance rénale chronique: vers une meilleure gestion de la maladie
L. Jorge
1, R. t’Kindt
1, J. Boelaert
2, E. Schepers
3, G. Glorieux
3, N. Neirynck
3, F. Lynen
2, R. Vanholder
3,
P. Sandra1, K. Sandra
1
1 Metablys, Research Institute for Chromatography, President Kennedypark 26, Kortrijk, Belgium
2 Separation Science Group, Department of Organic Chemistry, Ghent University, Krijgslaan 281, S4-bis, Gent, Belgium 3 Nephrology Section, University Hospital Ghent, De Pintelaan 185, Ghent, Belgium
Les biomarqueurs utilisés actuellement dans le diagnostic d’insuffisance rénale chronique ne sont détectés qu’à un stade avancé de la maladie. Or, la détection de biomarqueurs précoces est une question primordiale dans la gestion de la maladie. L’étude présentée ici décrit une preuve de concept conduite sur des échantillons de sérum sanguin humain de patients atteints d’insuffisance rénale chronique à différents stades de la maladie. Les analyses ont été menées en utilisant une plate-forme métabolomique globale et non-ciblée, combinant à la fois la chromatographie liquide en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse haute résolution quadripôle temps de vol (HPLC-QTOF) en modes positif et négatif, et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse simple quadripôle (GC-MS). La combinaison de ces 2 techniques analytiques permet la détection d’une part importante du métabolome du sérum sanguin humain. 85 métabolites ont montré une corrélation entre leur concentration et le stade d’insuffisance rénale chronique du patient, parmi lesquels 43 avaient déjà été décrits dans la littérature comme étant des solutés et/ou toxines urémiques. L’étape suivante de cette étude serait la confirmation de ces résultats par à l’analyse d’un plus grand nombre d’échantillons. Mots clé Insuffisance rénale chronique, Métabolomiques, GC-MS, LC-MS, Q-TOF, Sérum
107
P47
Plant Metabolomics at Bordeaux Metabolome Facility, a member of MetaboHUB IA project. Tools and Applications.
Annick Moing1, Catherine Deborde
1, Patricia Ballias
1, Camille Bénard
1*, Stéphane Bernillon
1, Cécile
Cabasson3, Virginie Cocureau
1, Yves Gibon
1, Daniel Jacob
1, Nadia Lamari
1*, Mickaël Maucourt
3,
Duyen Prodhomme1, Vanessa Zhendre
1*, Laetitia Fouillen
2, Sébastien Mongrand
2, Jean-Jacques
Bessoule2, Frédéric Domergue
2, Marina Le Guédard
**, Eric Testet
3, Tristan Richard
3, Grégory Da
Costa3, Marie-Laure Iglesias
3, Jean-Pierre Monti
3, Eric Pédrot
3, Pierre Waffo-Teguo
3, Dominique Rolin
3
1INRA,
2CNRS,
3Université de Bordeaux, *: CDD IA, **: CDI Adera;
Centre INRA de Bordeaux-Aquitaine, IBVM, CS 20032, 33 140 Villenave d'Ornon www.cgfb.u-bordeaux2.fr/en/metabolome
www.metabohub.fr
Main collaborations: Canada (O Rowland, Carleton Univ.; Y Desjardins, Québec Univ.; S Charette, Laval Univ.), Japan (Tsukuba Univ., T. Ariizumi), UK (P Doerner, Edinburgh Univ. ; Oxford Univ, L. Sweetlove; Oxford Brookes Univ, D. Fell), France (INRA Avignon, M. Causse, M. Génard; INRA Montpellier, F. Tardieu ; INRA Sophia Antipolis, P. Frendo; INRA Bordeaux, F. Forget, ISVV Bordeaux). Investissement d’Avenir INBS projects: PHENOME (www.phenome-fppn.fr) and MetaboHUB
(http://www.metabohub.fr/) Investissement d’Avenir Biotechnologies & Bioressources projects: AMaizING, BreedWheat, Sunrise EU e-infrastructure COSMOS (http://cosmos-fp7.eu/), a Coordinated Action aimed at setting standards in
metabolomics and enabling free and open sharing of metabolomics data. The Bordeaux Metabolome Facility (PMB) develops and applies plant metabolomics and high-throughput metabolic phenotyping for local, national and international projects. Applications range from the characterization of plant derived extracts to systems biology: 1- Quantitative metabolic profiling of plant organs or tissues by
1H-NMR
[1,2],
2- Plant metabolomics or lipidomics by LC-HRMS [2,3]
and GC-MS [4]
, 3- Robotised high-throughput measurements of metabolite concentrations and enzyme activities and
kinetics[5]
, 4- Storage of metadata and raw data and biostatistical analysis through web-based applications: “MeRy-B”
(Metabolomics Repository of Bordeaux, http://bit.ly/meryb) and BioStatFlow (http://bit.ly/biostatflow) [6,7]
, 5- Development of spectra processing method for metabolite identification from
1H-NMR metabolomics data
[8],
6- Identification of metabolic markers for biotic or abiotic environmental changes [9,10]
or plant-pathogen interactions
[11],
6- Characterization of plant extracts having bioactive properties by LS-MS and LC-NMR [12]
, 9- Integrative modelling of tomato fruit metabolism (ERASysBio FRIM project), 10- Integration of metabolomics data with other ‘omics data for the study of fleshy fruit development and
metabolism [2,13]
. In this poster, we will provide an overview of the major features of some of these metabolomics studies and tools developed at Bordeaux and show that PMB has a commitment to develop solutions that will help creating knowledge rather than just data. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
References
1 Bourgis et al, (2011) PNAS 108 : 12527-12532 8 Jacob et al. (2013) Anal Bioanal Chem 405:5049 2 Pascual et al. (2013) J Exp Bot 64:5737. 9 Bernillon et al. (2013) Metabolomics 9:57-77 3 Buré C et al. (2014). Anal Bioanal Chem 406:995-1010 10 Le Provost et al. (2013) BMC Plant Biol 13:95 4 Cacas et al. (2012) Anal Bioanal Chem 403 :2745-2755 11 Baldacci et al. (2012) PLoS Pathogens 8 :e1002471 5 Biais et al. (2014) Plant Physiol 164:1204-1221 12 Acevedo de la Cruz et al. (2012) Anal Chim Acta
732:145-152 6 Ferry-Dumazet et al. (2011) BMC Plant Biol. 11:104 13 Moing et al. (2011) New Phytol. 190:683-696 7 Deborde & Jacob (2014) Exploring plant primary metabolism with MeRy-B a metabolomic database and knowledge base
dedicated to plant. In G Sriram, ed, Plant Metabolism: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press
108
P48
Combination of double isotopic labeling and high resolution mass spectrometry: a novel method for untargeted fungal metabolic profiling
Emilien L. Jamin1,2
, Patricia M. Cano1,2
, Souria Tadrist1, Pascal Bourdaudhui
1, Michel Péan
3,4,5,
Laurent Debrauwer1,2
, Isabelle P. Oswald
1,2, Marcel Delaforge
6, Olivier Puel
1,2
1 INRA, UMR 1331, Toxalim, Platform MetaToul-AXIOM-MetaboHUB, F-31027 Toulouse,
2 Université de Toulouse, INP, Toxalim, F-31076 Toulouse, 3 CEA, DSV, IBEB, Groupe de Recherches Appliquées en Phytotechnologie, F-13108 Saint-Paul-les-Durance,
4 CNRS, UMR Biologie Végétale & Microbiologie Environnementale, F-13108 Saint-Paul-les-Durance, 5 Aix-Marseille Université, F-13108 Saint-Paul-les-Durance,
6 CEA Saclay, iBiTec-S, SB2SM and URA CNRS 8221, F-91191 Gif sur Yvette
Characterization of fungal secondary metabolomes is of great concern since the last decades due to both the emergence of fungal threats to natural ecosystems and public health; and the industrial interest of natural products. However, the specific characterization of fungal metabolites among complex mixtures is still challenging. In this context, the aim of the present study was to develop an integrated and untargeted approach for analyzing fungal metabolomes, by combination of high resolution Fourier transform mass spectrometry and double isotopic labeling. This strategy efficiently enabled the unambiguous determination of exact chemical formulas, as well as the discrimination of non-fungal molecules. In our experiments, wheat grains represented the only source of carbon and nitrogen for fungal growth. The NRRL 35693 Aspergillus fumigatus strain, an important fungal pathogen which metabolome is quite well described, was used to develop and validate our approach. This strain was grown on three different wheat grain substrates, namely naturally enriched grains (99%
12C), 96.8%
13C enriched grains, and 53.4%
13C /
96.8% 15
N doubly labeled grains. This allowed discrimination of fungal metabolites against non-fungal compounds which remained unlabelled in the three substrates. Fungal origin was further confirmed by analysis of blank
12C wheat extracts (without any fungus). The use of a 50% 13C enrichment for the 13C/15N
wheat substrate resulted in nearly Gaussian-shaped isotopic patterns which enabled the specific detection of fungal metabolites. Furthermore, the m/z comparison of a same metabolite detected in the different cultures led to the unambiguous determination of the number of carbon and nitrogen atoms in the metabolite. This process was facilitated by using an in-house developed software “Mass Compare”, allowing (i) the generation of theoretical isotopic patterns from different isotopic enrichments, (ii) the comparison of different lists of possible chemical formulas obtained from the different isotopic enrichments, and (iii) the determination of the only possible chemical formula for each metabolite. This high-performance liquid chromatography−high-resolution mass spectrometry approach was successfully applied to the detection and unambiguous identification of twenty known metabolites of A. fumigatus. The identity of the metabolites was assigned using the AntiBase 2012 secondary metabolite database. Tandem mass spectrometry experiments carried out on the linear ion trap of the LTQ-Orbitrap XL instrument allowed to identify a new member of the fumigaclavins family: fumigaclavin D. Moreover, isotopic labeling also prevented compound misidentification due to e.g. solvent adducts formation. For example, the post biosynthesis methylation of tryptoquivaline F via extraction solvents (methanol) could be evidenced by revealing the presence of additional
12C or
14N atoms of non-fungal origin. The method was then applied to
the characterization of the less-known metabolome of Fusarium graminearum, for which only a few secondary metabolites have been described. 40 secondary metabolites could be unambiguously characterized (including fusaristatin A which had never been isolated from F. graminearum) as well as 30 other new metabolites. Among the 30 new compounds, 2 new fusaristatin have been identified. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés Mycotoxins, stable isotopes, mass spectrometry
109
P49
Comparative metabolomics and lipidomics extraction protocols to optimize the LC-MS fingerprinting of blood-derived samples
Pop Raluca Maria
a,b, Romanciuc Florina
c, Buzoianu Anca Dana
a, Socaciu Carmen
b,c
aUniversity of Medicine and Pharmacy “Iuliu Hatieganu”, 8 Victor Babes Street, Cluj-Napoca, Romania
bCentre for Applied Biotechnology CCD-BIODIATECH, Proplanta Ltd. Cluj-Napoca, Romania
cUniversity of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, 3-5 Mănăştur Street, Cluj-Napoca, Romania
Untargeted Metabolomics has been increasingly used as a versatile tool for the discovery of molecular biomarkers in many areas, to diagnose or establish the prognosis of the diseases and treatment response. Until now, no single method, accurate and comprehensive, is available to determine the whole profile (metabolome) by a single analysis. Hence, the application of non-targeted metabolomics to hundreds of biological samples is not yet practical. Therefore the common challenge for scientists working in this field is to overcome the difficulty to perform comprehensive metabolic profiling within one experiment. Here, we present a novel approach to combine both metabolomics and lipidomics specific extraction protocols in order to obtain a complementary fingerprint, from polar to non-polar metabolites. In the current study, we have developed a reproducible protocol for analysis of the blood serum metabolome by coupling UPLC with ESI(+) QTOF mass spectrometry. To evaluate the sensitivity, reproducibility (retention time, peak area, mass accuracy) and the ability of these methods to identify and discriminate disease biomarkers, we used serum from normal men and patients with different prostate-specific antigen (PSA) levels. For metabolomics, the deproteinization and extraction efficiency using methanol or acetonitrile were tested (protocols Ia and Ib), using ratios sample: extraction solvent of 1:2, 1:3 and 1:5, respectively. In case of lipidomics, the extraction was performed using either a mixture of chloroform: methanol: water (6:3:1, v/v/v) (protocol IIa) or a mixture of methyl tert-butyl ether: methanol: water (6:3:1, v/v/v) (protocol IIb), resulting two phases of polar and non-polar compounds. The profile of each phase was determined and compared by chemometry. The capability of solvents in reducing the levels of proteins and to extract a high diversity of serum molecules by protocols I-II were compared using for LC/MS separation a C18 Acclaim column and two different elution protocols (M and L) specific for metabolomics and lipidomics, respectively. All obtained data were evaluated by multivariate statistical tools, including principal component analysis (PCA). The results clearly indicated that in case of polar compounds, methanol extraction protocol Ia followed by separation M protocol was more efficient than methanol extracts from protocols IIa and IIb, separated by M protocol. For non-polar molecules, the chloroform extraction (protocol IIa) was more efficient than IIb. By enabling a simultaneous profiling of polar vs nonpolar serum metabolites, this technical approach may optimize the fingerprinting of blood-derived samples by a complementary and more comprehensive profiling.
110
P50
Profilage métabolique des graines de lin (Linum usitatissimum) en fonction des conditions pédoclimatiques.
Romain Roularda,b,
Christopher Wattiera, Roland Molinié
a, Jean-Xavier Fontaine
a, Emmanuel Petit
a,
Larbi Rhazib, François Mesnard
a.
a EA3900 BIOPI Biologie des Plantes et Innovation, UFR de Pharmacie, 1 rue des Louvels 80037 AMIENS cedex, France
b Institut Polytechnique LaSalle Beauvais, 19 rue Pierre Waguet, BP 30313, 60026 BEAUVAIS Cedex, France
Les composés de la graine de lin (Linum usitatissimum) suscitent un intérêt croissant depuis la dernière décennie. En effet, la graine de lin contient de grandes quantités
1 de métabolites originaux qui peuvent être
valorisés dans différents secteurs industriels. Les lignanes, par exemple, ont un intérêt dans l’industrie pharmaceutique pour leurs propriétés anti-oxydante et anti-cancéreuse
2. Le mucilage présent à la surface du
tégument de la graine possède des propriétés de viscosité et d’hydrophilie qui peuvent être mises à profit dans des procédés cosmétiques
3. Ainsi, il est nécessaire de connaître précisément le contenu en métabolites
de la graine de lin et ses éventuelles variations en fonction des conditions de culture.L’étude présentée ici concerne la composition de la graine de lin oléagineux de différentes variétés cultivées dans différentes régions entre 2011 et 2013. Les lignanes ont été analysés spécifiquement par HPLC-UV et la caractérisation en oses du mucilage a été réalisée par HPAEC-PAD. La RMN du proton a permis de réaliser un profilage métabolique des différentes graines.Les conditions pédoclimatiques semblent jouer un rôle sur le contenu en certains métabolites tels que des polyphénols ou encore les hétérosides cyanogénétiques. Le rendement en mucilage ainsi que sa composition semblent également affectés par les conditions pédoclimatiques. Références bibliographiques 1Hall III et al. (2008). Flaxseed. Advances in food and nutrition research, 51 : 1-97.
2Hu et al. (2007). Antioxidant activities of the flaxseed lignan secoisolariciresinol diglucoside, its aglycone secoisolariciresinol and the
mammalian lignans enterodiol and enterolactone in vitro. Food and Chemical Toxicology, 45(11) : 2219-2227. 3Prajapati et al. (2013). Pharmaceutical applications of various natural gums, mucilages and their modified forms. Carbohydrate
Polymers, 92(2) : 1685-1699.
Mots-clés Graine, Lin, métabolomique, lignanes, mucilage, hétérosides cyanogénétiques, RMN, HPAEC-PAD, HPLC-UV.
111
P51
Responses of the Phytophtora metabolome and transcriptome to “mock infection”
Adeline Harant1, Jasen Finch
2, Kabindra Kandel
1,3, John Draper
2, Michael Csukai
4, Ingo Hein
1,
Paul Birch3, Steve Whisson
1
1The James Hutton Institute, Invergowrie, Dundee DD2 5DA
2 Aberystwyth University, Penglaism Aberystwyth, Ceredigion SY23 3FL
3University of Dundee, Division of Plant Sciences at the James Hutton Institute, Invergowrie, Dundee, DD2 5DA
4 Syngenta, Jealott’s Hill International Research Center, Bracknell RG42 6EY.
Phytophthora infestans, the plant destroyer, is the most infamous oomycete plant pathogen. Causing potato late blight, it was responsible for the Irish Potato Famine in the mid-19th century. Most molecular studies of late blight focus on secreted pathogen effector proteins that promote infection, and plant resistance genes. Few studies have focused on P. infestans biology in the early stages of infection, especially on which nutrients the pathogen uses from plants. Here, a mass spectrometry approach, combined with global transcriptome analysis, is being used to identify which compounds are depleted from apoplastic fluid extracts from Nicotiana benthamiana leaves during P. infestans growth (‘mock’ infection), and which genes are regulated in this process. Samples were collected every 12 hours for three days. Metabolomic analysis revealed signals decreasing in the apoplastic fluid only. These included fatty acids, citric acid cycle intermediates and amino-acids. P. infestans genes upregulated when grown in apoplastic fluid were classified according to their functions. Transcripts encoding transport and metabolic proteins represented a large proportion, along with pathogenesis-related proteins. Future work will include accurately identifying compounds used by P. infestans, and more detailed temporal transcriptome analysis. This is the first global metabolomic study of P. infestans nutrition under infection-like conditions. Mots-clés Phytophthora infestans, plant-pathogen interactions
112
P52
Recherche de biomarqueurs par analyse métabolomique (LC-MS) d’une bactérie marine Pseudoalteromonas lipolytica TC8 issue d’un biofilm
Laurie Favre
1, Annick Ortalo-Magné
1, Jean-Charles Martin
2 & Gérald Culioli
1
1 Université de Toulon, MAPIEM, EA 4323, 83957 La Garde Cedex, France.
2 Aix-Marseille Université, UMR INSERM 476/INRA 1260, Faculté de Médecine de la Timone, 13385 Marseille, France.
Toute surface immergée en milieu marin est sujette à un processus de colonisation par un large éventail d’organismes (bactéries, diatomées, micro- et macro-algues, invertébrés, …) : ce phénomène naturel est communément appelé biofouling. L’une des étapes critiques de la colonisation consiste en la formation de biofilms [Railkin, 2004]. Au sein de ces structures complexes de micro-organismes insérés dans une matrice exopolymérique, les bactéries marines entrent pour une part importante [Stoodley, 2002]. L’analyse de la production métabolique des biofilms marins représente un élément-clé dans la compréhension de leur formation, de leur composition (diversité des espèces) et de leurs interactions avec les surfaces ainsi que les autres organismes colonisateurs. Les substances chimiques qui y sont produites sont très diverses et la structure chimique de la plupart d’entre-elles est le plus souvent inconnue [Goulitquer, 2012]. Pour pallier à la complexité de l’étude de ces matrices naturelles, une approche par métabolomique a été choisie. Le but est ainsi de mettre en évidence l’existence de biomarqueurs taxonomiques et d’état physiologique de bactéries marines, via des travaux de profilages métaboliques non ciblés puis ciblés qui pourront ensuite être appliqués à des biofilms complexes. Dans le cadre de ces travaux, une souche bactérienne Pseudoalteromonas lipolytica TC8, récoltée à partir d’un biofilm prélevé sur une surface inerte immergée dans la rade de Toulon (mer Méditerranée, France), a été initialement étudiée. Son métabolome a été analysé par LC-MS à différents stades de croissance lors de sa culture en mode planctonique. Les résultats révèlent une distinction claire de la production métabolique de cette souche en fonction de ses phases de croissance avec une variété chimique maximale en fin de phase stationnaire. Son métabolome lorsqu’elle est cultivée en biofilm a été également analysé et montre une composition significativement différente de celle obtenue en culture planctonique.
Références bibliographiques Goulitquer S., et al. (2012) Mass spectrometry-based metabolomics to elucidate functions in marine organisms and ecosystems. Mar
Drugs 10(4): 849-880. Railkin A. I. (2004). Marine biofouling : colonization processes and defenses. Boca Raton, Florida, US, CRC Press. Stoodley P.,et al. (2002) Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol 56: 187-209.
Mots clés Pseudoalteromonas lipolytica ; bactérie marine ; biofouling ; biofilm ; cultures planctoniques ; LC-MS.
113
P53
Optimisation de l’analyse métabolomique multimodale (RMN, GC-MS et LC-HRMS) de cultures cellulaires.
Blandine Madji Hounoum *, Hélène Blasco, Charlotte Veyrat-Durebex, Binta Diémé, Cinzia Bocca,
Lydie Nadal-Desbarats, Frédéric Montigny, Christian R Andres, Patrick Emond, Sylvie Mavel
INSERM U930, Université François Rabelais, CHRU, 37000 Tours, France
L’approche métabolomique dans des modèles cellulaires a émergé comme un outil prometteur avec des applications potentielles dans de nombreux domaines de la biotechnologie et de la recherche. Une étude métabolomique comprend classiquement quatre principales étapes : (i) conception expérimentale, (ii) collection et préparation des échantillons, (iii) analyse des échantillons, et (iv) traitement des données. Alors que ces étapes sont relativement standards pour la plupart des matrices biologiques, l’application de la métabolomique à l’étude des cellules implique des traitements spécifiques des échantillons. Parmi eux, la fixation «quenching», l’extraction des métabolites du milieu intracellulaire et la préparation des échantillons en vue d’une analyse métabolomique multimodale sont des étapes délicates et indispensables qui vont conditionner la faisabilité de l’analyse, la reproductibilité du profil et la fiabilité de l’interprétation biologique des données. Ainsi une optimisation des procédés de traitement des échantillons cellulaires qui ne font actuellement pas consensus est une phase clé de ce type d’études. Ce travail a pour but de mettre au point la méthodologie adéquate de préparation des échantillons cellulaires et d’optimiser les techniques d’analyses en fonction de trois techniques complémentaires : RMN, LC-HRMS et GC-MS. Dans le but d’approfondir l’hypothèse de l’excitotoxicité médiée par le glutamate dans la physiopathologie de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), la lignée cellulaire motoneuronale NSC-34 est utilisée comme modèle. Nous avons testé plusieurs méthodes de « quenching » : avec du méthanol à -20°C, -40°C vs sans méthanol à -80°C et plusieurs méthodes d’extraction avec différentes combinaisons de solvants : Acétonitrile, Méthanol, et Dichlorométhane. Les échantillons ont été analysés par RMN
1H. A partir des conditions
optimales d’extraction, nous avons optimisé les analyses en LC-HRMS et GC-MS. Pour la LC-HRMS, nous avons testé cinq gradients avec des solvants d’élution différents (Acétonitrile/Eau vs Méthanol/Eau) et trois volumes d’injection (5, 10, 20 µL). Pour la GC-MS, deux techniques de dérivation (oxymation + sylilation vs sylilation) ont également été testées. Afin de juger les performances des méthodes d’extraction, nous avons analysé les paramètres suivants : qualité du chromatogramme (signal/bruit), nombre de pics détectés et de métabolites identifiés. Nous avons montré une très grande variabilité de la qualité des résultats, et ces différents essais soutiennent la nécessité d’une optimisation préalable des protocoles de préparation et d’analyse des extraits cellulaires pour des analyses métabolomiques. Mots-clés Métabolomique, cellule, RMN, GC-MS, LC-HRMS
114
P54
Construction and application of reference MS spectral database for metabolite profiling and matrix annotation of plant organisms
N. Lamari 1*
, D. Jacob 1*
, C. Deborde 1*
, A. Moing 1*
, S. Bernillon 1*
1INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon (FR).
*Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard
Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon (FR).
In the past decades the use of “omics” technologies has taken up a very important position in the study of systems biology. Although a single analysis is not feasible to investigate the total genome, transcriptome and proteome, the data-mining of sequencing and proteins characterization are independent of the method used. On the other hand, the complexity level of metabolome, which includes an enormous variety and chemical diversity of molecules, shows that its analysis is a quite challenging task. One of the main advantages to perform a metabolomic analysis is due to the fact that metabolites represent the ultimate response of an organism to genetic and environmental changes. Although emerging technologies in mass spectrometry (MS) are increasing, there is no method that can simultaneously achieve the analysis of all metabolites. Despite MS-based techniques combined with chromatographic methods are in extensive development and continuous improvement, metabolite identification and biological matrix annotation remain limiting steps, especially in plants. In this study metabolite profiling of Solanum lycopersicum at two different growth stages were acquired by LC-micrOTOF-Q/MS in positive and negative mode. Using MS spectra-related information reported in the literature, secondary metabolites such as phenolic derivatives, flavonoids and glycoalkaloids were annotated. Although these compounds are extensively detected in plant metabolomics, the wide chemical diversity and the large number of MS analytical tools used for their detection do not allowed clear spectra comparisons and unambiguous identifications. Free and commercial metabolite spectral databases have greatly been developed over the last years but the poor spectra reproducibility and high inter-instruments variability in the generation of fragmentation patterns by LC-MS
[1] suggest that a homemade reference MS/MS spectral
repository development is useful to confirm peak annotations and to characterize “known unknown” compounds in tomato fruits. Therefore, in the MetaboHUB Infrastructure project (ANR-11-INBS-0010) we will contribute to acquire reference MS spectra in standardized conditions and enrich MS/MS spectral databases usable with any mass spectrometer and in any laboratory. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Référence bibliographique [1] Ichou et al. 2013. J Mass Spec 48, 179-186.
Mots-clés metabolomics, tomato fruits, MS spectra database.
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P55
Impact du stress thermique sur le métabolome du bénitier Tridacna maxima
Vaimiti Dubousquet1,2
, Gael Lecellier1, Véronique Berteaux
1, Cédric Bertrand
2
1 Centre de Recherche Insulaire et Observatoire de làvironnement (CRIOBE) - USR 3278, Papetoai, Moorea, Polynésie française.
2 Centre de Recherche Insulaire et Observatoire de l’environnement (CRIOBE) - USR 3278, Université de Perpignan, France
Laboratoire d’Excellence CORAIL
Les bénitiers sont des invertébrés marins des eaux tièdes peu profondes. Ils sont particulièrement présents et en grande densité dans les lagons de Polynésie française. Des échantillons génétiquement proches ont été sélectionnés pour réaliser une expérience de stress thermique. L’expérience a été conçue pour reproduire au mieux les conditions naturelles. Elle a été réalisée en circuit ouvert, pendant deux semaines, durée pendant laquelle des échantillons ont été prélevés régulièrement. Une approche intégrée alliant génomique, transcriptomique et métabolomique a été mise au point afin de déterminer les mécanismes cellulaires et la réponse métabolique concomittante mis en jeu lors de cette réponse. Concernant l’approche métabolomique, les métabolites ont été extraits et analysés par LC-MS et GC-MS. Les résultats montrent qu’une augmentation de température d’un degré celsius permet de discriminer immédiatement les échantillons provenant des individus ayant subi le stress des échantillons témoin, avec une modulation qualitative ou quantitative de différents métabolites. Cette différence s’accentue lorsque les bénitiers subissent le stress thermique de manière prolongée. L’ensemble des données métabolomiques et transcriptomiques devrait permettre de mieux comprendre et d’identifier de nouvelles voies cellulaires de réponse aux stress et/ou de nouveaux biomarqueurs. Mots-clés Tridacna maxima, stress thermique, profilage métabolique, biomarqueurs
116
P56
Use of 1H-NMR for the metabolomic study of flaxseed (Linum usitatissimum) in development
Miart F.
a, Pageau K.
a, Roulard R.
a, Fontaine J-X.
a, Molinie R.
a, Bouton S.
a, Fournet F.
a, Petit E.
a,
van Wuytswinkel O.a, Thomasset B.
b & Mesnard F.
a
a EA3900 BIOPI Biologie des Plantes et Innovation, UFR des Sciences, 33 rue Saint Leu, F-80039 Amiens France
b CNRS UMR6022 Génie Enzymatique et Cellulaire, Université de Technologie de Compiègne, BP 20529, F-60205 Compiègne cedex France
Interest for flaxseed (Linum usitatissimum) is actually growing because of its high content in valuable metabolites (mucilage, lignans and omega-3 fatty acids). Whereas the two first compounds accumulate in the seed coat, the last accumulates in the embryo. Fatty acid biosynthesis pathways has been largely characterized in the model species Arabidopsis thaliana [1] and a relation was demonstrated between genes involved in mucilage biosynthesis and the fatty acid content in embryo [2]. In addition, in flax, it was suggested a relation between lignans and oil rate using a
1H-NMR metabolomic approach [3]. In order to get information
about the inter-regulation of these three pathways in flax, phenotypic screenings on fatty acid composition and the secreted mucilage content was performed on recombinant inbreed lines from the crossing between Oliver and Viking. Three lines with different mucilage and omega-3 content profiles were then selected and harvested in greenhouse. Here we report a NMR metabolomic analysis method using a microprobe to follow the seed coat and embryo metabolic profiles of the selected lines at five developmental stages (10, 15, 25, 35, mature). Références bibliographiques [1] Dyer et al. (2008) Plant J. 54, 640-655. [2] L. Shi et al. (2012) Plant J. 69, 37-46. [3] A Ramsay, Memory of thesis, University of Picardie Jules Verne, 2011
Mots-clés NMR, flax, seed coat, mucilage, embryo fatty acids, lignans
117
P57
Plateforme de Lipidomique Fonctionnelle IBiSA, CarMeN/IMBL Bernoud-Hubac Nathalie
1, Guichardant Michel
1, Daira Patricia
1, Fourmaux Baptiste
1, Molière Patrick
2,
Picq Madeleine2, Lagarde Michel
1
1 INSA-Lyon 2 INSERM
The Functionnal Lipidomics platform (located at the Pasteur-IMBL building of INSA-Lyon) offers both expertise and assistance in lipidomics research. It is open to the whole private and public scientific community interested in lipid projects by means of fee-based analytical services and collaborative projects. The facilities include: advices to set up lipidomics projects, theorical and practical training in lipidomics, lipid analyses, technological survey and assistance in bringing projects to fruition. A wide range of lipid analyses are performed with the platform including analysis of fatty acid profiles from phospholipids, triacylglycerol and sterol esters, analysis of phospholipid classes, analysis of sterols and oxysterols, analysis of fatty acid oxygenated metabolites (eicosanoids, docosanoids…), analysis of lipid peroxidation products. The platform is equipped with Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS), Gas Liquid Chromatography (GLC), Gas Chromatography coupled with Mass Spectrometry (GC-MS), GC-MS/MS, analytical High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), preparative HPLC, analytical Ultra Pressure Liquid Chromatography (UPLC), Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC), Polarization Modulation Infra-Red Reflection Absorption Spectroscopy (PM-IRRAS), Brewster Angle Microscopy (BAM). Références bibliographiques 1.Lagarde M., Bernoud-Hubac N., Calzada C., Véricel E. and Guichardant M. (2013) Lipidomics of essential fatty acids and oxygenated
metabolites. Mol. Nutr. Food Res. 57:1347-1358. 2.Lefils-Lacourtablaise J., Socorro M., Géloën A., Daira P., Debard C., Loizon E., Guichardant M., Dominguez Z., Vidal H., Lagarde M.
and Bernoud-Hubac N. (2013) The eicosapentaenoic acid metabolite 15-Deoxy-D12,14-prostaglandin J3 increases adiponectin secretion by adipocytes partly via a PPARg-dependent mechanism. PLOS ONE 8:e63997.
3.Lagarde M, Bernoud-Hubac N, Guichardant M. Expanding the horizons of lipidomics. Towards fluxolipidomics. Mol Membr Biol. 2012 Nov;29(7):222-8. Review.
4.Guichardant M, Chen P, Liu M, Calzada C, Colas R, Véricel E, Lagarde M. Functional lipidomics of oxidized products from polyunsaturated fatty acids. Chem Phys Lipids. 2011 Sep;164(6):544-8. Review.
5.Lefils J, Géloën A, Vidal H, Lagarde M, Bernoud-Hubac N. Dietary DHA: time course of tissue uptake and effects on cytokine secretion in mice. Br J Nutr. 2010 Nov;104(9):1304-12.
6.Chen P, Fenet B, Michaud S, Tomczyk N, Véricel E, Lagarde M, Guichardant M.Full characterization of PDX, a neuroprotectin/protectin D1 isomer which inhibits blood platelet aggregation. FEBS Lett. 2009; 583(21):3478-3484.
7. Chen P, Véricel E, Lagarde M, Guichardant M. Poxytrins, a class of oxygenated products from polyunsaturated fatty acids, potently inhibit blood platelet aggregation. FASEB J. 2011; 25(1):382-388.
8.Bernoud-Hubac N, Alam DA, Lefils J, Davies SS, Amarnath V, Guichardant M, Roberts LJ 2nd, Lagarde M. Low concentrations of reactive gamma-ketoaldehydes prime thromboxane-dependent human platelet aggregation via p38-MAPK activation. Biochim Biophys Acta. 2009 Apr;1791(4):307-13.
9.Bacot S, Bernoud-Hubac N, Chantegrel B, Deshayes C, Doutheau A, Ponsin G, Lagarde M, Guichardant M. Evidence for in situ ethanolamine phospholipid adducts with hydroxy-alkenals. J Lipid Res. 2007 Apr;48(4):816-25.
10.Bacot S, Bernoud-Hubac N, Baddas N, Chantegrel B, Deshayes C, Doutheau A, Lagarde M, Guichardant M. Covalent binding of hydroxy-alkenals, 4-HDDE, 4-HHE and 4-HNE to ethanolamine phospholipid subclasses. J Lipid Res. 2003; 44(5):917-926.
Mots-clés Lipidomic analysis, liquid and gas chromatography, mass spectrometry, structural lipids, signaling lipids
118
P58
Profilage d’acides gras bactériens par analyse GC-MS : Compréhension du mécanisme intestinal murin.
Fabien Riols1, Sébastien Alguerola
1, François Tercé
2, Justine Bertrand-Michel
1
1 I2MC INSERM U1048, Plateau Metatoul-Lipidomique - MetaboHUB, Toulouse, France
2 I2MC INSERM U1048, Toulouse, France
Le microbiote intestinal est reconnu actuellement comme un acteur majeur du bon fonctionnement de notre métabolisme. Des altérations du microbiote sont associées et reliées de façon causale aux maladies métaboliques comme le diabète de type II et l’obésité chez les rongeurs ou l’homme. Un régime gras entraîne un déséquilibre du microbiote et altère la barrière intestinale, conduisant à une endotoxémie principalement par entrée de lipopolysaccharide, et le déclenchement de maladies métaboliques chez la souris. Cependant l’interdépendance entre les composés bactériens de notre intestin et notre métabolisme reste encore peu connue, de même que les mécanismes moléculaires permettant l’entrée de ces composés dans l’organisme hôte. La grande diversité des lipides, essentiels dans la structure des cellules et dans la régulation de nombreuses voies métaboliques en fait des molécules particulièrement intéressantes à étudier dans ce contexte. Pour tenter d’élucider ces problématiques, il est proposé de marquer à homogénéité des bactéries au
13C
et de les réimplanter dans l’intestin de souris afin de suivre le devenir des composés bactériens dans différents organes selon la situation physiologique de la souris. Le suivi des lipides bactériens marqués au
13C, dont certains sont communs aux lipides de l’hôte,
nécessite donc leur identification de façon claire et précise et la discrimination avec les lipides bactériens déjà présents dans l’organisme. Parmi les nombreuses classes de lipides à étudier, l’accent est tout d’abord mis sur des molécules simples, les acides gras, pour lesquels l’analyse par chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse (GC-MS) a été développée sur matrice bactérienne et murine. La caractérisation et l’optimisation de la détection des acides gras
12C/
13C a ainsi été mise en
place en mode impact électronique sur un appareil GC-MS de type ISQ.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés
Acides gras 12
C/13
C, mécanisme intestinal murin, GC-MS
119
P59
NMR metabolomics study of the glucose and glutamine metabolism modification during HCV infection
Gilles Rautureau
1, Pierre Lévy
2, Birke Bartosch
2,3 , Bénédicte Elena-Herrmann
1
1 Centre de RMN à Très Hauts Champs, Institut des Sciences Analytiques, CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon 1, 69100 Villeurbanne, France 2 Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052 CNRS 5286, 69003 Lyon, France
3 Hospices Civils de Lyon (HCL), 69004 Lyon, France
Background and aims: Hepatitis C virus (HCV) is known to perturb hepatic glucose and lipid metabolism with important pathophysiological consequences. Chronic carriers often develop steatosis, insulin resistance and type 2 diabetes, which resolve with successful antiviral treatment. The exact circumstances of this metabolic reprogramming still remain vague. Here we show that HCV infection induces an important modification of glucose utilization that seems to be in part compensated by anaplerotic mechanisms following an activation of glutamine metabolism. Methods: The properties of the hepatitis C virus (HCV) JFH1 isolate have made it possible to produce and study HCV in an infectious cell culture system.
1H and
13C-NMR-based metabolomics at 600-800MHz and
biological analyses in the context of diverse nutrient situations were performed with JFH1 infected Huh7.5 cell extracts and supernatants. The metabolic signature was obtained using a range of univariate and multivariate statistical methods. Results: NMR-based metabolomic assays showed that HCV infected cells have an impaired glucose utilization scheme compared to non-infected cells. The lactate production is highly increased in comparison to non-infected cells. The alternative source to glucose that drives the metabolism of HCV-infected cells appears to be glutamine. Indeed, cell proliferation rates of HCV infected and uninfected cells in conditioned growth media showed that infected cells become dependent on glutamine and lose their glucose dependence. Conclusions: Altogether, these data suggest that HCV reprograms the hepatocyte metabolism and establishes glutamine dependence. This HCV-induced metabolic reprogramming shares some similarities to that commonly found in many types of tumor cells. Mots-clés HCV, NMR, metabolomics
120
P60
Comparative analysis of Cerebrospinal Fluid (CSF) and serum in multiple sclerosis patients
Varennes O1,3
, Molinié R1, Laverdure C
2, Galmiche A
2, Constans JM
3, Al Khedr A
4, Mesnard F
1, Fliniaux
O1.
1 EA3900 BIOPI Biologie des Plantes et Innovation, UFR de Pharmacie, 1 rue des Louvels 80037 AMIENS Cedex, France 2 Centre de Biologie Humaine, Laboratoire de Biochimie, CHU AMIENS Sud, 80054 Amiens Cedex, France 3 Service de
Neuroradiologie, CHU AMIENS Nord, Place Victor Pauchet, 80054 Amiens Cedex, France 4 Service de Neurologie, CHU AMIENS Nord, Place Victor Pauchet, 80054 Amiens Cedex, France
Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating and neurodegenerative disease which affects specially the central nervous system. The MS diagnosis is difficult to confirm, because the clinical aspects are similar to some neurological diseases. To confirm the diagnosis of MS, the patient has to manifest a temporal criterion (an increase in the number of crisis in time) and a spatial criterion (an increase of the number of neurological lesions visible in MRI) (Milo et al., 2014). A biochemical criterion, in addition to the clinical manifestations, based on the evidence of the immunoglobulin isoelectric focusing, could confirm the diagnosis (Link et al., 2006). The research of NMR-based metabolomic
1H profiles to identify MS biomarkers has a great interest
(Sinclair et al., 2010). The comparative metabolomic analysis with 1H NMR of sera and CSF from 12 healthy
subjects, 9 MS patients who show more than 5 oligoclonal IgG bands, and 3 patients with a strong suspicion of MS and whom analysis of IgG revealed the presence of 3 or 4 oligoclonal IgG bands. A multivariate analysis of spectral data are conducting to search for discriminating metabolites according to pathological conditions. Références bibliographiques Milo et al. “Revised Diagnostic Criteria of Multiple Sclerosis.” Autoimmunity Reviews 13, no. 4–5. Diagnostic Criteria in Autoimmune
Diseases 9th International Congress on Autoimmunity (2014): 518–24. Link et al. “Oligoclonal Bands in Multiple Sclerosis Cerebrospinal Fluid: An Update on Methodology and Clinical Usefulness.” Journal of
Neuroimmunology 180, no. 1–2 (2006): 17–28. Sinclair et al. “NMR-based Metabolomic Analysis of Cerebrospinal Fluid and Serum in Neurological Diseases – a Diagnostic Tool?” NMR
in Biomedicine 23, no. 2 (2010): 123–132.
Mots-clés cerebrospinal fluid, serum, metabolomic,
1H-NMR, multiple sclerosis.
121
P61
Effect of PtMYB134 and PtMYB097 transcription factors overexpression on phenolic metabolism and transcriptome in hybrid Poplar.
Vincent Walker
1, Michael Reichelt
2 C. Peter Constabel
1
1 University of Victoria, Center for forest biology, Victoria, BC, Canada
2 Max Planck Institute for Chemical Ecology, Jena, Germany Plant phenolics are major compounds for plant defense in widespread plant families. In poplar, main defense phenolics are tannins and phenolics glycosides (PGs). MYB transcription factors are proteins involved in the regulation of various biosynthetic secondary metabolites pathways including phenylpropanoid pathway. During an insect attack, MYB transcription factors are up-regulated. We proposed in this study to assess the effect of two poplar MYB transcription factors MYB134 and MYB097 on phenolic metabolism of the entire poplar plantlet. After 4 months of growth, all parts of plants are harvested (leaves, bark, wood, roots) and we performed a metabolite profiling analysis in HPLC and a HPLC/MS/MS analysis for metabolites identification. First we found that the metabolite fingerprint is specific according part of plant and the overexpression of MYB 134 or MYB097. More specifically, tannins are more abundant in older leaves than young leaves and their synthesis is up-regulated by MYB134. For MYB097 over-expressor lines, we couldn’t find any increase of tannins synthesis but a slight increase in global phenolics glycosides. Second, we assessed the level of expression of specific flavonoids genes related to flavan-3-ol synthesis in the entire plant (in MYB134 and MYB097 transgenic lines). We found that MYB134 increase the expression level of these genes in the entire plant. The MYB097 overexpression induces an overexpression in bark, and a down regulation of targeted genes in leaves. This is the first study focusing on the effect of transcription factors at a metabolomics and transcriptomics scale, and we consider that this approach could be a good tool in order to determine some genes functions. Mots-clés Poplar, metabolite profiling, transcriptomic, transcritpion factor
122
P62
Compréhension des voies de régulation impliquées dans la biosynthèse de la lignine par profilage métabolique de lin (Linum usitatissimum) surexprimant le gène F5H
Anthony Quéro1, Emma Stepinac
1, Marie-Aude Tribalat
1, Cédric Decourtil
1, Roland Molinié
1,
Jean-Xavier Fontaine1, Ophélie Fliniaux
1, Rebecca Dauwe
1, Christophe Pineau
2, Eric Laine
3,
Christophe Hano3, Simon Hawkins
4, Brigitte Chabbert
5 et François Mesnard
1.
1- Laboratoire de BIOlogie des Plantes et Innovation (EA 3900) UPJV, IUT/GB, Avenue des Facultés, Le Bailly, 80025
Amiens Cedex, France. 2- Linea Semences de Lin, Bâtiment Serres-Transfert, Pas du Sourire d’Avril, rue d’Allery, 80000 Amiens, France. 3- Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures UPRES EA 1207, Antenne Scientifique Universitaire de
Chartres, 21 rue de Loigny la Bataille F-28000 Chartres, France. 4- UMR INRA N°1281 Stress Abiotiques et Différenciation des Végétaux Cultivés UFR de Biologie, Bât SN2 Université de
Lille 1 59655 Villeneuve d’Ascq cedex1. 5- INRA, UMR614 Fractionnement des AgroRessources et Environnement, 2 Esp R Garros, 51100 Reims, France.
La lignine présente une structure complexe constituée essentiellement d’unités hydroxyphényles (H), guaïcyles (G) et syringyle (S) obtenues à partir de 3 monolignols (alcool p-coumarylique, alcool coniférylique, alcool sinapylique). Cet hétéropolymère aromatique représente le deuxième composé naturel le plus abondant sur terre et sa présence dans les parois secondaires représente un frein à la valorisation des végétaux cultivés [1]. Chez le lin (Linum usitatissimum), la lignine est majoritairement représentée par les unités G et bien que le dépôt en lignine dans les fibres soit mineur (moins de 5%), sa présence constitue une limitation à la séparation des faisceaux en fibres unitaires lors du rouissage. De ce fait, la lignine joue un rôle déterminant lors de la valorisation du lin fibre et une meilleure compréhension des voies de régulation de la formation de ce biopolymère est nécessaire [2].Dans cette optique, différentes lignées surexprimant le gène impliqué dans la production de la férulate 5-hydroxylase (F5H) ont été obtenues. L’enzyme F5H gouverne une voie clé impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine. Elle permet la conversion du coniférylaldéhyde en 5-hydroxy-coniféraldéhyde qui constitue un des précurseurs des unités syringyles (S) de la lignine [3]. Une fois les plantes transgéniques obtenues et la sélection des plantes homozygotes transformées réalisée, un profilage métabolique des feuilles et des tiges de lin a été entrepris par GC-MS au niveau de composés polaires. La comparaison de ce métabolome obtenue à partir des plantes contrôles et des plantes modifiées génétiquement indique que la surexpression du gène F5H n’induit pas de modification notable du contenu en métabolites primaires chez le lin. Des analyses plus ciblées sur des composés présents à proximité des voies où intervient la F5H sont actuellement en cours.
Références bibliographiques
[1] Vanholme R. et al., Curr Opin Plant Biol, 2008, vol. 11, pp. 278-285 [2] Huis R. et al., Plant Physiol, 2012, vol. 158, pp. 1893-1915. [3] Stewart J.J. et al., Plant Physiol, 2009, vol. 150, pp. 621-635.
Mots-clés
lin (Linum usitatissimum), Férulate 5-hydroxylase, lignine, GC-MS, profilage métabolique
123
P63
HRMS dereplication, MS/MS networks and small molecule epigenetic modifiers:
tools to decipher cryptic metabolite pathways in fungal microorganisms
Pierre-Marie Allard1, Marija Perisic
1, Florence Mehl
1, Julien Boccard
1, Yung-Sing Wong
2,
Katia Gindro3, Jean-Luc Wolfender
1
1 School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva, University of Lausanne, Quai Ernest-Ansermet 30,
CH-1211 Geneva 4, Switzerland 2 Département de Pharmacochimie Moléculaire, Université Joseph Fourier, Grenoble 1, CNRS UMR 5063, CNRS ICMG FR
2607, bâtiment André Rassat, 470 rue de la Chimie, F-38041 Grenoble Cedex 9, France 3 S iss Federal Research Station Agroscope Changins-W dens il, Route de Duillier, P.O. Box 1012, CH-1260 Nyon,
Switzerland
Introduction The interest of microorganisms as a valuable source of bioactive compounds needs no more justifications. Since the discovery of Flemming’s penicillin G from Penicillium notatum at the beginnings of the XXth century to the isolation of the proteasome inhibitor salinosporamide A from Salinospora tropica in 2003, numerous valuable biologically active metabolites have been isolated from microorganisms. Recent insights from the progress in genetics have shed a new light on the biosynthesis of microbial natural products. It is now well known that under classical laboratory culture conditions, microorganisms only express a small proportion of their biosynthetic potential.[1] This phenomenon, known as gene cluster silencing, is very common and has been reported to occur in a vast range of living organisms.[2] Recently, new approaches aiming to address silenced biosynthetic pathways in eukaryotes have appeared. [3,4] One of our research interest is the de novo induction of secondary metabolites stimulated by the co-culture of diverse fungal strains [5,6]. In the present study, inductions mechanisms are studied under a different angle and it is hoped to gain new perspectives and deeper understanding of communication between fungi at the metabolite level. Methods In order to explore the hidden biosynthetic potential of filamentous fungi we used small molecule epigenetic modificators (EM) of various classes (HDACi, DNAMTi) on phylogenetically diverse fungal strains. A metabolomic approach implying UHPLC-HRMS analysis, semi-automated dereplication procedures, MS/MS spectral networks generation and multivariate data analysis was set up to detect the induction of novel metabolites and select promising fungal candidates for further scale-up culture. Results This workflow allowed us to highlight the production of various secondary metabolites not detected in control conditions. The application of HR-MS/MS networking provided valuable information regarding structures of the induced features. In particular, MS/MS networks allowed to reveal a family of closely related compounds as induced in one of the treated strain, thus indicating the probable unlocking of a common biosynthetic cluster.
124
Références bibliographiques
(1) Chiang, Y.-M.; Lee, K.-H.; Sanchez, J. F.; Keller, N. P.; Wang, C. C. C. Nat. Prod. Commun. 2009, 4, 1505–1510. (2) Gross, H. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2009, 12, 207–219. (3) Wang, X.; Sena Filho, J. G.; Hoover, A. R.; King, J. B.; Ellis, T. K.; Powell, D. R.; Cichewicz, R. H. J. Nat. Prod. 2010, 73, 942–948. (4) Williams, R. B.; Henrikson, J. C.; Hoover, A. R.; Lee, A. E.; Cichewicz, R. H. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 1895–1897. (5) Bertrand, S.; Schumpp, O.; Bohni, N.; Monod, M.; Gindro, K.; Wolfender, J.-L. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1157–1165. (6) Bertrand, S.; Schumpp, O.; Bohni, N.; Bujard, A.; Azzollini, A.; Monod, M.; Gindro, K.; Wolfender, J.-L. J. Chromatogr. A 2013, 1292, 219–228.
Mots-clés
HRMS dereplication, MS/MS spectral networks, epigenetic modification, fungal metabolome
125
P64
Détermination de biomarqueurs prédisant la mortalité dans le cas de patients atteints de choc septique par 1H RMN métabolomique
Z. Liu
1, M. Triba
1, R. Amathieu
2, N. Bouchemal
1, L. Le Moyec
3, P. Savarin
1
1 Université Paris 13, SorbonneParis Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France (METEVBO : plateforme Métabolomique Evry-Bobigny)
2 Service d’Hépatologie, Université Paris 13, UMR 1162, Hôpital Jean Verdier, Bondy, France 3 Université Evry, UBIAE, U902, France
Contexte: Le choc septique est la forme la plus sévère de sepsis. En France, il y a environ 75 000 nouveaux patients en choc septique chaque année. A cause du manque de finesse dans le diagnostic, le taux de mortalité reste élevé. A l’heure actuelle, le pronostic de ces patients est particulièrement délicat à préciser. Les praticiens hospitaliers manquent de marqueurs cliniques et biologiques fiables pour classifier le choc septique.C’est pourquoi, la métabolomique apparaît être une technique de choix permettantd’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs.Elle permet d’identifier et de quantifier des métabolites dans un fluide biologique. Objectifs: 1. Détermination de biomarqueurs qui prédisent la mortalité lors d’un choc septique. 2. Caractérisation des marqueurs de l’évolution de la maladie du patient. Matériel et méthodes : Nous disposons de 301 échantillons de sérum prélevés au moment de l’admission à l’hôpital (H0) et jusqu’à 7 jours après l’hospitalisation (J7) correspondant à 114 patients atteints de choc septique. 114 échantillons de 58 patients ont été analysés dans une étude préliminaire.Chaque échantillon a été analysé en RMN
1H à 23°C sur un spectromètre Bruker 500 MHz. Deux séquences d’acquisition1D ont
été utilisées: la séquence CPMG et la séquence NOESY1D. Letraitement des différents spectres obtenus est réalisé à l’aide du logiciel NMR Pipe (Delaglio et al., 1997). Les méthodes statistiques multivariées utilisées sont de type analyse en composantes principales ACP et OPLS. Résultats préliminaires: D’après les modèles supervisés établis, on a trouvé une discrimination entre les échantillons de patients vivants et décédés (décès à au plus 7 jours). De plus, certains métabolites ont été trouvés comme des marqueurs susceptibles de prédire l’évolution du choc septique entre H0 à H12 pour les survivants et pour les patients décédés.
Conclusion : L’analysedu suivi longitudinal des sera séquentiels sera effectuée de manière à déterminer des
biomarqueurs susceptibles d’affiner la prédiction de la récidive et le pronostic de patients traités.
126
P65
INTERET D’UNE APPROCHE MULTI-TECHNIQUES APPLIQUEE A L’ANALYSE METABOLOMIQUE DU SERUM
A.-L. ROYER, H. GALLART-AYALA, J.-P. ANTIGNAC, F. MONTEAU, B. LE BIZEC
LUNAM Université, ONIRIS, Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments
(LABERCA), Nantes, F-44307, France
L’analyse métabolomique du sérum a été utilisée avec succès pour la découverte de biomarqueurs d’intérêts notamment dans les domaines de la physiologie, de la toxicologie, ou encore de la nutrition. Cette approche, peu invasive, est considérée comme un indicateur important d’états physiologiques ou pathologiques. Le sérum contient en effet des centaines voire des milliers de métabolites fournissant par conséquent une vue d'ensemble appropriée du métabolisme de l'organisme. Au vue de la complexité de ce biofluide, une seule technique analytique ne peut permettre de détecter l’ensemble des métabolites présents au sein de ce dernier. Ainsi les approches analytiques multi-techniques sont requises pour étendre la détection des métabolites, ce qui en fait un des enjeux majeurs actuels dans le domaine de la métabolomique. Dans ce sens, une approche analytique multi-techniques couvrant l’ensemble des métabolites a été développée. Le profil métabolique du sérum a été réalisé d’une part par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse de haute résolution (LC-HRMS). Deux types de colonnes chromatographiques présentant des interactions complémentaires ont été utilisés afin de couvrir l’ensemble de la gamme de polarité retrouvé au sein du métabolisme. Une phase stationnaire inverse a été utilisée pour l'analyse des métabolites polaires tandis que pour la rétention et l'analyse des métabolites très polaires une méthode de chromatographie à interaction hydrophile (HILIC) a été appliquée. D’autre part, la matrice sérum a été également analysée avec une technique de chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) permettant ainsi d’étendre la couverture du métabolome. La complémentarité et la spécificité de ces trois techniques seront ainsi démontrées.
127
P66
Combining metabolite and enzymatic profiling during tomato fruit development
Mickaël Maucourt1*
, Camille Bénard3*
, Benoît Biais3, Patricia Ballias
3*, Catherine Deborde
3*, Bertrand
Beauvoit1, Sophie Colombié
3, Duyên Prodhomme
3*, Guillaume Ménard
3, Cécile Cabasson
1*, Vanessa
Zhendre3*
, Stéphane Bernillon3*
, Daniel Jacob3*
, Hélène Gautier2, Dominique Rolin
1*, Michel Génard
2,
Yves Gibon3*
, Annick Moing3*
1 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
2 INRA UR 1115 Plantes et Systèmes de culture Horticoles, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon, France
3 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
* Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard
Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
Abstract
The Fruit Integrative Modelling project is an Eranet EraSysBio+ project which aims at describing and
modelling the influence of environmental factors on tomato central metabolism during fruit development. In
this project, high-throughput biochemical phenotyping and NMR spectrometry have been used to characterise
fruit compounds and estimate their levels for tomato plants (Solanum lycopersicum cv Moneymaker)
cultivated in a greenhouse in control, low light and water stress conditions. One experiment focussed on the
effect of the stage of fruit development. Compositional changes in fruit pericarp were characterized at different
stages of fruit development, from 8 days post-anthesis to red-ripe stage using 1H-NMR profiling of polar
extracts and robotized analysis of starch, soluble proteins and measurement of enzyme activities of central
metabolism (Biais et al. 2014). Compositional data were processed using univariate, multivariate and
clustering analyses. Metabolite and enzyme profiling data were combined and visualized using networks in
order to highlight key points of metabolism regulation during fruit development.
Remerciements: FP7 Eranet EraSysBio+ FRIM project and MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Référence bibliographique
Biais B et al. 2014. Remarkable reproducibility of enzyme activity profiles in tomato fruits grown under contrasting environments provides a roadmap for studies of fruit metabolism. Plant Physiology 164, 1204-1221.
Mots-clés Solanum lycopersicum, fruit metabolism,
1H-NMR, metabolomics
128
P67-P68
MetaboLights: Metabolomics data repository and the role of COSMOS
Reza M Salek1,15
, Kenneth Haug1, Pablo Conesa
1, Mark Williams
1, Steffen Neumann
2, Philippe Rocca-Serra
8,
Eamonn Maguire8, Alejandra González-Beltrán
8, Susanna-Assunta Sansone
8, Julian L. Griffin
14,15, Elon Correa
10,
Theo Reijmers12
, Daniel Schober², Jan Hummel3, Kenny Billiau
3, Joachim Kopka
3, Antonio Rosato
4, Leonardo
Tenori4, 19
, Paola Turano4, Silvia Marin
5, Catherine Deborde
6, Daniel Jacob
6, Dominique Rolin
6, Benjamin
Dartigues7, Steve O’Hagan
10, Jie Hao
16, Michael van Vliet
12, Marko Sysi-Aho
13, Christian Ludwig
17, Jildau
Bouwman11
, Marta Cascante5, Timothy Ebbels
16, Annick Moing
6, Macha Nikolski
9 , Matej Oresic
13, Mark R. Viant
18,
Royston Goodacre10
, Ulrich L Günther17
, Thomas Hankemeier12
, Claudio Luchinat4 , Dirk Walther
3 and Christoph
Steinbeck1.
1 European Molecular Biology Laboratory, European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Wellcome Trust - 2 Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, United Kingdom - 3 Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, 06120 Halle, Germany - 4 Max Planck
Institute of Molecular Plant Physiology, 14476 Potsdam-Golm, Germany - 5 Magnetic Resonance Center (CERM), University of Florence, 50019 Sesto Fiorentino (FI), Italy - 6 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Biology Universitat de Barcelona,
Spain - 7 INRA, Univ. Bordeaux, UMR1332 Fruit Biology and Pathology, Metabolome Facility of Bordeaux Functional Genomics Center, MetaboHUB, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av Edouard Bourlaux, F-33140 Villenave d’Ornon, France - 8 Centre of bioinformatics of Bordeaux (CBIB), University of Bordeaux, 33000 Bordeaux, France - 9 University of Oxford e-Research Centre, 7 Keble Road, Oxford,
OX1 3QG, UK - 10 Univ. Bordeaux, CBiB / LaBRI, F-33000 Bordeaux, France - 11 School of Chemistry & Manchester Institute of Biotechnology, University of Manchester, 131 Princess St., M1 7DN, UK. - 12 Microbiology & Systems biology, TNO, Zeist, The
Netherlands - 13 Division of Analytical Biosciences, Leiden University, The Netherlands - 14 VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, FIN-02044, Finland - 15 Medical Research Council Human Nutrition Research, Fulbour Road, Cambridge, CB1 9NL, UK - 16
Department of Biochemistry, University of Cambridge, Cambridge, CB2 1GA, UK. - 17 Computational and Systems Medicine, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, London SW7 2AZ, UK. - 18 School of Cancer Sciences, University of
Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, UK - 19 School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, UK
The MetaboLights database was officially launched in 2012. It has now successfully established itself within the metabolomics community as the first open-access, general-purpose repository. In addition to a comprehensive metabolomics data archiving and metadata collection, we are now expanding its resources by adding a metabolite reference database, called the MetaboLight Reference Layer. The MetaboLight Reference Layer is a knowledge-based resource for metabolites, which includes biological and chemical meta-data. The MetaboLights Reference Layer holds over 9 200 metabolite datasets with structures, chemistry and species information from ChEBI, reaction integration with Rhea, literature integration with Europe PubMed Central, pathways visualiser curated by MetaboLights team, and finally NMR & MS reference spectra. New compounds submitted and subsequently curated in MetaboLights are assigned to relevant pathways in Reactome (where possible). We also highlight metabolites occurrence, concentration within species, organs, tissues and cell compartments, as well as their status as healthy or diseased. Our plan for future development is to provide tools to assist with visualising the metabolomics data. This includes visualising raw spectra, chromatograms or compound directly without a need to download the data, as well as linking the identified metabolite to our reference layer. In addition, over the next few years MetaboLights will exploit open-source tools and investigate workflows for the commonest approaches used in metabolomics, to provide a set of online-analysis tools.Moreover, one of our main purposes has always been to adapt and to further develop the MSI (Metabolomics Standards Initiative) standards. 2012 saw the launch of a global effort to enable free and open sharing of metabolomics data. Coordinated by the EMBL-EBI, COSMOS (Coordination of Standards in Metabolomics) brings together European data providers to set and promote community standards that will make it easier to disseminate metabolomics data through life science e-infrastructures. We work to combine highly curated reference layer with promotion of standard metabolomics submission, as well as interconnecting various metabolomics infrastructure resources. Therefore, we will be able to provide a comprehensive resource for the metabolomics community. Références bibliographiques 1- Steinbeck C et al., 2012. MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data management. Metabolomics 8:757-760 2- Haug K et al., 2013. MetaboLights—an open-access general-purpose repository for metabolomics studies and associated meta-data.
Nucl Acids Res 41 (D1): D781-D786 3 -Salek, RM et al., 2013, The MetaboLights repository: curation challenges in metabolomics. Database bat029
doi:10.1093/database/bat029 4 -Salek RM et al., 2014, COSMOS - COordination of Standards in MetabOlomicS: Facilitating integrated metabolomics data access. (in
preparation)
Mots-clés: data repository, metabolomic reference database
129
P69
Optimisation de la prise d’essai pour la détermination de profils métaboliques plasmatiques chez des modèles animaux
Mathieu Rambeau1, Mélanie Pétéra
1,2*, Charlotte Joly
1,2*, Sergio Polakof
1, Jérémie David
1,
Blandine Comte1, Estelle Pujos-Guillot
1,2*
1 INRA, UMR 1019, UNH, CRNH Auvergne, F-63000 CLERMONT-FERRAND
2 INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme- MetaboHUB, UNH, F-63000 CLERMONT-FERRAND
* PFEM-MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010) http://www.metabohub.fr/
Dans le cadre d’études nutritionnelles, la Plateforme d’Exploration du Métabolisme-MetaboHUB applique en routine une méthode d’analyse métabolomique non-ciblée par UPLC-ESI-QToF/MS développée et validée à partir d’échantillons de plasma humain [Pereira et al., 2010]. Cette étude, portant notamment sur les conditions de prélèvement et de préparation de l’échantillon (étapes critiques de l’approche métabolomique), avait conclu qu’une précipitation lente à froid des protéines par ajout de 400µL de méthanol à 200µL de plasma prélevé sur héparine permettait l’extraction d’un maximum de métabolites avec une reproductibilité optimale.Dans l’optique d’appliquer cette méthode aux études animales, il nous est apparu indispensable de réduire la prise d’essai initiale, car la quantité de plasma prélevée sur les animaux peut être limitée, surtout s’il s’agit de petits animaux et/ou si des prélèvements en cinétique sont effectués sur un laps de temps assez court lors d’études longitudinales. L’objectif de cette étude était donc de vérifier si la transposition du protocole original à une prise d’essai initiale réduite de plasma donnait des résultats comparables en terme de richesse des profils métaboliques obtenus et de variabilité analytique.Ce travail a été mené chez deux espèces animales différentes (9 rats et 5 mini-porcs). Pour chaque animal, 3 échantillons plasmatiques ont été obtenus, par prélèvement du sang total sur 3 concentrations différentes d’héparine, puis centrifugation. Chacun des 42 plasmas a été extrait 2 fois (prise d’essai de 50µL d’une part, de 200µL d’autre part). Après analyse par UPLC-ESI-QToF/MS des échantillons, les données brutes ont été extraites par XCMS afin de pouvoir étudier les profils métaboliques complets. Les analyses statistiques multivariées (PCA et PLS-DA) des données obtenues montrent que, chez le rat comme chez le mini-porc, la réduction de la prise d’essai à 50µL n’altère pas l’empreinte métabolique obtenue, malgré des différences inter-espèces. Ces résultats ouvrent ainsi des perspectives de miniaturisation des protocoles de préparation d’échantillons lors des études métabolomiques chez l’animal. Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Référence bibliographique Pereira et al., Development and validation of a UPLC/MS method for a nutritional metabolomic study of human plasma, Metabolomics, 6
(2010) 207-218
Mots-clés : analyse métabolomique non ciblée, optimisation, prise d’essai, plasma, modèles animaux
130
P70
Mass Spectrometry based metabolomic analysis of flax germinating seeds: Is there a remobilisation of the lignan macromolecule?
Thiombiano B 1,2
, Dauwe R1, Schiltz S
1, Molinié R
1 , Marcelo P
3, Grand E
2, Hano C
4, Thomasset
B5, Gontier E
1, Mesnard F
1.
1 UPJV, Biologie des Plantes et Innovation EA3900, 33 rue St-Leu 80039 Amiens, 2 UPJV, Laboratoire des Glucides FRE 3517 33 rue St-Leu 80039 Amiens, 3 UPJV, Plateforme d’ingénierie Cellulaire et Analyse des Protéines Pôle Santé 1-3, rue des Louvels, Amiens, 4 Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures Antenne Scientifique Universitaire de Chartres, 21 rue de
Loigny la Bataille, 28000 Chartres
5 Université de Technologie de Compiègne CNRS-FRE 3580, Génie Enzymatique et CellulaireCentre de Recherche de
Royallieu, Rue Roger Couttolenc, CS 60319, 60203 Compiègne cedex
During germination sugars, amino acids, organic acids and some phenolics are released in the spermosphere
and can play a role in seeds defense against pathogens (Windstam and Nelson, 2008) and the establishment
of favorables interactions between seeds and microrganisms (Ofec et al. 2011).Studies regarding the
spermosphere are numerous, however, they are limited to primary metabolites, and little is known about
secondary metabolites and their effects on microbial communities in the rhizosphere soil (Badri et al.
2009).To better understand the interactions between flaxseed and its environment during germination, we
have performed a metabolomic analysis of seed exudates (spermosphere).Flax (Linum usitatissimum:
Baladin) seeds were germinated in axenic condition in glass Petri dishes, and the exudates were collected
and freeze-dried. Metabolites were extracted from the exudates with and without basic hydrolysis to visualize
oligomers that accumulate as a complex form in flax seeds. Metabolites profiling were performed with GCMS
or LCMS. The peak table in both cases was recovered using the R packages «xcms» and «CAMERA».It was
shown that free phenyl propanoids normally known as a part of the lignan-macromolecule are detected during
germination (Secoisolariciresinol DiGlucoside: SDG, SDG-Hydroxy Methyl Glutarate, SDG-2HMG,
Lariciresinol DiGlucoside: LDG….). A correlation analysis revealed that the pathern of some of these
metabolites are highly correlated. Moreover the comparison of the amount of SDG, Herbacetine DiGlucoside,
LDG, CaAG, CouAG, FeAG… in the two tested conditions suggest they are mainly released in a complex
form. More identifications attempts are in way to elucidate the composition of these complex forms.
Références bibliographiques
Badri DV, Weir TL, van der Lelie D, Vivanco JM (2009) Rhizosphere chemical dialogues: plant microbe interactions. Current Opinion in Biotechnology 20: 642-50.
Maya Ofek YH, Dror Minz (2011) Colonization of cucumber seeds by bacteria during germination. Environmental Microbiology 13: 2794–2807
Windstam S, Nelson EB (2008) Temporal Release of Fatty Acids and Sugars in the Spermosphere: Impacts on Enterobacter cloacae-Induced Biological Control. Applied and environmental microbiology 74: 4292-4299.
Mots-clés
Seed germination, lignan macromolecule, Mass spectrometry.
131
P71
STRATÉGIE DE VALIDATION DE L’UTILISATION DE BIOMARQUEURS MIS EN ÉVIDENCE PAR APPROCHE MÉTABOLOMIQUE
Sylvain CHEREAU, Gaud DERVILLY-PINEL, Audrey GICQUIAU, Fabrice MONTEAU, Bruno Le Bizec
LUNAM Université, ONIRIS, Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments
(LABERCA), F-4430 Nantes, France
Depuis leur avènement, les approches métabolomiques ont montré leur pertinence notamment pour la mise en évidence de réponses biologiques liées à l’administration de molécules anabolisantes. En particulier, plusieurs études métabolomiques basées sur un couplage chromatographie liquide-spectrométrie de masse ont permis de discriminer des populations d’animaux traités (à l’aide de ces substances) de populations d’animaux témoins au travers de modèles statistiques descriptifs et/ou prédictifs [1-5]. A la suite de ces études exploratoires, plusieurs métabolites, candidats biomarqueurs, ont pu être mis en évidence grâce à des outils statistiques (ACP, (O)-PLS). Ces modèles (et donc ces candidats biomarqueurs) sont généralement établis sur la base d’échantillons collectés dans des conditions expérimentales bien maîtrisées et sur un nombre relativement faible d’animaux. Avant d’envisager la mise en œuvre officielle de ces modèles dans un contexte de dépistage de pratiques anabolisantes en élevage, il convient toutefois de valider l’outil ainsi développé. Dans ce sens, une première étape de validation de ces modèles a été d’évaluer leur capacité à prédire des échantillons issus d’expérimentations animales différentes: animaux différents (âge, genre…) mais aussi traitements anabolisants différents (en termes de molécule(s) administrée(s), de dose ou de durée). En effet, inclure de la variabilité biologique (au travers des animaux et des traitements utilisés) est primordial pour garantir la capacité du modèle à prédire, à l’échelle du territoire, des pratiques anabolisantes. L’objectif de cette présentation est d’illustrer, au travers de l’exemple d’un modèle dédié aux b-agonistes, quelques stratégies permettant d’assurer la pertinence et mais aussi la robustesse des biomarqueurs qui forment le modèle. L’implémentation de seuils de suspicion sera décrite et les performances du modèle associé seront discutées dans le cadre réglementaire européen des méthodes de dépistage.
Références bibliographiques
[1] Courant, F., et al., Analyst, 2009, 134: 1637-1646. [2] Anizan, S., et al., Journal of Chromatography A, 2010, 1217: 6652-6660. [3] Pinel, G., et al., Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29: 1269-1280. [4] Pinel, G., et al., Analytica Chimica Acta, 2011, 700: 144-154. [5] Dervilly-Pinel, G., et al., Drug Testing and Analysis, 2012, 4, 59-69.
Mots-clés
Validation, biomarqueurs, métabolomique
132
P72
Differential stable isotopic coding of the urine metabolome to measure exposure to dietary polyphenols in epidemiological studies
Achaintre D.
1, Cren C.
2, Li L.
3, Rinaldi S.
1, Scalbert A.
1
1 International Agency for Research on Cancer (IARC), Nutrition and Metabolism Section, Biomarkers Group, F-69372 Lyon, France 2 University Lyon 1, ENS Lyon, Institut des Sciences Analytiques, Departement Service Central d’Analyses, UMR5280, CNRS, Equipe
TRACES, F-69100 Villeurbanne, France 3 Department of Chemistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta T6G 2G2 Canada
A large number of studies support a role of polyphenols in the prevention of chronic diseases such as cardiovascular diseases, diabetes or cancers, however epidemiological evidence is still limited. Robust methods are needed to reliably assess exposure to a large variety of dietary polyphenols which can be easily applied to epidemiological studies. We report here the development of a quantitative method to measure dietary polyphenols in urine, based on differential metabolite coding with
12C- and
13C-dansylation labelling and quantification of the coded
metabolites by mass spectrometry. Urine samples are first hydrolysed with a β-glucuronidase / sulfatase enzyme mixture and the resulting polyphenol aglycones extracted twice with ethyl acetate. Quantitative dansylation of phenolic hydroxyl groups is carried out with
13C2-dansyl chloride (unknown urine samples), and a non-labelled
12C-dansyl chloride
(well-characterized reference pooled urine sample). 12
C-Dansylated reference sample and 13
C-dansylated samples are mixed and relative concentration in unknown samples over the reference sample are determined by UPLC-ESI-MS-MS. The method is set up for the measurement of 38 different polyphenols, and provides a simple and robust mean for measuring polyphenols in urine, and overcomes the need of having expensive labelled standards for each compound. This method will be applied to samples from the European Prospective Investigation of Cancer and Nutrition (EPIC) cohort, to study the association with dietary polyphenol intake (collected through questionniares). Référence bibliographique 1.Guo K, et Li L. Differential 12C-/13C-Isotope Dansylation Labeling and Fast Liquid Chromatography/Mass Spectrometry for Absolute and Relative Quantification of the Metabolome. Anal . Chem. 2009, 81, 3919-3932
Mots-clés Polyphenols, IDMS
133
P73
Towards high-throughput fluxomics and metabolomics analysis using Linear Trap
Quadropole Orbitrap Velos Mass Spectrometry and Capillary Ion Chromatography
H. Kulyk Barbier1; F. Bellvert
1; J-C. Portais
1,2, F. Létisse
2,3
1 MetaToul - MetaboHUB, F-31077 Toulouse,
2 Université de Toulouse; INSA, UPS, INP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, INRA,
3 UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse.
Recent advances in ‘-omics’ technologies and the development of new computational techniques and
algorithms have greatly contributed to progress in the field of biology. Among the main ‘-omics’ technologies,
metabolomics and fluxomics are expected to play a significant role in bridging the phenotype–genotype gap,
since they amplify changes in the proteome and provide a better representation of the phenotype of an
organism than other methods.
To date, there is no single analytical platform capable of covering all of the fluxomic and metabolomic
strategies with the maximum quality of results. Mass spectrometric techniques, including liquid
chromatography––mass spectrometry (LC/MS), gas chromatography––mass spectrometry (GC/MS),
capillary electrophoresis––mass spectrometry (CE/MS) are among the analytical techniques used in
fluxomics and metabolomics research1. These techniques commonly use up-front classical separation steps
to reduce the sample complexity and reduce suppression effects, thereby enhancing the detection sensitivity.
Such techniques increase the coverage of the metabolome, but at the same time add more challenges in data
processing due to the run-to-run variability of the chromatographic or electrophoretic separations, and
increase the analysis time. Improvement of separation techniques and of quantitative accuracy, enhancement
of the spectrum of simultaneously monitored metabolites, and developments towards flux phenotyping are top
priorities.
The poster presents our work demonstrating future approach to high-throughput analysis based on analytical
method using the latest analytical platforms such as Capillary Ion chromatography (ICS-5000+) coupled to
ESI-HRMS (LTQ Orbitrap Velos Thermo Scientific) and in-house developed software algorithms (IsoCor2 ,
Influx_s3 , IsoDesign
4 , IsoQuant (in preparation), MetaboQuant) for data processing. Capillary Ion
Chromatography is chosen as separation techniques since it provides enhanced detection sensitivity,
increased separation of isobaric metabolites involved mainly into the central carbon metabolism, sample-size
limited research, reduced time analysis and reliable data analysis.
Using LTQ Orbitrap as a high performance LC-MS and MSn system, combining rapid LTQ ion trap data
acquisition with high mass accuracy Orbitrap analysis, permits covering both strategies: metabolite profiling
and metabolic flux determination (fluxomics).
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Références bibliographiques
1 J Biol Chem, Jul 22, 2011; 286(29): 25435–25442. 2 Bioinformatics. 2012 May 1;28(9):1294-6 3 Bioinformatics. 2012 Mar 1;28(5):687-93 4 Biotechnol Bioeng. 2014 Jan;111(1):202-8
134
P74
Spectral Database: from data model to web interface
Nils Paulhe1, Christophe Duperier
1, Daniel Jacob
2, Étienne Thévenot
3, Jean-Francois Martin
4,
Franck Giacomoni1
1 Metabolism Exploration Platform - MetaboHUB, INRA (Clermont-Ferrand/Theix)
2 Bordeaux Metabolome Platform - MetaboHUB, INRA (Bordeaux) 3 The MetabolomeIDF - MetaboHUB, CEA (Saclay)
4 MetaToul - MetaboHUB, INRA (Toulouse)
MetaboHUB is a metabolomics and fluxomics infrastructure that provides tools to research teams and
partners. The Bioinformatics and Biostatistics service is specialized in NMR, GC- and LC-MS data processing
and analysis, from raw rata to metabolite identification. To challenge the annotation of these data and
centralize knowledge, a dedicated team is building a software to assist in identification, including a compound
and spectra database.
The core of the MetaboHUB Spectral Database, called data-model, is a computational representation of each
entity involved in Spectra analysis and Chemical Compounds identification. One of the strengths of the project
is the common work between chemical experts and bioinformaticians in data model design permitting respect
of logics and constraints uses in Metabolomics during data manipulation and storage. The software
architecture allows us to use parts of the project as standalone software, available for the community.
The data-model allow us to manage several types of chemical compounds (like standards or sub-structures)
and different types of Spectra (MS, MS/MS and NMR).
We will be able to approve the data-model with data from the chemical libraries provided by MetaboHUB
members.
One of the final goals of the spectral database is to provide a computed aided spectra identification tool, using
all these data thought a web-portal. Two milestones are coming: a first to provide a mechanism to import
spectral data in the data-model (which means in the database too), a second to define metadata around
spectral analysis.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés :
Database, metabolomics, spectra
135
P75
A study of the infection and defence mechanism of Linum usitatissimum inoculated
by Verticillium dahliae
Sylvain Lecomte1,2
, Charles-Henri Biard2, Laurent Gutierrez
3, Reynald Tavernier
2, François Mesnard
1,
Christophe Pineau2.
1 Laboratoire Biologie des Plantes et Innovation (BIOPI) EA3900, Université de Picardie Jules Verne Amiens, France.
2 Linéa – Semences de Lin, Grandvilliers, France
3 Centre de Ressources Régionales en Biologie Moléculaire, Amiens, France.
Verticillium dahliae is the root pathogen causing Verticillium wilt of flax (Linum usitatissimum), which is
nowadays a disease arising with increasing frequency involving considerable economical loss (Cariou-Pham
et al., 2009). However, in fields, characteristic behaviour of this disease consist of silver colour of flax stem
that appear at the final stage of cultivation during retting, when flax is lying on soil. Control of the disease is
very difficult to achieve, on the one hand, the soilborne pathogen can survive several years in soil by
producing resting structures (Fradin and Thomma, 2006), on the other hand, up to now effective fungicides
are not available. Consequently, the use of resistant cultivars is currently the most efficient measure. In this
work, we study the interaction between L. usitatissimum and three strains of V. dahliae, which were isolated
from French fields. The aim of this study is to understand the mechanisms involved in the plant response to
the pathogen and, thereby, to decipher flax resistance. For that purpose, three different approaches are used:
genetics, transcriptomics and metabolomics.
In order to better evaluate the symptoms of the disease, we developed an artificial infection protocol, which
consists of root inoculation of two weeks L. usitatissimum plants grown under controlled conditions with a
spore suspension of V. dahliae. This artificial infection induces chlorosis, necrosis, reduced growth and
premature senescence. Different behaviours were observed depending on the flax cultivar (more or less
susceptible but not resistant). In the same time, we developed a method allowing to assess the quantity of
fungus within the infected plants using real-time PCR. Based on amplification of ITS regions, our goal is to link
the quantity of fungus found in the plant to the severity of the symptoms, in controlled conditions as well as in
field conditions.
Candidate genes will be selected for their involvement in resistance pathways in others species. To address
the question of the role of these genes in the resistance to V. dahliae in flax, gene expression during the
infection phase will be quantified and sequence polymorphisms between tolerant and susceptible flax
cultivars will be analysed.
To characterize the plant defence mechanisms triggered by V. dahliae at the metabolome level, metabolomic
analyses will be performed on infected and non-infected cultivars using NMR and MS techniques. Moreover,
histological changes related to pathogen infection will be studied as well as chemical characterization of cell
wall polymers (pectins, polysaccharides and lignin).i
Références bibliographiques
Cariou-Pham, E., Bansar, M., Brochard, M., (2009). Influence of crop management and soil composition on Verticillium flax wilt. The French Association for Plant Protection, 9th International Conference on Plant Disease.
Fradin, E. F., & Thomma, P. H., (2006). Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V. albo-atrum. Molecular Plant Pathology, 7, 71- 86
Mots-clés
flax, Verticillium wilt, plant defence, large scale approaches
136
P76
Factory and Libraries for Automatic Metabolomic Exploration: F.L.A.M.E.
Marion LANDI 1, Mélanie PETERA
1, Misharl MONSOOR
2, Gildas LE CORGUILLE
2,
Christophe DUPERIER 1, Sophie GOULITQUER
2, Jean-François MARTIN
3, Pierre PERICARD
2, Etienne THEVENOT
4, Marie TREMBLAY-FRANCO
3, Christophe CARON
2, Franck
GIACOMONI 1.
1 PFEM - MetaboHUB, UMR1019 INRA, Centre Clermont-Ferrand-Theix, 63122, Saint Genès Champanelle, France
2 ABiMS - IFB, FR2424 CNRS-UPMC, Station Biologique, Place Georges Teissier, 29680, Roscoff, France
3 PF MetaToul-AXIOM - MetaboHUB, UMR 1331 Toxalim INRA, 180 chemin de Tournefeuille, F-31027, Toulouse, Frances
4 DRT/LIST/DM2I/LADIS IDF-MetaboHUB, Saclay Center CEA, F-91191, Gif-sur-Yvette, France
Le projet FLAME (Factory and Libraries for Automatic Metabolomic Exploration) a pour objectif de proposer à
la communauté scientifique internationale un outil bioinformatique rapide et efficace, disponible via une
interface web pour l’annotation expertisée et à haut débit des empreintes métabolomiques. Après une phase
de validation, nous avons sélectionné la plateforme web scientifique Galaxy, orientée génomique
(http://galaxyproject.org/), avec l’ambition de l’enrichir d’outils dédiés au traitement de données
métabolomiques. Dans le projet FLAME, l’approche de Galaxy s’est faite suivant deux angles distincts :
- celui d’une personne voulant contribuer à l’amélioration de cette plate-forme par le développement de
nouveaux outils ou par l’optimisation du fonctionnement général ;
- celui de l’utilisateur sans connaissance en informatique, qui souhaite traiter ses données brutes et aller
jusqu’à l’identification, voir à l’analyse des réseaux métaboliques.
Suivant l’approche d’amélioration de Galaxy, de nombreux scripts d’analyses ont été développés et/ou
intégrés à cette plateforme. Ils permettent l’extraction des signaux, des analyses statistiques et l’annotation
par interrogation de banques de données. La conception de chaque outil d’analyse s’effectue de manière à
ce qu’il puisse être enchaîné automatiquement avec d’autres par la fonctionnalité « workflows » de Galaxy.
Le projet FLAME a permis de nouer de solides collaborations avec la plateforme bioinformatique ABIMS et
les équipes de l’infrastructure nationale de métabolomique MetaboHUB. Ces échanges ont permis de
développer de nouveaux outils de traitement, d’augmenter leur fréquence de mise à jour et de diversifier les
stratégies d’analyses bioinformatiques.
L’environnement Galaxy se propose de mettre à disposition des plateformes de production et de traitement
de données en métabolomique, une boîte à outils aujourd’hui complète, des enchainements pré-paramétrés
et optimisés, tout en disposant d’une totale traçabilité des analyses effectuées.
Remerciements: MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project).
Mots-clés
Galaxy, bioinformatique, traitement de données, métabolomique.
137
P77
PHYTOCHEMICAL ANALYSIS OF TREE ROOT EXUDATES IN SITU AND THEIR
POSSIBLE IMPLICATION IN TREE N-ACQUISITION STRATEGY
Serge Michaleta,b*
, Julien Rohra, Denis Warshan
b, Clément Bardon
b,c, Jean-Christophe Roggy
c,
Floriant Bellverta, Gilles Comte
a, Franck Poly
a.
aUniversité Lyon1, CNRS, UMR5557, INRA, USC1364, Ecologie Microbienne, Centre d’Etude des Substances Naturelles, Villeurbanne,
F-69622, France.
bUniversité Lyon1, CNRS, UMR5557, INRA, USC1364, Ecologie Microbienne, Groupes Fonctionnels Microbiens et Cycle de l’Azote,
Villeurbanne, F-69622, France.
cINRA, UMR8172, Ecologie des Forêts de Guyane, BP 709, Kourou, F-97387, French Guiana.
Eperua falcata (Aublet), a late-successional species abundant in French Guiana, has developed an original
strategy concerning N-acquisition by largely preferring nitrate, rather than ammonium [1].Given this
preference for nitrate, we hypothesized that root exudates would promote nitrate availability by a) enhancing
nitrate production by stimulating ammonium oxidation or b) minimizing nitrate losses by inhibiting
dentrification. Root exudates were collected in situ in monospecific planted plots. The phytochemical analysis
of these exudates and of several of their corresponding root extracts was achieved using
UHPLC/DAD/ESI-QTOF. Our results show that (i) the distinct exudation patterns observed are related to
distinct root morphologies [Fig. 1], and this was associated with a shift in the root flavonoid content, (ii) a root
extract representative of the diverse compounds detected in roots showed a significant and selective
metabolic inhibition of isolated denitrifiers in vitro, and (iii) in soil plots the abundance of nirK-type denitrifiers
was negatively affected in rhizosphere soil compared to bulk. Altogether this led us to formulate hypothesis
concerning the ecological role of the identified compounds in relation to N-acquisition strategy of this species.
Fig. 1: PCA of the 27 exudates of E. falcata analysed and highlights of the three main groups corresponding with distinct root morphologies named “old”, “intermediate” and “young”.
Référence bibliographique [1] H. Schimann, S. Ponton, S. Hättenschwiler, B. Ferry, R. Lensi, A.M. Domenach, J.C. Roggy, Soil Biol. Biochem. 40 (2008)
487-494.
138
P78
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN HIGH THROUGHPUT METABOLOMIC STRATEGY TO REVEAL FUNGAL INTERSPECIES COMMUNICATION
Antonio Azzollini
1, Samuel Bertrand
1, Olivier Schumpp
2, Nadine Bohni
1, Michel Monod
3, Katia Gindro
2,
Jean-Luc Wolfender1
1 School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva, University of Lausanne, quai Ernest-Ansermet 30, CH-1211
Geneva 4, Switzerland
2 Swiss Federal Research Station Agroscope Changins-Wädenswil, Route de Duillier, P.O. Box 1012, CH-1260 Nyon, Switzerland
3 Department of Dermatology and Venereology, Laboratory of Mycology, CHUV, CH-1011 Lausanne, Switzerland
In the field of natural product (NP), finding new sources of bioactive compounds is of primary
importance. In this respect microorganisms have provided a large number of biologically active
molecules. Recently, the use of fungal co-culture for the induction of new NPs has emerged as a
promising field in drug discovery [1,2].
A key point for the success of such studies is the development of co-culture experiments that
provide high reproducibility of metabolite induction pattern and that are compatible with high
throughput analytical procedure.
To tackle this issue, a method based on 12-well plate miniaturized Petri dishes compatible with high
throughput UHPLC-TOF-MS metabolomics [3] has been developed. This strategy was used to
screen for metabolite induction and study their dynamics in the co-cultures of soil fungus Aspergillus
clavatus and a systemic human pathogenic fungus Fusarium sp.
This approach provided a satisfactory reproducibility and was used for the identification of induced
biomarkers. This study demonstrates the consistent induction of new metabolites through
co-culture.
This 12 well-plate approach and the adapted data mining strategy was validated by the untargeted
metabolomic study of a model co-culture, characterized by Eutypa lata and Botryosphaeria
obtusa, already known to produce de novo induced metabolites [1] and it is currently used for
screening new fungal co-cultures.
Acknowledgements: This work was supported by Swiss National Science Foundation Sinergia Grant
CRSII3_127187 (to J.-L. W., K. G. and M. M.).
Références bibliographiques [1] G. Glauser et al., J. Agr. Food. Chem., 2009, 57, 1127. [2] S. Bertrand et al., Biotechnol. Adv., 2014, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2014.1003.1001. [3] S. Bertrand et al., J. Chromatogr., A, 2013, 1292, 219-228.
139
P79
Impact de la dégradation de l’acide férulique sur le métabolisme primaire
d’Agrobacterium fabrum
T. Meyer, L. Vial, S. Renoud, L. Loiseau, X. Nesme, G. Comte et C. Lavire
Laboratoire d'Écologie Microbienne CESN, UMR CNRS 5557, USC INRA 1364 - Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, 43, Boulevard du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne cedex
Agrobacterium tumefaciens est un complexe d'espèces bactériennes vivant dans le sol et la
rhizosphère de nombreuses plantes avec lesquelles elles établissent des interactions
commensales anodines voire favorables de type PGPR. Les agrobactéries sont par ailleurs
connues pour induire la maladie de la galle du collet chez de nombreuses plantes mais ceci
concerne uniquement les agrobactéries qui hébergent un plasmide accessoire (i.e. plasmide Ti).
Des études précédentes ont montré qu’A. fabrum était particulièrement présent dans la rhizosphère
de la luzerne, Medicago truncatula (Mt). Par ailleurs, des comparaisons de génomes ont permis
d'identifier 8 régions génomiques spécifiques de l'espèce A. fabrum, absentes des autres espèces
d’Agrobacterium, et qui pourraient être impliquées dans des interactions entre bactérie et plante.
Afin de caractériser l'écologie spécifique des bactéries de l’espèce A. fabrum, en ciblant des traits
impliqués dans l’interaction de ces micro-organismes avec la plante, nous avons étudié la région
génomique impliquée dans la dégradation de l’acide férulique.
Alors que ce composé phénolique est connu pour inhiber la croissance de nombreuses bactéries,
il peut au contraire servir de ressource trophique pour les bactéries capables de le dégrader. La
caractérisation fonctionnelle de la voie de dégradation de l’acide férulique chez A. fabrum a montré
que ce groupe de gènes permet effectivement la dégradation de l’acide férulique, mais aussi
d’autres composés phénoliques tels que les acides coumarique et caféique. Ces composés sont
utilisés comme source de carbone et d’énergie pour la croissance, et les gènes impliqués sont
effectivement exprimés au contact des racines de Mt. L’étude de l’influence du métabolisme de
l’acide férulique sur les capacités trophiques de cette espèce a également mis en évidence que
l’acide férulique serait plus qu’une ressource trophique pour A. fabrum. En effet, par l’utilisation de
puce phénotypiques de type Biolog™, nous avons montré que la présence d’acide férulique dans le
milieu de culture modifiait les capacités d’A. fabrum C58 à utiliser comme ressource trophique
environ 10% des composés habituellement utilisés, certains appartenant au même réseau
métabolique. En outre, cette propriété semble altérée dans un mutant de délétion de la voie de
dégradation de l’acide férulique. Ainsi la dégradation de l’acide férulique aurait pour conséquence
une reprogrammation des capacités de la bactérie à utiliser certains composés végétaux (sucres,
acides organiques ou acides aminés) comme sources de carbone et d’énergie.
Nous présenterons l’impact de la dégradation de l’acide férulique sur le fonctionnement d’autres
voies métaboliques, nous aborderons les mécanismes à l’origine des modifications observées, et
l’importance écologique de ce phénomène.
140
P80
CORSAIRE (COopéRationS en métAbolomIque du gRand ouEst) : la plate-forme de BIOGENOUEST dédiée au profilage métabolique et à la métabolomique.
Laurent Rivet1, Alain Bouchereau2, Michel Krempf3
1Animateur, INRA, UMR IGEPP, Domaine de la Motte, BP 35327 - 35653 Le Rheu cedex
[email protected] 2Coordinateur, UMR IGEPP, INRA-Agrocampus Ouest-Université de Rennes 1, Rennes
[email protected] 3Coordinateur, UMR 1280 PHAM CRNH, SFR Santé, F Bonamy – IRS-UN. 8 quai Moncousu BP 70721 44007 Nantes cedex 1
La plate-forme CORSAIRE, créée en 2010, est la plate-forme de métabolomique et fluxomique du GIS Biogenouest. Elle a vocation à réunir compétences et technologies analytiques associées au profilage métabolique et à la métabolomique et à proposer un dispositif coordonné soutenant l’activité des structures de recherche adossées à Biogenouest et accessible à la communauté scientifique nationale. CORSAIRE est structuré en réseau de plateaux techniques supportés par différentes tutelles académiques (INRA, Universités, CNRS, INSERM) et implantées autours de 4 grands pôles géographiques du nord Ouest (Angers, Brest-Roscoff, Nantes et Rennes). La coordination centralisée du dispositif en réseau repose sur les complémentarités technologique et thématique des différents plateaux, sur l’harmonisation des procédures de fonctionnement et de conditions d’accès et sur le partage et la mutualisation d’outils bioinformatiques. Le réseau CORSAIRE couvre un large spectre de champs thématiques :
- Santé humaine, nutrition. - Agronomie : production animale et végétale, qualité et santé. - Mer : valorisation, adaptation, évolution. - Environnement. -Sécurité alimentaire.
Les savoir-faire relèvent à la fois de capacités d’analyses (qualitative, quantitative, structurale) ciblées de produits des métabolismes primaire, secondaire, de xénobiotique, médicaments, polluants à partir de matrices biologiques d’origines diversifiées (microbienne, animale, végétale) mais aussi d’approches holistiques à caractère métabolomique. La plate-forme dispose d'un très large parc analytique basé sur les technologies de RMN et de spectrométrie de masse en couplage avec différents moyens de chromatographie. Contact : Laurent Rivet, [email protected]
141
Atelier 1
Initiation au traitement et à l'analyse des données métabolomiques sur la plateforme Galaxy IFB-MetaboHUB.
Personnes encadrant la formation :
M. Landi, C. Duperier, M. Petera, F. Giacomoni. PF INRA PFEM-MetaboHUB
E. Thévenot. CEA, LIST- PF IDF-MetaboHUB
D. Jacob. PF INRA Métabolome Bordeaux-MetaboHUB
M Tremblay-Franco, J-F. Martin PF INRA AXIOM-MetaboHUB
G Le Corguillé, M Monsoor, Ch. Caron, S Goulitquer. PF CNRS ABIMS-IFB.
Public envisagé et les prérequis :
Public : L'atelier s'adresse en priorité aux expérimentateurs souhaitant analyser leurs données ; les
modules de traitement actuellement implémentés concernent uniquement les données
LC-MS mais les modules d'analyses statistiques peuvent également s'étendre aux
données de RMN. Il peut également être l'occasion pour les développeurs de scripts
informatiques de connaître les possibilités offertes par la plateforme web Galaxy.
Prérequis : Connaissances de base sur les étapes du traitement et de l'analyse des données
métabolomiques.
Objectif de la formation :
Formation de la communauté des métabolomiciens à l'utilisation de la plateforme web Galaxy de
traitement, d'analyse statistique et d'annotation des données développée conjointement par
l'Institut Français de Bioinformatique (IFB) et l'Infrastructure Nationale de Métabolomique
(MetaboHUB).
Compétences acquises à la sortie de la formation :
- Utilisation de premier niveau de la plateforme web Galaxy et connaissance de ses fonctionnalités
de gestion de workflows.
- Enchaînement des étapes de traitement et d'analyse sur la plateforme Galaxy de
l'IFB-MetaboHUB.
Durée de la formation : 3 heures.
Date : Lundi 19 mai à 10H en salle informatique, sur le lieu des 8 JS RFMF
Format : Travail pratique sur ordinateur (a priori, 2 personnes par ordinateur)
Nb de places max : 30 personnes (2 par ordinateur).
142
Table Ronde 2
Preparation of blood samples for metabolomic analyses. .
Personnes animant la table ronde :
Pekka Keski-Rahkonen IARC, Lyon
Estelle Pujos-Guillot PF INRA PFEM-MetaboHUB, Clermont-Ferrand
Claire Lopez UNH PF INRA PFEM-MetaboHUB, INRA Clermont-Ferrand
Elodie Jobart ENS Lyon.
Langue de la table ronde: Anglais
Thème :
Blood sample preparation is a key part of bioanalytical workflow for metabolomics and can have a
major effect on the performance and throughput of the method. In untargeted metabolomics, LC-MS
and GC-MS analyses of plasma or serum samples are typically performed after removal of proteins
from the sample, often employing traditional protein precipitation techniques with miscible organic
solvents. Further sample preparation steps such as derivatization may be necessary, depending on
the employed chromatographic technique. NMR-based metabolomics benefits from the ability to
perform direct analysis of plasma and serum, but can also benefit from pre-analytical sample
processing such as protein removal, controlling of the pH, and addition of internal standards.
However, even if the requirements for the samples in NMR and MS-based analyses are different,
the untargeted nature of metabolomics presents common challenges to both techniques. These
include sensitivity, maximum metabolite coverage, reproducibility and robustness, post-preparative
sample stability, and throughput. Yet, most of these objectives are difficult to monitor due to the lack
of defined target analytes to which traditional indexes of goodness of sample preparation can be
applied, making impossible the estimation of extraction recovery and matrix effect. In this workshop,
recent developments and the unique requirements for sample preparation in untargeted
metabolomics will be discussed.
Durée de la table ronde : 1 heure.
Date et lieu : Mercredi 21 mai à 14h dans l’amphi rotonde sur le lieu des 8 JS RFMF.
143
Table Ronde 3
High resolution mass spectrometry and metabolomics – Looking for best solutions to three major hurdles.
Personnes animant la table ronde :
Dinesh Barupal IARC, Lyon,
Christophe Junot PF IDF-MetaboHUB, CEA Saclay.
Langue de la table ronde: Anglais
Thème :
High resolution mass spectrometry enables detection and identification of metabolites in biological
matrices that were not amenable to conventional low resolution mass spectrometers, thus allowing
generation of metabolite datasets of many thousands metabolites. Setting up a metabolomics SOP
using a high-res mass spectrometer faces three major problems, stability of instrument over long
series of samples, rapid and standardized processing of raw data to generate statistics-ready data
matrices and structure elucidation of the detected compounds. While, stability of instruments can be
achieved by rigorous preventative steps and quality controls checks on instruments, new
developments are required in data processing and peak annotation for the generation of high quality
metabolomics datasets. Availability of free software such as XCMS, MzMine, and openMS can
streamline data processing and vender-specific software such as Agilent Qual and Mass profiler
professional are often used to generate data matrices, each with their own advantages and
disadvantages. Although, 5ppm or below threshold in mass matching is often used to annotate
mass spectral peaks, however it has been shown that even below 1ppm accuracy is not enough to
reliably identify compounds, warranting the inclusion of orthogonal information in compound
annotation pipelines. This information can include but is not limited to retention time and MS/MS
spectra. Availability of MS/MS spectra acquired using a high resolution mass spectrometer along
with chromatographic details can narrow down possible candidate compounds for peak annotation,
significantly reducing the number of false positive annotations. In this workshop, new developments
in above three issues related for high resolution mass spectrometry in metabolomics will be
discussed.
Durée de la table ronde : 2 heures.
Date et lieu : Mercredi 21 mai à 15h dans l’amphi rotonde sur le lieu des 8 JS RFMF.
144
Atelier 4
Hands on data submission to MetaboLights using ISATools. AND Maximizing ‘-Omics’ interoperability by promoting metabolomics open
standards data exchange formats: The biologist view.
Personne encadrant la formation : Reza Salek, EBI Cambridge UK.
EMBL - European Bioinformatics Institute.
Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge,
CB10 1SD, Royaume-Uni
Public envisagé et les prérequis :
o Expérimentateurs qui travaillent sur la gestion des données métabolomiques o Bioinformaticiens o Personnes qui souhaitent déposer des données lors d’une publication
Objectif de la formation:
L'objectif est d'acquérir une connaissance de l’architecture de la base MetaboLights et une certaine
autonomie dans le dépôt et la recherche de données métabolomiques.
Overview of MetaboLights: The MetaboLights metabolomics repository was officially launched
in June 2012 and is available under http://www.ebi.ac.uk/metabolights as well as
http://www.metabolights.org. MetaboLights is the first general-purpose, open-access repository for
metabolomics studies, their raw experimental data and associated metadata, maintained by one of
the major open-access data providers in molecular biology. The MetaboLights repository is
powered by the open source ISA frameworks for capture and annotating metabolomics
experiments.
The curated MetaboLights Reference layer is the new addition to our service, soon to be
released. In this reference layer, for each reference compound we display information about the
chemistry, biology, pathways, reactions, spectroscopy and literature. We are in the process of
importing more spectroscopic reference data from external data sources. It will also cover
metabolite structures and their reference spectra as well as their biological roles, locations,
concentrations and raw d ata from metabolic experiments.
COSMOS - COordination Of Standards In MetabOlomicS: COSMOS was setup in 2012 to bring
together leading researchers and bioinformaticians of the European metabolomics community,
members of the Metabolomics Society, along with other stakeholders worldwide to develop data
infrastructure and workflows for a broad range of metabolomics applications. COSMOS also
realizes that the potential of metabolomics cannot be harvested without major standardization of
formats and terminologies therefore extending on earlier efforts initiated by the MSI, PSI and
metabolomics society. COSMOS aims to work on common open source data exchange formats
(syntax) and data semantics that maximize interoperability with other ‘-Omics’ standards. More
information at (http://cosmos-fp7.eu/).
145
Compétences acquises à la sortie de la formation :…..
- Une compréhension générale de l'utilisation de MetaboLights et de l'outil d'édition ISAcreator - L’autonomie dans le dépôt de données sur MetaboLights
Durée de la formation : 2 heures.
Date et lieu : Mercredi 21 mai à 14h en salle informatique sur le lieu des 7 JS RFMF
Nb de places max : 30 personnes maximum.
Références bibliographiques :
Kenneth Haug, Reza M. Salek, Pablo Conesa, Janna Hastings, Paula de Matos, Mark Rijnbeek, Tejasvi Mahendraker, Mark Williams, Steffen Neumann, Philippe Rocca-Serra, Eamonn Maguire, Alejandra González-Beltrán, Susanna-Assunta Sansone, Julian L. Griffin and Christoph Steinbeck. MetaboLights-- an open-access general-purpose repository for metabolomics studies and associated meta-data. Nucl. Acids Res. (2012) doi: 10.1093/nar/gks1004
Steinbeck C, Conesa P, Haug K, Mahendraker T, Williams M, Maguire E, Rocca-Serra P, Sansone SA, Salek
RM, Griffin JL. MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data management. Metabolomics. 2012 Oct;8(5):757-760. Epub 2012 Sep 25. PubMed PMID: 23060735; PubMed Central PMCID: PMC3465651.
http:// www.ebi.ac.uk/metabolights
146
Liste des Participants
Achaintre David
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Aidoud Nacima
UMR Inserm 1062 / Inra 1260 Nutrition obésite et
risque thrombotique
27 bvd Jean Moulin, Fac Méd La Timone 13005
Marseille
Ait Moussa Samira
UMR 5557
8 avenue Rockefeller
69373 Lyon
Akoka Serge
CEISAM - Bat9
2 rue de la houssinière,
44322 Nantes cedex
Alexandre-Gouabau Marie-Cécile
INRA, UMR Physiologie des Adaptations
Nutritionnelles, CHU-Hôtel Dieu, HNB 1, Place
Alexis Ricordeau
44093 Nantes cedex
Allard Pierre-Marie
Phytochemistry and bioactive natural products
Université de Genève
Quai Ernest Ansermet 30,
1211 Genève 4
Suisse
Alves Sandra
IPCM-UMR 8232, Université Pierre et Marie
Curie
Bat F, 7ème
étage, porte 730, case 45
4 place Jussieu
75252, Paris cedex 05
Amiel Aurélien
INRA Toxalim
180 Chemin de Tourneufeuille
31300 Toulouse
Argyropoulos Dimitris
Magnetic Resonance Systems
Agilent Technologies UK
10 Mead Road, Yarnton, Oxford OX5 1QU
Royaume-Uni
Arnaud Luc Agilent Technologies France
Parc Technopolis ZA Courtaboeuf
3 av du Canada
91978 Les Ullis cedex
Aros-Calt Sandrine
Laboratoire d'Etude du Métabolisme des
Médicaments. DSV/iBiTec-S/SPI &
MetabolomeIDF-MetaboHUB
bat 136, CEA-Saclay
91191 Gif sur Yvette cedex
Arzur Danielle
INSERM 1078 ECLA
22 Av C Desmoulins
29200 Brest
Assemat Olivier
BRUKER
34 rue de l'Industrie, BP 10002
67166 Wissembourg
Assi Nada (Mme)
International Agency for Research on Cancer
150, cours Albert Thomas
69008 Lyon
Attala Suleiman
Medday Pharmaceuticals
ICM-iPEPS, Hôpital Pitié-Salpétrière
75013 Paris
Azzollini Antonio
Phytochimie et Produits Naturels Bioactifs
Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne
Section des Sciences Pharmaceutiques
Université de Genève
Quai Ernest Ansermet 30,
1211 Genève 4
Suisse
147
Baltenweck-Guyot Raymonde
UMR1131 INRA/UdS - équipe
MSV-Métabolisme secondaire de la Vigne
28 rue de Herrlisheim
68021 Colmar
Banaigs Bernard
CRIOBE, USR CNRS-EPHE-UPVD 3278
Université de Perpignan
52 avenue Paul Alduy
66860 Perpignan
Baverel Gabriel
METABOLYS
Faculté de Médecine Laennec,
rue G. Paradin
69008 Lyon
Bayle Marie-Laure
ROVALTAIN
1 avenue de la Gare
26300 Alixan
Bellvert Floriant
MetaToul-MetaboHUB
Ingénierie des Systèmes Biologiques et des
Procédés, UMR5504, UMR792 CNRS, INRA,
INSA, INSA Toulouse
31077 Toulouse cedex 4
Bernillon Stéphane
Plateforme Métabolome de
Bordeaux-MetaboHUB & UMR1332 Biologie du
Fruit et Pathologie
INRA Université de Bordeaux
71, avenue E. Bourleaux,
33140 Villenave d'Ornon
Bernoud-Hubac Nathalie
Plateforme de Lipidomique Fonctionnelle,
CarMeN/IMBL
69621 Villeurbanne
Berrocal Gwenaèle
CESN
6, Rue Raphaël Dubois
69100 Villeurbanne
Berthemy Antoine
Sanofi
195 Rte d'Espagne - BP13669
31036 Toulouse
Bertrand Cédric
CRIOBE USR 3278 UPVD
58 Avenue Paul Alduy
66860 Perpignan
Bertrand Samuel
Mer Molécules Santé
2 rue de la houssinère
44322 Nantes
Bertrand-Michel Justine
MetaToul-Lipidomique-MetaboHUB
Inserm U1048,
1av J Poulhes
31432 Toulouse
Bilbille Yann
CortecNet
15/17 rue des Tilleuls
78960 Voisins Le Bretonneux
Blondel Claire
LECA
2233 Rue de la Piscine
38041 Grenoble Cedex 9
Boccard Julien
Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne
20 Bd d'Yvoy
CH-1211 Genève 4,
Suisse
Bohni Nadine
School of Pharmaceutical Sciences, University of
Geneva, University of Lausanne
Quai Ernest-Ansermet 30
1211 Geneva 4
Suisse
Bonnard Isabelle
CRIOBE, USR CNRS-EPHE-UPVD 3278
Université de Perpignan
58 Avenue Paul Alduy
66860 Perpignan
Boquet Gérald
Sanofi
9, quai Jules Guesde
94403 Vitry sur Seine
Bouchemal Nadia
CSPBAT - UMR CNRS 7244
UFR SMBH
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
148
Bouchereau Alain
UMR 1349 IGEPP, INRA-Agrocampus
Ouest-Université de Rennes 1
Domaine de la Motte
35653 Le Rheu cedex
Boudah Samia
Laboratoire d'Etude du Métabolisme des
Médicaments. CEA-Saclay
69 Rue de Paris
91400 Orsay
Boudra Hamid
INRA, UMRH-DIMA
63122 Saint Genès Champanelle
Briand Gilbert
Centre de Biologie Pathologie
Bd du Professeur J. Leclercq
59037 Lille cedex
Buatois Bruno
Centre d'écologie fonctionnelle et évolutive
1919, Route de Mende
34293 Montpellier Cedex5
Bukhari Syed (M)
Nonlinear Dynamics
Keel House - Garth Heads
NE 12 JE Newcastle upon Tyne
Royaume-Uni
Bulete Audrey
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Bunescu Andrei
Bioaster
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Cabasson Cécile
UMR1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome de
Bordeaux-MetaboHUB
INRA Université de Bordeaux
71, avenue E. Bourleaux,
33140 Villenave d'Ornon
Canlet Cécile
UMR INRA 1331 TOXALIM
&MetaTOUL-AXIOM-MetaboHUB
180, chemin de Tournefeuille
31931 Toulouse cedex 9
Caron Christophe
Station Biologique – CNRS
ABiMS /Place Georges Teissier
29680 Roscoff
Carvalho Maryline
Thermo Fisher Scientific
16 avenue du Québec - SILIC 765
91 963 Courtaboeuf cedex
Centeno Delphine
UMR 1019 / Plate Forme d'Exploration du
Métabolisme - MetaboHUB
INRA Clermont Ferrand / Theix
63122 Saint Genès Champanelle
Cerveau Laurent
R.I.C.
4 place Berthe Morisot
69800 Saint Priest
Chao de la Barca Juan Manuel
Département de Biologie neuro-vasculaire et
Mitochondrie Intégrées
Institut de Biologie en Santé, CHU.
4, Rue Larrey
49100 Angers
Charles Christian
SIGMA PLUS
6 rue Collange
92300 Levallois-Perret
Chéreau Sylvain
ONIRIS-LABERCA
ONIRIS Chantrerie, Route de Gachet
44307 Nantes
Colsch Benoît
CEA, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM - IDF-
MetaboHUB
Centre CEA-SACLAY
91190 Gif sur Yvette
Combourieu Bruno
ROVALTAIN
1 avenue de la Gare
26300 Alixan
Comte Blandine
Unité de Nutrition Humaine Centre de
Clermont/Theix
63210 St Genes-Champanelle
149
Comte Gilles
CESN
Batiment FOREL - 6, rue Dubois
69100 Villeurbanne
Conan Céline
Laboratoire de Biologie Intégrative des Modèles
Marins (LBI2M)
Place Georges Teissier
29688 Roscoff
Corbin Agnès
NonlinearDynamics
Keel House Garth Heads
NJ1 2 JE
Newcastle Upon Tyne, UK
Corcos Laurent
INSERM U1078-ECLA
Faculté de médecine,
22 avenue Camille Desmoulins
29200 Brest
Coronado Sandra
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Cortay Hélène
IBCP-CNRS U.5086
7 passage du vercors
69007 Lyon
Cotton Jérome
CEA/Profilomic
31 rue d'Aguesseau
92100 Boulogne Billancourt
Coupat Bastien
INRA PFEM
Centre de Clermont-Ferrand -Theix
63122 Saint Genès Champanelle
Courant Frédérique UMR Hydrosciences - Université Montpellier
Département Sciences de l'Environnement et
Santé Publique - Faculté de Pharmacie,
15, Av Charles Flahault
34093 Montpellier
Cren-Olivé Cécile
Université Lyon 1, ENS Lyon,
Institut des Sciences Analytiques,
Departement Service Central d’Analyses,
UMR5280, CNRS, Equipe TRACES,
69100 Villeurbanne
Croyal Mikael
CRNH- UMR1280 Phan
IRS-UN, 8 quai Moncousu
44007 Nantes
Cuperlovic-Culf Miroslava (Mme)
National Research Council
100 des Aboiteaux Street, Suite 1100,
Moncton, N.B., E1A 7R1,
Canada
da Silva Ricardo Roberto
University of São Paulo
Av. Bandeirantes 3900, Bairro Vila Monte Alegre
14040900 São Paulo
Brésil
Daniele Gaelle
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Deborde Catherine
Plate-forme Métabolome Bordeaux -MetaboHUB
&UMR1332 Biologie du Fruit & Pathologie,
INRA Université Bordeaux
71, avenue E. Bourlaux,
33140 Villenave d'Ornon
Dechaumet Sylvain
IGEPP
Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Defoort Catherine
UMR INSERM 1062 NORT
9 place Antide Boyer
13009 Marseille
Delecolle Julien
Laboratoires LEHNING
3 rue du Petit Marais
57640 Sainte-Barbe
Desoubzdanne Denis
Ingénieur de Recherche en Métabolomique.
150
Diaz Olivier
Centre International de Recherche en Infectiologie
(CIRI)
21, Avenue Tony Garnier
69007 Lyon
Diémé Binta
Equipe 2-Inserm U930
Bâtiment vialle
10 bd Tonnellé
37032 Tours cedex 1
Dijoux-Franca Marie-Geneviève
UMR 5557
8 avenue Rockefeller
69373 Lyon
Dubin Elodie
Eurofins Analytics France
rue Adolphe Bobierre
44300 Nantes
Ducruix Céline
Profilomic
CEA saclay
91191 Gif sur yvette
Duperier Christophe
PFEM - MetaboHUB
Route de Saint Genès
63122 Saint Genès Champanelle
Dupuy Nathalie
LISA-METICA
Faculté de Saint Jérôme Case 451
13397 Marseille
Durand Mélanie
SIGMA ALDRICH
80 Rue de Luzais
78300 Poissy
Dury Lauriane
IBCP BMSSI
7 Passage du Vercors
69367 Lyon cedex 07
El Ghezal Salma
IBMM
Université Montpellier 2
34095 Montpellier
Elena-Herrmann Bénédicte
Institut des Sciences Analytiques / CRMN
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Emond Patrick
UMR INSERM 930
Equipe Neurométabolomique
10 bd Tonnellé BP3223
37032 Tours cedex 1
Fauvelle Florence
IRMaGe Grenoble-Institut des Neurosciences -
Inserm U836
Chemin Fortuné Ferrini - Batiment Edmond J
Safra
38700 La Tronche
Favé Gaëlle
NORT, UMR Inserm 1062 / Inra 1260 / Aix
Marseille Université
27 boulevard Jean Moulin
13385 Marseille
Favre Laurie
MAPIEM
SeaTech Ecole d'Ingénieurs, Bât X
Université de Toulon BP 20132
83957 La Garde
Febvay Gérard
UMR 203 INRA / INSA BF2I
INSA Bât L. Pasteur, 20 Av A. Einstein
69621 Villeurbanne cedex
Feraud Baptiste
UCL - ISBA
Voie du Roman Pays 20 bte L1.04.01
1348 Louvain-la-Neuve
Belgique
Ferchaud-Roucher Véronique
Plateforme spectrométrie de masse CRNH-
UMR1280 Phan
IRT-UN 8 quai Moncousu BP70721
44007 Nantes
Fildier Aurélie
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
151
Sébastien Folz
Thermo Fisher Scientific
16 avenue du Québec - SILIC 765
91 963 Courtaboeuf cedex
Frainay Clément
Toxalim
180 Chemin de Tournefeuille
31300 Toulouse
Gagnebin Yoric
Ecole de Pharmacie Genève Lausanne
20 Boulevard d'Yvoy
1211 Genève
Suisse
Gaillard Vincent
Centre d'Etude des Substances Naturelles -
UMR5557 Ecologie Microbienne
UCB Lyon 1
Bât. Forel 4ème
étage - 43 bd du 11 Novembre
1918
69622 Villeurbanne Cedex
Gallart Ayala Hector
LABERCA
Route Gachet-Site Chantrerie
44307 Nantes
Gaquerel Emmanuel
Centre for Organismal Studies (COS)
Im Neuenheimer Feld 360
69120 Heidelberg
Allemagne
Gavey Bernard
Sanofi
13 quai Jules Guesdes
94400 Vitry sur Seine
Giacomoni Franck
INRA - UNH-PFEM - MetaboHUB
Centre INRA de Theix
63122 St Genès Champanelle
Ginies Christian
UMR NORT
Faculté de médecine la Timone
27 boulevard Jean Moulin
13385 Marseille
Gomez Elena
UMR Hydrosciences - Université Montpellier
Département Sciences de l'Environnement et
Santé Publique - Faculté de Pharmacie,
15, Av Charles Flahault
34093 Montpellier
Gonçalves-Martins Maximilien
CESN
UMR CNRS 5557 - CESN (Centre d’Étude des
Substances Naturelles) Université Claude Bernard
Lyon 1 Bâtiment Forel
6, rue Raphaël DUBOIS
69622 Villeurbanne
Gontier Eric
BIOPI EA3900-UPJV "Biologie des Plantes et
Innovation"
Ilot des poulies, UFR de Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens
Goossens Corentine
Metevbo, CSPBAT-UMR7244, UP13
74, rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Gosselin Isabelle
Génie Enzymatique et Cellulaire FRE 3580
UPJV-CNRS
33 rue Saint-Leu
80039 Amiens
Goulitquer Sophie
MétaboMER, Station Biologique Roscoff
Place Georges Tessier
29680 Roscoff
Govaerts Bernadette
ISBA-UCL
20 voie du roman pays
1348 Louvain-la-neuve
Belgique
Greff Stéphane
IMBE UMR CNRS 7263
Aix-Marseille Université - Centre Saint-Charles -
case 4
3, place Victor Hugo
13331 Marseille cedex 03
Grovel Olivier
Mer Molécules Santé - Université de Nantes
2 rue de la Houssinère
44322 Nantes
152
Guichardant Michel
INSA
20 Avenue A. Einstein
69370 Villeurbanne
Guitton Yann
Mer Molecule Santé
2 rue de la Houssinière - BP92208
44322 Nantes
Haddad Mohamed
PharmaDEV, UMR152 IRD/UPS
35 chemin des Maraîchers
31400 Toulouse
Halter David
INRA Colmar
82 rue de Herrlisheim
68000 Colmar
Hamzaoui Jihane (Mme)
Centre d'Etude des Substances Naturelles -
6 Rue Raphaël Dubois
69100 Villeurbanne
Hance Philippe
UMR SADV USTL/INRA 1281
USTL - Avenue Mendeleïv -Bât SN2
59655 Villeneuve d'Ascq
Harant Adeline
The James Hutton Institute Invergowrie
DD2 5DA Dundee
Royaume-Uni
Hay de Bettignies Anne-Emmanuelle
CESN -LEM
Université Claude Bernard Lyon I - 43,
Boulevard du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne
Heude Clément
Bruker BioSpin, Laboratoire d’application RMN,
34 rue de l’industrie,
67166 Wissembourg
Université de Strasbourg, IMIS/ICube,
67000 Strasbourg
Huc Laurence
ToxAlim
180 Chemin de Tournefeuille, BP 93173 31027
Hugueney Philippe
Métabolisme Secondaire de la Vigne. UMR 1131
INRA-Université de Strasbourg.
28 rue de Herrlisheim BP 20507,
68021 Colmar
Hutinel Olivier
ABSCIEX
3, avenue du Canada - Parc Technopolis -
Bâtiment Sigma
91940 Les Ulis
Ichou Farid
Institut du cerveau et de la moelle épinière
47 Boulevard Hôpital
75013 Paris
Illig Thomas
Hannover Medical School, Hannover Unified
Biobank,
Hannover,
Allemagne
Jacob Daniel
Plate-forme Métabolome Bordeaux-MetaboHUB,
&UMR1332 Biologie du Fruit & Pathologie,
INRA
71, avenue E. Bourleaux,
33140 Villenave d'Ornon
Jamin Emilien
MetaToul-AXIOM-MetaboHUB
180 chemin de tournefeuille
31027 Toulouse
Janin Maxime
Laboratoire de métabolomique et protéomique,
Hôpital Necker
149, rue de Sèvres
75015 Paris
Jezequel Tangi (M)
CEISAM Nantes-INRA Bordeaux
2 rue de la Houssinière
44322 Nantes Cedex 3
Jobard Elodie
Institut des Sciences Analytiques/CRMN
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
153
Jorge Lucie
RIC bvba
Kennedypark 26
8500 Kortrijk
Belgique
Jourdain Sabine
Bruker Daltonique
34 rue de l'industrie
67166 Wissembourg
Jourdan Fabien
INRA TOXALIM & MetaboHUB
180 chemin de Tournefeuille
St-Martin-du-Touch BP 3
31931 Toulouse cedex
Jousse Cyril
ICCF/PFEM
Chimie 4 (1er étage),
24 avenue des Landais, BP 80026
63171 Aubière
Junot Christophe
Laboratoire d'Etude du Métabolisme des
Médicaments. DSV/iBiTec-S/SPI &
MetabolomeIDF-MetaboHUB
bat 136, CEA-Saclay
91191 Gif sur Yvette cedex
Kerzaon Isabelle
CESN ISPB UMR5557 Ecologie Microbienne
UCB Lyon 1
Pavillon Netien 2ème
étage
8 av. Rockefeller
69373 Lyon
Keski-Rahkonen Pekka
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Kiss Agneta
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Kulyk Barbier Hanna
LISBP, Plateforme MetaToul- MetaboHUB
135 avenue de Rangueil
31077 Toulouse
Kumar Barupal Dinesh (M.)
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Lagarde Michel
Plateforme de Lipidomique Fonctionnelle,
CarMeN/IMBL
69621 Villeurbanne
Lalande-Martin Julie
CEISAM
2 rue de la Houssinière
44322 Nantes Cedex 3
Lamari Nadia
Plateforme Metabolome Bordeaux - MetaboHUB
71 Avenue E. Bourleaux
33140 Villenave d'Ornon
Lamirand Florence
ROVALTAIN
1 Avenue de la Gare
26300 Alixan
Landaud Sophie
UMR GMPA 782 INRA-AgroParisTech
rue Lucien Brétignières- CBAI
78850 Thiverval Grignon
Landi Marion
INRA Centre de Clermont-Ferrand - Theix
63122 Saint Genès Champanelle
Lartigaut Florence
UMR1332 BFP
71 av. E. Bourlaux
33140 Villenave d'Ornon
Lascoux David
Waters S.A.S.
BP 608
78056 Saint-Quentin en Yvelines Cedex
Lavire Céline
UMR5557 Ecologie microbienne
Bat Forel 4ème
étage
43, Boulevard du 11 novembre 1918
69622 Villeurbanne
Le Bellec Matthieu
Mer Molécules Santé
2 rue de la Houssinère
44322 Nantes
154
Le Corguillé Gildas
Station Biologique de Roscoff
ABiMS / Place G.Teissier - CS 90074
29688 Roscoff cedex
Le Gall Hyacinthe (Mme)
BIOPI - EA 3900 - UPJV
Ilot des Poulies - UFR des Sciences
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Le Gouellec Audrey
TIMC/TheREx
bat Jean Roget 8ème
UFR de médecine
38700 La Tronche
Le Jossic-Corcos Catherine
INSERM U1078 ECLA
22 avenue Camille Desmoulins
29200 Brest
Le Moyec Laurence
Université d'Evry Val d'Essonne
UBIAE INSERM U902
Université d'Evry Val d'Essonne
Bd F. Mitterrand
91025 Evry
Lecomte Sylvain
Biologie des Plantes et Innovation (EA3900)
Linéa - Semences de Lin
80000 Amiens
Legendre Laurent
UMR 5557
UCBL1/CNRS
43 Bd du 11 Nov 1918
69622 Villeurbanne
Legoahec Laurie
UMR INRA IGEPP 1349
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Legrand Shirley
CortecNet
15/17 rue des Tilleuls
78960 Voisins Le Bretonneux
Leroux Lénaïc
Institut des Sciences Analytiques / CRMN
5 rue de la doua
69100 Villeurbanne
Leroux Fanny
Profilomic
CEA Saclay Batiment 136
91191 Gif-sur-Yvette
Letisse Fabien
LSBP & MetaboHUB
135 Avenue de Rangueil
31077 Toulouse
Liu Zhicheng (M.)
Université P13 - CSPBAT UMR7244
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Lombard Marie-Lou
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie SFR
Biologie Intégrative et Ecologie - MetaboHUB
INRA, 71 Av E. Bourlaux
33140 Villenave d'Ornon
Lopez Claire
INRA Plateforme d'Exploration du Métabolisme-
MetaboHUB
Centre de Clermont-Ferrand - Theix
63122 Saint-Genès-Champanelle
Lorrain Yves
Advanced Chemistry Development (ACD/Labs)
3 quai Kléber, Tour Sébastopol,
67000 Strasbourg
Luck Margaux
UBIAE INSERM U902
Université d'Evry Val d'Essonne,
Bd François Mitterrand
91025 Evry
Lyan Bernard
INRA Plateforme d'Exploration du Métabolisme -
MetaboHUB
Centre de Theix
63122 St Genès Champanelle
Madji Hounoum Blandine
Neurogenetique et neurometabolomique
10 Bd Tonnellé
37032 Tours cedex
Marnet Nathalie
2M2_PRP_BIA_IGEPP
INRA Domaine de la Motte
BP 35327
35653 Le Rheu Cedex
155
Martin Jean-Charles
UMR NORT
Faculté de médecine de La Timone
27 bd Jean Moulin
13385 Marseille
Martin Jean-François
UMR 1331 TOXALIM &
MetaTOUL-MetaboHUB
180 chemin de Tournefeuille BP 93173
31027 Toulouse cedex 3
Masson Perrine
Technologie Servier
27 rue Eugène Vignat
45000 Orléans
Maurier Florence
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome Bordeaux-MetaboHUB
71 Avenue Edouard Bourlaux
33140 Villenave d'Ornon
Mavel Sylvie
INSERM U930, Université François Rabelais
10 bd Tonnellé
37200 Tours
Mehl Florence
Ecole de Pharmacie Genève Lausanne
20, Bd d'Yvoy
CH-1211 Genève
Suisse
Meiffren Guillaume
Plateforme CESN - UMR5557 Ecologie
Microbienne - Université Claude Bernard Lyon 1
Bât. Forel 4ème
étage –
6, rue Raphaël Dubois
69622 Villeurbanne cedex
Merchak Noëlle
CEISAM UMR CNRS 6230
2, rue de la Houssinière
44322 Nantes cedex
Mercier Pierre-Edouard
CESN Ecologie Microbienne UMR 5557
43, Boulevard du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne cedex
Mesnard François
BIOPI
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Meyer Thibault
CESN Ecologie Microbienne UMR 5557
43, Boulevard du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne cedex
Miart Fabien
Laboratoire de Phytotechnologie - BIOPI EA3900
UPJV
UFR de Pharmacie - UPJV
1, rue des Louvels,
80000 Amiens
Michalet Serge
Centre d'Etude des Substances Naturelles
Bât. Forel 4ème
étage – Université Claude Bernard
Lyon1
43 bd du 11 Novembre 1918
69100 Villeurbanne
Migné Carole
INRA UNH UMR1019 & PFEM-MetaboHUB
63122 Saint Genès Champanelle
Mistrik Robert
HighChem
Leskova 11
81104 Bratislava
Slovaquie
Moing Annick
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome Bordeaux-MetaboHUB
71 Avenue Edouard Bourlaux
33140 Villenave d'Ornon
Molinié Roland
Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -
BioPI UFR de Pharmacie – UPJV
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Monsoor Misharl
Station Biologique de Roscoff
ABIMS / Place G. Teissier-CS 90074
29688 Roscoff cedex
156
Mottelet Stéphane
LMAC-EA2222
Université de Technologie de Compiègne
60200 Compiègne
Mouly Isabelle
LESAFFRE INTERNATIONAL
147 rue Gabriel Péri
59700 Marcq en Baroeul
Nadal-Desbarats Lydie INSERM U930
10 Blvd Tonnellé
37000 Tours
Nazabadioko Laurence
Institut de Chimie Moléculaire de Reimsbat 18
moulin de la Housse
51100 Reims
Negrel Lise
Métabolisme Secondaire de la Vigne.
UMR 1131 INRA-Université de Strasbourg
28 rue de Herrlisheim BP 20507
68021Colmar
Neveu Vanessa
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Oliveira Lydie
Laboratoire d'Etude du Métabolisme des
Médicaments. DSV/iBiTec-S/SPI
bat 136, CEA-Saclay
91191 Gif sur Yvette cedex
Ouattara Djomangan Adama
Bioaster,
5 rue de la Doua,
69100 Villeurbanne
Ouguerram Khadija (Mme)
CRNH- UMR1280 Phan
IRS-UN 8 quai Moncousu BP 70721
44007 Nantes
Palama Tony
Institut des Sciences Analytiques / CRMN
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Pardo Pierre
Ecolab
Avenue de l’Agrobiopole – BP 32607
31326 Castanet Tolosan
Paris Debora
Istituto di Chimica Biomolecolare (ICB), CNR
Via Campi Flegrei, 34, Comprensorio Olivetti
80078 Pozzuoli (Napoli)
Italie
Paulhe Nils
INRA-PFEM-MetaboHUB
Centre de Clermont-Ferrand - Theix
63122 Saint Genès Champanelle France
Perrin-Cocon Laure
Centre International de Recherche en Infectiologie
(CIRI)
21, Avenue Tony Garnier
69007 Lyon
Pétéra Mélanie
INRA-PFEM-MetaboHUB
63122 Saint Genès Champanelle
Peyriga Lindsay
LISBP - Plateforme MetaToul-MetaboHUB
135 avenue de Rangueil
31077 Toulouse
Pham Hoang Nam
UMR 5557
8 avenue Rockefeller
69373 Lyon
Picque Daniel
UMR GMPA
rue Brétignières
78850 Thiverval Grignon
Polakof Sergio
UNH
Centre INRA de Theix
63122Saint Genès Champanelle
Pollet Brigitte
UMR GMPA
rue Brétignières
78850 Thiverval Grignon
157
Pop Raluca Maria
Department of Pharmacology, Toxicology and
Clinical Pharmacology,
University of Medicine and Pharmacy “Iuliu
Hatieganu”
8 Victor Babes
Cluj-Napoca
Roumanie
Pujos-Guillot Estelle
INRA UNH &
Plateforme d'Exploration du Métabolisme -
MetaboHUB
63122 Saint-Genès-Champanelle
Quéro Anthony
Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -
BioPI
IUT/GB, Avenue des Facultés, Le Bailly
80025 Amiens
Rambeau Mathieu
INRA - UNH
Centre de Recherche de Theix
63122 Saint Genès Champanelle
Rathahao-Paris Estelle
Laboratoire de Chimie Analytique &
MetabolomeIDF-MetaboHUB
16 rue Claude Bernard
75231 Paris
Rautureau Gilles
Institut des Sciences Analytiques / CRMN,
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Rech Alexandre
Institut des Sciences Analytiques / CRMN,
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Renaud David
IFPC
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Rey Marjolaine
BF2I
Bâtiment Louis Pasteur
20 av Albert Einstein
69621 Villeurbanne cedex
Rezig Lamya
Institut des Sciences Moléculaires de Marseille
Campus Scientifique de Saint Jérôme
Avenue de l'Escadrille Normandie Niemen
13397 Marseille Cedex 20
Riols Fabien
I2MC INSERM U1048, Plateau Metatoul
Lipidomique -MetaboHUB
CHR Rangueil bat L3 2ème
ss
1, avenue Jean Poulhès
31432 Toulouse
Rivet Laurent
Plate-forme Corsaire Biogenouest
Domaire de la Motte - BP 35327
35653 Le Rheu cedex
Rolin Dominique (M)
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome Bordeaux - MetaboHUB
71, avenue E. Bourlaux,
33140 Villenave d'Ornon
Rosique Clément
Nutrition, Obésité et Risque Thrombotique
(NORT) UMR INSERM 1062 INRA 1260 AMU
27 boulevard Jean Moulin
13385 Marseille cedex 5
Rouaix Heloise
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Rouillac Lénaïck
IRSTEA
1 rue Pierre-Gilles de Gennes
CS 10030
92761 Antony cedex
Roulard Romain
Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -
BioPI UFR de Sciences – UPJV
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Royer Anne-Lise
LABERCA
Route Gachet-Site Chantrerie
44307 Nantes
158
Sadaka Georges
LMAC-EA2222
Université de Technologie de Compiègne
60200 Compiègne
Sagot Marie-France
LBBE
43 bd du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne
Saint-Lary Laure
Payan Bertrand
28 avenue Jean XXIII
06130 Grasse
Salek Reza (M)
EMBL - European Bioinformatics Institute.
Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge, CB10 1SD,
Royaume-Uni
Scalbert Augustin
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Seyer Alexandre
Profilomic SA
CEA de Saclay, Bâtiment 136
91191 Gif-sur-Yvette
Seeburn Gaëtan
EURISO-TOP
Parc des Algorithmes, Bât Homère,
Route de l'Orme
91194 Saint-Aubin Cedex
Shintu Laetitia
Institut des Sciences Moléculaires de Marseille
UMR CNRS 7313 Aix Marseille Université,
Faculté de Saint Jérôme -case 512
av escadrille Normandie Niemen
13397 Marseille cedex
Simon Yann
LECO France
Stocchero Matteo
S-IN Soluzioni Informatiche,
Via G. Ferrari 14,
36100, Vicenza,
Italie
Svilar Ljubica (Mme)
NORT
Faculté de médecine de La Timone
27 bd Jean Moulin
13385 Marseille
Tabet Jean-Claude
IPCM-UMR-CNRS 7201, Université Pierre et
Marie Curie - IDF-MetaboHUB
porte 721, case 45
4 place Jussieu
75252, Paris cedex 05
Taylor Neil
Chenomx
4350, 10230 Jasper Ave.,
Edmonton, AB,
Canada T5J 4P6
Tea Illa (Mme)
CEISAM UMR CNRS 6230
2 rue de la Houssinière
44322 Nantes
Thévenot Etienne
Laboratoire d'Outils pour l'Analyse de Données et
l'Intelligence des Systèmes & MetabolomeIDF -
MetaboHUB
CEA, Centre de Saclay
91191 Gif-sur-Yvette
Thibaudeau Christophe
Génie Enzymatique et Cellulaire FRE 3580
UPJV-CNRS
33 rue Saint-Leu
80039 Amiens
Thiombiano Benjamin
BIOPI - UPJV
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Traïkia Mounir
ICCF - PFEM -MetaboHUB
24 av des Landais
63171 Aubière cedex
Triba Mohamed Nawfal
CSPBAT
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
159
Tremblay-Franco Marie
UMR INRA 1331 TOXALIM
&MetaTOUL-AXIOM-MetaboHUB
180, chemin de Tournefeuille
31931 Toulouse cedex 9
Triballat Marie-Aude
Institut de Chimie de Nice
28 avenue Valrose
06000 Nice
Vansteelandt Marieke
PharmaDEV, UMR152 IRD/UPS
35 chemin des Maraîchers
31400 Toulouse
Varennes Olivier
BIOPI EA3900
Faculté de Pharmacie.
1, Rue des Louvels
80000 Amiens
Verdu Alexandre
Bruker Daltonique
4, allée Hendrik Lorentz
77447 Marne la Vallée Cedex 02
Viant Mark R
School of Biosciences,
University of Birmingham,
Edgbaston,
Birmingham B15 2TT
Royaume-Uni
Viaud Catherine
INRA UMR IGEPP
Domaine de la Motte
35650 Le Rheu
Vulliet Emmanuelle
ISA
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Walker Vincent
UMR-CNRS 5557 Ecologie Microbienne
11 bd du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne
Willeman Honorine
Université Lille 1 Sciences et Technologies, UMR
1281, Stress Abiotiques et Différenciation des
Végétaux Cultivés
Cité Scientifique
59655 Villeneuve d'Ascq
Yorke Jean-Christophe
CIRC-IARC
150 cours Albert Thomas
69008 Lyon
Zani Michele (M)
Agilent Technologies France
Parc Technopolis ZA Courtaboeuf
3 av du Canada
91978 Les Ullis cedex
Zhendre Vanessa
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome Bordeaux -MetaboHUB
71, avenue E. Bourlaux,
33140 Villenave d'Ornon
160
