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MARINA MOURÛT
IDENTIFICATION DE GENES DECOMPÉTENCE OVOCYTAIRE CHEZ LA
VACHE
Mémoire présentéà la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Sciences animalespour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se)
FACULTE DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DEL'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVALQUÉBEC
2006
© Marina Mourot, 2006
RESUME
La production d'embryons bovins in vitro demeure aujourd'hui moitié moins efficace
que le processus in vivo. La réserve de transcrits maternels accumulés par l'ovocyte semble
déterminante dans sa capacité à se développer en un embryon viable. Quatre groupes
d'ovocytes et de jeunes embryons ont été comparés afin d'isoler des marqueurs potentiels
de compétence à partir de leur transcriptome. Chaque groupe a permis d'étudier l'influence
d'une caractéristique associée au niveau de compétence : les conditions de la maturation
finale, la composition du milieu de maturation, le délai de premier clivage et le diamètre
folliculaire. L'utilisation de techniques modernes de biologie moléculaire telles que
l'hybridation soustractive suppressive et l'hybridation de biopuces a permis de sélectionner
treize candidats potentiels. Après vérification par PCR en temps réel, neuf candidats
présentent un niveau d'ARNm associé à la compétence. Leur caractérisation pourrait
contribuer à l'enrichissement de nos connaissances sur la qualité ovocytaire.
AVANT-PROPOS
Merci à mon professeur de recherche Marc André Sirard qui, par sa confiance, m'a
donné l'opportunité de vivre ces années de maîtrise tout en accueillant et élevant mes deux
garçons. Sa rigueur scientifique et son avidité de connaissances sont de riches modèles pour
l'étudiant, admirablement complétées par la compréhension et la tolérance humaine dont
Marc André fait preuve.
Merci à toute l'équipe du laboratoire de Marc André Sirard, en particulier Isabelle
Dufort qui m'a accompagnée par son aide et ses conseils tout au long de nombreuses
techniques de biologie moléculaire.
Merci aux membres du CRBR qui ont contribué à rendre ces quelques années bien
agréables en les chargeant d'expériences et de nouvelles amitiés.
Merci à ma famille, ma mère Patricia, mon père Jean Louis, ma sœur Maïté et mon
frère Tabaré qui, quelque soit la longitude, m'ont toujours soutenu et encouragé dans mes
choix de vie.
Enfin un grand merci à mon conjoint, ce merveilleux papa sans qui il aurait été bien
plus éprouvant de concilier famille et études.
TABLE DES MATIERES
RESUME ii
AVANT-PROPOS iii
TABLE DES MATIÈRES iv
LISTE DES ILLUSTRATIONS vii
LISTE DES TABLEAUX viii
GLOSSAIRE ix
CHAPITRE 1 1
INTRODUCTION GÉNÉRALE 1
CHAPITRE 2 4
REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS ' 4
2.1 Développement de l'ovocyte 4
2.1.1 Généralités 4
2.1.2 Ovogenèse 4
2.2 Folliculogenèse 6
2.2.1 Chronologie 6
2.2.2 Atrésie et apoptose 9
2.2.3 Influence de la taille folliculaire lors de la récolte du complexe ovocyte-cumulus sur son potentiel au développement embryonnaire in vitro 10
2.3 Cycle oestral 12
2.3.1 Chronologie 12
2.3.2 Influence du statut folliculaire lors de la récolte du COC sur son potentiel audéveloppement embryonnaire in vitro 15
2.4 Maturation ovocytaire 18
2.4.1 Prématuration 19
2.4.2 Maturation finale 20
2.4.2.1 Reprise de la méiose 21
2.4.2.2 Maturation cytoplasmique 23
2.4.2.3 Maturation nucléaire 24
2.4.2.4 Maturation moléculaire 24
2.4.3 Fécondation et développement embryonnaire 25
2.5 Régulation par polyadénylation 26
2.6 Les étapes de la production d'embryons in vitro 27
2.6.1 Environnement pré-collecte 28
2.6.2 Collecte et sélection 28
2.6.3 Mise en maturation et importance des hormones 30
2.6.4 Fécondation et mise en culture 33
2.6.5 Culture et influence de la durée séparant la fécondation du premier clivage34
2.6.6 Transfert d'embryon 37
2.7 Influence de l'utilisation de gonadotrophines in vivo avant la MIV 38
2.8 PLAN DE TRAVAIL 42
2.8.1 Objectif général 42
2.8.2 Objectifs spécifiques 42
CHAPITRE 3 44
INFLUENCE DE LA TAILLE DU FOLLICULE, DE L'ENRICHISSEMENT DUMILIEU DE MATURATION EN FSH ET D'UN CLIVAGE PRÉCOCE SUR LESNIVEAU D'ARNm MATERNELS D'OVOCYTES BOVINS 44
3.1 AVANT-PROPOS 44
3.2 RÉSUMÉ DE L'ARTICLE 45
3.3 TITLE 46
3.4 AUTHORS 46
3.5 ABSTRACT 46
3.6 INTRODUCTION 48
3.7 MATERIALS AND METHODS 50
3.7.1 Suppressive Subtractive Hybridizations materials 50
3.7.2 Total RNA extraction 51
3.7.3 SSH technique 51
3.7.4 Microarray préparation 52
3.7.5 Microarray probes and hybridization 53
3.7.6 Real-time Polymerase Chain Reaction 54
3.7.7 Statistical analysis 56
3.8 RESULTS 57
3.9 DISCUSSION 60
3.10 ACKNOWLEDGEMENTS , 68
3.11 TABLES AND FIGURES 69
VI
CHAPITRE 4 78
CONCLUSION GÉNÉRALE 78
RÉFÉRENCES 82
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 2.1 : Folliculogenèse. 8
Figure 2.2 : Cycle oestral chez la vache. 14
Figure 2.3 : Schématisation de la croissance de follicules bovins lors des vaguesfolliculaires d'un cycle oestral.188
Figure 2.4 : Phases de développement du follicule pré ovulatoire et de l'embryon chez la
vache. 19
Figure 2.5 : Cycles cellulaires et synthèse d'ARNm chez l'embryon bovin. 26
Figure 2.6 : Cinétique de maturation et développement de l'ovocyte et de l'embryon bovin.34
Figure 2.7 : Diagramme opposant les milieux in vivo et in vitro lors d'une productiond'embryon in vitro. 39
Figure 3.1 : Protocol diagram. 73
Figure 3.2 : Quantification of mRNA level by real-time PCR in bovine GV oocytesextracted from différent sizes of follicles: < 3 mm, 3-5 mm, 5-8 mm, and > 8 mm ofdiameter. 75
Figure 3.3 : Quantification of mRNA level in 6 hr in vitro matured bovine oocytes inprésence or absence of r-hFSH. 76
Figure 3.4 : Quantification of mRNA levels of thirteen candidate gènes in 36 hr in vitrodeveloped bovine embryos at two development states: 1C, 1-cell embryo; 2C, 2-cellembryo. 77
LISTE DES TABLEAUX
Table 3.1 : Information on primers used for real-time PCR experiments. 69
Table 3.2 : Microarray hybridization experiments. 71
Table 3.3 : Composition of library clones. 71
Table 3.4 : Selected candidates from SSH library and microarray hybridizationexperiments. 72
GLOSSAIRE
ADN ou DNAADNc ou cDNAAPC/CARN ou RNAARNm ou mRNAARN poly(A)A, T, G, CBFFCOCCPGCSFE2
ESTFSHr-hFSHGFPGVGVBD
IVC ou CIVIVF ou FIVIVM ou MIVIVP ou PIVLHMIMilMPFMZTOPUpbPCRrpmRT-qPCRSSH
acide désoxyribonucléiqueacide désoxyribonucléique complémentaireanaphase promoting complex/cyclosomeacide ribonucléiqueacide ribonucléique messageracide ribonucléique polyadényléadénine, thymine, guanine, cytosinefluide folliculaire bovincomplexe ovocyte-cumuluscellule germinale primordialefacteur cytoplasmique de stabilisationoestradiolexpressed séquence taghormone folliculo stimulantehormone folliculo stimulante recombinante humainegreen fluorescent proteinvésicule germinaledémantèlement de la vésicule germinale et début de lacondensation chromosomiqueculture d'embryons in vitrofécondation in vitromaturation in vitroproduction d'embryons in vitrohormone lutéinisantemétaphase de llère division méiotiquemétaphase de 2ieme division méiotiqueM-phase promoting factortransition materno-zygotiqueovum pick-uppaires de basesréaction de polymérase en chaînerévolutions par minuteréaction de polymérase en chaîne quantitative en temps réelhybridation suppressive soustractive
CHAPITRE 1
INTRODUCTION GENERALE
L'homme intervient depuis plusieurs décennies dans le processus de la reproduction
chez les animaux domestiques. La fécondation in vitro chez le bovin permet d'augmenter
significativement la production annuelle de veaux de qualité. Les géniteurs sont choisis
selon les caractéristiques recherchées puis des vaches de moindre catégorie sont mises à
profit le temps de la gestation. Cependant, la production d'embryons in vitro reste moitié
moins efficace comparativement au processus in vivo. En effet beaucoup d'embryons
cultivés in vitro n'atteignent pas le stade de blastocyste, un des indices de la qualité
ovocytaire. Les avancées scientifiques dans la compréhension du mécanisme et des besoins
en techniques de reproduction permettent d'optimiser les traitements contre l'infertilité et
promettent une application chez l'humain.
Le monde de la recherche est très actif dans l'optimisation des techniques de
production d'embryons in vitro (PIV). Les principaux domaines étudiés sont la nutrition
(Adamiak et al. 2005), les traitements hormonaux (van de Leemput et al. 1999), la sélection
des ovocytes par observation morphologique (Blondin et Sirard 1995) ou par taille
folliculaire (Lonergan et al. 1994), la composition des milieux de culture (Ali et Sirard
2002a), ou encore la sélection des embryons suivant leur rapidité à procéder au premier
clivage (Lonergan et al. 1999). Des techniques rigoureuses permettent d'analyser les
résultats de la PIV dans le but de mieux comprendre les phénomènes observés et de
déterminer les besoins spécifiques des gamètes. Au niveau physiologique, l'analyse porte
essentiellement sur le taux de mortalité et de malformations autour de la parturition suivant
un transfert d'embryon. Au niveau cellulaire, l'observation porte sur les caractéristiques de
la reprise de la méiose, la dynamique des étapes de méiose, le taux de fécondation, de
clivage et d'éclosion du blastocyste, ainsi que la visualisation de structures par
immunocytochimie. Au niveau moléculaire, des techniques de laboratoire de haute
technologie, telles l'hybridation suppressive soustractive (SSH), l'hybridation de biopuces
ou l'amplification par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) informent sur le niveau
d'ARNm différentiel entre tissus, entre divers stades de maturation ou de développement
ou entre ovocytes de différentes qualités.
Travailler au niveau moléculaire avec l'ovule ou l'embryon présente le défi d'un
accès à une faible quantité de matériel puisqu'un ovule contiendrait environ 55 pg d'ARN
poly(A) (Lequarre et al. 2004), soit environ 5% de l'ARN total (Bilodeau-Goeseels et
Schultz 1997). Ces dernières années ont vu se développer des techniques d'amplification
d'ARNm hautement puissantes et fidèles permettant la comparaison de transcriptomes de
tissus quasi-similaires. Ce type d'expérience adapté à l'ovocyte ou l'embryon est de plus en
plus fréquent (Dode et al. 2006 ; Donnison et Pfeffer 2004 ; Robert et al. 2000 ; Vallée et
al. 2005). Le choix des techniques détermine l'aspect qualitatif (SSH, hybridation de
biopuces) ou quantitatif (RT-qPCR) des résultats. Les techniques dites d'analyse à grande
échelle, analysent l'information sur des milliers de gènes, permettant d'identifier des
facteurs déterminants pour la qualité de l'embryon. Cependant peu d'études cumulent
plusieurs de ces techniques.
Le transcriptome maternel complété lors de l'ovogenèse et de la maturation de
l'ovocyte assure pratiquement à lui seul le développement de l'ovocyte mature et du stade
zygote jusqu'au 4ieme cycle cellulaire du développement embryonnaire. À un même stade de
développement, les divergences du transcriptome entre ovocytes/embryons de qualités
différentes illustrent donc les ARNm éventuellement impliqués dans l'acquisition de la
compétence au développement embryonnaire. Ces ARNm seront nommés des facteurs de
compétence potentiels. Notre hypothèse est que les différents niveaux d'ARNm sont induits
par des facteurs intrinsèques (statut et environnement folliculaire) ou extrinsèque (milieu de
maturation) à l'ovocyte ou à l'embryon. Des comparaisons pertinentes de transcriptomes
d'ovocytes et d'embryons choisis pourraient mener à la sélection de facteurs de compétence
potentiels dont l'identification aiderait à la compréhension des besoins des ovocytes et des
embryons.
Le mémoire est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre introduit le projet. Le
deuxième chapitre relate les travaux antérieurs sur le sujet : folliculogenèse, ovogenèse,
cycle oestral, niveaux de maturation, techniques de production d'embryons in vitro,
utilisation de gonadotropes et propose un plan de travail. Le troisième chapitre présente les
résultats de l'expérimentation : identification d'ARNm spécifiques aux situations de forte
compétence. Enfin, le quatrième chapitre donne une conclusion générale du projet.
CHAPITRE 2
REVUE DES TRAVAUX ANTERIEURS
2.1 Développement de 1 ' ovocyte
2.1.1 Généralités
Chez les mammifères on compte principalement trois phénomènes inter reliés soit
l'ovogenèse, la folliculogenèse et le cycle oestral, aboutissant au développement du gamète
femelle. L'ovogenèse est le processus débutant le plus tôt, dès la vie embryonnaire, et actif
le plus longtemps, jusqu'à la fin de la vie reproductive de la femelle. Il regroupe les étapes
de croissance, différenciation et maturation du gamète femelle ayant lieu en grande partie
au sein du follicule ovarien. Chez la vache, la folliculogenèse débute également durant la
vie embryonnaire. Elle englobe le développement du follicule jusqu'à la libération d'un ou
plusieurs ovocytes matures. Enfin, le cycle oestral est le processus le plus court des trois,
soit 18 à 24 jours, mais qui se répète inlassablement depuis la puberté, 18 mois chez la
vache, jusqu'à la fin de la vie reproductive de la femelle, environ 20 ans chez la vache. Le
cycle oestral est capital puisqu'il détermine le contrôle endocrinien régissant l'ovogenèse et
la folliculogenèse.
2.1.2 Ovogenèse
Chez la vache, l'ovogenèse débute au 30eme jour de la vie embryonnaire et peut durer
2 à 20 ans et plus (Braw-Tal et Yossefi 1997). Ce processus que Russe (1983) a divisé en
six périodes, comprend le développement des cellules germinales femelles à partir du stade
de cellule germinale primordiale (CPG) jusqu'à l'obtention d'un ovocyte haploïde apte à
être fécondé. L'origine des CPG diffère suivant l'espèce (Matova et Cooley 2001). En ce
qui concerne la vache, les CPG de 30 jxm accompagnées de cellules somatiques et d'une
membrane basale migrent par des mouvements amiboïdes depuis l'ectoderme
embryonnaire jusqu'aux ovaires en devenir : les crêtes génitales formées par un
épaississement de la paroi du mésonéphros. À cette étape, les CPG se séparent en deux
groupes, le premier forme le groupe des cellules souches, le second subit de nombreuses
divisions mitotiques et devient l'initiateur de la lignée cellulaire des ovogonies. Une fois le
nombre de mitoses prédéfini spécifique à l'espèce atteint, les ovogonies prennent le nom
d'ovocytes et entrent spontanément en méiose. Chez la vache, cette entrée en méiose se
situe autour du 82eme jour de gestation alors qu'elle a lieu au cours de la 9ieme semaine de
grossesse chez l'humain, ou même après la naissance chez la souris (Russe 1983). La
division méiotique n'est pas un phénomène continu. La première phase est interrompue au
stade pachytène de prophase. L'ovocyte reste en arrêt méiotique jusqu'à l'ovulation. À
partir de 18 mois chez la vache, le cycle oestral devenu actif permet une reprise de la
méiose avec extrusion du premier globule polaire. Une seconde interruption a lieu au stade
de métaphase de la phase équationnelle. L'ovocyte est prêt à être fécondé. La pénétration
du spermatozoïde dans le cytoplasme ovocytaire déclenche la complétion de la méiose.
L'ovocyte prend alors le nom d'ovule.
Hyttel et al. (1997) ont largement décrit l'évolution de la machinerie de
transcription durant la croissance de l'ovocyte ainsi que le parallélisme entre
l'augmentation en taille de l'ovocyte et du follicule. Chez le bovin, l'ovocyte continue à
grossir jusqu'à un diamètre de 110 à 120 u.m dans un follicule tertiaire de 3 à 20 mm, alors
que chez la souris sa taille maximale est déjà atteinte lorsque l'antrum apparaît (Senbon et
al. 2003). La croissance de l'ovocyte est corrélée à l'augmentation de son contenu en
protéines et en autres matériels essentiels comme les transcrits d'ARNm qui servent à la
maturation ovocytaire, la fécondation et le développement préimplantatoire de l'embryon.
En fin de croissance de l'ovocyte, la transcription diminue significativement pour ne
reprendre principalement que lors du 4eme cycle cellulaire du développement de l'embryon.
Tout au long de sa croissance, l'ovocyte subit plusieurs niveaux de différenciation
augmentant sa compétence au développement. Ces acquis fondamentaux pour la
fécondation et le développement en embryon sont détaillés plus bas, dans la partie 2.4
traitant de la maturation ovocytaire.
2.2 Folliculogenese
L'importance cruciale de la communication bidirectionnelle entre l'ovocyte et les
cellules somatiques qui l'entourent a récemment été résumée par Senbon et al. (2003),
soutenant le fait que la folliculogenese et l'ovogenèse progressent de façon synchronisée et
interdépendante.
2.2.1 Chronologie
L'initiation de la folliculogenese (figure 2.1) coïncide avec celle de la méiose, vers le
90eme jour de gestation. Au cours de son développement, le follicule passe par quatre stades
de développement : follicule primordial, follicule primaire, follicule secondaire et follicule
tertiaire ou à antrum. Fair et al. (1997) ont détaillé l'évolution des organelles et de
différentes structures de l'ovocyte tout au long de ces étapes. La dynamique de localisation,
la nature et l'abondance de chaque composante informent sur les activités cellulaires
propres à la maturation de l'ovocyte.
Le follicule primordial est la forme la plus représentée chez les mammifères. Formés
durant l'embryogenèse, les follicules primordiaux ne sont pas renouvelés après la naissance
et constituent donc une des limites à la fertilité (Picton 2001). L'origine des premières
cellules folliculaires est encore controversée. D'après Russe (1983) elles pourraient
provenir des cellules somatiques qui accompagnent les CPG pendant leur migration. Au
stade du follicule primordial, l'ovocyte se retrouve entouré d'une unique couche de cellules
aplaties et d'une membrane basale lui offrant un isolement relatif. Les nombreux ovocytes
qui ne sont pas incorporés dans un follicule primordial dégénèrent. Le follicule primordial
chez le bovin a un diamètre de 35 u.m et abrite un ovocyte de 20 [im au moyen de 5 à 8
cellules aplaties en position équatoriale, cellules précurseurs de la granulosa (Fair 2003).
Une fois tous les follicules primordiaux formés, dont le nombre varie suivant l'espèce et
l'âge de la femelle, leur croissance ne commence pas en même temps. Ils sont activés tour à
tour jusqu'à la fin de vie de la femelle ou lorsque l'ovaire n'est plus fonctionnel. Ainsi on
trouve dans l'ovaire tous les stades de croissance de la folliculogenèse. Les follicules
primaires se situent dans la zone cortico-médullaire richement vascularisée de l'ovaire,
alors que les follicules primordiaux quiescents logent dans la partie externe du cortex moins
vascularisée.
La nature du ou des facteurs d'activation ou de maintien du follicule primaire est
encore énigmatique. Parmi les candidats potentiels, l'hormone AMH (Anti-Mullérian
Hormone) se distingue par son rôle dans l'inhibition du recrutement des follicules
primordiaux chez la souris (Visser et Themmen 2005). Une fois le follicule primordial
activé, les cellules folliculaires ou cellules de la granulosa se multiplient lentement et
prennent une forme cubique. À ce stade, l'ovocyte commence à sécréter deux protéines
spécifiques à l'ovocyte murin : GDF9 (growth differentiation factor 9) et BMP 15 (bone
morphogenetic protein 15). Ces dernières agissent sur les cellules de la granulosa pour
accélérer leur prolifération. Les cellules de la granulosa sécrètent le facteur KIT ligand qui
va à son tour stimuler la croissance de l'ovocyte en se liant au récepteur transmembranaire
tyrosine kinase KIT (Braw-Tal 2002 ; Senbon et al. 2003). Le follicule prend le nom de
primaire lorsqu'il est entouré d'une couche complète de cellules folliculaires cubiques (Fair
et al. 1997). Lorsque la couche de cellules de la granulosa est double, le follicule est dit
secondaire. La zone pellucide est en devenir ainsi que les cellules de la thèque. Enfin, le
follicule se recouvre de plusieurs couches de cellules de la granulosa et de cellules de la
thèque puis une cavité intérieure apparaît. Il s'agit du follicule tertiaire. L'ovocyte du
follicule tertiaire présente une zone pellucide traversée par des projections de cellules de
cumulus dont l'extrémité aboutit à la surface de la membrane cytoplasmique de l'ovocyte.
Ce moyen de communication entre les cellules du cumulus et l'ovocyte maintient les
jonctions communicantes qui permettent une communication privilégiée (Senbon et al.
2003). Près de 3 mois après l'activation du follicule primordial chez le bovin, le follicule
atteint 3 mm de diamètre (Fair 2003). Deux cycles œstraux sont nécessaires pour que le
follicule dominant atteigne 15 mm de diamètre (Webb et al. 2004), étape au cours de
laquelle l'ovocyte atteint son diamètre maximal de 120 (xm. Lors de l'ovulation, il est éjecté
sous la forme d'un ovule prêt à être fécondé.
Il est aujourd'hui indéniable que plusieurs mécanismes sont à l'origine du contrôle
de la croissance folliculaire. Les facteurs impliqués diffèrent suivant l'étape de croissance
folliculaire pré ou post antrale mais certains sont permanents comme des facteurs de
croissance, gonadotrophines, enzymes stéroïdogéniques, inhibine... La nutrition joue
également un rôle dans l'évolution de la croissance folliculaire (Webb et al. 2004). La
folliculogenèse est donc un phénomène continu, prenant fin soit suite à l'ovulation d'un
ovocyte mature, soit par l'atrésie de l'ensemble follicule-ovocyte.
OvulationSélection etdominance
Recrutement
Initiation de lacroissance dufollicule
Formationde l'antrum
Folliculesprimordiaux
•^——»• ~ 3 mois
Croissance du folliculepréantral
1*P ̂ r Atrésie
~ 2 cycles oestraux —•
Croissance du follicule antral
Figure 2.1 : Folliculogenèse. Tiré de Webb et al. (2004).
2.2.2 Atrésie et apoptose
Sauf si précisé autrement, les affirmations de ce paragraphe concernant l'atrésie et
l'apoptose découlent du livre de Thibault et Levasseur (2000). L'atrésie ovarienne fait
référence à une dégénérescence, suivie d'une résorption d'un ou plusieurs follicules
ovariens. L'atrésie folliculaire fait référence à l'apparition de cellules apoptotiques à
l'intérieur du follicule. La perte de cellules de la granulosa entraîne une réduction de la
communication avec l'ovocyte (Zeuner et al. 2003), mais ce dernier dégénère en dernier.
L'atrésie est communément rattachée au processus d'apoptose qui est un processus de mort
programmée des cellules par fragmentation de l'ADN. L'apoptose peut toucher les
follicules à tous les stades de développement et entraîne la disparition de 99,9% des
follicules. Les premiers signes morphologiques de l'apoptose apparaissent au niveau des
cellules de la granulosa antrale. La difficulté d'appréciation de la qualité d'un follicule
uniquement par ses caractéristiques morphologiques a inspiré de nombreuses études
d'identification des premiers signes pro-apoptotiques (Nicholas et al. 2005 ; Pomar et al.
2005).
L'apoptose est également impliquée dans la dégénérescence d'un grand nombre de
cellules germinales lors de l'ovogenèse et des cellules lutéales du corps jaune lors de la
lutéolyse (voir paragraphe 2.3 sur le cycle oestral, Tilly 1996). Elle est considérée comme
un système d'élimination des cellules inutiles. Le processus d'apoptose dans le système
reproducteur est largement étudié. Plusieurs marqueurs apoptotiques sont connus, tels les
caspases, la protéine pro-apototique BAX, la protéine anti-apoptotique BCL-2, le facteur
Fas et son ligand dont les rôles sur l'atrésie du follicule dominant sont notamment étudiés
(Valdez et al. 2005). Certains de ces facteurs sont utilisés comme marqueurs de qualité
ovocytaire, c'est le cas de la caspase-3 et de IGFBP-5 (insulin-like growth factor-binding
protein-5, Nicholas et al. 2005). Mais les précisions sur le fonctionnement et l'utilité de
l'apoptose restent à découvrir.
10
2.2.3 Influence de la taille folliculaire lors de la récolte du complexe ovocyte-cumulus sur
son potentiel au développement embryonnaire in vitro
Au cours de la folliculogenèse, l'ovocyte acquiert progressivement une compétence
au développement embryonnaire. Le stade physiologique du follicule, à partir duquel sont
collectés les complexes ovocyte-cumulus (COCs), est donc déterminant pour les résultats
de la PIV.
De nombreuses études ont comparé la capacité au développement d'ovocytes
provenant de petits comparativement à de gros follicules. Alors qu'une étroite relation entre
la taille folliculaire et le niveau de compétence a été montrée, la délimitation des tailles
augmentant ou non la compétence reste floue et seuls les follicules dont le diamètre est
inférieur à 2 mm ou supérieur à 8 mm trouvent un consensus dans la littérature, leur
accordant respectivement une moindre et une plus grande compétence. Quant aux follicules
de 2 à 8 mm, ils sont classés différemment suivant les études. Blondin et Sirard (1995) ont
observé un arrêt du développement des embryons ayant comme origine des follicules de
diamètre inférieur à 3 mm. Ils sont parmi les rares auteurs à ne pas avoir remarqué de
différence significative dans le développement des ovocytes provenant de follicules de
diamètre de 3 à 5 mm comparativement à un diamètre folliculaire supérieur à 5 mm. Mais
étant donné qu'ils se sont basés sur le taux de formation de morulas et non de blastocystes,
il est difficile de confronter leurs résultats aux autres études. Rizos et al. (2002a) ont obtenu
des taux de blastocystes plus importants (46,5%) pour des ovocytes originaires de follicules
de diamètre supérieur à 6 mm plutôt que de 2 à 6 mm (38,9%). L'étude de Lonergan et al.
(1994) basée sur les mêmes dimensions folliculaires aboutit aux mêmes conclusions
complétées par un meilleur taux de maturation et de fécondation pour les plus gros
follicules. Ces résultats soutiennent ceux de Pavlok et al. (1992) dont la PIV à partir
d'ovocytes provenant de follicules de diamètre 1 à 2 mm, 2 à 4 mm, ou 4 à 8 mm a abouti à
un meilleur taux de développement en blastocystes pour les plus gros follicules alors
qu'aucun blastocyste n'a été obtenu à partir des plus petits follicules. Plus récemment,
Lequarre et al. (2005) ont également obtenu un meilleur taux de blastocystes à partir
d'ovocytes provenant de follicules de diamètre supérieur à 6 mm comparativement à des
Il
follicules de diamètre inférieur à 4 mm. Dans cette dernière étude, les auteurs ont comparé
des PIV organisées dans trois différents laboratoires européens en prenant soin de suivre le
même protocole expérimental. Ils ont approfondi l'étude par l'appréciation du métabolisme
énergétique des ovocytes couplés ou non au cumulus et par la quantité de transcrits et du
patron des protéines avant et après maturation, mais n'ont relevé aucune influence de la
taille des follicules d'origine. Au niveau de la cinétique de reprise de la méiose et des trois
premières divisions cellulaires de l'embryon, seule la quatrième division aurait un aspect
spécifique en se montrant plus tardive pour les embryons provenant de gros follicules.
Enfin, aucune différence dans le nombre de cellules du blastocyste n'a été observée alors
que les stades de cavitation et d'expansion seraient plus tardifs pour les embryons
provenant de petits follicules. Hagemann et al. (1999) ont poussé l'analyse jusqu'aux
follicules de 9 à 12 mm et supérieur à 13 mm de diamètre et ont obtenu une relation
positive entre le taux de développement et l'augmentation de la taille folliculaire.
Une autre approche expérimentale teste l'effet de l'ajout de fluide folliculaire bovin
(BFF) provenant de petits ou de gros follicules dans le milieu de maturation. Algriany et al.
(2004) ont obtenu une meilleure expansion du cumulus, de meilleurs taux de maturation
nucléaire, de clivage et de formation des blastocystes suite à l'utilisation de BFF provenant
de follicules de 5 à 8 mm comparativement à ceux de 2 à 4 mm de diamètre. En accord
avec ces résultats, un plus grand nombre de blastocystes a été obtenu après culture des
ovocytes en présence de 5 % de BFF dérivant de follicules de diamètre supérieur à 8 mm
plutôt que de diamètre 2 à 5 mm (Ali et al. 2004). Iwata et al. (2004) ont observé en outre
une maturation nucléaire plus rapide en présence de BFF provenant de gros follicules alors
que l'étude de Lonergan et al. (1994) n'a observé aucun effet pour des conditions
similaires.
Bien qu'aucune étude ne l'ait encore démontrée, l'idée générale expliquant la
différence de compétence liée aux dimensions des follicules réside dans l'acquisition du
plein potentiel de certains facteurs dont l'activité serait critique pour le développement
futur de l'embryon. Le délai d'acquisition s'étendrait jusqu'en phase finale de la
folliculogenèse (Lonergan et al. 1994). En ce qui concerne les différentes conclusions
12
portant sur les follicules de diamètre 2 à 8 mm, il pourrait s'agir de l'existence de statuts
folliculaires différents dissimulés à l'intérieur d'une étroite gamme de diamètres
folliculaires. Ce dernier point est une des conclusions de Hendriksen et al. (2000) pour qui
le faible taux de formation de blastocystes obtenus in vitro à partir d'ovocytes provenant de
follicules de 3 à 8 mm de diamètre serait dû à l'hétérogénéité de cette population. En effet,
outre la taille du follicule, la détermination du stade de croissance folliculaire par un suivi
étroit du cycle oestral est une méthode de sélection ovocytaire reconnue. Elle est moins
populaire car plus dispendieuse, et demande un traitement et une observation de plusieurs
semaines. Ce dernier aspect est discuté à la fin du point 2.3 présentant le cycle oestral.
2.3 Cycle oestral
2.3.1 Chronologie
Un cycle oestral dure en moyenne 21 jours chez la vache et se décompose en deux
phases, la phase folliculaire et la phase lutéale, séparées par l'ovulation (figure 2.2). Durant
un seul cycle il se produit en général deux à trois vagues folliculaires mais une seule
mènera à l'ovulation du follicule dominant.
Le système de vagues folliculaires menant à la sélection d'un follicule dominant est
observé dans tous les états reproductifs de la vache : cycle oestral, gestation, période pré-
puberté, post-partum et anoestrus nutritionnel. Il est étroitement relié à l'alternance de taux
faible ou élevé de l'hormone folliculo-stimulante (FSH), aux pulsations de l'hormone
lutéinisante (LH) et d'autres facteurs protéiques créant une dynamique entre croissance,
dominance et atrésie des follicules. Une première augmentation de la concentration
sanguine en FSH, soit le pic FSH préovulatoire, correspond à l'établissement de la première
vague folliculaire et suffit au déclenchement des vagues suivantes du cycle. Les follicules
de 3 mm de diamètre et plus répondent à l'augmentation de la concentration en FSH grâce à
leurs récepteurs au FSH alors que ceux dont le diamètre est inférieur à 3 mm ne sont pas
stimulés faute de récepteurs (Mihm et al. 2002).
13
Une vague folliculaire se divise en trois phases. Une phase de recrutement (jours 1 à
3 pour la première vague, le jour 1 correspond au jour de l'ovulation) stimule la croissance
d'une vingtaine de follicules de 3 mm de diamètre. Une phase de sélection (jours 3 à 6 pour
la première vague) permet au follicule dominant ayant atteint un diamètre de 8 à 9 mm de
continuer à croître alors que les follicules subordonnés ralentissent ou stoppent leur
croissance. Une phase de dominance (jours 6 à 8 pour la première vague) suit, au cours de
laquelle les follicules subordonnés régressent, laissant le follicule dominant comme unique
candidat potentiel à la maturation finale (cf. paragraphe sur la maturation ovocytaire au
point 2.4) et à l'ovulation (Hendriksen et al. 2003).
De nombreuses études travaillent à décrypter les mécanismes de recrutement et de
sélection des follicules. Des transcrits propres aux cellules de la granulosa de follicules
dominants ayant atteint 12 mm de diamètre ont été identifiés par une méthode de
soustraction moléculaire : inhibin fiA, apolipoprotein E receptor 2, MAPK kinase kinase 5,
carboxypeptidase D et aromatase P450 (Sisco et al. 2003). D'autres facteurs ont été
identifiés tels IGF-I (insulin-like growth factor-I) et ses protéines de liaison IGFBPs,
notamment IGFBP-4 dont la diminution serait liée à la sélection du follicule dominant
(Fortune et al. 2004). Seul le follicule dominant sélectionné possède des récepteurs à LH et
est donc capable de répondre aux pulsations de LH. Il atteint un diamètre de 12 à 20 mm à
la fin de la phase de sélection. Le premier follicule dominant du cycle conserve pendant 3 à
4 jours une forte croissance et une forte production d'oestradiol assurant un bas taux de
FSH. Privés de FSH, les follicules subordonnés arrêtent leur croissance. En l'absence de
puises adéquats de.LH qui est régulé négativement par la sécrétion de progestérone, le
follicule dominant dégénère. Devenu atrétique, ce dernier diminue sa sécrétion d'oestradiol
vers le 6ème jour et perd sa dominance entre les jours 7 et 9. Cela engendre un pic de FSH
caractérisant l'initiation de la seconde vague folliculaire du cycle (Mihm et al. 2002).
14
Vieux corps jaune
Ovule
Rupture du"fo l l icu le
Follicule mûr
..Vieux corpsjaune
Follicule endéveloppemen
Corps jauneen régression(corps blanc)
RÉGRESSION DUCORPS JAUNE(Jours 16-20)
Corps jaunemûr -
DÉVELOPPEMENTDU CORPS JAUNE
Corps blanc (Jours 2-4)
CORPS JAUNE MÛR(Jours 5-15)
Figure 2.2 : Cycle oestral chez la vache. Adapté du site internet de l'université de
Missouri-Columbia (http://muextension.missouri.edu/explore/agguides/ansci/g02015.htm)
L'ovulation a lieu lorsque la fin de la phase lutéale du cycle précédent coïncide avec
la période de dominance du follicule dominant de la deuxième ou troisième vague
folliculaire. Néanmoins, si le corps jaune formé par les cellules résiduelles du follicule
ayant ovulé au cycle précédant inhibe encore activement les pulsations de LH lorsque la
seconde vague commence, alors le second follicule dominant part en atrésie et une
troisième vague folliculaire commence. Dans le cas contraire (régression du corps jaune),
les pulsations de LH de la phase folliculaire permettent au follicule dominant de subir la
maturation finale et l'ovulation (Mihm et al. 2002). En absence de signal embryonnaire
adéquat, le corps jaune dégénère en corps blanc et la sécrétion de progestérone cesse. À
15
l'opposé, si l'embryon se manifeste, la sécrétion de progestérone par le corps jaune prépare
la paroi utérine à l'implantation de l'embryon et maintient l'état de gestation.
2.3.2 Influence du statut folliculaire lors de la récolte du COC sur son potentiel au
développement embryonnaire in vitro
Le stade de développement du follicule dans la vague folliculaire définit le statut
folliculaire, c'est-à-dire sa nature de subordonnée ou dominant, son niveau d'atrésie,
l'acquisition des récepteurs LH et par conséquent sa compétence au développement
embryonnaire (Fair 2003 ; Sirard et al. 2006). Il est aujourd'hui évident que le follicule
dominant a un effet répressif sur le follicule subordonné. Examinons le mode d'interaction
entre les follicules dominant et subordonné ainsi que l'effet résultant sur leur compétence
au développement pour chacun d'entre eux.
Afin d'analyser les caractéristiques d'un nombre suffisant de follicules au même
stade de développement, il est courant de synchroniser le cycle oestral des vaches à l'étude.
Cette pratique consiste généralement à provoquer une phase lutéale courte par deux
injections de prostaglandines à dix jours d'intervalle, suivie de l'ablation de tous les
follicules de diamètre supérieur à 4 ou 5 mm afin d'induire l'émergence d'une vague
folliculaire (Vassena et al. 2003).
Quelle est la compétence du follicule dominant ? La qualité du follicule dominant de
la première vague folliculaire est controversée (Hagemann et al. 1999 ; Machatkova et al.
1996). L'absence de consensus pourrait s'expliquer par une différence de compétence entre
la phase de croissance folliculaire et la phase plateau de la dominance. En effet vers le 5eme
jour de la vague folliculaire, le seul follicule dominant sélectionné croît rapidement. À cette
étape sa compétence est faible (Sirard 2001) et s'explique par le fait que le follicule
dominant en croissance se différencie peu (Hagemann et al. 1999). La phase de croissance
terminée, sa compétence devient très élevée (Humblot et al. 2005 ; Vassena et al. 2003).
Puis, en fin de vague folliculaire et en absence d'ovulation, le follicule conserve sa
16
dominance pendant quelques jours mais n'a plus d'effet répressif sur les follicules
subordonnés. Comme suggéré par Sirard et al. (2006), il conserve probablement sa forte
compétence puisque une injection de prostaglandines mène à l'ovulation et à la gestation
(Twagiramungu et al. 1995).
Qu'en est-il de la compétence des follicules subordonnés ? Dans le cas de la mise en
maturation de COCs dérivant de follicules subordonnés, l'objectif est de discerner le
meilleur moment de la vague folliculaire pour prélever les COCs. De nombreuses études
s'intéressent à l'influence de la présence du follicule dominant sur le potentiel au
développement d'ovocytes provenant de follicules subordonnés. Alors que plusieurs
résultats obtiennent un meilleur rendement en blastocystes pour les ovocytes prélevés en
phase de croissance folliculaire, soit les jours 2 ou 3 de la première vague folliculaire,
plutôt qu'en fin de phase de dominance, soit le 7eme jour de la première vague folliculaire
(Hagemann 1999 ; Machatkova et al. 2004 ; Salamone et al. 1999), d'autres études
observent plutôt une nette supériorité d'aptitude au développement embryonnaire pour des
ovocytes prélevés au 5eme jour de la première vague folliculaire (Sirard et al. 2006 ;
Vassena et al. 2003). Hendriksen (2004) obtient des taux de blastocystes équivalents après
ponction des ovocytes le 2eme ou le 5eme jour de la vague. En outre, Vassena et al. (2003)
précisent que la taille folliculaire ne reflète pas pertinemment le statut folliculaire.
L'observation de la morphologie et de la structure d'ovocytes issus de follicules
dominants ou subordonnés (Assey et al. 1994 ; Dieleman et al. 2002) aide à la
compréhension de la compétence des follicules subordonnés. La répression du follicule
dominant à la fin de sa phase plateau induit l'atrésie des follicules subordonnés en
croissance (Hagemann 1999). En prolongeant artificiellement le plateau de dominance, un
taux exceptionnel de 80 % de blastocystes est obtenu (Blondin et al. 2002). Un follicule
subordonné en début d'atrésie (autour du 5eme jour du cycle) présente des caractéristiques
ultrastructurales proches de celle du follicule dominant (Sirard et al. 1999 ; Vassena et al.
2003), alors qu'un niveau d'atrésie avancé induit une diminution de son potentiel au
développement.
17
La déviation du follicule subordonné vers la dominance dépend de sa capacité à
répondre à la LH. Elle se produit vers une taille de 8,5 mm de diamètre, lorsque le follicule
devient moins dépendant à FSH (Ginther et al. 2000). En outre, l'ovulation fait suite à une
brusque et importante élévation de LH plasmatique. Le niveau d'expression du récepteur
LH est donc décisif. C'est pourquoi plusieurs auteurs s'intéressent au lien potentiel entre le
récepteur LH et la compétence ovocytaire. Mais alors qu'il est généralement accepté que le
récepteur LH n'apparaisse qu'à la fin de la foUiculogenèse dans les cellules de la granulosa
du follicule dominant, peu d'études confirment pour l'instant son expression spatiale et
temporelle précise en ARNm. Ainsi, l'ARNm du récepteur LH est observé par hybridation
in situ spécifiquement dans les cellules de la granulosa d'un seul follicule par vache et de
diamètre supérieur à 8 mm (Bao et al. 1997), alors qu'une autre étude ne fait pas de
distinction de niveaux d'ARNm suivant le statut folliculaire (Evans et Fortune 1997). Par
ailleurs, Robert et al. (2003) ont évalué que la présence isolée d'ARNm du récepteur LH
dans les cellules de la granulosa n'est pas spécifique à la compétence au développement de
l'ovocyte associé. Ils ont identifié plusieurs isoformes de l'ARNm du récepteur LH dont la
régulation et les rôles restent à déterminer. Certains de ces isoformes sont présents dans les
cellules de la thèque. Une récente étude a identifié la présence d'ARNm du récepteur LH
dans les cellules du cumulus (Calder et al. 2005). Finalement et pour l'instant, aucune étude
ne semble démentir l'absence de l'ARNm et de la protéine du récepteur LH dans l'ovocyte.
L'importance du statut folliculaire lors de la récolte du COC est résumée par Sirard et
al. (2006) qui proposent une illustration des fenêtres de compétence d'un cycle oestral
bovin (figure 2.3). La supériorité du follicule dominant et celle des follicules subordonnées
en début d'atrésie correspondant approximativement au 5ème jour de la lere vague
folliculaire est illustrée telle qu'observée par Vassena et al. (2003) et Hendriksen et al.
(2004).
Fenêtre de compétence
Figure 2.3 : Schématisation de la croissance de follicules bovins lors des vagues
folliculaires d'un cycle oestral. La zone ombrée représente la fenêtre dans laquelle la
compétence serait significativement augmentée. Le niveau de gris des follicules indique
leur niveau de différenciation. Les follicules en pointillés sont atrétiques. Adapté de Sirard
et al. (2006).
2.4 Maturation ovocytaire
L'accumulation de transcrits et protéines maternelles est essentielle au soutien des
quatre premiers cycles cellulaires du jeune embryon en attendant l'activation majeure du
génome embryonnaire à la fin du 4eme cycle cellulaire (Memili et First 2000).
Le niveau de transcription est maximal avant que le follicule n'atteigne 3 mm de
diamètre, c'est-à-dire avant le début de la vague folliculaire. Ensuite la transcription
diminue mais reste néanmoins nécessaire sinon essentielle à l'acquisition de la compétence
de l'ovocyte, c'est à dire à l'acquisition de la capacité à être fécondé et à se développer en
blastocyste. La compétence s'acquiert au fil d'étapes dont les principales sont la
prématuration et la maturation. La prématuration ou capacitation débute lorsque le follicule
dominant atteint un diamètre de 8 mm. La maturation ou maturation finale a lieu entre le
19
pic de LH et l'ovulation et regroupe les maturations nucléaire, cytoplasmique et
moléculaire de l'ovocyte. La maturation précède la fécondation et le développement
embryonnaire incluant la transition materno-zygotique (MZT). C'est au cours de cette
dernière qu'a lieu la principale activation du génome embryonnaire permettant à l'embryon
de produire ses propres transcrits et protéines et ne plus dépendre essentiellement de
l'héritage génétique maternel (figure 2.4).
Vague folliculaire
zygote 2-cellules 4-cellules 8-cellules 16-cellules
activation mineure activation majeure
Maturation finale
3 mm.Pic LH
Ovulation
Transition materno-embryonnaire
Début du développement embryonnaireFécondation
Figure 2.4 : Phases de développement du follicule pré ovulatoire et de l'embryon chez la
vache. Adapté de Dieleman et al. (2002).
2.4.1 Prématuration
La prématuration, ou capacitation, correspond à la période de la folliculogenèse
précédant le pic de LH au cours de laquelle le follicule dominant passe de 8 mm de
diamètre à environ 15 mm de diamètre. Au cours de ce phénomène, des changements
morphologiques ultra structuraux se produisent telles la migration des granules corticaux et
l'ondulation de la membrane nucléaire de l'ovocyte. Une synthèse de protéines a lieu dans
le COC, contribuant probablement à l'accomplissement de la maturation finale ou aux
premiers stade de l'embryogenèse (Dieleman et al. 2002). Hyttel et al. (1997), les premiers
à utiliser le terme capacitation, ont également relevé des différences ultra structurales entre
ovocytes observés à plusieurs moments de la période de dominance folliculaire, c'est-à-dire
20
présentant un niveau de capacitation plus ou moins avancé. Ces différences, telles
l'expansion du compartiment lipidique, la réduction de l'appareil de Golgi ou des
modifications de l'aspect du nucléole, nourrissent l'idée d'un rôle de la capacitation. Leurs
données soutiennent l'idée de l'obtention par PIV d'un plus grand nombre de blastocystes à
partir d'ovocytes ayant subi la capacitation, plutôt qu'à partir d'ovocytes provenant de
follicules immatures de 2 à 6 mm de diamètre (Fair 2003).
Les changements au niveau moléculaire ne sont par contre que partiellement compris.
Humblot et al. (2005) ont comparé des ovocytes prélevés par ovariectomie 20 h, 28 h et 52
h avant le pic de LH. Aucune différence significative n'a été obtenue après comparaison de
leur morphologie, de leur capacité au développement et de la quantité de certains ARNm
impliqués dans la compétence au développement, concluant à la remise en question de
l'importance de la capacitation. Néanmoins, le nombre et la nature trop subjective des
paramètres de comparaison retenus pour l'étude sont critiqués. Knijn et al. (2002) ont
étudié l'effet de la prématuration sur l'abondance de six ARNm considérés comme des
marqueurs importants du développement. Pour cela, ils ont comparé l'abondance relative
de ces ARNm entre blastocystes dérivant d'ovocytes provenant de follicules de diamètre 3-
8 mm ou prélevés juste avant le pic de LH. En accord avec les résultats de Humblot et al.
(2005), aucune différence significative n'a été observée, malgré la confirmation d'un
meilleur taux de blastocystes obtenus pour le groupe ayant subi la prématuration. Les
auteurs suggèrent de tester d'autres marqueurs du développement, notamment des facteurs
impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, la compétence méiotique et l'expansion du
cumulus et d'analyser leur abondance relative immédiatement après la prématuration.
2.4.2 Maturation finale
Chez la vache, la maturation finale du follicule ovulatoire et de son ovocyte est initiée
par le pic préovulatoire de LH. La maturation finale est complétée en 24 h et prend fin avec
l'ovulation d'un ovocyte dit mature et prêt à être fécondé. Les maturations cytoplasmique,
nucléaire (méiotique) et moléculaire s'accomplissent simultanément et représentent une
21
série de processus complexes qui vont permettre à l'ovocyte de s'équiper pour passer avec
succès les étapes de fécondation et de développement de l'embryon pré-MZT (Sirard et al.
2003 ; Sirard et al. 2006).
2.4.2.1 Reprise de la méiose
In vivo, l'ovocyte prémature est bloqué au stade dyctiée de prophase de première
division de méiose jusqu'à la décharge de gonadotrophines. In vitro, l'extraction du COC
hors du follicule provoque, quelques heures plus tard, la reprise de la méiose, probablement
due à l'élimination d'un facteur folliculaire d'inhibition (Richard et Sirard 1996a ; Richard
et Sirard 1996b). Les facteurs de reprise de la méiose sont encore passablement inconnus.
Un processus crucial semble être l'activation du MPF (M-Phase Promoting Factor). Il s'agit
d'une protéine sérine/thréonine kinase constituée d'une cycline B et d'une kinase
dépendante des cyclines (CDK1) nécessaire au bon déroulement du cycle cellulaire
mitotique aussi bien que méiotique. L'évolution de la méiose chez l'ovocyte est régulée
suivant l'activité du MPF. Wu et al. (1997) ont décrit en détails la dynamique du cycle du
MPF. À la reprise de la méiose, la traduction des constituants du MPF s'intensifie. Le
complexe formé est dit pré-MPF et est activé suite à des déphosphorylations spécifiques du
CDK1 induites par la phosphatase CDC25. L'activité du MPF augmente jusqu'en
métaphase de première division (MI) induisant la condensation des chromosomes, la
rupture de la vésicule germinale et une réorganisation cytoplasmique. La séparation des
chromatides caractérisant le passage en anaphase est inhibée essentiellement par deux
facteurs apparemment indépendants : le MPF actif et la sécurine ou PTTG1 (Pituitary
Tumor Transforming Gène 1). Madgwick et al. (2004) ont étudié ces deux facteurs qui sont
des substrats du complexe APC/C (Anaphase Promoting Complex ou Cyclosome). Ce
dernier, une fois activé, reconnaît un court motif N-terminal (appelé la boîte de destruction)
de ses substrat cibles qu'il dégrade par poly-ubiquitination. Plus précisément, la présence
de sécurines inhibe l'action d'une séparase dont le rôle est de dégrader les cohésines qui
maintiennent les chromatides-sœurs ensemble. La deuxième division de méiose a lieu sans
passage par une phase S (phase de synthèse d'ADN). La cycline B est à nouveau traduite
pour former un nouveau MPF actif permettant le passage en métaphase de deuxième
22
division méiotique (Mil). Le même processus suivi en première division a lieu, avec
activation du APC/C induite par une série de pics de Ca2+ provoquée par la fécondation.
Chez les cellules HeLa (Chang et al. 2003), le maintien en activité du MPF via l'utilisation
de cycline Bl non dégradable empêche la transition métaphase-anaphase de la seconde
division méiotique. Chez la souris, alors que la sécurine est dégradée, cette transition est
seulement retardée puisque la séparation des chromatides-sœurs survient quelques heures
plus tard (Madgwick et al. 2004). L'effet de la non dégradation de la cycline Bl sur
l'établissement de la transition métaphase-anaphase varie suivant les études. Certains
résultats sont difficilement comparables car les espèces étudiées et le type de cycline Bl
non dégradable sont différents ce qui n'assure pas l'absence d'effets spécifiques au matériel
utilisé.
Plusieurs autres facteurs participent à la dynamique du MPF. Le facteur
cytoplasmique de stabilisation (CSF), surtout étudié chez Xenopus laevis, aide à l'activation
et à la stabilité du MPF lors de la première division de méiose, ainsi que lors du maintien de
l'ovocyte en Mil en absence de fécondation (Tunquist et Maller 2003). Les protéines C-
MOS et WEE 1 sont des kinases qui régulent l'activation du MPF en première division de
méiose, sa réactivation en métaphase de première division méiotique (MI) et le maintien de
son activité en Mil via des déphosphorylations et phosphorylations (Castro et al. 2001). La
cycline B1 est généralement présentée comme la partie régulatrice du MPF. Elle est absente
de l'ovocyte immature (Levesque et Sirard 1996) alors que ses transcrits y sont abondants
(Robert et al. 2002b). Cependant Wu et al. (1997) décrivent la partie régulatrice du MPF
bovin comme étant la cycline B2 et proposent une même dynamique de
formation/dégradation de la protéine que pour la cycline Bl. Les deux types de cycline B
semblent donc présents mais il reste à déterminer leurs différences fonctionnelles. Par
ailleurs, chez la souris la cycline Bl est un gène essentiel ce qui n'est pas le cas de la
cycline B2 (Brandeis et al. 1998).
23
2.4.2.2 Maturation cytoplasmique
Au cours des 24 h suivant le pic de LH, la maturation cytoplasmique se matérialise
par des changements dans l'organisation cytoplasmique de l'ovocyte. Sa réserve en lipides
augmente pour servir probablement aux premières étapes du développement embryonnaire.
L'abondance de l'appareil de Golgi diminue, les mitochondries s'organisent autour des
gouttelettes lipidiques et les granules corticaux s'alignent le long de l'oolemme en vue
d'empêcher la polyspermie. Cette réorganisation est une continuité de celle qui a lieu
pendant la prématuration (Hyttel et al. 1997).
Des changements ont également lieu au niveau du cumulus et de la granulosa. Ainsi,
peu avant l'ovulation, on observe une cessation de la synthèse d'oestradiol par les cellules
de la granulosa, un début de lutéinisation de la paroi folliculaire, une forte augmentation de
la production en progestérone et une considérable expansion des cellules du cumulus. La
communication entre l'ovocyte et les cellules du cumulus s'atténue suite au retrait
progressif des projections des cellules de cumulus hors du cytoplasme de l'ovocyte
(Dieleman et al. 2002). Elle demeure fonctionnelle chez le bovin jusqu'à l'arrêt méiotique
en Mil puisqu'elle permet le transport de petites molécules. Pourtant, Sutovsky et al. (1993)
ont observé le retrait d'un type de jonctions communicantes composées de connexine 43
hors de l'oolemme dès l'atteinte du stade GVBD vers 6 h de maturation. Au même
moment, un autre type de connexine, la connexine 32, apparaît dans le cytoplasme des
ovocytes. Plusieurs systèmes serviraient donc à la communication entre l'ovocyte et les
cellules du cumulus. Après 6 à 10 h de maturation finale, l'ovocyte est le siège d'une
intense traduction possiblement liée à l'intensification du processus de polyadénylation
cytoplasmique des ARNm concernés. Le niveau de traduction diminue à nouveau en Mil
(Tomek et al. 2002). Cette diminution est également observée par Coenen et al. (2004) dont
les travaux montrent une synthèse proteique maximale en début de maturation maintenue
jusqu'au stade MI après 10-12 h de culture, suivie d'une diminution de la synthèse
proteique pour atteindre un niveau stable maintenu jusqu'à la fin de la maturation. Trois
phases de synthèse proteique ont été identifiées pendant la maturation finale. La première a
lieu au cours des quatre premières heures de maturation, pendant le stade GV, la suivante a
24
lieu entre la 4eme et la 16ème heure de maturation, c'est-à-dire pendant la transition du stade
GVBD au stade MI et la dernière a lieu après le stade MI. Chez la souris, la large utilisation
des ARNm par les phénomènes de dégradation et de traduction (Schultz 1993) n'est pas
compensée par une augmentation de la transcription. Au contraire, cette dernière,
probablement rendue difficile par la compaction de la chromatine, diminue largement au
stade de démantèlement de la vésicule germinale (GVBD) jusqu'en Mil (Hyttel et al.
1997).
2.4.2.3 Maturation nucléaire
La maturation nucléaire désigne les modifications observées à l'intérieur du noyau de
l'ovocyte arrêté en prophase de première division de méiose jusqu'en MIL Le processus
dure 24 h. Il commence 4 à 8 h après le pic de LH (Hyttel et al. 1997) ou, in vitro, 4 à 8 h
après l'extraction du COC hors du follicule. La première étape visible est le stade GVBD
avec rupture de la membrane nucléaire et condensation de la chromatine environ après 6 h
de maturation. Le stade MI est atteint après 12 à 19 h de maturation. Au bout de 20 h de
maturation, la majorité des ovocytes sont au stade Mil (Sirard et al. 1989). La continuité de
ce processus exige une séparation correcte des chromosomes homologues et chromatide-
sœurs gouvernée par le MPF et les sécurines.
2.4.2.4 Maturation moléculaire
Un phénomène invisible au microscope et pourtant fondamental pour le devenir de
l'embryon est la maturation moléculaire. Cette idée récente désigne les modifications de
l'expression génique dont le patron permettra à l'ovocyte de mener à terme ou non son
développement en embryon. Une étude menée par Hyttel et al. (1997) a montré que, dans
des conditions in vitro, un ovocyte de 100 um au stade de vésicule germinale (GV) est
capable de reprendre la méiose, mais il faut qu'il ait atteint une taille de 110 um de
diamètre pour qu'il soit capable d'atteindre le stade Mil et une taille de 120 um de diamètre
pour pouvoir se développer en blastocyste. Au cours de sa croissance, l'ovocyte accumule
25
des transcrits maternels dont il se servira progressivement jusqu'à la MZT puisque la
transcription est très faible à partir de la maturation finale. Il est donc probable que le
niveau de compétence soit lié à l'accumulation de ces transcrits. C'est à partir de cette idée
que de nombreuses études ont entrepris de comparer l'expression de gènes ou de comparer
le transcriptome entre ovocytes ou embryons de différents niveaux de compétence. Des
techniques récentes de biologie moléculaire telles la technique de soustraction moléculaire
(Robert et al. 2000), l'hybridation de biopuces (Sirard et al. 2005 ; Vallée et al. 2005) ou
l'amplification par PCR en temps réel (Dode et al. 2006 ; Vigneault et al. 2004), permettent
de comparer quantitativement deux ou plusieurs groupes à partir d'une quantité infime de
matériel. Ainsi, depuis environ cinq ans, les données s'accumulent, assurant une place de
choix à la bioinformatique dont l'utilité sera sans égale pour gérer les quelques milliers de
données recueillies.
2.4.3 Fécondation et développement embryonnaire
L'intrusion du spermatozoïde dans l'ovocyte induit l'expulsion du deuxième globule
polaire ce qui permet la reprise/complétion de la méiose. Le développement de l'embryon
s'effectue pour les quatre premières divisions avec une transcription mineure. Il faut
attendre la MZT pour que l'activation du génome embryonnaire permette une production
conséquente de transcrits et de protéines propres à l'embryon (figure 2.5, Memili et First
2000).
26
Activation genique mineure Activation genique majeure
FécondationOh
G1 i32h 46h
S iG2l S62h
iG2l168h
M M M M
Figure 2.5 : Cycles cellulaires et synthèse d'ARNm chez l'embryon bovin. Activation
mineure entre les stades embryonnaires de 1 à 4 cellules et activation majeure débutant au
stade embryonnaire de 8 cellules. Adapté de Memili et al. (2000).
2.5 Régulation par polyadénylation
L'ARN a la particularité d'être une molécule très instable. Etant donné que la
transcription est majoritairement interrompue entre le stade GV et la MZT, l'ovocyte doit
posséder un système de régulation de la traduction/dégradation pour conserver ses ARNm.
Ce système est sensible à la longueur de la queue poly(A) à l'extrémité 3' de l'ARNm.
Ainsi, la régulation de la polyadénylation mène soit à la traduction après allongement de la
queue poly(A), soit à la dégradation en cas de défaut de déadénylation, soit au stockage en
cas de courte queue poly(A) de l'ARNm (Bachvarova 1992). Ce contrôle est essentiel car la
27
synthèse de protéines est indispensable à la maturation (Sirard et al. 1989). Chez la vache,
l'inhibition de la polyadénylation empêche la condensation de la chromatine, l'activation
du MPF et des MAP kinase ainsi que l'atteinte du stade GVBD dont les protéines
responsables sont généralement polyadénylées entre la 6ème et la I2eme heure de culture
(Krischek et Meinecke 2002). Enfin, le lien observé entre la perturbation de la
polyadénylation et l'altération du niveau de compétence d'ovocytes bovins mis au contact
de produits toxiques tels les biphényls polychlorés (BPCs), illustre l'importance de ce
système dans l'acquisition de la compétence au développement (Pocar et al. 2001).
Le patron de polyadénylation entre la maturation et le stade de blastocyste a
probablement une grande importance car il varie suivant les transcrits ainsi que suivant le
niveau de compétence de l'ovocyte ou de l'embryon. Notamment, il diffère pour un même
transcrit suivant la vitesse de clivage de l'embryon (Brevini et al. 2002), ou entre différents
transcrits suivant leur fonction. Par exemple, l'ARNm de la cycline Bl impliquée dans la
reprise de la méiose est polyadénylé avant le début de la maturation in vitro (Tremblay et
al. 2005), contrairement à la majorité des ARNm qui subissent, après le stade GVBD de la
maturation, soit une déadénylation (Lequarre et al. 2004) soit une polyadénylation (Tomek
et al. 2002). Il est également intéressant de noter que les isoformes d'un transcrit peuvent
présenter différents patrons de polyadénylation, c'est le cas pour la cycline Bl (Tremblay et
al. 2005). La cinétique de polyadénylation se poursuit jusqu'en fin de maturation,
augmentant la traduction de certains ARNm, alors que la transcription diminue.
2.6 Les étapes de la production d'embryons in vitro
De nombreuses études s'appliquent à reproduire in vitro jusqu'au stade de blastocyste
la production d'embryons bovins. Certaines poursuivent le processus jusqu'au transfert de
l'embryon chez une femelle réceptrice. Mais malgré ces essais, le taux de production in
vivo n'a toujours pas été approché à plus de 30-40% (Peterson et Lee 2003 ; Sirard et
Blondin 1996), si ce n'est en ayant recours à des traitements de superovulation augmentant
le taux de réussite à 80 % (Blondin et al. 2002). Les étapes de la production d'embryons
28
bovins in vitro, soit la collecte des ovocytes, la mise en maturation, la fécondation, le
développement et le transfert de l'embryon, illustrent les niveaux d'intervention ciblés par
les projets de recherche. Ces étapes sont brièvement citées ci-dessous car elles sont
largement décrites dans les thèses de Blondin (1997) et Ali (2003).
2.6.1 Environnement pré-collecte
L'idée que les conditions de vie de la femelle jouent un rôle sur la qualité du COC est
intuitive. Pourtant, chez la vache, l'alimentation de la femelle restreinte à 15 % sur une
période de 100 jours précédant la collecte des COCs n'affecte ni le nombre de follicules en
croissance, ni le taux de formation des blastocystes in vitro (Tripp et al. 2000). En fait, le
type de relation de la diète de la femelle sur la qualité ovocytaire dépendrait de la
physiologie de la femelle. Ainsi, augmenter l'apport alimentaire d'une femelle en surpoids
diminue la qualité de ses ovocytes alors que chez une femelle trop maigre, la qualité
ovocytaire en est augmentée (Adamiak et al. 2005). D'autres facteurs entrent enjeu, c'est le
cas des périodes de lactation. Ces dernières ne sont pas propices à donner de forts taux de
blastocystes car une partie de l'énergie de la femelle est réservée à la production de lait. De
même, les périodes très chaudes créent un stress, fatiguent l'organisme et sont défavorables
à la reproduction (Sartori et al. 2002).
2.6.2 Collecte et sélection
II existe plusieurs systèmes de récolte des ovocytes et embryons en vue d'une PIV.
Sur l'animal vivant, la laparoscopie (Sirard et Lambert 1986) permet de visualiser
l'intérieur de l'abdomen alors que la technique «ovum pick-up» (OPU) utilise
l'échographie pour sélectionner les follicules à ponctionner (Kruip et al. 1991).
L'application de cette dernière technique généralement associée à un traitement hormonal
est néanmoins critiquée. En effet, la fréquence des ponctions doit être étudiée pour ne pas
affecter la qualité et le rendement en ovocytes (McEvoy et al. 2006). L'optimisation de la
ponction du COC a été étudiée chez le mouton, impliquant le choix du matériel utilisé et la
29
pression d'aspiration (Rodriguez et al. 2006). Récolter les COCs après abattage de l'animal
ne compromet pas la qualité de l'ovocyte (Blondin et al. 1997). En cas de besoin de
stockage des ovaires entre le moment de l'abattage et de la collecte du COC, la température
doit être contrôlée. Alors que la qualité du COC chez la vache ne semble pas affectée par
un stockage d'une durée de 24 h à une température de 10°C suivi d'une maturation in vitro
avec sérum, elle diminue lorsque la température est de 0°C (Matsushita et al. 2004) ou de
37-39°C (Nakao et Nakatsuji 1992).
Lorsque la dimension des follicules nécessite une grande exactitude, la collecte des
ovocytes se fait généralement après dissection et mesure du follicule (Lequarre et al. 2005).
Les différentes méthodes de récolte de l'ovocyte permettent de jouer sur la maturité du
follicule en se basant sur la taille folliculaire, le statut folliculaire ou le traitement hormonal
tel que décrit respectivement aux points 2.2.3, 2.3.2 et 2.7.
La sélection des COCs est fréquemment basée sur sa morphologie. Ainsi, après
Leibfried et First (1979), plusieurs auteurs ont proposé une classification des COCs en se
référant à l'aspect et au nombre des couches de cellules du cumulus entourant l'ovocyte
ainsi que sur l'aspect de l'ovocyte lui-même. Généralement, les ovocytes désignés comme
les plus compétents sont décrits avec un cytoplasme homogène légèrement granulé et
entourés par moins de trois couches de cellules de cumulus. Pourtant les caractéristiques
morphologiques de l'ovocyte ne semblent pas toujours suffisantes pour prédire son niveau
de compétence (Hagemann et al. 1999 ; Vassena et al. 2003). Blondin et Sirard (1995) ont
travaillé sur des follicules de 2 à 18 mm de diamètre et ont proposé 6 classes de COCs
indépendamment de la taille folliculaire en se fiant au nombre de couches de cellules du
cumulus, au niveau d'atrésie et à l'aspect du cumulus et de l'ooplasme. Ils ont conclu à une
plus forte compétence des classes 1, 2 et 3 correspondant à des COCs non atrétiques ou en
début d'atrésie, possédant au moins trois couches de cellules et un cytoplasme homogène.
30
2.6.3 Mise en maturation et importance des hormones
Les COCs sont transférés dans un milieu de maturation pour une durée de 24 h. Il
s'agit du temps nécessaire pour l'accomplissement de la maturation nucléaire. Les variantes
de cette étape permettent entre autres de tester l'efficacité de différents milieux définis ou
non (Rosé et Bavister 1992), l'effet de co-cultures ou de remettre en question un matériel
ou un choix protocolaire. Il est également possible de vérifier l'avancée de la maturation
nucléaire par visualisation de la chromatine ou encore d'observer la communication peri-
oolemme à l'aide de colorants (Thomas et al. 2004).
La maturation ovocytaire est une étape cruciale dans l'acquisition du potentiel au
développement (cf. point 2.4). L'environnement et la composition du milieu de maturation
lors d'une PIV doivent donc être choisis avec attention. Tel que décrit dans la thèse de Ali
(2003), de nombreux milieux ont déjà été testés. La base de ces derniers se compose
généralement d'une solution physiologique tamponnée par du bicarbonate et additionnée de
lactate, pyruvate et glucose. Des antibiotiques peuvent être ajoutés pour prévenir les
contaminations ainsi que des composants complexes comme du sérum, des cellules
folliculaires ou du fluide folliculaire pour leur apport en éléments variés. L'ajout de ces
trois derniers composants complexes empêche néanmoins le milieu d'être complètement
défini puisque la composition précise demeure inconnue. C'est pourquoi certains
laboratoires préfèrent plutôt enrichir le milieu spécifiquement avec par exemple des acides
aminés, vitamines, gonadotrophines, hormones stéroïdes, antioxydants et facteurs de
croissance. Les projets de recherche basés sur des milieux complètement définis ou semi-
definis (ajout de BSA, albumine de sérum bovin) peuvent ainsi étudier les effets précis de
chaque constituant sur le déroulement de la PIV.
Les paragraphes suivants s'intéressent au rôle spécifique de l'hormone stéroïde
oestradiol (E2) et des gonadotrophines LH et FSH dans un milieu de maturation in vitro
exempt de sérum, de cellules folliculaires ou de fluide folliculaire. Dans des conditions in
vivo, le COC baigne dans le fluide folliculaire tout au long de la maturation. Alors que la
31
présence de LH et FSH dans le milieu de maturation n'est pas indispensable pour une PIV
(Trounson et al. 1994), les laboratoires de recherche se basent sur la littérature pour
constituer le milieu de maturation dans le but d'augmenter la compétence au
développement de l'ovocyte.
L'oestradiol est produite à partir d'une conversion enzymatique des androgènes dans
les cellules de la granulosa du follicule tandis que les gonadotrophines LH et FSH sont des
glycoprotéines produites par l'hypophyse et composées de deux sous unités a et |3. Les
rôles principaux de E2 chez la femme - préparation de la muqueuse utérine en vue d'une
implantation embryonnaire et rétrocontrôle positif et négatif sur la sécrétion des
gonadotrophines - sont bien documentés. Le rôle de LH dans l'induction de l'ovulation et le
maintien du corps jaune au cours du cycle oestral tout comme celui de FSH dans la
stimulation et le soutien de la croissance folliculaire et dans la sélection du follicule
dominant le sont également (Thibault et Levasseur 2000). Par contre, le rôle de ces trois
hormones au niveau de la maturation ovocytaire est moins connu et plus ou moins
controversé.
In vivo, la concentration de E2 dans le fluide folliculaire reste élevée jusqu'à une
durée de 6 h après le pic de LH (Dieleman et al. 1983). Mais l'absence de consensus dans la
littérature ne permet pas de lui attribuer un rôle dans la maturation ovocytaire. Ainsi, sa
présence dans le milieu de maturation peut avoir un effet nul (Beker-van Woudenberg et al.
2006) ou positif lorsque sa concentration équivaut à celle présente dans le fluide folliculaire
après le pic de LH (Ali et Sirard 2002b).
In vivo, les follicules de diamètre inférieur à 8 mm, c'est-à-dire ceux utilisés pour la
maturation in vitro (MIV) en général, présentent des ARNm de récepteur LH uniquement
dans les cellules de la thèque (Xu et al. 1995). Etant donné que les COCs mis en maturation
ne possèdent pas de cellules de la thèque, l'ajout de LH est inutile lors de l'étape de la
MIV. Pourtant les études sur le rôle de LH pendant la maturation ovocytaire et les étapes
subséquentes du développement sont controversées, concluant à un effet positif (Zuelke et
32
Brackett 1990) ou nul (Keefer et al. 1993). Une explication envisagée réside dans la
complexité du milieu de maturation. En effet, l'utilisation de sérum peut fausser les
résultats puisque ce dernier contient une multitude d'hormones dont la nature et les
proportions sont inconnues. Ainsi dans un milieu de maturation complètement défini, LH
n'a pas montré d'effet positif sur la compétence au développement de l'ovocyte (Ali et
Sirard 2002b). Notons par ailleurs que l'ajout de LH est souvent couplé à FSH, ce qui ne
permet pas de tirer de conclusion sur les rôles précis et distincts de LH et FSH (Saeki et al.
1991). En outre, certaines sources de LH (glande pituitaire, sérum ou urine) peuvent être
contaminées par FSH. L'effet observé attribué à LH pourrait ainsi résulter en réalité d'un
effet de FSH. C'est probablement ce qui a mené Zuelke et Brackett (1990) à attribuer un
rôle positif à l'ajout de LH pendant la MIV puisqu'ils ont utilisé une LH de source
pituitaire à une concentration de 100 ug/mL alors qu'à une telle concentration, la quantité
de FSH apportée n'est pas anodine. Pour toutes ces raisons, l'hormone LH commence à être
éliminée du milieu de maturation.
Le rôle de FSH dans l'acquisition d'un potentiel au développement lors de la
maturation in vitro est fréquemment cité (Ali et Sirard 2002b ; Izadyar et al. 1998) In vivo,
les follicules de diamètre inférieur à 8 mm possèdent des ARNm pour les récepteurs FSH
dans les cellules de la granulosa mais pas au niveau de l'ovocyte (Xu et al. 1995). Ce
dernier perçoit l'effet de FSH via les cellules de cumulus et de la granulosa. Il est accepté
que la présence de FSH dans le milieu de maturation provoque une augmentation du niveau
d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans les COCs induisant l'activation de la
protéine kinase A (PKA) (Webb et al. 2002) et l'expansion du cumulus (Ali et Sirard 2002a
; Luciano et al. 2004). L'activation d'une autre protéine kinase, la PKC, est évoquée,
notamment chez la souris (Viveiros et al. 2004). Le mécanisme d'aucune de ces deux voies
de transduction n'est bien compris mais, tel que suggéré par Ali et Sirard (2005), il pourrait
impliquer la libération de Ca2+ dans les cellules du cumulus ayant des effets sur la
transcription, la traduction ou le transfert d'informations dans l'ovocyte via les jonctions
communicantes. L'importance des voies PKA et PKC lors de la maturation des ovocytes
bovins a été testée (Ali et Sirard 2005) par le biais d'activateurs et d'inhibiteurs de ces deux
protéines kinase. L'implication de PKA apparaît complexe alors que l'activation des PKC
33
augmente significativement le taux de blastocystes. Plus précisément, FSH agirait dès les 6
premières heures de la maturation in vitro et aurait un plus gros impact lorsque ajoutée à
une concentration de 500 ng/mL et simultanément avec E2 (1000 ng/mL). Un judicieux
dosage de FSH dans le milieu de maturation semble capital puisque, à un niveau élevé chez
la souris (> 20 ng/mL), il induit des anomalies chromosomiques (Roberts et al. 2005) ainsi
qu'une maturation nucléaire accélérée. Au contraire, Izadyar et al. (1998) notent un retard
de la maturation nucléaire qui pourrait être avantageux pour l'acquisition de la compétence
au développement des ovocytes. En effet, ce délai pourrait aider à la complétion de la
maturation cytoplasmique incluant le stockage de tous les ARNm nécessaires au
développement.
De récentes études se penchent sur l'influence de la composition du milieu de
maturation sur l'expression de certains gènes. Ainsi Calder et al. (2005) ne notent aucun
effet relatif à la présence de FSH dans le milieu de maturation sur le niveau de transcrits
des récepteurs LH et FSH. Une banque de gènes exprimés par les cellules de la granulosa et
régulés par FSH a été construite chez la souris. Cette étude révèle l'importance de kinases,
phosphatases, facteurs de protection contre le stress oxydatif et facteurs impliqués dans
l'apoptose et la communication inter-cellulaire impliqués dans le mécanisme d'action de
FSH (Sasson et al. 2004).
Notons que la MIV ne reflète pas exactement le phénomène de maturation in vivo
car l'interaction entre follicules tout comme le statut et la taille folliculaire ne sont pas pris
en compte malgré leur importance (Bevers et al. 1997).
2.6.4 Fécondation et mise en culture
Après lavage, les COCs mûris sont transférés dans un milieu de fécondation où ils
restent en présence de spermatozoïdes pendant 16 à 18 h. Cette étape permet de tester la
qualité de la semence de différentes provenances. Une importante caractéristique
recherchée chez la semence est sa capacité à supporter la congélation. De nouvelles
34
compositions des milieux ou encore des techniques d'assistance à la fécondation peuvent
également être testées à cette étape. Après élimination des spermatozoïdes par lavage, les
ovocytes fécondés sont transférés dans un milieu adapté au développement de l'embryon où
la composition, la pression osmotique et la fréquence de changement des milieux sont
notamment étudiées (Wirtu et al. 2003). Tout comme pendant la maturation, la nutrition
durant les premières étapes du développement est capitale. En effet, l'embryon a vite fait
d'épuiser ses réserves pour dépendre complètement du milieu où il baigne.
2.6.5 Culture et influence de la durée séparant la fécondation du premier clivage
La cinétique de développement pour un embryon bovin obtenu in vitro est présentée
par Lequarre et al. (2005) comme étant de 25 h pour le 1er cycle cellulaire, de 10 h pour les
2eme et 3eme cycles et près de 40 h pour le 4eme cycle. Ces données correspondent à celles de
Massicotte et al. (sous presse) illustrées à la figure 2.6. L'inconstance de ces durées entre
ovocytes ou embryons est reliée à leur niveau de compétence au développement. La
relation inverse entre compétence et délai de clivage a été observée entre autres chez
l'embryon de souris (Warner et al. 1998), de buffalo (Totey et al. 1996) et chez l'humain
(Fenwick et al. 2002).
-24 0
GV Mil
36 48 60
1-cell 2-cell 4-cell 8-cell
108 hpi
16-cell
Figure 2.6 : Cinétique de maturation et développement de l'ovocyte et de l'embryon bovin.
Adapté de Massicotte et al. (sous presse), hpi, heures post fécondation.
Chez le bovin, Iwata et al. (2004) ont constaté une durée plus courte de la maturation
finale chez des ovocytes présentant un niveau de compétence supérieur à la moyenne. La
même constatation existe concernant le délai pour l'exclusion du premier globule polaire
(Dominko et First 1997). Cette précocité pourrait avoir des répercussions plus tard dans le
développement embryonnaire. Niemann et al. (1982) ont comparé la survie après
congélation/décongélation de blastocystes dont l'expansion a lieu au bout de 7 ou 8 jours de
culture. Tous deux présentent un même nombre de cellules témoignant la bonne qualité des
blastocystes, mais un meilleur taux de survie est observé pour ceux au développement
rapide. La majorité des études s'intéressant à la cinétique du développement embryonnaire
se concentrent sur les premières divisions cellulaires, en particulier sur le délai séparant la
fécondation du premier clivage. La relation inverse entre niveau de compétence et durée du
premier cycle cellulaire est bien acceptée dans la littérature et des précisions sont
régulièrement apportées. Ainsi, les milieux de maturation et de fécondation ont été mis en
cause notamment par Holm et al. (2002) dont l'étude relie le raccourcissement du 1er et du
4ieme cycle cellulaire à la présence de sérum. Cette étude présente également une diminution
de 1 à 5 h des 2eme, 3eme et 5eme cycles cellulaires chez les embryons dérivant d'ovocytes de
vaches superovulées (meilleure qualité) comparativement à des ovocytes mûris in vitro
(moindre qualité). Suivant le même raisonnement, Lequarre et al. (2005) obtiennent une
durée du 1er et du 3ème cycle cellulaire plus courte pour les embryons les plus compétents,
quelle que soit la taille du follicule d'origine, ce qui n'est pas le cas pour le 4eme cycle
cellulaire, (cf. paragraphe 2.2.3 sur l'effet de la taille folliculaire sur la compétence
ovocytaire). Dinnyes et al. (1999) obtiennent une nette influence du délai au 1er clivage sur
la résistance des embryons bovins à la cryopréservation, les plus résistants présentant un 1er
clivage avant 30 hpi (heures post fécondation). Lonergan et al. (1999) obtiennent également
de meilleurs taux de clivage et de formation de blastocystes suite au clivage précoce, mais
précise qu'une fois le stade de blastocyste atteint, aucunes différences ne concernent les
taux d'éclosion du blastocyste, le nombre de cellules, le taux de gestation ou le ratio
male/femelle. Ce dernier critère est néanmoins controversé dans la littérature. En effet, chez
le bovin un développement plus rapide de l'embryon mâle a été observé (Carvalho et al.
1996), alors que Peippo et al. (2001) restreignent cet effet à la présence de glucose dans le
milieu de culture. Chez la souris, le mouton et l'humain, les études alternent entre rapidité
36
du développement pré-implantatoire supérieure chez le mâle (Bernardi et Delouis 1996 ;
Nedambale et al. 2004) et absence de relation avec le sexe (Dumoulin et al. 2005 ;
Kaminski et al. 1996).
Quoiqu'il en soit, les conséquences du délai de clivage sur le développement
embryonnaire se restreignent aux étapes pré-implantatoire, ce qui pousse à privilégier un
rôle prépondérant de la nature et de l'abondance des ARNm maternels. Une idée est que la
surabondance ou la simple présence de transcrits ou protéines spécifiques apportent les
éléments nécessaires à un clivage précoce. Puisque le niveau de transcription est quasi nul
entre le début de la maturation finale et la MZT (4ieme cycle cellulaire chez le bovin) et que
le développement des embryons de PIV est majoritairement bloqué aux 2eme et 4eme cycles
cellulaires (Holm et al. 2002), il est intéressant d'étudier la nature et le niveau des transcrits
des embryons au clivage précoce comparativement à ceux présentant un clivage tardif. De
cette idée découlent les études récentes (et en constante augmentation) sur le contenu
moléculaire des jeunes embryons. En comparant deux groupes d'embryons présentant un
délai de clivage différent, respectivement inférieur à 27 h contre supérieur à 33 h et 24 h à
32 h contre 36 h à 42 h après la fécondation, les études de Fair et al. (2004) et Dode et al.
(2006) ont utilisé deux méthodes différentes, le SSH et l'hybridation de biopuces d'ADNc,
pour identifier des transcrits dont le niveau est plus élevé en cas de clivage précoce. Ils ont
ainsi isolé les transcrits de protéines nucléaires H2A et H3A responsables de la structure
des nucléosomes, de la protéine de défense IOH contre le stress oxydatif et de la protéine
YEAF jouant un rôle de répresseur de la transcription. De façon similaire, Lonergan et al.
(2000) ont isolé les transcrits des gènes «housekeeping» G6PD (code pour une enzyme
protectrice des cellules sanguines) et HPRT (code pour une enzyme impliquée dans
l'utilisation cellulaire des purines) chez des embryons et des blastocystes dérivant
d'embryons clivant en 27 ou 30 h comparativement à 33 h suivant la fécondation. Enfin,
une étude appuyant l'idée de faiblesse des embryons au clivage tardif (Gutierrez-Adan et al.
2004) a relevé la surabondance de transcrits impliqués dans le métabolisme et la croissance
chez des embryons obtenus in vivo ou ayant un développement rapide comparativement à
la surabondance de transcrits impliqués dans la défense contre le stress oxydatif chez des
embryons obtenus in vitro ou présentant un développement lent. En restant au niveau
moléculaire mais au stade de blastocyste, Wrenzycki et al. (2003) ont montré la
surreprésentation de transcrits jouant un rôle clé dans la formation et l'expansion de
blastocystes formés en 7 jours plutôt qu'en 8 jours. La mise en commun des études
identifiant des transcrits dont le niveau présente un lien avec la cinétique de développement
du jeune embryon promet de grands progrès dans la compréhension du fonctionnement et
des implications de cette dynamique.
Outre l'étude quantitative des transcrits, le niveau de polyadénylation de certains
gènes, tel le raccourcissement ou l'élongation de la queue polyA, a été relié au délai de
clivage de l'embryon (Brevini et al. 2002). Or, il est accepté que le niveau de compétence
est lié au niveau de polyadénylation des transcrits (cf. point 2.5 sur la régulation par
polyadénylation). Par ailleurs, le rôle de facteurs génétiques ne doit pas être négligé. Chez
la souris, le gène PED se retrouve sous deux formes, chacune liée à une vitesse de
développement préimplantatoire (Warner et al. 1998). En outre, la semence est mise en
cause car elle affecte la cinétique du développement chez le bovin en agissant sur la
première réplication de l'ADN du zygote et indirectement sur le délai pour le premier
clivage. Ainsi, la semence donnant de forts taux de blastocystes induit une phase S précoce
et allongée (Eid et al. 1994) suivi d'un clivage précoce (Comizzoli et al. 2000).
2.6.6 Transfert d'embryon
La dernière étape de la PIV est le transfert de l'embryon chez une femelle réceptrice
pour le temps de la gestation. Les données de mort post-transfert présentées chez le bovin
par Peterson et Lee (2003) montrent le faible rendement des méthodes utilisées. Il est
encore aujourd'hui difficile de comprendre précisément la cause de ce manque d'efficacité.
Outre les pertes in utero, de nombreux animaux naissent avec des malformations dont une
manifestation fréquente est le syndrome du gros veau (Young et al. 1998). Dans ce dernier
cas, un défaut d'empreinte génétique semble être mis en cause (Khosla et al. 2001), mais le
mécanisme n'est encore que partiellement compris.
2.7 Influence de l'utilisation de gonadotrophines in vivo avant la MIV
L'administration biquotidienne pendant 4 jours de doses décroissantes de
gonadotrophines chez le bovin peut provoquer une superovulation ou superstimulation. La
superovulation mène à une augmentation considérable du nombre de follicules prêts à
ovuler. Cette technique promet un fort rendement dans la production de veaux provenant de
la PIV. Le principe repose sur l'élargissement du phénomène de sélection folliculaire. En
effet, l'apport de FSH étendue sur plusieurs jours permet la sélection d'un plus grand
nombre de follicules de 2 à 4 mm de diamètre qui poursuivront leur croissance sans
percevoir l'inhibition du follicule dominant (Baird 1988). La réponse de l'ovaire à une
superovulation est néanmoins très variable (Lerner et al. 1986), ce qui constitue un facteur
limitant important pour une exploitation optimale de ce traitement. La cause majeure de
variabilité serait le statut du follicule au moment de l'initiation du traitement par les
gonadotrophines, mais d'autres facteurs telles la nature et la fréquence d'injection des
gonadotrophines ainsi que des caractéristiques intrinsèques à l'animal sont également mis
en cause (Mapletoft et al. 2002). De nombreuses pistes d'amélioration du protocole de
superovulation sont proposées. Ainsi plusieurs études s'attachent à optimiser la
synchronisation des vagues folliculaires (Humblot et al. 2005 ; van de Leemput et al. 1999),
la nature et la fréquence des gonadotrophines LH et FSH ajoutées (Blondin et al. 2002;
Durocher et al. 2006 ; Goodhand et al. 2000), la fréquence et le protocole des OPU
(McEvoy et al. 2006) et la personnalisation des traitements, par exemple selon le niveau de
réponse aux gonadotrophines de l'animal (Durocher et al. 2006).
Malgré les progrès des dernières décennies, les vaches stimulées présentent plusieurs
différences avec celles non stimulées. Van de Leemput et al. (2001) résument quelques-
unes des différences : cinétique de méiose (seuls 73 % des ovocytes de vaches stimulées
atteignent le stade de Mil comparativement à 100 % en absence de stimulation), présence
d'asynchronies intra et interfolliculaires ou encore dépendance à FSH (75 % des follicules
préovulatoires des vaches stimulées conservent une dépendance à FSH). Malgré cela, la
superovulation est couramment utilisée dans les études comparant les techniques de PIV in
vitro et in vivo. En effet, il s'agit du seul moyen pour obtenir un grand nombre d'ovocytes
39
mûris in vivo simultanément à partir d'un nombre de vaches restreint. Par ailleurs, alors que
peu d'études comparent la compétence au développement in vivo chez des vaches stimulées
ou non, Blondin et al. (2002) ont obtenu un niveau de compétence proche de celui d'un
processus totalement in vivo à partir d'ovocytes obtenus suite à une superovulation
optimisée.
Comme présentée au point 2.4, l'importance donnée à l'étape de maturation
ovocytaire s'est accrue ces dernières années, d'où les nombreuses études comparant la MIV
et la maturation in vivo. La figure 2.7 présente différents niveaux de transition entre les
protocoles in vivo et in vitro et elle illustre les comparaisons possibles qui alimentent de
nombreuses études (comparaison des scénarios A, B, C et D).
A)
B)
C)
Prématuration Maturationfinale
°q^ ̂ Développementde l'embryon
Prématuration
Prématuration
Maturationfinale
FIV CIV
+ MIV + FIV + CIV
MIV + FIV + CIV
Figure 2.7 : Diagramme opposant les milieux in vivo et in vitro lors d'une production
d'embryon in vitro. Les lettres A à D présentent quatre transitions possibles entre les
milieux in vivo (étapes encadrées) et in vitro menant à la production d'embryons à partir de
follicules préovulatoires. Les embryons en A) sont obtenus totalement in vivo. Les
ovocytes en B) subissent une maturation complète in vivo avant d'être fécondés puis les
embryons sont cultivés in vitro. Les ovocytes en C) sont transférés in vitro juste avant le pic
40
de LH pour subir la maturation finale, la fécondation et la culture de l'embryon. En D), les
ovocytes sont prélevés à différents stades de croissance du follicule pour subir les mêmes
étapes qu'en C). MIV, maturation in vitro ; FIV, fécondation in vitro ; CIV, culture in vitro.
Holm et Callesen (1998) proposent une revue de la littérature relatant les différences
morphologiques, biochimiques et génomiques entre un environnement in vivo et in vitro
dans la production d'embryons bovins. Il ressort en particulier une similitude de la majorité
des paramètres analysés mais une compétence au développement significativement
supérieure après une maturation in vivo. En effet, la meilleure qualité des ovocytes
subissant une maturation in vivo (figure 2.7.B) par rapport à une maturation in vitro (figure
2.7.C ou D) est largement reconnue (Rizos et al. 2002a). La conséquence la plus évidente et
la mieux étudiée est la différence du taux de formation en blastocystes trois fois plus élevé
après une maturation in vivo chez le bovin plutôt que après une maturation in vitro (Sirard
et Blondin 1996). Les études récentes citées ci-dessous analysent plusieurs aspects validant
l'importance des étapes de prématuration (avant le pic de LH) et de maturation finale in
vivo (entre le pic de LH et l'ovulation). Dieleman et al. (2002) proposent une liste d'effets
propres à ces étapes de prématuration et de maturation finale in vivo comparés à ces mêmes
étapes in vitro sur la capacité au développement et la qualité des embryons
préimplantatoires. En se basant sur des études comparant les scénarios B et C (figure 2.7), il
apparaît que la maturation finale in vivo permet un plus grand taux de formation de
blastocystes. Par exemple, après traitement de superovulation et respectivement avec
maturation finale in vivo et in vitro, 49,3 % et 26,4 % de blastocystes ont été obtenu après
11 jours de CIV (van de Leemput et al. 1999). Une étude similaire a obtenu respectivement
58,2 % et 39,2 % de blastocystes après 8 jours de CIV (Rizos et al. 2002a). Les aberrations
chromosomiques ainsi que le taux de croissance des embryons dérivant d'une maturation
finale in vivo sont respectivement plus faibles et plus élevé que pour des embryons dérivant
d'une maturation finale in vitro (Dieleman et al. 2002).
L'importance de la prématuration est moins documentée. Contrairement à d'autres
études, Rizos et al. (2002a) n'obtiennent pas de différence entre le taux de blastocystes
dérivant d'une prématuration in vivo (figure 2.7.C) ou dérivant d'ovocytes prélevés
41
pendant cette période (figure 2.7.D). Pourtant, les COCs lors de la prématuration in vivo
sont le siège d'une synthèse de protéines dont un rôle dans l'acquisition d'une compétence
au développement est proposé (Dieleman et al. 2002).
Les différences de compétence au développement observées entre l'utilisation de
milieux in vitro et in vivo découlent-elles d'un contenu distinct au niveau moléculaire ou
d'une empreinte génétique incomplète ? C'est ce que plusieurs auteurs ont étudié en se
basant sur le fait que la maturation (pré- et finale) est le siège d'une faible transcription
ovocytaire et que l'embryon est contraint de se satisfaire des ARNm maternels jusqu'à la
MZT (cf. point 2.4). Les résultats diffèrent selon les études et les transcrits analysés.
Aucune différence n'est observée dans le niveau d'ARNm impliqués dans les phénomènes
de cavitation, de métabolisme et de réponse au stress pour des blastocystes dérivant d'une
maturation finale in vivo ou in vitro suivi d'une fécondation in vitro (FIV) et d'une culture
in vitro (CIV), alors que des différences apparaissent après comparaison avec des
blastocystes obtenus totalement in vivo (Knijn et al. 2002). Lonergan et al. (2003) ont
observé une augmentation du niveau d'ARNm de certaines enzymes impliquées dans la
protection contre le stress oxydatif dans un scénario D comparativement à un scénario C
(figure 2.7). Mais l'effet inverse se produit pour l'enzyme G6PDH. Aucun effet n'apparaît
pour des facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. Enfin, le niveau d'ARNm
de GDF9 diminue significativement pour le scénario B (menant aux ovocytes les plus
compétents) comparativement aux scénarios C ou D (figure 2.7), mais l'explication reste à
déterminer. Enfin, une étude récente (Humblot et al. 2005) s'est intéressée à quatre
moments différents précédant le pic de LH pour y mesurer le niveau d'ARNm de transcrits
clés dans l'acquisition d'une compétence au développement. Alors que le niveau des
ARNm de GDF9 et G6PDH ne montrent pas de variation, celui du facteur de réponse au
stress HSP diminue significativement lorsqu'il est mesuré juste avant le pic de LH
(prématuration in vivo) indiquant l'importance d'une protection contre les situations
compromettant la survie de l'ovocyte pendant la prématuration. Il n'est pas évident de
comparer les résultats des études suscitées car, si un même transcrit est parfois analysé dans
plusieurs études, les mesures n'ont pas été effectuées exactement aux mêmes étapes de
développement. De plus, ces études ne révèlent pas le rôle fonctionnel des candidats
42
identifiés puisqu'elles informent uniquement sur le niveau d'ARNm sans en analyser la
traduction en protéine ou le niveau de la protéine alors que seule cette dernière est
impliquée directement dans le fonctionnement, le développement ou la régulation de la
cellule.
Finalement, il apparaît que plusieurs situations indépendantes sont favorables à la
compétence au développement. Dans ce cas, peut-on s'attendre à une relation entre la
présence d'ARNm spécifiques et une forte compétence au développement toutes situations
confondues ? La comparaison de transcriptomes sélectionnés pourrait aider à y répondre.
2.8 PLAN DE TRAVAIL
Tel que présenté dans la revue de la littérature, il existe chez l'ovocyte et l'embryon
plusieurs situations critiques pour la compétence au développement embryonnaire. Nous
avons choisi d'axer le projet sur quatre de celles-ci, soit les conditions de la maturation
finale, la composition du milieu de maturation, le délai de premier clivage et le diamètre
folliculaire. L'identification de transcrits présents majoritairement ou spécifiquement dans
les situations de forte compétence nous permettra de les proposer comme marqueurs
potentiels de qualité ovocytaire.
2.8.1 Objectif général
L'objectif général de cette étude consiste à identifier des marqueurs de compétence
chez l'ovocyte et le jeune embryon.
2.8.2 Objectifs spécifiques
Le premier objectif est de construire une banque de transcrits spécifiques à la
maturation in vivo. Cette banque de données construite grâce à une technique de
soustraction moléculaire entre ovocytes mûris in vivo et ovocytes mûris in vitro sera
ensuite transférée sur une biopuce d'ADNc pour servir de point de départ à la sélection de
marqueurs de compétence potentiels.
Le deuxième objectif est l'isolement de marqueurs de compétence potentiels parmi
ceux de la banque de données obtenue précédemment. Pour cela, la biopuce sera hybridée
avec deux sondes compatibles pour chacune des situations de compétence divergente :
1) Privation ou enrichissement du milieu de maturation en FSH
2) Premier clivage tardif ou précoce.
Enfin, le troisième objectif réside dans la vérification de la réelle spécificité des
candidats sélectionnés pour des conditions connues de forte compétence. Une technique
d'amplification par PCR en temps réel sera utilisée pour comparer le niveau d'ARNm pour
trois situations de compétence divergente :
1) Privation ou enrichissement du milieu de maturation en FSH
2) Premier clivage tardif ou précoce
3) Diamètre folliculaire inférieur à 3 mm, 3 à 5 mm, 5 à 8 mm ou supérieur à
8mm.
CHAPITRE 3
INFLUENCE DE LA TAILLE DU FOLLICULE, DE L'ENRICHISSEMENT DU
MILIEU DE MATURATION EN FSH ET D'UN CLIVAGE PRÉCOCE SUR LES
NIVEAU D'ARNm MATERNELS D'OVOCYTES BOVINS
3.1 AVANT-PROPOS
Ce chapitre présente un article publié dans la revue «Molecular Reproduction and
Development» sous la référence suivante : M. Mourot, I. Dufort, C. Gravel, O. Algriany, S.
Dieleman, and M.A. Sirard. The influence of follicle size, FSH-enriched maturation
médium, and early cleavage on bovine oocyte maternai mRNA levels. Mol. Reprod. Dev.
2006 Nov; 73(11): 1367-79.
Parmi les coauteurs, Isabelle Dufort a participé à plusieurs expériences de biologie
moléculaire et à l'analyse des résultats d'hybridations de la biopuce, Catherine Gravel a
participé à l'identification des «Expressed Séquence Tags» (ESTs) issus du SSH, Omran
Algriany et Steph Dieleman ont fourni les ovocytes bovins récoltés à 6 h pré-LH et ont
effectué le SSH entre ovocytes récoltés à 2 h pré-LH et ovocytes récoltés à 6 h post-LH.
Enfin, Marc-André Sirard a inspiré et supervisé le projet.
Je suis l'auteure principale de cet article que j'ai rédigé. J'ai effectué la quasi-
totalité des expériences présentées même si j 'ai bénéficié de l'aide des coauteurs tel que
spécifié ci-dessus.
3.2 RESUME DE L'ARTICLE
Chez l'ovocyte bovin, la transcription cesse dès les premières heures de maturation
in vitro. L'ARN maternel accumulé dans l'ovocyte est donc essentiel au soutien du
développement embryonnaire jusqu'à la transition materno-zygotique. Les ovocytes mûris
in vivo présentent un taux de formation en blastocystes supérieur à celui des ovocytes mûris
in vitro suggérant que leur contenu en ARNm est de meilleure qualité. Afin de déterminer
quels transcrits pourraient être associés à la compétence au développement, une hybridation
suppressive soustractive a été effectuée entre ovocytes récoltés par ovariectomie 6 h après
le pic de LH et ovocytes d'abattoir récoltés après 6 h de maturation, résultant en une
librairie enrichie en ces ARNm fonctionnellement importants. Les clones ont été déposés
sur une biopuce d'ADNc et de potentiels transcrits associés à la compétence au
développement ont été hybrides sur ces lames. Les hybridations ont d'abord été effectuées
avec des transcrits provenant d'ovocytes ayant mûris 6 h in vitro en présence ou en absence
de rFSH, puis avec des transcrits provenant d'embryons au clivage précoce ou demeurant
au stade 1-cellule 36 h après fécondation. À partir de ces hybridations, treize candidats ont
été sélectionnés. Leur lien fonctionnel avec la compétence embryonnaire a été validé par
PCR quantitative en temps réel en mesurant le niveau relatif de leur transcrit selon huit
conditions : ovocytes mûris en présence ou absence de rFSH, embryons au clivage précoce
ou tardif et ovocytes provenant de follicules de différents diamètres (1 à 3 mm, 3 à 5 mm, 5
à 8 mm et supérieur à 8 mm). Les gènes candidats CCNB2, PTTG1, H2A, CKS1, PSMB2,
SKIIP, CDC5L, RGS16 et PRDX1 ont révélé une association quantitative significative avec
la compétence contrairement à BMP 15, GDF9, CCNB1 et 57X15.
46
3.3 TITLE
The influence of follicle size, FSH-enriched maturation médium, and early cleavage on
bovine oocyte maternai mRNA levels
3.4 AUTHORS
Marina Mourot, Isabelle Dufort, Catherine Gravel, Omran Algriany, Steph Dieleman, and
Marc-André Sirard
3.5 ABSTRACT
Transcription is arrested in the bovine oocyte within the first few hours of in vitro
maturation, thus the stored maternai mRNAs accumulated in the oocyte are essential to
sustain development until the Maternal-Zygotic Transition. In vivo matured oocytes hâve
superior blastocyst formation rates than in vitro matured oocytes, suggesting that the
mRNA content of thèse oocytes is of higher quality. To détermine which transcripts may be
associated with developmental compétence, a Suppressive Subtractive Hybridization was
performed between oocytes collected by ovariectomy at 6 hr post-LH surge and oocytes
from slaughterhouse collected after 6 hr of maturation, resulting in a library enriched in
thèse functionally important mRNAs. The clones were spotted onto a cDNA microarray
and transcripts potentially associated with developmental compétence were hybridized onto
thèse slides. Hybridizations were performed with transcripts up-regulated in oocytes
cultured for 6 hr in the présence or absence of rFSH in vitro, and secondly with transcripts
up-regulated in early-cleaving embryos versus those at the one-cell stage at 36 hr
postfertilization. From thèse hybridizations, thirteen candidates were selected. Their
functional association with embryonic compétence was validated by measuring their
relative transcript levels by quantitative real-time PCR in eight différent conditions: oocytes
cultured with or without the présence of rFSH, early- versus late-cleaving embryos, and
oocytes from différent follicle sizes (1-3 mm, 3-5 mm, 5-8 mm, and > 8 mm of diameter).
47
The gène candidates CCNB2, PTTG1, H2A, CKS1, PSMB2, SKIIP, CDC5L, RGS16, and
PRDX1 showed a significant quantitative association with compétence compared to
BMP15, GDF9, CCNB1, and STK6.
3.6 INTRODUCTION
Until the Maternal-Zygotic Transition (MZT), which occurs at the 8- to 16-cell
stage in the bovine, the early embryo is entirely dépendent on stored information in the
oocyte (Memili and First 2000) consisting of mRNAs and proteins produced during
oogenesis and oocyte maturation. Major maternai transcription diminishes before final
oocyte maturation as the follicles reach 3 mm or greater (Fair et al. 1995). From this point
on, transcription continues at low levels implying that stockpiled proteins and transcripts
are no longer replaced and rather are gradually used (translated or degraded) through to
MZT to satisfy the requirements of fertilization and early embryo development. Whereas
the major transcription begins at the 8- to 16-cell stage, the onset of bovine embryo
transcription is suspected to begin as early as 2-cell stage with a minor transcription period
(Memili and First 1999). The hypothesis that the quality of the stockpiled mRNA in the
matured oocyte will dictate developmental competency is largely accepted (Dieleman et al.
2002; Fair et al. 2004; Rizos et al. 2002b; Sirard 2001).
A number of variables hâve been identified to be associated with developmental
compétence. It is well known that in vivo matured oocytes are more developmentally
compétent than in vitro matured oocytes (Rizos et al. 2002a) and that full compétence in
ovine is acquired before the first third of the 24 hr maturation period (Moor and Warnes
1978). But other conditions or criteria can be also used to identify compétent oocytes in
vitro. The follicle size from which the oocytes are obtained characterizes the developmental
stage of the follicle and the maturational stages of the oocyte within that follicle (Blondin
and Sirard 1995; Lequarre et al. 2005; Lonergan et al. 1994). In addition, the composition
of the in vitro maturation média will also provide the oocyte with certain factors that may
contribute to acquisition of developmental competency (Ali and Sirard 2002a; Ali and
Sirard 2002b; Izadyar et al. 1998; Lim et al. 2003). For instance, the addition of Follicle
Stimulating Hormone (FSH) in the maturation médium has been shown to improve
blastocyst formation rates (Ali and Sirard 2005; Izadyar et al. 1998). Lastly, the time of first
49
cleavage was identified as an important factor related to developmental compétence (Fair et
al. 2004; Gutierrez-Adan et al. 2004; Lonergan et al. 2003).
Already many studies hâve compared potentially important or essential gènes
involved in oocyte maturation, fertilization and embryo development in the bovine. Most of
thèse gène candidates hâve been selected due to their potential rôles or functions in early
development, such as metabolism, régulation of gène and protein expression, intercellular
communication, protection from oxidative stress (Calder et al. 2005; Knijn et al. 2002;
Lonergan et al. 2003), or because they hâve been characterized in other species such as
knock-out mouse (Rajkovic and Matzuk 2002). Rarely has the sélection of gène candidates
come from expérimental observations made directly in the bovine species.
The purpose of the présent study was to use powerful molecular techniques to
reveal new gène candidates involved in the acquisition of developmental compétence. In
view of this objective, a Suppressive Subtractive Hybridization (SSH) library was
constructed highlighting the gènes spécifie to 6 hr post-LH surge oocytes compared to in
vitro matured oocytes at the same maturational stage. Microarray hybridization was then
used to sélect potential candidates from the library. Microarrays were hybridized with
transcripts from oocytes or embryos subjected to différent conditions that resuit in higher
developmental competency in vitro; the présence of recombinant-human FSH (r-hf?SH) in
the in vitro maturation médium and early-cleaving embryos. From the potential candidates,
thirteen were selected and investigated by quantitative PCR to quantify and verify levels in
oocytes derived from follicles of varying sizes, oocytes cultured with or without FSH, and
embryos that cleave at différent rates. This study demonstrates how high throughput
techniques can be utilized to identify factors related to the acquisition of developmental
compétence in the bovine.
50
3.7 MATERIALS AND METHODS
Organization of the materials and methods is resumed in figure 3.1. Ail chemicals
originate from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) unless otherwise stated.
3.7.1 Suppressive Subtractive Hybridizations materials
SSH1: 2 hr pre- and 6 hr post-LH surge oocytes collection
Material was provided by Dr. Dieleman (Utrecht University, The Netherlands),
whose protocol for superovulation with controlled LH surge was described in détail
elsewhere (Knijn et al. 2002). Briefly, on Day 9 of the synchronized estrous cycle, the cows
received an ear implant for 5 days (3 mg norgestomet, Crestar; Intervet International BV,
Boxmeer, The Netherlands). Superovulation was triggered from Day 10 onwards with
administration of FSH twice a day over a period of 4 days. Prostaglandin was administered
together with the 5th dose of FSH, and 50 hr later implants were removed. GnRH was then
also given, and cows (n=19) were ovariectomized by laparotomy immediately which
corresponds to 2 hr pre-LH surge, or 8 hr later which corresponds to 6 hr post-LH surge;
one cow was excluded on the basis of the LH profile in blood plasma. Oocytes of
preovulatory-sized follicles were completely denuded using hyaluronidase, and then
washed 3 times in PBS-PVA. Concentrations of estradiol, progestérone and testosterone
were measured by radioimmunoassay in the follicular fluid to sélect only compétent
follicles. For the 2 hr pre-LH surge and 6 hr post-LH surge groups 72% (49/68; n=10 cows)
and 71.2% (52/73; n=8 cows) of the follicles showed a normal steroid profile, respectively,
as in the one preovulatory follicle of non-stimulated, cyclic cows (Dieleman et al. 1983).
Thirty oocytes from each treatment were pooled and stored at -80°C in a minimal volume
until RNA extraction for SSH.
51
SSH2: 6 hr post-LH surge and 6 hr IVM oocytes collection
Six hours post-LH surge oocytes for SSH2 are the same than used for SSHl. Six
hours IVM oocytes were got as followed. Bovine ovaries were collected at a commercial
slaughterhouse and transported to the laboratory at 30°C in a 0.9% saline solution
supplemented with an antibiotic-antimycotic (penicillin, streptomycin, and amphotericin
B). Cumulus-oocytes-complexes (COCs) were collected and selected as detailed by Ali and
Sirard (2005). Only the COCs that were classified as classes 1 to 3 from follicles 3-5 mm in
diameter were selected for in vitro maturation according to Blondin and Sirard (1995).
Groups of 10 selected oocytes were incubated in 50 ul droplets containing maturation
médium under stérile minerai oil for 6 hr at 38.5°C with 5% CO2 and a saturated humidified
atmosphère. The maturation médium was composed of modified Synthetic Oviductal Fluid
(SOF) médium supplemented with 0.8% BSA, 20 ml/L of 50X Modified Eagle Médium
(MEM) non essential amino acids (Gibco BRL, Burlington, ON, Canada), 10 ml/L of 100X
MEM essential amino acids (Gibco), 0.33 mM pyruvic acid, 1 mM glutamine, and 50
u,g/ml gentamicin. After maturation the oocytes were denuded, washed three times with
PBS, and stored at -80°C until RNA extraction.
3.7.2 Total RNA extraction
Ail materials used in this study were total RNA extracted using the Absolutely
RNA™ Microprep Kit (Stratagen, La Jolla, CA, USA) following the manufacturers
instructions. A DNAse I digestion was performed and the RNA was eluted twice in 50 u.1 of
warm elution buffer.
3.7.3 SSH technique
After extraction, the RNA was precipitated by adding 1/10 volume of 3M sodium
acétate pH 5.2, 40 ng of linear acrylamide (Ambion, Austin, TX, USA) as a carrier and 1
volume of isopropanol. The mixture was chilled at -80°C for 30 min, centrifuged for 20 min
52
at 4°C at 16000 g. The pellet was then washed with 75% EtOH and resuspended in 3 ui of
nuclease-free water.
The SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA) was
used to amplify the mRNA prior to the subtraction. Subtraction was performed according to
the manufacturers directions. A first subtraction was performed with 6 hr post-LH surge
oocytes as tester cDNA and 2 hr pre-LH surge oocytes as driver cDNA. A second
subtraction was performed with the same material as tester cDNA but 6 hr in vitro matured
oocytes as driver cDNA. The subtracted material was then ligated into the pGEM-T and
pGEM-T easy vector System Kit (Promega, Madison, WI, USA) and transformed into
DH5a-Tl max efficiency E. coli cells (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). White
colonies were isolated and grown individually in LB/ampicillin médium at 37°C for 6 hr
with agitation. Each clone was PCR amplified using 1 jxl of bacteria growth, nested PCR
primer 1 (5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3') and 2R (5'-
AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3') (Clontech), and 1 U of HotMaster™ Taq DNA
polymerase (Eppendorf, Westbury, NY, USA). Amplified products were visualized on a
2% agarose gel (fig 3.1. step 1).
3.7.4 Microarray préparation
PCR products originating from the SSH2 were purified using the Unifilter® 384-
well purification plates (Whatman, Clifton, NJ), speedvac evaporated (SPD SpeedVac
ThermoS avant), and resuspended in 5 (il of 3X standard saline citrate
(SSCydimethylsulfoxide (DMSO; 1:1). Two replicates of each PCR product were spotted
on GAPS II glass slides (Corning, Acton, MA, USA) using a VersArray ChipWriter Pro
(BioRad, Mississauga, ON, Canada). Various controls were printed on the slide in two
replicates: three cDNA products of the SpotReport Alien cDNA Array Validation System
(Stratagen) were used as négative controls, a fragment of the Green Fluorescent Protein
(GFP) as an exogenous positive control, and various housekeeping gènes (actin, tubulin,
H2A, and GAPDH) as internai positive controls. Slides were cross-linked with ultraviolet
53
(UV) rays according to the manufacturers instructions and quality of each printing pool was
controlled with Terminal Transferase dye (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada).
3.7.5 Microarray probes and hybridization
First set of probes: SSH1 versus SSH2 products
Subtracted PCR products were used as probes to hybridize the glass slide in order to
sélect the positive clones for sequencing. Probes were labeled with Alexa Fluor® 555 and
647 reactive dye (Molecular Probes, Burlington, ON, Canada) using Amino Allyle dUTP
(Ambion) according to the manufacturers instructions. Two dye swap hybridizations were
performed with two différent protocols. The first protocol is already described in détail
(Sirard et al. 2005) and the second using the SohdHyb™ Array Kit (Viridis Biotech, QC,
Canada) follows the manufacturers instructions. Loess normalization transformations and
background were calculated as described in the microarray analysis section below. The
clones hybridized with the SSH2 PCR products (positive clones) présent in both
hybridization experiments were selected for sequencing. DNA sequencing and clone
identification were performed as described previously (Sirard et al. 2005).
Second set of probes: 6 hr IVM ± FSH
Groups of 6 hr in vitro matured oocytes were produced: one exactly as for SSH2
and the other one adding 0.1 ug/ml r-hFSH (Gonal-F, Serono, Mississauga, ON, Canada) in
the maturation médium. Total RNA of each pool was reverse transcribed and amplified
using the BD Atlas™ SMART™ Fluorescent Probe Amplification Kit (Clontech)
according to manufacturers instructions but by labeling the amine-modified PCR products
indirectly with Alexa Fluor® 555 or 647 reactive dyes (Molecular Probes). Labeled cDNA
was resuspended in 4 ui of 10 mM EDTA. Glass slides were hybridized using the SlideHyb
Buffer # 1 (Ambion) and the labeled DNA. Hybridization was performed at 55°C for 18 hr
in the ArrayBooster™ using the Advardcard AC3C (The Gel Co., San Francisco, CA,
54
USA). Slides were washed twice with 2X SSC-0.5% SDS for 15 min at 55°C and twice
with 0.5X SSC-0.5% SDS for 15 min at 55°C. Slides were air dried by centrifugation for 5
min at room température at 1200 g (fig 3.1. step 2).
Third set of probes: 2-cell versus J-cell at 36 hpi
Embryos were produced the same way than for SSH2 but cultured in maturation
médium for 24 hr with 0.1 u.g/ml r-hFSH, fertilized and cultured for development as
described by Ali and Sirard (2005). Pools of 1-cell and 2-cell embryos were collected after
36 hr of in vitro development, washed in PBS and frozen at -80°C until RNA extraction.
Total RNA of each pool was prepared for hybridization exactly as described for the second
set of probes (fig 3.1. step 2).
Microarray analysis
Slides were scanned using the VersArray ChipReader System (Bio-Rad) and
analyzed using the ArrayPro Analyser software (Media Cybernetics, San Diego, CA, USA).
After a Loess normalization transformation, the ratios of data from hybridizations with
second and third set of probes were calculated. Uninformative data were eliminated
according to a calculated threshold that détermines the background (t = m + 2 x s.d., where
t is the calculated threshold, m is the mean of the négative controls raw data and s.d. is the
standard déviation of those same négative control raw data). Only the spots with the highest
ratio were considered as true positives and among those, eleven were selected for testing
with real-time PCR (fig 3.1. step 3).
3.7.6 Real-time Polymerase Chain Reaction
Materials
55
Three set of oocyte pools were used. The first set was a sélection of oocytes from
spécifie follicle sizes. Oocytes were collected from spécifie follicle sizes where Germinal
Vesicle (GV) stage oocytes were pooled from follicles of < 3mm, 3-5 mm, 5-8 mm, and >
8mm in diameter. The COCs from follicles < 3 mm were obtained after dissection at room
température, measured under a stereomicroscope. Oocytes were denuded mechanically by
vortexing, washed three times in PBS buffer, frozen in three pools of 17-20 oocytes for
each follicle size, and stored at -80°C until RNA extraction (fig 3.1. step 4).
The second set was three pools of 17-20 oocytes at 6 hr of IVM ± FSH produced
exactly as second set of microarray probes.
The third set was three pools of 17-20 embryos for each of the two cleavage stages
2-cells and 1-cell at 36 hpi produced exactly as third set of microarray probes.
Reverse Transcription and primer s design
RNAs used to perform real-time PCR were reverse transcribed with the Sensiscript®
Reverse Transcription Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) following manufactured
instructions. Primers for each selected candidates were designed using Primer3 web
interface (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi) from bovine
séquences or consensus séquences derived from human séquences from positive sequenced
clones. Table 1 shows the séquences from the différent primers ordered from IDT (Toronto,
ON, Canada). The amplified fragments were electrophoresed on a standard 1.2% agarose
gel, purified with the Qlaquick PCR Purification Kit (Qiagen), quantified with a
spectrophotometer, and sequenced to confirm the specificity of the primers. PCR products
were then diluted from 0.1 pg to 0.1 fg and used to create the standard cure in the real-time
PCR experiment.
Real-time Polymerase Chain Reaction
56
Real-time PCR was performed on a Light Cycler® 1.5 Instrument (Roche) using the
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche). Reactions were performed
with the quantity of cDNA corresponding to half an oocyte or embryo. Each candidate was
amplified from three différent biological replicates. To minimize variations, samples and
standard curves were amplified during the same run with the same PCR master mix. The
PCR amplification program for ail the candidates was: dissociating cycle of 10 min at 95°C,
50 PCR cycles (dissociation for 5 sec at 95°C, annealing for 5 sec at température showed in
table 1, and elongation for 20 sec at 72°C), one melting cycle consisting of 5 sec at 95°C,
30 sec at 72°C, and a step cycle up to 97°C (0.2°C/sec transition rate), and finally a cooling
down cycle at 40°C. PCR product was analyzed on a 1.2% agarose gel with ethidium
bromide to confirm amplification. The Lightcycler Software Version 3.5 (Roche) was used
to quantify cDNA by comparison with the standard curve and the product specificity is
assessed using the melting curve. Product sizes, annealing and fluorescence acquisition
températures for each gène are presented in table 1.
3.7.7 Statistical analysis
Quantitative results of each gène in each pool of amplified cDNA were normalized
using the quantity of the GAPDH gène. The pool showing the highest amount of GAPDH
was designated as the référence value, and ail other GAPDH values were expressed as a
ratio of the référence value, thus creating a correction factor for each pool. The values
obtained for each candidate gène in each pool were then corrected by the correction factor
of the corresponding pool. Différences in the mRNA level between oocytes from différent
follicle sizes for each gène were calculated by ANOVA and Tukey's multiple comparison
tests. The t-test was used to compare the différences in mRNA levels between
oocytes/embryos from différent maturation conditions or time of first cleavage. Différences
were considered statistically significant at the 95% confidence level (P < 0.05). Data are
presented as mean ± SEM.
57
3.8 RESULTS
Suppressive Subtractive Hybridization and custom-made slide design
SSH was performed using mRNA that was extracted and reverse transcribed from
58 oocytes at équivalent nuclear maturation states: 6 hr post-LH surge and after 6 hr of in
vitro maturation without r-hFSH. The ubiquitin and GAPDH housekeeping gènes were used
as controls to assess the efficiency of the subtraction and as expected, their amounts were
dramatically reduced after subtraction. After cloning and transformation, the library
contained 1075 clones, from which 803 were positive for single insert-containing clones.
The insert size range was between 250 and 800 bp. Custom-made slides were constructed
with two replicates from the 1075 SSH library clones and in addition, two replicates of 62
négative and positive controls randomly distributed on the slide. Thèse controls were also
used as références for data normalization.
Microarray hybridization
Three hybridization experiments were performed. The first hybridization was
performed with the subtracted libraries themselves (auto-hybridization). The two probes
were composed of differentially expressed 6 hr post-LH surge oocyte transcripts: the first
probe was made after subtraction with transcripts from 6 hr in vitro matured oocytes
médium without r-hFSH and the second probe was made after subtraction of 2 hr pre-LH
surge oocyte transcripts. This hybridization highlighted spécifie mRNAs présent at
increased levels around the time of the LH surge in oocytes matured in vivo. A dye swap
experiment was also performed. Détermination of the background hybridization signal
threshold was performed by considering ail of the GFP négative controls and SpotReport
Alien cDNA. Ail of the misshapen spots were also eliminated from the analysis.
Fluorescence signal was calculated using each replicate for each clone. If one of the
replicates was lower than the corrected background, then the corresponding clone was
completely eliminated from the analysis. Calculation of the mean for each candidate
including the dye swap experiments and the positive clones in both protocols for the results
of the first hybridization, the microarray analysis resulted in a total of 395 positive clones
that were sequenced and analyzed. Thèse clones constituted the library from which the
candidates were chosen for the real-time PCR experiments.
The second hybridization experiment was performed with amplified material from 6
hr in vitro r-hFSH matured oocytes compared to oocytes matured in the absence of r-hFSH
and the third hybridization was performed with amplified material from embryos that were
at the 2-cell stage versus the one-cell stage at 36 hr postfertilization in vitro. The number of
positive clones showing a signal above the background threshold and the calculated
hydridization ratio for the three hybridiations are presented in table 2. The second
hybridization with a probe enriched in transcripts from oocytes matured in the présence of
r-hFSH revealed one new positive clone and the third hybridization with a probe with
transcripts enriched in early-cleaving embryos revealed four new positive clones that were
not identified by the first hybridization. Those five clones were sequenced and analyzed
leading to a library of 400 clones.
Library sequencing results
The sequenced clones were analysed using the nucleotide-nucleotide BLAST
(blastn) program on the NCBI database. The best hits were retained for each submitted
clone according to the score, e-value, % homology, number of fit nucleotides, and the
species. The unigen number and intrablast program were used to regroup same gènes or
redundant séquences. Table 3 présents the distribution of the clones according to species,
level of characterisation, redundancy, and frequency of the séquences.
Real-time PCR candidate sélection
Candidates for real-time PCR vérification were selected from the 400 library clones
identified through microarray hybridization. Différent parameters were used to sélect the
59
potential candidates. First, each candidate had to be positive for the second and/or the third
hybridization identifying it as a factor potentially associated with developmental
compétence. Also, of those séquences, bovine or homolog human séquences were
preferred. The frequency as well as expression rate for each hybridization were important
criteria as a high level of hybridization is more related to high SSH clone frequency then to
a higher differential expression between the subtracted conditions, but expression rate for
the candidate is directly related to differential expression. Function of the 200 first selected
candidates was searched in the literature and evaluated. Gènes with a known link with the
oocyte (folliculogenesis, oogenesis, maturation, development, and antioxidant protection),
enzymatic cascades, cell cycle régulation and other potentially important proprieties were
selected. Candidates and their sélection parameters are presented in table 4. In addition to
the eleven candidates chosen in the library, three more gènes were added to evaluate their
expression in the transcriptomes of compétent oocytes and embryos. The housekeeping
gène GAPDH was used as a standard and two other candidates, GDF9 and H2A, were
chosen because of their link to the oocyte. GDF9 has a function in folliculogenesis and
H2A is a housekeeping gène involved in chromatin support and often measured as a control
(Robert et al. 2002b).
Real-îime PCR
Real-time PCR was performed for the selected candidates on oocytes from four
différent follicular sizes (<3 mm, 3-5 mm, 5-8 mm and greater than 8 mm), oocytes
matured with or without r-hFSH, and 2-celled and one-celled embryos at 36 hr
postfertilization. Thèse are ail factors that are associated with differential developmental
compétence. The GAPDH amount did not significantly change between any of the oocytes
or embryos tested and therefore was chosen for data normalization (P < 0.05) (data not
shown). Real-time PCR experiments revealed the présence of ail the gènes tested. Nine
candidates showed differential mRNA levels according to follicle size, two candidates in
early dividing cells and none according to the influence of r-hFSH in the culture média.
Figure 3.2 présents the quantification of mRNA levels in GV oocytes extracted from
différent sizes of follicles (< 3 mm, 3- 5 mm, 5-8 mm, and > 8 mm). A first group of four
60
candidates (fig 3.2.A): GDF9, CCNB1, STK6, and BMP15 did not show any différences in
mRNA level according to différent follicle sizes. A second group of five candidates (fig
3.2.B): PSMB2, SKIIP, CDC5L, RGS16, and PRDX1 ail showed a higher mRNA level for
the > 8 mm follicle size compared to the other sizes. A last group of four candidates (fig
3.2.C) showed différent RNA levels at nearly every follicle size: the amount of CKS1 and
CCNB2 rosé sharply to the 5-8 mm and > 8mm follicle sizes, whereas H2A and PTTG1
rosé gradually from the 5 mm follicle size and substantially increased for the > 8 mm
follicle size.
Figure 3.3 présents the quantification of mRNA levels in 6 hr in vitro matured
oocytes in the présence or absence of r-hFSH. None of the candidates showed differential
mRNA levels between oocytes cultured in those two conditions. Figure 3.4 présents the
quantification of mRNA levels in 36 hr in vitro developed embryos at 1-cell or 2-cell stage.
Two candidates showed a differential mRNA level according to the time of cleavage:
PTTG1 and CCNB2. Their transcript levels are higher when first cleavage occurs before 36
hr following IVF. The other eleven candidates did not show any significant différences
related to time of first cleavage.
3.9 DISCUSSION
Quantitative PCR allowed the vérification of thirteen candidate gènes, selected
through high throughput techniques, in conditions associated with varying developmental
potential. Among the potential candidates, nine gènes showed differential mRNA levels
according to follicle size, two gènes were elevated in early-cleaving embryos and there
were no différences amongst any of the thirteen gènes in oocytes cultured with or without r-
hFSH.
SSH analysis is now widely used to distinguish expression différences in two
tissues. Robert and coUaborators (2000) were the first users of this technique with bovine
oocytes, and it has been used since in the oocyte and embryo to study developmental
61
potential (Donnison and Pfeffer 2004). This technique allows the use of sparse materials,
but the amplification process and the use of similar tissue inevitably lead to numerous false
positives that hâve to be identified. Subséquent microarray hybridization analyses do reveal
the false positives and can restrict the sélection to fewer but more appropriate candidates.
Our hypothesis was that only slight différences in transcript abundance would exist
between oocytes of high compared to low developmental compétence, but that thèse very
slight différences would be of great conséquence on developmental potential. One of the
important challenges of this study was to use materials for the SSH technique that were
similar enough to identify only those transcripts in oocytes that were related to
developmental compétence. It was essential that the oocytes were compared at the same
stage of development to prevent time-related changes in transcript levels, thus the observed
différences in transcript levels would not be involved in gênerai function, but instead
related to the subtle différences associated with superior developmental potential.
The SSH analysis was used to enrich for the transcripts more abundant between
oocytes collected by ovariectomy at 6 hr post-LH surge and oocytes from slaughterhouse
collected after 6 hr of maturation, as it is well known that in vivo derived oocytes hâve a
higher developmental potential than in vitro matured oocytes and that those first hours of
the maturation period are décisive for full compétence, as showed in ovine (Moor and
Warnes 1978). This is an idéal period to compare différences in transcript abundance
because oocytes from both treatments are presumed to be in the condensing configuration
(GV - GV breakdown) where transcription has ceased (Hyttel 1997). GV breakdown
(GVBD) is the first event characterizing meiosis resumption and it is not dépendent on the
attainment of developmental compétence as oocytes lower than 100 um are able to reach
GVBD (Fair et al. 1995). Tomek and collaborators (2002) showed that mRNA
polyadenylation and translation increase at the GVBD stage whereas transcription déclines
before GVBD up to Metaphase II (Mil) stage, therefore this is the period at which the
maximum amount of mRNA is stockpiled in the oocyte and when new transcription ceases.
Moreover, a 10 % increase in blastocyst formation is obtained with oocytes collected after
an hCG injection given 6 hr prior to recovery compared to no hCG, suggesting that the 6 hr
62
maturation period in vivo is enough to create différences in developmental potential
between thèse two groups of oocytes (Blondin et al. 2002).
Further microarray hybridizations and/or PCR vérification were used to examine,
sélect and validate the gène candidates under various conditions where différences in
developmental compétence are observed; in vitro maturation of oocytes in the présence of
r-hFSH (Ali and Sirard 2005), early-cleaving embryos at 36 hr postfertilization (Lonergan
et al. 1999), and oocytes obtained from différent follicle sizes (Fair et al. 1995). However,
SSH and microarray technologies as we used them are essentially qualitative techniques, as
they reveal the highest différences between two tested tissues. SSH and microarray analysis
led to a group of potential markers of developmental compétence. As primers used for PCR
vérification of each gène candidate were chosen within the séquence of the microarray
hybridized clone, and as qRT-PCR products presented an own band in electrophoresis gel
and an own product, we supposed that only one isoform of each gène candidate is
measured. The thirteen selected candidates can be presented as members of six functional
gène catégories: cell cycle (PTTG1, CDC5L, STK6, CKS1B, CCNB2, CCNB1), cell
metabolism (PSMB2, PRDX1), cell signalling (RGS16), gène expression (SKIIP), follicle-
oocyte interaction (BMP15, GDF9), and chromatin support (H2A). It's not surprising that
cell cycle regulator gènes category is the largest group selected. The embryo has to divide 3
times to reach MZT in conditions of very low transcription (Barnes and First 1991).
Therefore the compétent oocyte must store enough mRNA coding for cell cycle proteins
like CCNB1 (Tremblay et al. 2005) to ensure that thèse proteins will no be limiting the
embryo progression. A quantitative and précise technique as real-time PCR is essential to
validate the truly differential mRNA levels (Sirard et al. 2005; Vigneault et al. 2004). It is
not surprising that not ail candidates were confirmed by quantitative PCR in this study. In a
similar project, Knijn and collaborators (2002) confirmed less differential expression than
expected and concluded that neither maturation (in vivo or in vitro) nor oocyte status (from
< 2 to 6 mm follicle size or just before LH surge) was the major cause of differential
expression in in vitro produced blastocysts compared to in vivo developed blastocysts from
superovulated cows.
63
The four gènes GDF9, BMP 15, CCNB1, and STK6 did not show differential
expression according to follicle sizes, time of first cleavage nor in vitro maturation
conditions. GDF9 and BMP 15 are two members of the TGFp superfamily of growth factors
involved in folliculogenesis. They are essential for the initiation of follicle growth (Braw-
Tal 2002) and in the régulation of ovulation rate (McNatty et al. 2004). Therefore, although
they are important oocyte gènes, they do not appear to be mediators of developmental
potential in the conditions tested.
The CCNB1 protein is part of the Maturation-Promoting Factor (MPF) complex. Its
association with the cyclin dépendent kinase (CDKl) protein is necessary to activate the
MPF and promote meiotic resumption (Levesque and Sirard 1996). The CCNB1 protein
was not detected in GV stage bovine oocytes, whereas transcripts are abundant (Robert et
al. 2002a), suggesting that MPF activity and transcript abundance are not necessarily
related. Absence of significant différences in CCNB1 transcript levels in ail conditions
tested suggests that the transcript abundance does not play a rôle in developmental potential
of oocytes and early embryos.
STK6, also known as aurora-A, is involved in centrosome séparation and spindle
assembly during somatic cell mitosis. During Xenopus oocyte meiosis this small
serine/threonine kinase is involved in a cascade of phosphorylation triggered by
progestérone and leading finally to MPF activation (Maton et al. 2003). Vigneron and
collaborators (2004) proposed an involvement of STK6 in the régulation of bovine oocyte
maturation independently to the MPF activity. A potential rôle of STK6 has been observed
in cell cycle régulation and microtubule organization during mouse oocyte meiotic
maturation, fertilization, and early embryo cleavage (Yao et al. 2004). There were no
observed différences in STK6 transcript levels related to différences in developmental
potential in this study.
The majority of observed différences in the candidate gènes were related to
follicular size. It is well recognized that oocytes from larger follicles hâve a greater
64
fertilization rate (Pavlok et al. 1992) and a greater developmental compétence to the
blastocyst stage in vitro (Blondin and Sirard 1995; Lequarre et al. 2005; Lonergan et al.
1994). Five gènes, PSMB2, SKIIP, CDC5L, RGS16, and PRDX1 showed a higher mRNA
level for the >8 mm follicles, which contain oocytes that hâve already begun prematuration
(Dieleman et al. 2002). PSMB2 is one of the fourteen 20S proteasome subunits contributing
to the cytosolic and nuclear peptide cleavage. Studies in the pig showed that proteasome
inhibitors blocked the exit of maturing pig oocytes from the MI stage (Chmelikova et al.
2004). We can postulate a positive effect of PSMB2 transcripts on the correct setup of
bovine oocyte meiosis.
SKIIP is a nuclear hormone receptor coactivator involved in the TGF-P signaling
pathway. SKIIP would affect gène expression by both transcriptional activation and
régulation of pre-mRNA splicing (Nagai et al. 2004), therefore modulation of SKIIP
mRNA levels according to maturation stage could control transcription according to cell
needs.
CDC5L is a nuclear protein highly conserved across species and it is involved in
pre-mRNA splicing (Ajuh and Lamond 2003). It also has a rôle in regulating G2
progression and mitotic entry and in gène transcription régulation (Lei et al. 2000). Higher
CDC5L levels may help to ensure a correct cell division cycle by checking that DNA is
correctly replicated and not damaged (G2/M checkpoint).
The RGS16 protein is a négative regulator of G-protein signalling that médiates
extracellular signais. This family of proteins controls diverse processes such as cell growth
and hormone sécrétion. RGS16 hâve been found to link spinophilin (Wang et al. 2005) and
Ca2+/calmodulin (Abramow-Newerly et al. 2006). An influence on Ca2+ signalling by
RGS16 would be of importance for oocyte and embryo development.
PRDX1 belongs to a six-member family of peroxidases involved in antioxidant
défenses and intracellular signalling. AU are présent in the bovine oocyte and embryo, and
65
expression of transcripts coding for PRDX6 is upregulated following oocyte maturation
(Leyens et al. 2004). Antioxidant défenses are essential during oocyte maturation and
embryo development and especially during fertilization because sperm decondensation
requires protamine réduction by gluthatione.
Four gènes showed a graduai increasing mRNA level according to follicle size
among which H2A contributes to the chromatin support in the early embryo while CKS1B,
PTTG1, and CCNB2 participate in cell cycle régulation.
H2A is one of the four histones constituting the nucleosomes around which
eukaryotic cell DNA is wrapped. Previous study showed that mRNA H2A level is stable
during the embryo preimplantation period when a mixed population of oocytes is studied
(Robert et al. 2002b). However the présent study showed an increase in H2A transcript
level according to follicle size. Meiosis and each subséquent cellular division needs H2A to
assemble DNA into chromatin. From the beginning of maturation until MZT, two meiosis
divisions and 3-4 DNA replications occur without any new H2A transcription (Marzluff and
Duronio 2002), therefore large quantities of maternai mRNAs and proteins hâve to be
stored. A higher level of H2A mRNA can therefore be an advantage and contribute to a
higher developmental potential. The discrepancy with Robert et al. results (2002b) can be
explained by the fact that only follicle 3-5mm were used in their study.
The CKS1B protein is a component of the CDC28-cyclin complex. In yeast, Cdc28
kinase is the central coordinator of the major events of cell division cycle promoting the
transition of cells from Gl to S phase, progression through S phase, and entry into mitosis.
CKS1 function is controversial but it may play an important rôle at the G2/M checkpoint
(Mendenhall and Hodge 1998). Other rôles for the CKS1/CDC28 complex may be to
enhance RNA polymerase elongation (Yu et al. 2005). The graduai accumulation of CKS1B
mRNA according to follicle size may facilitate transcription or ensure a correct G2/M
checkpoint similar to CDC5L function.
66
PTTG1 protein, also named securin, is a multifunctional protein. At the metaphase-
to-anaphase transition, séparation of sister chromatids is triggered by proteolytic cleavage
of a cohesin subunit by a conserved cysteine protease called separase. Such cleavage allows
sister chromatids move toward opposite pôles of the cell via spindle microtubules. For most
of the cell cycle, PTTG1 binds separase and acts as an inhibitor of chromatid séparation.
PTTG1 is therefore required for efficient chromosome ségrégation. In Saccharomyces
cerevisiae, securin (named Pdsl) is also required to delay anaphase in response to spindle
and DNA damage (Wang et al. 2001) and similarly, in mammals, downregulation of
PTTG1 triggers increased DNA damage and malignant tumor development (Romero et al.
2004), implying that PTTG1 also plays a rôle in régulation of DNA repair régulation. In the
mouse, PTTG1 is overexpressed in zygotes compared to oocytes, which supports a rôle for
this protein in zygotic gène activation (ZGA) and in protein synthesis via its interaction
with DNA J protein, a member of heat shock protein family (Yao et al. 2003). In bovine
GV oocytes, an increase in mRNA accumulation as the follicle grows may permit more
efficient cell cycle régulation and increased developmental potential.
The function of CCNB2 in the oocyte is not clear. Both CCNB1 and CCNB2 are
part of cyclin B family and participate in MPF (Wu et al. 1997). Contrary to CCNB1,
CCNB2 is not an essential gène in mice (Brandeis et al. 1998). The hypothesis is that both
cyclins B share the same function but CCNB2 may be accessory and sustains CCNB1
(Paradis et al. 2005). However, others imply that the two cyclins hâve différent functions
because CCNB2 does not share high homology with CCNB1 (Brandeis et al. 1998; Robert
et al. 2002a). The observed increase in oocyte mRNA levels in larger follicles may allow
for a greater stock of CCNB2 until the MZT, as MPF is cyclic throughout oocyte
maturation and early development. High amounts of maternai cyclin B mRNA hâve to be
stored since the protein is degraded at every cell cycle. A surplus of CCNB2 may
complément and replace CCNB1 when necessary in the formation of MPF.
Interestingly, no differential expression was observed between the GVBD oocytes
matured with or without r-hFSH even if the microarray hybridization step displayed
variation in mRNA levels. False positives are more likely to occur between two very
67
similar tissues or treatments, as in this study. Moreover, probes were constructed with a
wide range of oocytes from classes 1 to 3 (Blondin et al. 2002) that were obtained from 2 to
6 mm follicles, and according to our results, some gène candidates demonstrated a
differential expression according to follicular size. The différences in gène expression
resulting from the heterogeneous population of oocytes used for in vitro culture with r-
hFSH may hâve masked any of the différences that the culture conditions would hâve
created.
There were two gènes, PTTG1 and CCNB2, which had higher transcript levels in
early-cleaved embryos compared to late-cleaving embryos. It's probable that some 1-cell
embryos were in fact not fertilized oocytes. Thèse oocytes might hâve retained more
mRNA since fertilization is known to induce mRNA dégradation (Schultz 1993). In that
case they serve as better control conditions since the contrast with early cleaving two cells
is potentially masked. Both PTTG1 and CCNB2 gènes are involved with cell cycle
régulation and are factors preventing sister chromatid séparation at metaphase-to-anaphase
transition: active MPF characterized by présence of CCNB1 and CCNB2, and présence of
PTTG1. Also, both of thèse gènes showed increased expression in large follicle sizes. The
présence of active MPF and absence of PTTG1 is not sufficient to prevent the sister
chromatid séparation, showing that MPF and PTTG1 may be complementary (Madgwick et
al. 2004). It would be interesting to examine a potential link between CCNB2 and PTTG1,
as important factors for cellular divisions either at the G2/M checkpoints or for G2/M
transition or a link with the Cytoplasmic Stabilizating Factor (CSF) that maintains activity
of MPF. Perfect coordination between those two factors is primordial for the oocyte or
embryo to complète the cell cycle.
Potential factors of developmental compétence in the oocyte and early embryo were
identified in this study. A séries of high throughput experiments involving SSH and
microarrays allowed the sélection of potential candidates, and real-time PCR verified the
présence of thèse candidates of oocytes and embryos with varying developmental
compétence. PTTG1 and CCNB2 transcripts were differentially expressed according to
follicle size and time of first cleavage and their rôle in cell cycle régulation could be an
68
important factor for developmental potential. More gènes were differentially expressed
according to différent follicular sizes, suggesting that there are critical implications on
developmental compétence associated with the origin and maturational state of the oocyte.
Further investigation into the function of thèse gènes will establish rôles for thèse factors in
oocyte maturation and embryo development.
3.10 ACKNOWLEDGEMENTS
We thank François Paradis for the CCNB1 and CCNB2 primers, Maud Vallée for
the PTTG1 primers, Margot Dode for the STK6 primers, and Maxime Sasseville for the
GDF9 primers. The authors thank Suzan Novak for reviewing the manuscript. We thank
Isabelle Laflamme for her help in collecting > 8 mm follicle size GV oocytes and Isabelle
Dufort for her judicious help at the molecular laboratory and her help in dissecting < 3 mm
follicles.
Marina Mourot is supported by Natural Sciences and Engineering Research Council
of Canada (NSERC). The authors thank NSERC for funding this project.
3.11 TABLES AND FIGURES
Table 3.1 : Information on primers used for real-time PCR experiments.
69
Gènes GeneBankaccessionnumber
Oligos séquences Product Annealing Fluorescencesize température acquisition(bp) (°C) température
CDC5L NM 001253
CKS1B BT007196
STK6
SKIIP
PSMB2
PRDX1
GDF9
CCNB1
H2A
GAPDH
BC027464
XM_612217
RGS16 NM_174450
PTTG1 XM_584768
BT020920
AF305561
NM 174681
BMP15 AY304484
L26548
CCNB2 AF080219
Up 5'-gaatggcagactacagtgat-3'Low 5'-tcatttcctttacacgctctg-3'
Up 5'-agctggtccctaaaactcatt-3'Low 5'-aagatgtgaggttctggttca-3'
Up 5'-ctctgagtccatcttccatgag-3'Low 5'-ggtgctttgctatgagttcctc-3'
Up 5'-gctggatacctcggttattag -3'Low 5'-ctttgaaggtctgggtcatc -3'
Up 5'-tcagaactgggctctgatacc -3'Low 5'-ggagcttcttgaactcctcac-3'
Up 5'-aactgcaagaaaggctttgg-3'Low 5'-caaacaggtggcaattcaac-3'
Up 5'-ccgaaacctggctgactatc-3'Low 5'-ttggcagattcaggatgaag-3'
Up 5'-atgccagatggtcagttcaag-3'Low 5'-ccttgtttcttgggtgtgttg-3'
Up 5'-tggtccttgctgaagcatctaga-3'Low 5 ' -acagtgttgtagaggtggcttct-3 '
Up 5'-gtcagcagccaagaggtagtg-3'Low 5'-cccgaggacatactcccttac-3'
Up 5'-tgactgacaacacctacaccaag-3'Low 5 ' -ctgtgctagagtgctgatcttag-3 '
Up 5'-agcttcaggctgttggcattac-3'Low 5'-gcactatcacccttccaaggtg-3'
NM_013549 Up 5 ' -gtcgtggcaagcaaggag-3 'Low 5'-gatctcggccgttaggtactc-3'
U85042 Up 5'-ccaacgtgtctgttgtggatctga-3'Low 5 ' -gagcttgacaaagtggtcgttgag-3 '
241
112
212
256
226
417
275
224
202
360
436
305
181
237
53
53
55
52
58
54
56
54
57
60
57
58
57
60
80
78
89
80
87
80
81
84
CDC5L, Homo sapiens Cdc5 cell division cycle 5-like (S. pombe); CKS1B, Homo sapiens CDC28 proteinkinase regulatory subunit 1B; STK6, Homo sapiens serine/threonine kinase 6; SKIIP, Homo sapiens SKI
70
interacting protein; RGS16, Homo sapiens regulator of G-protein signalling 16; PTTG1, Homo sapienspituitary tumor-transforming 1; PSMB2, Homo sapiens proteasome subunit, beta type, 2; PRDX1, Bos taurusperoxiredoxin 1 ; GDF9, Bos taurus growth differentiation factor 9; BMP]5, Bos taurus bone morphogeneticprotein 15; CCNB1, Bos taurus cyclin B l ; CCNB2, Bos taurus cyclin B2; H2A, Bos taurus histone 2A;GAPDH, Bos taurus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
71
Table 3.2 : Microarray hybridization experiments.
Microarray hybridization experiment Number of Dye Hybridization ratiopositive clones swap c/d, and e/f
a) 6 hr post-LH - 6 hr in vitro maturation 395 Yes n.a.b) 6 hr post-LH - 2 hr pre-LH
c) 6 hr in vitro maturation (r-hFSH) 72 No >1 to 2.02d) 6 hr in vitro maturation (no r-hFSH)
e) 2-cell 36 hr development embryo 102 No >1 to 1.80f) 1-cell 36 hr development embryo
A total of 803 clones from the SSH library were spotted on the slide. Three hybridizations
were performed: a) vs b), c) vs d), and e) vs f); n.a., not applicable; Lower hybridization
limit allowed: background + 2 s.d.
Table 3.3 : Composition of library clones.
Homolog human séquencesBovine séquencesOthers organisms séquences
Known séquencesUncharacterised séquencesUnknown séquencesUnreadable séquences
% clones611410
6718123
% redundancy1441
1544
n.a.
frequency1 to6x1 toôx1 to2x
1 toôx1 to4x1 to4x
n.a.
% were calculated on the total number of the clones sequenced: 400. Known séquences,
match with a séquence already characterised; Uncharacterised séquences, match with a
clone, BAC, RIKEN, or hypothetical protein; Unknown séquences, no match in the NCBI
database; Unreadable séquences, too high background to be correctly sequenced; n.a., not
applicable.
72
Table 3.4 : Selected candidates from SSH library and microarray hybridization
experiments.
Potentialcandidate
PTTG1
CDC5L
STK6
CKS1B
CCNB2
CCNB1
PSMB2
PRDX1
RGS16
SKIIP
BMP15
Hybridization resuitlst hyb 2nd hyb
### *
** *
* *
* *
*
* *
*
*
*
*
and frequency3rd hyb
**
***
**
-*
-
-
*
*
*
-
Function
Cell cycle
Cell metabolism
Cell signalization
Gène expression
Folliculogenesis
Hyb, hybridization. lst hyb, auto-hybridization; 2n hyb, 6 hr in vitro maturation with vs
without r-hFSH; 3rd hyb, 36 hr in vitro development 2-cell vs 1-cell embryos; - , not
positive hybridization; number of * corresponds to frequency of the clone.
73
-a
a,tu4 *
2 h pre-LH
n = 30 oocytes
6 h post-LH
n = 30 oocytes
6hIVM
n = 56 oocytes
SSH 1
6 h post-LH gènes enriched
SSH 2
6 h post-LH gènes enriched
c3 c3H T3
S *
IfProbes (two dyes)for cDNA array
hybridization
Spotting cDNA array
6 h IVM ± FSH
n = 58 oocytes foreach treatment
tu
(U
Literature Microarray hybridization results
Candidates sélection
PiU
ïiqRT-PCR
Materialused to lperform |
qRT-PCRj
Follicle size : < 3, 3-5,5-8, > 8 mm in diameter
n = 3 x 17-20 oocytes foreach treatment j
6 h IVM ± FSH
n = 3 x 17-20 oocytesfor each treatment
1-cell vs 2-cellsat 36 hpi
n = 3 x 17-20 oocytesy for each treatment y
Figure 3.1 : Protocol diagram.
10000-1
74
o) 1000-
o
<CE 100-
IL • —Ii!
• M B
I Is11
13-5CZ3 5-8CZZ1>8
GDF9 CCNB1 STK6 BMP15
100-1
ce
(B)0.1-1
<33-55-8>8
PSMB2 SKIIP CDC5L RGS16 PRDX1
75
1000-
100-
O)
o
<oc
<3
3-5
5-8
>8
(C) H2A CKS1 PTTG1 CCNB2
Figure 3.2 : Quantification of mRNA level by real-time PCR in bovine GV oocytes
extracted from différent sizes of follicles: < 3 mm, 3-5 mm, 5-8 mm, and > 8 mm of
diameter. Each reaction was performed with cDNA équivalent to 1/2 oocyte. Each follicle
size was tested with three différent biological replicates except for 3-5 mm follicles with
two replicates. RNA level refers to quantity of transcripts corrected with GAPDH
measurement in the corresponding sample. A same pool of cDNA was used for the
quantification of ail gènes. Gènes showed either no différences in mRNA level in différent
follicular sizes (A), a sharp increase at the >8 mm follicles (B) or a graduai increase as
follicular size increased (C).
*indicates a significant différence within gène (P<0.05)a"c différent letters within gène indicate a significant différence (P < 0.05).
> • -
o'55
10000i
1000-
100-
10-
0.1
oIF
PSMB2 H2A SKIIP CDC5L GDF9 CKS1B RGS16 CCNB2 PRDX1 PTTG1 CCNB1 STK6 BMP15
Figure 3.3 : Quantification of mRNA level in 6 hr in vitro matured bovine oocytes in présence or absence of r-hFSH: O, r-hFSH free; F,
0. lug/ml r-hFSH. Each reaction was performed with cDNA équivalent to 1/2 oocyte. Each maturation condition was tested with three différent
biological replicates. RNA level refers to quantity of transcripts corrected with GAPDH in the corresponding sample. A same pool of cDNA was
used for the quantification of ail gènes. There were no significant différences between the treatments. *indicates a significant différence within
gène (P<0.05).
77
ëo
'entnaiS.xo
10000-1
1000-
100-
10-
0.1
1C
I2C
PSMB2 H2A SKIIP CDCSL GDF9 CKS1B RGS16 CCNB2 PRDX1 PTTG1 CCNB1 STK6 BMP15
Figure 3.4 : Quantification of mRNA levels of thirteen candidate gènes in 36 hr in vitro developed bovine embryos at two development states:
1C, l-cell embryo; 2C, 2-cell embryo. Each reaction was performed with cDNA équivalent to 1/2 embryo. Each development state was tested
with three différent biological replicates. RNA level refers to quantity of transcripts corrected with GAPDH in the corresponding sample. The
same pool of cDNA was used for the quantification of ail gènes.
*indicates a significant différence within gène (P<0.05).
CHAPITRE 4
CONCLUSION GENERALE
L'ovocyte a la particularité d'être la cellule la plus volumineuse de l'organisme
chez les mammifères et revêt par ailleurs une importance cruciale dans l'assurance de la
survie de l'espèce. Le succès du développement de l'embryon dépend en grande partie
de l'intégrité et de la qualité du transcriptome apporté par l'ovocyte. Connaître les
détails d'exploitation du transcriptome ovocytaire est une fenêtre ouverte sur les besoins
de l'embryon en devenir. Dans cette étude, nous avons voulu identifier des marqueurs
dont la présence ou la surabondance est associée à une compétence au développement
embryonnaire élevée. La connaissance de tels marqueurs de compétence pourrait
permettre de mieux comprendre les besoins de l'embryon en devenir afin d'optimiser
les protocoles de la production d'embryons in vitro (PIV).
La présente étude a permis de clarifier et d'extraire les marqueurs associés à la
compétence au développement embryonnaire en isolant neuf candidats à partir de plus
d'un millier de candidats. Sans l'utilisation de techniques d'analyse à haut rendement à
la pointe de la haute technologie, telle l'hybridation suppressive soustractive (SSH) et
l'hybridation de biopuces, il aurait été impossible de tester individuellement tous les
éléments du transcriptome ovocytaire.
Notre laboratoire s'intéresse aux transcrits spécifiques à l'ovule et à l'embryon
respectivement aux stades de développement préovulatoire et pré-MZT. Plus
précisément, notre intérêt porte sur la période du stade de la vésicule germinale (GV) de
l'ovocyte immature jusqu'au stade blastocyste de l'embryon et leurs intermédiaires.
Dans cet optique, notre laboratoire utilise des nouvelles technologies qui offrent
sensibilité, précision et haut rendement.
Ainsi la technique SSH utilisée dans ce projet permet de confronter deux tissus
pour en isoler les caractéristiques propres à chacun. Etant donnée la sensibilité de cette
technique, elle est de premier choix pour l'étude de l'ovocyte et du jeune embryon
79
puisqu'elle permet d'une part de débuter avec une infime quantité de matériel et d'autre
part de comparer deux tissus similaires ou ayant subi deux traitements similaires.
Coupler le SSH à l'hybridation de biopuces augmente largement la pertinence des
résultats. En effet une même biopuce présentant les produits du SSH peut être hybridée
par plusieurs paires de sondes pour ne retenir que les résultats communs à toutes les
hybridations effectuées. C'est cette technique, dite analyse «intra-biopuce» qui a été
utilisée dans notre étude. Comme toutes les techniques d'analyse à haut rendement,
l'hybridation de biopuces présente des limites (Sirard et al. 2005) qu'il s'agit
d'identifier et de corriger, telle la génération de faux positifs.
Outre l'analyse «intra-biopuce», une analyse «inter-biopuces» serait également
très informative. Le terme «inter-biopuces» désigne la mise en commun d'informations
dérivant de l'hybridation de différentes biopuces. En accord avec ce point de vue, notre
laboratoire a entamé un vaste projet de répertoire de marqueurs associés à différents
stades ou traitements. Déjà, une biopuce nommée «blue chip» regroupe les «Expressed
Séquence Tags» (ESTs) correspondant à la partie du transcriptome spécifique à
l'ovocyte et aux stades de développement GV (ovocyte immature) et blastocyste. Une
deuxième biopuce réunit les ESTs des transcrits propres aux embryons dont le premier
clivage est précoce, alors qu'une troisième biopuce rassemble les ESTs des transcrits
spécifiques aux ovocytes bovins récoltés 6 h après le pic de LH comparativement à ceux
récoltés 2 h avant le pic de LH. Grâce au projet présenté dans ce mémoire, la
construction d'une quatrième biopuce présentant les ESTs correspondant au
transcriptome spécifique aux ovocytes bovins récoltés 6 h après le pic de LH
comparativement à ceux ayant subi 6 h de maturation in vitro, pose une pièce
supplémentaire dans l'identification des acteurs impliqués dans la qualité ovocytaire.
Notre engouement ne s'arrête pas ici et l'élaboration de nouvelles biopuces est à l'étude.
Les renseignements tirés de la combinaison de ces précieuses mines d'informations,
associés à l'analyse de biopuces dérivant des cellules de la granulosa et du cumulus,
promettent de grands progrès dans la compréhension des besoins moléculaires de
l'ovocyte et de l'embryon.
Dans le présent projet, les situations de compétence élevée choisies pour identifier
et valider les marqueurs de compétence ne sont pas exhaustives et il serait intéressant de
80
poursuivre l'étude avec de nouvelles situations. Par exemple, des informations
pourraient dériver de la confrontation de transcriptomes entre ovocytes provenant de
follicules dominants, de follicules subordonnés en croissance ou en début d'atrésie. Il
est néanmoins intéressant de noter que les situations testées dans la présente étude
englobent les étapes de développement de l'ovocyte encore immature jusqu'au jeune
embryon. Les marqueurs finalement sélectionnés sont donc particulièrement importants
tout au long du développement ou en tous cas pour atteindre la MZT.
Penchons nous sur le cas de la cycline B2. En assumant que son rôle fonctionnel
est équivalent à celui de la cycline Bl, soit de permettre l'activation du pré-MPF, une
réserve importante de transcrits de la cycline B2 offre un accès facilité à une traduction
en protéines permettant la progression à travers les étapes du cycle cellulaire. Avant
d'atteindre la MZT, la cellule subit deux divisons méiotiques et 3-4 divisions
mitotiques. Chacune de ces divisions requiert un MPF actif, donc la présence de
cyclines Bl ou B2. Etant donné que le MPF est dégradé après chaque cycle cellulaire et
que la transcription est quasiment absente, la réserve de transcrits doit être traduite de
façon discontinue à chaque cycle cellulaire. Il est alors pertinent de se demander
comment la cellule régule le processus de la traduction. Une hypothèse intéressante
pourrait être l'existence de signaux informant la cellule sur les transcrits à traduire en
accord avec l'avancée dans les étapes du développement. Ainsi, les différences entre les
séquences nucléiques 3'UTR (extrémité non traduite en 3') des transcrits de la cycline
Bl et ceux de la cycline B2 pourraient être un premier signal régulateur privilégiant la
traduction de l'une ou l'autre cycline. Un second signal pourrait être celui déjà observé
chez la cycline Bl et qui n'a pas encore été étudié chez la cycline B2. Il s'agit de
l'existence de deux isoformes présentant chacun un patron de polyadénylation différent,
leur offrant une cinétique de traduction particulière (Tremblay et al. 2005). Finalement,
la combinaison de ces deux signaux pourrait permettre à la cellule de gérer la réserve de
transcrits des cyclines Bl et B2 afin de permettre les divisions cellulaires même à un
stade avancé du développement et jusqu'à l'atteinte de la MZT. L'idée d'assurer des
divisions cellulaires de qualité rejoint la constatation d'un rôle prépondérant des
régulateurs du cycle cellulaire parmi les candidats finalement sélectionnés puisque ces
facteurs sont nécessaires à la complétion de chaque cycle cellulaire du stade de
l'ovocyte immature jusqu'au stade du jeune embryon. Il serait alors intéressant d'étudier
l'effet direct de la protéine cycline B2 sur la cellule, par exemple en utilisant la
technique d'interférence par l'ARN (RNAi). Cette dernière permet de rendre l'ARNm
ciblé impropre à la traduction, privant ainsi la cellule de la protéine associée. Si les
conséquences résultantes au niveau physiologique modifient le développement
cellulaire menant à une diminution du taux de blastocystes, ce pourrait être une preuve
de l'importance du rôle de la cycline B2 dans le développement cellulaire.
En fait, pour tous les candidats, il serait intéressant d'étendre l'étude au niveau
physiologique, plus précisément au niveau protéique. En effet, ce sont les protéines qui
participent directement au fonctionnement des cellules alors que l'ARNm constitue un
stade intermédiaire servant à la mise en réserve du matériel et permettant une rapide
traduction en protéines en accord avec les besoins de la cellule. Une analyse protéique,
telles que la localisation, le niveau d'expression ou les conséquences d'inhibition d'une
protéine candidate, pourrait nous informer sur son rôle réel entre ovocytes ou embryons
de niveaux de compétence divergents. Si l'analyse protéique confirme la surexpression
des candidats identifiés, alors la compréhension du mécanisme impliqué pourrait
permettre l'exploitation de nouveaux acquis pour optimiser la PIV. Par contre, si la
surexpression n'est pas confirmée par l'analyse protéique, alors il pourrait être
intéressant d'étudier le mode de mise en réserve des ARNm sélectionnés et le but de
cette mise en réserve délibérée.
La présente étude est donc un point d'impulsion vers une analyse ciblée et
approfondie des mécanismes impliqués dans l'acquisition de la compétence au
développement embryonnaire.
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