Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes

myeloprolifératifs

F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.

Syndromes myeloprolifératifs• Similitudes cliniques et biologiques

Origine commune: CSH hyperplasie myéloïde globale hypersensibilité voire indépendance des progéniteurs

hématopoeitiques aux facteurs de croissance.

• Classification OMS: semi moléculaire

SMP classiques:

•SMP BCR-ABL+: LMC

• SMP BCR-ABL neg: P.V, TE, MFP

SMP atypiques • leucémie neutrophile chroniq • mastocytose systémique• leucémie éosinophile chroniq•SHE

Jak2 V617F

Mutation Jak2V617F…?

• Jak2: famille Janus kinases

(Jak1,Jak2,jak3,Tyk2)• TK associée R-EPO, MPL, R-G-CSF• Fonction: régulation de l`expression des

gènes en réponse aux cytokines.

migration vers le noyau

CASCADE DE SIGNAUX DE PROLIFERATION:

Jak-STAT

Mutation Jak2V617F

• Gène cloné 1989: 9p24

• Mutation JH2• Substitution G……T nt 1849• Changement Val…..Phe au codon 617 Jak2 V617F • Mutation acquise, unique,clonale CSH: cellules myéloïdes (PN,

EB, pqt) Absente des Ly T

Jak2 muté: pas d`inhibition par le domaine JH2 activité kinase constitutivement active, indépendante de la

fixation du ligand sur son récepteur….activation signaux en aval.

JH1JH2FERM SH2

domaine pseudo Kinase

Src homology 2 domaine Kinase YY

R-EPO interacting domain

Jak2 et oncogenèse

• Protéines de fusion:SMP atypiques : t(8;9)(p21;p24) PCM1-JAK2 t(9;12)(p24;p13) JAK2-ETV6 t(9;22)(p24;q11.2) JAK2-BCR

• Perte du domaine de fixation aux récepteurs de cytokines (FERM)

• pas de gain de fonction !!!

Fréquence de la mutation JAK2

Auteur PV TE MF

Kralovics65%(27%)

n=12823%(3%)

n=9357%(22%)

n=23

James 89%(30%)

n=4543%n=21

43%n=7

Levine74% (25%)

n=16432% (3%)

n=11535%(9%)

n=46

Baxter97%(26%)

n=7357%(0%)

n=5150%(19%)

n=16

Différences de fréquences: Stringence des critères de diagnostic de PV,La sensibilité des méthodes de détection de la mutation,La source de l`ADN (PN..!!!)

Méthodes de détection

Auteur Référence Méthode Cellules

Kralovics NEJM Séquencage PN

James Nature Séquencage PN

Levine cancer cell Séquencage PN

Baxter Lancet AS-PCR PN

Jones Blood AS-PCR Sang total

Mc Clure LeukemiaAS-PCR

Melting curve assayPN

Passamonti Blood Real time AS-PCR PN

LevineBlood mai

2006Q-PCR PN

Patients (n=59)

SMP Ph- (n=45)

SMP? (n=14)

Total (n=59)

PV 16 (35.5%) - 16 (27%)

TE 23 (51%) - 23 (39%)

MFP 6 (13%) - 6 (10%)

Budd-Chiari - 8 (57.14) 8 (13.5%)

Suivi médian(an)

3 [1 - 9] - 3 [1 – 9]

Age (médiane) 48 [24 – 75] 33 [30 – 60] 48 [24 - 75]

Sexe ratio (h/f) 18/27 (0.66) 5/8 (0.62) 23/34 (0.7)

Fev 2010 – mars 2011. 22 (37%) Patients traités HU; …….. BCR-ABL neg.

Échantillons biologiques• Sang total: EDTA 0.34M• PN+++: Ficoll+lyse totale GR• 3 étapes:

Extraction d`ADN (QiagenTM)…..10ng/ulAmplification: PCR: Seeplex Jak2 genotyping Kit.

« primers DPO » - Gène sauvage (WT)

- Gène muté 35 cycles

Visualisation des produits de PCR (E-se gel d`agarose à 2% +BET)…..UV

800pb (contrôle int)

600pb (non muté)

300pb (muté)

Résultats:

SMP Ph- (n=45)

SMP? (n=14)

Total (n=59)

PV(n=16)

11 (68.75%)

- 11 (18.6%)

TE(n=23)

3 (13%) - 3 (5%)

MFP(n=6)

1 (16.6%) - 1 (1.7%)

Budd-Chiari(n=8)

- 3 (37.5%) 3 (13.5%)

Total 15 (33.3%) 3 (21.4%) 18 (30.5%)

Résultats

• Mutations à l`état hétérozygote:• 2 situations:

Allèle muté +allèle WT

PN normaux PN malins

Commentaires3 implications: Affirmer le diagnostic de SMP au même titre que

BCR-ABL, 1er examen à effectuer devant:

• Polyglobulie, .évaluation initiale + EPO sérique. (critère majeur)

• Thrombocytose,• Hyperleucocytose d`étiologie non évidente. • Budd-Chiari (thromboses révélatrices de SMP)

Rapport Jak2V817F/Jak2WT dans les PN: élément pronostique évolution vers myelofibrose TE,PV

Développer thérapeutiques de type ITK: ciblées Jak2 muté.

PCR

• Spécifique, sensible• Reproductible• Multiplex: coamplification des 2 allèles Jak2 (sauvage et

muté) ………… 1 seule étape• Rapide: 1 jour (5 heures).• Contrôle interne d`amplification (intégrité ADN:

reprentativité)• Marqueur de taille intégré.

Mais:• Faux négatifs:• Coexistance de PN issus de CSH non mutée et PN issus

de CSH mutée.• Nature du matériel cellulaire testé (lyse cellulaire)• traitements antérieurs: diminution de la charge de

l`allèle muté.