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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Impact Toxique des Nanoparticules Impact Toxique des Nanoparticules sur une Bactsur une Bactéérie Modrie Modèèlele
ValValéérie Siron & rie Siron & Roselyne FerrariRoselyne Ferrari
10 nm
2 µM
ANR ECCODYN 2006ANR ECCODYN 2006--20082008
Journées Scientifiques de l’Environnement - 5 & 6 Mai 2008
1/19
Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Grand Canyon, Arizona, USA
IndustriellesNaturelles
Rio solimoes
& Rio Negro,Amazonas, Brazil
Anthropogéniques
Soleil couchant à
Ivry, 1873, Guillaumin
1 µm
100 nm
Bactérie Magnétotactique
Fuego
de Antigua, Guatemala
2nm 6nm
Quantum Dots
Oxyde de Silicium
Oxyde de Titane Oxyde de Zinc
1 nm 100 nm1 Å 1 µmNanoparticules :
2/19
Les erreurs du PassLes erreurs du Passéé :
-- Amiante :Amiante : minéral utilisé
dans l’industrie entre 1960 et 19801995 : maladie professionnelle reconnue : l’asbestose
Pourquoi Pourquoi éétudier la toxicittudier la toxicitéé des nanoparticules ?des nanoparticules ?
20082008 : 500 produits sur le marché international contiennent des nanoparticules
Nombre en augmentationNombre en augmentation
-- Pas de lPas de léégislation gislation pour le suivi de l’utilisation de ces particules dont les caractéristiques révolutionnaires sont évidentes-- Trop peu de travauxTrop peu de travaux par des laboratoires indépendants étudient la toxicité
de ces nanoparticules
MAISMAIS
-- DDT : DDT : 1er Insecticide moderne développé
en 1948 1962 : DDT accusé
d’être cancérigène et
d’empêcher la reproductionMais toujours utilisé
dans la lutte contre le paludisme
3/19Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Les acteurs de notre Les acteurs de notre éétude : Les oxydes de Zinc tude : Les oxydes de Zinc -- ZnOZnO
Synthèse des nanoparticules de ZnO – ITODYS – Université Paris-Diderot
Brayner et al., Nano-Letters (2006)
B
A
B
A
B
A
B A BA
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
Zn-AcetateSurfactant : Tri-n-octylphosphine oxide (topo)
PolyVinylpyrrolidone (pvp)Solvant
: Diethylenglycol
Δ180°C
ZnOSurfactantsBA 10 nm
ZnO : Semi conducteur
Crème solaire
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Les acteurs de notre Les acteurs de notre éétude : tude : EscherichiaEscherichia colicoli
2 µM
Escherichia coli
Bioaccumulation????
Shewanella Cyanobactéries
Premier MaillonPremier Maillon
Dernier MaillonDernier Maillon
Organismes environnementaux
BioBio--accumulationaccumulationdes nanoparticulesdes nanoparticules dans la
chaîne alimentaire
??
Étude de l’impact des ZnO sur E. coli
- Bactéries pouvant se retrouver dans l’environnement- Conditions de croissance bien maîtrisées- Génome entièrement séquencé- Banque de «
mutants
»
disponibles
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
ÉÉtude du Comportement des tude du Comportement des nanoparticules de ZnOnanoparticules de ZnO
Part 1Part 1
-
Caractérisation des Nanoparticules dans différents milieux : • Milieu de synthèse• Milieu de culture Luria
bertani
(LB)
• Milieu naturel : Eau de Seine
- Évaluation de la spéciation des nanoparticules dans les milieux testés• Protocole 1 -
Centrifugation
• Protocole 2 -
Ultrafiltration• Résultats d
’une modélisation dans les milieux
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
CaractCaractéérisation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de synthrisation des nanoparticules de ZnO dans le milieu de synthèèsese
• Microscopie Électronique en Transmission (MET)
Réseau cristallin d’une nanoparticule de ZnO de 19 nm
• Diffusion des rayons X à
petit angle (SAXS)
Confirmation de la taille des plus petites particules : 16 +/-
4nmMise en évidence d’agrégats de 150 +/-
20nm dans le DEG
Couche de Surfactant
Variabilité dans la taille des particules utilisées pour l’étude Forme = bâtonnets
Stabilité
des nanoparticules de ZnO ?
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
CaractCaractéérisation des nanoparticules de ZnO dans les milieux testrisation des nanoparticules de ZnO dans les milieux testééss
(c) (d)
(a) (b)
Mili
eu d
e C
ultu
reLu
ria-B
erta
ni(L
B)
Eau
de
Sei
ne
stér
ilisé
es
Images de Microscopie Électronique à
Transmission
Agrégation des nanoparticulesde ZnO dans le
milieu de culture et dans l’eau de Seine
Hypothèse :Dans l’eau de Seine,
association des agrégats des nanoparticules
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Ferrari 5 Mai 2008
Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 1Protocole 1
Protocole
Centrifugation 20 103
G
Quantification du zinc dans le surnageant
Dosage de fraction libre du zinc??Dosage de nanoparticules de ZnO? ou
Dosage d’un mélangeZnO/Zn2+?
Milieu de CultureMilieu de CultureLBLB
Eau de SeineEau de Seine
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Temps (h)
Frac
tion
du z
inc
tota
l dan
s le
sur
nage
ant %
NPsdans le culot
Prélèvement
Interaction NPs/milieu
En LB : solubilisation des NPs
En eau de Seine : agrégation des NPs
Mais Autre Protocole
Protocole de Centrifugation
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
UltraFiltration : -
Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs-
Pas de rétention du zinc ionique, membrane perméable au zinc
L’eau de Seine n’induit pas une solubilisation des nanoparticules
Frac
tion
du z
inc
tota
l inf
érie
ure
à1K
D (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
03h6h
Eau de Seine
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
ZnO
Modélisation : 98 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO
Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 2 Protocole 2 –– Eau de SeineEau de Seine
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Ferrari 5 Mai 2008
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ZnO-topo IV 2,5mM ZnO-pvpII 2,5mM Zn2+ 1,25mM
03h6h
LB
Frac
tion
du z
inc
tota
l inf
érie
ure
à1K
D (%
)Devenir des NPs de ZnO Devenir des NPs de ZnO –– Protocole 2 Protocole 2 –– LBLB
UltraFiltration : -
Seuil de coupure de 1KD Pas de passage des NPs-
Rétention de 50% du zinc ionique par la Matière organique du milieu
LB
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
ZnO
Donc, % de zinc libre est équivalent dans les deux protocoles réalisés
Solubilisation d’une grande majorité
des NPs introduites dans le milieu LB
Modélisation : 60 % du zinc est sous forme de nanoparticules de ZnO
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ÉÉtude de la toxicittude de la toxicitéé des nanoparticules de ZnOdes nanoparticules de ZnO& &
Comparaison avec lComparaison avec l’’ion Znion Zn2+2+
1.
Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la croissance bactérienne
3.
Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactérienne
2.
Effet des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique sur la viabilité
bactérienne
4.
Implication d’un éventuel stress oxydatif
Part 2Part 2
12/19Siron –
Ferrari 5 Mai 2008 Interaction nanoparticules / bactérie modèle
Nom
bre
d’E
. col
i(10
8C
FU/m
L)
Temps (heures)N
ombr
e d’
E. c
oli(
108
CFU
/mL)
Temps (heures)
ZnOZnO ZnZn2+2+
Dans le milieu de culture - LB
croissance inhibée
en fonction1.
du temps d’interaction
2.
de la concentration
Les nanoparticules de ZnO inhibent la croissance bactérienne en LB
Action bactériostatique des nanoparticules
Effet des nanoparticules sur la croissance bactEffet des nanoparticules sur la croissance bactéérienne (1/2)rienne (1/2)
13/19Siron –
Ferrari 5 Mai 2008 Interaction nanoparticules / bactérie modèle
1mM
0.25mM
Ctl
Nom
bre
d’E
. col
i(10
8C
FU/m
L)
Temps (heures)N
ombr
e d’
E. c
oli(
108
CFU
/mL)
Temps (heures)
ZnOZnO ZnZn2+2+
Dans le milieu de culture - LB
Observation de l’effet des ions issus de la solubilisation des NPs
&&
Pas de différences des effets pour ZnO et Zn2+
Ctl
0,25mM
1mM
Ctl
0,25mM
1mM
2,5mM
ZnO-topoZnO-pvp
Effet des nanoparticules sur la croissance bactEffet des nanoparticules sur la croissance bactéérienne (2/2)rienne (2/2)
14/19Siron –
Ferrari 5 Mai 2008 Interaction nanoparticules / bactérie modèle
Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
Effet des nanoparticules sur la viabilitEffet des nanoparticules sur la viabilitéé cellulairecellulaire
Protocole :
LB
Eau deSeine
Pas de différence observée entre ZnO & Zn2+
effet des ZnO solubilisées
1mM : Toxicité
ZnO > Zn2+
+ on la conc en NPs+ les agrégats de ZnO
-
Interaction bactéries / NPs ou Zn2+ à
différentes concentrations-
Prélèvement à
différents temps d’incubation, dilutions et étalement sur boite de Pétri -
Dénombrement des colonies capables de se multiplier après traitement-
Rapport Essai / Contrôle0,25 mM
1 mM2,5 mM
ZnO Zn2+
Agrégats de NPs 2,5 mM : Toxicité
ZnO > Zn2+
Toxicité
agrégats de NPs = toxicité
Zn2+
0,25 mM : Toxicité
ZnO < Zn2+
Agrégats de NPs leuraction
0
20
40
60
80
100
3 6 9 24
0
20
40
60
80
100
ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II) ZnO Zn(II)
Cro
issa
nce
bact
érie
nne
% (e
ssai
/con
trôl
e)
Temps (heures)
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Ferrari 5 Mai 2008
250 nm500nm
Non-traitées Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h)
Apparition d’éléments
intracellulaires contenant du zinc et
du phosphore
Modification de la morphologie
bactérienne et de la taille des bactéries
2 µm
Non-traitées
2 µm
Traitées avec 2.5mM de ZnO (3h)
Impact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactImpact des NPs sur la morphologie et la physiologie bactéériennerienne
• Microscopie Électronique à
Balayage (MEB)
• Microscopie Électronique à
Transmission (MET)
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Ferrari 5 Mai 2008
Comparaison entre une souche sauvage et une souche Sod(délétée des gènes sodA
sodB)
Implication du stress oxydatif dans la toxicitImplication du stress oxydatif dans la toxicitéé des des NPsNPs
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Control
1mM ZnO-TOPOIV
1mM ZnO-PVPII
1mM ZnCl2
Control
1mM ZnO-TOPOIV
1mM ZnO-PVPII
1mM ZnCl2
Sauvage
Mutant SOD
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
PerspectivesPerspectives
•
Nanoparticules agrégées dans le milieu de synthèse mais également dans les
milieux étudiés pour des temps courts d’interaction
• Protocole 1, 2 & modélisation :
- LB : Solubilisation progressive des nanoparticules de ZnO
- Eau de Seine : Agrégation des nanoparticules de ZnO
ÉÉtude du Comportement des nanoparticules de ZnOtude du Comportement des nanoparticules de ZnO
ConclusionConclusion
•
Détermination du devenir des nanoparticules dans différents milieux (Ajout de
Matière organique de diverses origines, polluants, …
)
• Influence des bactéries sur le devenir des nanoparticules
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Interaction nanoparticules / bactérie modèleSiron –
Ferrari 5 Mai 2008
PerspectivesPerspectives
ConclusionConclusion
•
Effet bactériostatique & bactéricide des nanoparticules de ZnO et du zinc ionique en LB
• Effet bactéricide des nanoparticules de ZnO même agrégées en eau de Seine• MEB : Modification de la morphologie bactérienne•
MET : Apparition de particules intracellulaires contenant du zinc et
du
phosphore après traitement au ZnO
ÉÉtude de la toxicittude de la toxicitéé des nanoparticules de ZnOdes nanoparticules de ZnOComparaison ZnO / ZnComparaison ZnO / Zn2+2+
• MEB : Y a-t-il une modification de la morphologie bactérienne en présence de Zn2+ ?
• MET : Présence des particules intracellulaires avec Zn2+
?
•
En eau de Seine, recherche de sites d’action des NPs «
agrégées
»
et poursuite de
l’étude d’un stress oxydatif éventuel
Effet similaire dû
à
une solubilisation des NPs de ZnO
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