UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE VEGETALE

INFLUENCE DACACIA SENEGAL (L.) Willd SUR LES PROPRIETES PHYSIQUES, CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES

DES SOLS

Mmoire prsent et soutenu publiquement le 10 juillet 2010

au Dpartement de Biologie vgtale pour lobtention du

DIPLOME DETUDES APPROFONDIES (D.E.A)

DE BIOLOGIE VEGETALE

Option : cologie

par

Ndiaga SAMB Matre s sciences

Prsident : M. Aliou GUISSE Matre de confrences UCAD Membres : M. Lonard Elie AKPO Professeur UCAD Komi ASSIGBETSE Ingnieur de Recherches IRD Dominique MASSE Ingnieur de Recherches IRD Fary DIOME Matre Assistant IST/UCAD

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DEDICACES

Je ddie ce travail :

A feu mon pre, ma chre mre (que la terre lui soit lgre),

A mes parents pour leur investissement dans mon ducation,

Leurs conseils et soutiens inlassables. Chers

Parents Merci encore une fois.

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REMERCIEMENTS Ce travail de recherche a t ralis au laboratoire d'Ecologie Microbienne des Sols et Agrosystmes Tropicaux (LEMSAT) de l'Institut de Recherche pour le Dveloppement (IRD) de Dakar. Au terme de ce travail, je souhaite adresser mes remerciements aux personnes qui ont contribu de prs ou de loin son laboration.

Je tiens tout dabord exprimer ma profonde gratitude M. Komi ASSIGBETSE pour mavoir encadr tout le long de ce travail, guid travers la complexit de la biologie molculaire du sol et surtout pour sa patience. Monsieur Komi ASSIGBETSE, sest beaucoup investi dans le suivi et lvaluation de ce travail depuis sa conception jusqu sa ralisation totale. Vos enseignements, votre comptence, votre rigueur scientifique, et votre disponibilit mont permis de faire mes premiers pas dans le monde de la recherche. Je vous remercie galement pour vos conseils clairs, et de mavoir inculqu lesprit et la rigueur scientifique.

Jadresse mes sincres remerciements :

A M. Lonard Elie AKPO, Professeur au dpartement de Biologie Vgtale. A travers sa personne, je remercie tous les enseignants du dpartement de Biologie Vgtale et de la facult des Sciences et Techniques, pour leur contribution ma formation.

Jexprime ma reconnaissance M. Dominique MASSE (Directeur du LEMSAT), M. Sadou Nourou SALL, Mme Lydie CHAPUIS-LARDY, Mme NDOUR Yacine, M. Djibril DJIGAL, et M. Moussa DIENOR pour les soutiens quils mont apports. Je leur adresse ici mes remerciements chaleureux et ma profonde gratitude.

Je remercie M. Aliou GUISSE, Matre de Confrences lUCAD et M. Fary DIOME, Matre Assistant lIST/UCAD davoir accept de juger ce travail.

Aux camarades du DEA et Master II: Cheikh Moctar SYLLA, Pape Youssoupha GUEYE, Ahmadou GUEYE, Michel Norbert KOR, Sidy DIAKHATE, Isseu CISS, Ndim FALL et aux ains thsards : Ndye Hlne DIALLO, Thernio SOW et Abdoulaye BADIANE, je dis un grand merci pour leur amiti, leur complicit, leur sympathie et leurs conseils prcieux.

Je tiens remercier chaleureusement lensemble du personnel du LEMSAT pour leur prcieuse collaboration et sans qui cette exprience naurait jamais t pareille: Amadou Lamine DIENG, Mariama GUEYE, Amadou DIOP, Lamine SAGNA, Mme Pourmera GASSAMA, Mamouna MBOUP SEYE, Moustapha SANE, Omar BA, Omar FAYE, Mahcor DIOUF, Mme Fatou GUEYE Saliou FAYE. Pour la joie et la bonne humeur permanente qui rgnaient dans lenceinte des locaux du centre IRD de Bel Air, je tiens galement remercier le personnel du LAMA (Laboratoire des Moyens Analytiques).

Enfin, que tous ceux qui ont contribu de prs ou de loin ce travail trouvent ici lexpression de mes remerciements chaleureux.

Ce travail a bnfici de lappui financier et matriel de lUnion Europenne dans le cadre du projet ACACIAGUM 032233.

iii

TABLES DES MATIERES DEDICACES .............................................................................................................................. i REMERCIEMENTS .................................................................................................................. ii LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................. v TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................................ vii Tableaux ................................................................................................................................... viii LISTE DES ANNEXES .......................................................................................................... viii ABSTRACT: ............................................................................................................................. ix INTRODUCTION ............................................................................................................. 1 Chapitre1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................... 3

1.1 LE SOL ............................................................................................................................. 3 1.1.1 La phase solide ............................................................................................................ 3

1.1.1.1 La fraction minrale.............................................................................................. 3 1.1.1.2 La fraction organique ........................................................................................... 3

1.1.1.2.1 La fraction organique inerte ........................................................................... 3 1.1.1.2.2 La fraction organique vivante......................................................................... 4

a. Les microorganismes du sol ................................................................................. 4 - Les bactries ................................................................................................... 4 - Les champignons ........................................................................................... 5

b. La faune du sol .................................................................................................... 5 1.1.2 La phase liquide .......................................................................................................... 5 1.1.3 La phase gazeuse ......................................................................................................... 6 1.1.4 Lorganisation du sol ................................................................................................... 6

1.1.4.1. La texture ............................................................................................................ 6 1.1.4.2 structure ............................................................................................................... 7 1.1.4.3 La porosit ........................................................................................................... 8

1.1.5 Le fonctionnement du sol ........................................................................................... 8 1.1.5.1 Le cycle de lazote ................................................................................................. 9

1.1.5.1.1 Fixation non symbiotique de l'azote molculaire ............................................ 9 1.1.5.1.2 Lammonification .......................................................................................... 9 1.1.5.1.3 La nitrification ............................................................................................. 10 1.1.5.1.4 La dnitrification ......................................................................................... 10

1.1.6 Activits biologiques du sol ....................................................................................... 11 1.1.7 Structure gntique des communauts microbiennes ................................................. 12

1.2 ACACIA SENEGAL ...................................................................................................... 12 1.2.1. Introduction ............................................................................................................. 12 1.2.2. Description botanique .............................................................................................. 13 1.2.3. Rpartition et Habitat ............................................................................................... 14 1.2.4. Utilisations ............................................................................................................... 14

Chapitre 2 : MATERIEL ET METHODES .............................................................. 15 2.1 MATERIEL .................................................................................................................... 15

2.1.1 Prsentation du site d'tude ....................................................................................... 15 2.1.2 Dispositif exprimental et chantillonnage ................................................................ 16

2.2 METHODES .................................................................................................................. 16 2.2.1 Proprits physiques du sol : La granulomtrie .......................................................... 16 2.2.2 Proprits chimiques du sol ....................................................................................... 17

2.2.2.1 pH du sol ........................................................................................................... 17

iv

2.2.2.2 Dosage du phosphore total ................................................................................. 17 2.2.2.3 Dosage du carbone total et de l'azote total .......................................................... 17 2.2.2.4 Extraction des cations changeables ................................................................... 17

2.2.3 Densit et activit microbiologique ........................................................................... 18 2.2.3.1 Biomasse microbienne ........................................................................................ 18 2.2.3.2 Minralisation du carbone .................................................................................. 18

2.2.4 Structure gntique des communauts bactriennes totales et spcifiques .................. 18 2.2.4.1 Extraction de lADN du sol ................................................................................ 19 2.2.4.2 Etude de la structure des communauts bactrienne totale et fonctionnelles ...... 19

2.2.4.2.1 La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................... 19 a. Structure de la communaut bactrienne totale .................................................. 21 b. Structure de la communaut bactrienne dnitrifiante ........................................ 22 c. Structure de la communaut bactrienne nitrifiante ............................................ 23 d. Structure des communauts diazotrophes .......................................................... 24

2.2.4.2.2. La DGGE (Gel Electrophorse en Gradient de Dnaturation) ................... 26 2.2.5 Analyses statistiques .................................................................................................. 27

Chapitre 3 RESULTATS...28 3.1 PROPRIETE PHYSIQUE : la granulomtrie .................................................................. 28 3.2 IMPACT DA. SENEGAL SUR LES PROPRIETES CHIMIQUES DU SOL ............. 28

3.2.1 pH du sol .................................................................................................................. 29 3.2.2 Taux de carbone total et azote total ........................................................................... 29 3.2.3 Taux de phosphore total (Pt) ..................................................................................... 30 3.2.4 Capacit dchanges cationiques (CEC) ..................................................................... 31

3.3 DENSITE ET ACTIVITE MICROBIOLOGIQUE ..................................................... 32 3.3.1 Densit microbienne ................................................................................................. 32 3.3.2. Minralisation du carbone ........................................................................................ 33

3.4 STRUCTURE DES COMMUNAUTES BACTERIENNE SOUS LES PROVENANCES DA. SENEGAL .................................................................................................................. 34

3.4.1 Structure des communauts bactriennes totales ....................................................... 34 3.4.2 Etude de la structure des communauts bactriennes fonctionnelles ......................... 35

3.4.2.1 Structure des communauts bactriennes dnitrifiantes ...................................... 35 3.4.2.2 Structure des communauts nitrifiantes .............................................................. 37 3.4.2.3 Structure des communauts bactriennes diazotrophes ...................................... 38

Chapitre 4 DISCUSSION .................................................................................................. 40 4.1 EFFET DES PROVENANCES DA. SENEGAL SUR LES CARACTERISTIQUES PHYSICO-CHIMIQUES DU SOL ...................................................................................... 40 4.2 EFFET DES PROVENANCES DA. SENEGAL SUR LES PROPRIETES MICROBIOLOGIQUES DU SOL ...................................................................................... 41 4.3 EFFET DES PROVENANCES DA. SENEGAL SUR LA STRUCTURE GENETIQUES DES COMMUNAUTES BACTERIENNES ............................................. 42

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 45 BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 46 ANNEXES ................................................................................................................................. x

v

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : Acide Dsoxyribonuclique

ADNr: Acide Dsoxyribonuclique ribosomique

BET: Bromure dthidium

BSA: Bovine Serum Albumin

cm : centimtre

C: Carbone

CO2: dioxyde de Carbone

CEC: Capacit dEchange Cationique

CNRF : Centre National de Recherches Forestires

CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide

DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

dNTP: dsoxynucloside triphosphate

EDTA : Ethylne Diamine-Tetra acetic Acid

g : gramme

h : heure

HC : Hors-couvert

ISRA : Institut Sngalaise de Recherches Agricoles

J : jour

KAc : Actate de potassium

mg : milligramme

mM : millimolaire

min : minute

ml : millilitre

mm : millimtre

N : azote

ng : nanogramme

NH4Ac : Actate d'ammonium

nm : nanomtre

pb: paires de bases

PCR: Polymerase Chain Reaction

PEG: PolyEthylene Glycol

Pt : phosphore total

vi

qsp: quantit suffisante pour

rpm : rotations par minute

sec : seconde

TAE : Tris Actate EDTA

TBE : Tris Borate EDTA

U : Unit enzymatique

UV : ultra-violet

V : Volt

10 X : concentr 10 fois

m : micromtre

l : microlitre

g : microgramme

% : pourcentage

C : degr Celcius

& : et

vii

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figures

Figure 1 : Cycle de lazote dans le sol.. 9

Figure 2 : Diffrentes tapes de la nitrification...10

Figure 3 : Diffrentes tapes de la dnitrification....11

Figure 4 : Photo dA. senegal...13

Figure 5 : Situation gographique du site de lexprimentation...15

Figure 6 : Schma de la raction en chane par polymrisation (PCR)21

Figure 7 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne ADNr16S...22

Figure 8 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne nirk (nitrite rductase)23

Figure 9 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne amoA.24

Figure 10 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne nifH..25

Figure 11 : Description schmatique de llectrophorse en gradient de gel de dnaturation

(DGGE)..27

Figure 12 : pH du sol sous A. senegal de diffrentes provenances..29

Figure 13 : Teneur en carbone total des sols sous A. senegal et hors-couvert dA. senegal....30

Figure 14 : Teneur en azote total des sols sous A. senegal et hors-couvert dA. senegal ...30

Figure 15 : Teneur en phosphore total des sols d'A. senegal et hors-couvert dA. senegal ....31

Figure 16 : Capacit changeables cationiques sous et hors-couvert dA. senegal....31

Figure 17 : Biomasse microbienne totale dans les sols sous et hors-couvert dA. senegal....33

Figure 18 : Quantits de CO2 libr en g C/g sol dans les sols sous et hors-couvert dA.

Senegal...33

Figure 19 : Profil DGGE de lamplifit dune partie du gne 16SrDNA de la communaut

bactrienne totale des sols des provenances dA. senegal .34

Figure 20 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenu partir des profils DGGE-16S

des provenances dA. senegal ..35

Figure 21 : Structure gntique de la communaut bactrienne dnitrifiante des sols des

provenances dA. senegal ....36

Figure 22 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenu partir des profils DGGE-nirk

des provenances dA. senegal ..37

Figure 23 : Structure gntique de la communaut bactrienne ammonifiante des sols des

provenances dA. senegal ....37

Figure 24 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenu partir des profils DGGE-amoA

viii

des provenances dA. senegal ....38

Figure 25 : Structure gntique de la communaut bactrienne diazotrophe des sols des

provenances dA. senegal ......38

Figure 26 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenu partir des profils DGGE-nifH

des provenances dA. senegal .....39

Tableaux

Tableau 1 : Liste des provenances dA. senegal et pays dorigine..16

Tableau 2 : Squence des amorces et des gnes cibles des communauts microbiennes tudies..26

Tableau 3 : Texture des sols sous A. senegal de diffrentes provenances......28

Tableau 4 : Valeur de la concentration de carbone, azote en mg/g sol, de phosphore total en mg/kg sol et pH obtenues sous A. senegal de diffrentes provenances.....28

Tableau 5 : Quantit de CO2-C et biomasse microbienne totale dans les sols sous A. senegal et hors-couvert dA. senegal..32

LISTE DES ANNEXES

ANNEXE 1 : Prparation des solutions d'extraction d'ADN ...................................................... x

ANNEXE 2 : Extraction d'ADN du sol ..................................................................................... xi

ANNEXE 3 : Compositions des autres solutions utilises ......................................................... xii

ANNEXE 4: Electrophorse sur gel en gradient de dnaturant (DGGE) ................................ xiii

ix

ABSTRACT: Impact of Acacia senegal (L.) Willd on soil proprieties physical-chemical and biological.

The structure and functional diversity of microbial communities in the soil is tightly related to plant species composition above-ground, thus providing an important link between above and below-ground processes in terrestrial ecosystems.

Some studies have shown that individual plant species can greatly influence the size and activity of the microbial biomass, and that these effects are often closely related to various plant ecophysiological traits. It has also been suggested that exotic plants could interact with soil microbial communities and disrupt mutualistic associations between existing ecological associations within native communities

The objectives of this study were to assess the soil properties and functioning responses to A. senegal trees from different provenances in Senegal.

The experimental design consists of 17 A. senegal from different provenances from 9 countries. Soil chemical properties pH, C, N & P, microbial biomass, C mineralization and genetic structure of total and functional microbial communities by PCR-DGGE were studies.

The results indicated that the soils with provenances Ngane (Senegal) and those from Burkina (Bissiga & Burkina) have displayed the highest C, N and P contents. Soils supporting the Burkina provenances showed also the highest C mineralization rates contrary to Ngane soil. The results showed that A. senegal provenances has modified the total bacterial structure compared to the control soil.

The nifH profiles showed very few similarities among the N2 fixing bacterial communities structure suggesting that the nifH pool is variable in relation to the A. senegal provenances. The genetic structure by nirK profiles suggested that the denitrifiers communities are also too variable in relation to the A. senegal provenances.

We showed that some provenances have positively impacted on soil quality and have selected the functional bacterial community which in term will participated to a specific biogeochemical process in soil leading to soil fertility and yield improvement.

Key words: A. senegal provenances, soil, bacterial communities structure, PCR-DGGE, amoA gene, nirk gene, nifH gene.

1

INTRODUCTION Les pays sahliens sont confronts depuis plusieurs annes la forte variabilit aussi bien

temporelle, spatiale que quantitative des prcipitations. Ce phnomne combin aux facteurs anthropiques, ont srieusement affect les grands quilibres cologiques et entran une dgradation des ressources naturelles, des sols et des agro-cosystmes.

Cette situation a rendu les systmes de production agricole vulnrables (baisse de la production agricole) et fortement limit les possibilits dintensification, constituant de ce faite la contrainte majeure latteinte des OMD (Objectifs du Millnaire pour le Dveloppement) que se sont fixs les pays sahliens. La lutte contre la dforestation et la dsertification double de la diversification des cultures ouvrant des perspectives la promotion de nouvelles filires agricoles capables daccrotre les revenus des paysans, ont t toujours considres comme des solutions entre autres privilgier dans ces pays.

Dans ce contexte, certains pays dont le Sngal ont mis en place des programmes de dveloppement bass sur les plantations despces vgtales croissance rapide, usage multiple, parfaitement adaptes au climat aride et surtout qui prsentent divers avantages pour le dveloppement rural (gnration de revenus, contrle de lrosion, rduction de la dforestation par la fourniture de bois dans les zones rurales, promotion de la femme etc.). Cest ainsi que des plantations despces vgtales prsentant une haute valeur ajoute conomiquement et qui sont cologiquement utiles telles Balanites aegyptiaca, Azadirachta indica, Anacardium occidental, Ziziphus mauritiana, Acacia senegal, ont t mises en place dans diffrentes localits du Sngal. Parmi ces espces vgtales, A. senegal connat un essor considrable reconnu car au-del des avantages environnementaux des plantations dA. senegal comme, la protection des sols contre lrosion, lamlioration de la fertilit des sols (Dommergues et al., 1994) et la rduction du taux de dforestation, cette plante prsente un intrt conomique certain par sa production de gomme.

En effet, A. senegal est un arbre typique du Sahel caractristique des zones sches situes au sud du Sahara, depuis les ctes mauritaniennes et sngalaises jusquaux ctes de lEthiopie et de la Somalie. En Mauritanie et au Sngal, le bois lourd dA. senegal est prfr en tant que combustible au bois dautres espces ligneuses. Les feuilles et les gousses sont riches en protines digestibles (10-13%) et constituent une source importante de fourrage en saison des pluies et au dbut de la saison sche (Maydell, 1983). A. senegal est surtout utilis pour les projets de revgtalisation et pour la fixation des dunes. Au Soudan, A. senegal est utilis dans des systmes agroforestiers, en combinaison avec des cultures marachres, des plantes fourragres annuelles et des crales comme le mil (Anderson & Sinclair, 1993). Outre ces caractristiques, A. senegal est la principale espce productrice de gomme. Il fournit plus de 90% de la gomme arabique mise sur le march mondial. Cest la seule gomme dacacia alimentaire, car elle ne contient aucun produit toxique (Maydell, 1983).

Les peuplements conomiquement intressants se situent en Mauritanie, au Mali, au Niger au Tchad et au Soudan (Sall, 1997). Au Soudan, A. senegal a toujours contribu de faon significative laugmentation des recettes dexportation du pays.

Afin daugmenter la production de gomme au Sngal, il a t envisag l'introduction et les plantations des A. senegal originaires dautres zones gographiques (Provenances) o la production de gomme arabique est leve.

2

Pour ce faire, des essais dadaptation et de production de gomme des plantes des diffrentes provenances ont t mis en place par le CNRF (Centre National de Recherches Forestires). Cependant, aucune tude scientifique navait jamais t mene pour tudier limpact que pourrait avoir lintroduction et la plantation de ces provenances dA. senegal sur le fonctionnement biologique des sols au Sngal.

De nombreux auteurs ont montr que lintroduction des espces vgtales exotiques dans un autre milieu pouvait entraner des modifications des proprits chimiques des sols et de leur statut microbiologique (Kourtev et al., 2003 ; Kisa et al., 2007). De plus, linfluence des plantes sur les processus biologiques se manifeste travers les effets sur les microorganismes du sol dont les variations constituent par consquent de bons indicateurs de leffet des plantes (Turner et al., 1993; Bauhus et al., 1998; Priha et al., 2001). Les plantes, par la quantit et la qualit des ressources organiques quelles produisent au sol, influencent lactivit, la structure et la diversit de la biomasse microbienne du sol (Wardle and Nicholson, 1996; Bardgett and Shine, 1999 ; Wardle et al., 1999 ; Wardle, 2002). Par consquent, selon Wardle et al., (1998), ces effets sur les proprits biologiques et microbiologiques des sols sont troitement lis aux caractres cophysiologiques des plantes.

Lobjectif de notre travail est donc dvaluer limpact dA. senegal de diffrentes provenances sur les proprits chimiques, biologiques et microbiologiques des sols au Sngal.

Les plantations de diffrentes provenances dA. senegal mises en place Bambey nous permettront de tester les hypothses suivantes :

- lintroduction au Sngal des provenances dA. senegal modifie les proprits chimiques et lactivit biologique des sols par rapport hors-couvert dA. senegal.

- la structure des communauts bactriennes totales du sol et celle des communauts lies au cycle de l'azote sont modifies par les A. senegal de diffrentes provenances.

Ce mmoire sarticule autour de 4 chapitres. Le premier chapitre est une synthse bibliographique. Dans le deuxime chapitre, nous prsenterons le matriel et les mthodes utiliss. Le troisime chapitre sera consacr aux rsultats obtenus et le dernier chapitre rserv la discussion.

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Chapitre1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 1.1 LE SOL

Le sol est la zone meuble plus ou moins paisse parcourue par les racines des plantes. Il est issu dune transformation de la roche mre sous-jacente. Des processus physiques, chimiques et biologiques dsagrgent et altrent les roches mres dont les minraux sont plus ou moins transforms. Simultanment, les vgtaux et la faune qui se dveloppent sur ces minraux produisent de la matire organique frache (feuilles, fruits, cadavres danimaux et excrments) qui est dcompose par divers bactries et champignons. Au cours de la transformation de la matire organique, des minraux solubles et gazeux sont librs et peuvent ragir avec dautres molcules organiques pour former lhumus, matire organique brune ltat de collodes. Dans le sol, on retrouve une phase solide forme dlments minraux et organiques, une phase liquide forme deau et de substances dissoutes et une phase gazeuse.

1.1.1 La phase solide

La phase solide du sol est constitue de la fraction minrale et de la fraction organique.

1.1.1.1 La fraction minrale

Elle reprsente, en gnral 95 99% de la fraction solide du sol. Sa composition dpend de la nature de la roche mre. Ces lments minraux peuvent avoir diffrentes tailles granulomtriques :

- Sable (50 < < 2000 m)

- Limon (2 < < 50 m)

- Argile ( < 2 m)

Selon les proportions de ces trois fractions granulomtriques, la texture du sol peut tre qualifie de sableuse argileuse. La capacit du sol remplir ses fonctions dpend de la nature de la roche mre et de sa texture.

1.1.1.2 La fraction organique

La fraction organique comprend l'ensemble des substances biologiques d'origine animale et vgtale que l'on retrouve dans le sol. On peut distinguer deux fractions : une fraction organique vivante et une fraction organique inerte (Theng, 1987).

1.1.1.2.1 La fraction organique inerte

La matire organique morte reprsente elle seule 80% de la matire organique (MO) du sol. Ce compartiment est dfini par divers stades de dcomposition de la matire organique. Elle est constitue de tissus vgtaux (feuilles et rameaux morts) et de rsidus dorganismes (excrments, cadavres etc.). Elle subit de nombreuses transformations dans le sol. Ces transformations se font en deux phases : une phase de minralisation et une phase dhumification. Les dbris qui reprsentent une source importante de matire organique sont plus ou moins rapidement dcomposs ds leur retour au sol sous l'influence de l'activit biologique. Parmi ces dbris, la litire constitue une importante masse vgtale qui recouvre le sol minral. Dans les premires tapes de sa dcomposition, la litire donne naissance d'une part, des lments solubles ou gazeux, tels que, CO2, NH3, NO3

-, SO4- etc. (c'est la minralisation).

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D'autre part, cette litire donne des composs amorphes (fraction organo-argileuse) qui peuvent contracter des liaisons avec la fraction minrale chimiquement active du sol (argiles) pour former le complexe argilo-humique. Cette matire organique dont la minralisation est plus lente constitue l'humus. L'humus est relativement plus stable et plus rsistant la biodgradation que la matire organique frache. L'humification dsigne l'ensemble des processus de transformation de la matire organique frache en humus.

1.1.1.2.2 La fraction organique vivante

Le sol hberge une grande diversit de microorganismes (bactries, champignons etc.) et une faune trs varie (nmatodes, protozoaires, vers de terres, termites). Ces organismes jouent un rle important dans le cycle des nutriments, le stockage du carbone et la conservation de la diversit des plantes.

a. Les microorganismes du sol

Les microorganismes du sol sont composs principalement par les bactries et les champignons. Ces microorganismes sont les principaux responsables de la transformation de la MO. Ils participent aussi lhumification notamment par lexcrtion denzymes dans le sol ainsi qu la formation des complexes organo-minraux.

- Les bactries

Ce sont des organismes procaryotes unicellulaires paroi souple et de diverses formes. Lun des aspects cologiques les plus saillants chez les bactries est leur caractre ubiquiste (Horner-Devine et al., 2003). Les bactries sont prsentes dans le sol en proportions variables. Elles apprcient en gnral les milieux pH neutre ou alcalin, riches en azote et une temprature variant entre 20 et 40C (bactries msophiles). Cependant, Thermus aquaticus, une bactrie des eaux thermales reconnue pour sa contribution la Taq polymrase en biologie molculaire, a son optimum de croissance une temprature variant entre 70 et 79C, une gamme de temprature ltale pour les plantes et les animaux (Brock & Freeze, 1969).

Les bactries sont abondantes dans la rhizosphre des gramines et des lgumineuses et possdent une grande diversit spcifique et fonctionnelle. Certaines sont capables dutiliser le carbone sous forme minrale CO2 comme substrat nergtique. Ce sont les bactries autotrophes. Dautres ont besoin dune source de carbone organique pour leur mtabolisme nergtique et leur croissance. Ce sont les bactries htrotrophes. On trouve galement parmi les bactries, des organismes saprophytes qui vivent aux dpens de la ncromasse. Les htrotrophes et les saprophytes sont les plus nombreuses dans le sol.

Certains groupes de bactries du genre Rhizobium sont capables dentrer en symbiose avec les plantes de la superfamille des Lgumineuses pour la fixation biologique de lazote. Cette symbiose est dune importance agronomique considrable car elle permet dapporter aux plantes de la nutrition azote (NO3

-, NH4+).

Dautres groupes bactriens comme les actinomyctes (Eubactries gram +, High G-C) possdent des filaments ramifis et mettent des conidies (Davet, 1996). Ils sont proches de certains champignons avec lesquels ils partagent quelques caractres (filaments et conidies). Cependant leur filament ramifi prsente un diamtre plus petit que celui des champignons (0,5 1 m). Les actinomyctes participent activement lhumification en sattaquant la lignine (compose biochimique rcalcitrant). Mais surtout, ils sont capables de sattaquer aux humus

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pour quils librent la fois lazote quils contiennent, mais aussi les lments changeables quils avaient fortement adsorbs.

Des genres comme Streptomyces et Nocordia sont aussi frquemment rencontrs dans le sol et sont particulirement aptes dcomposer les composs rcalcitrants.

Par ailleurs, les bactries participent la structuration du sol par la scrtion de polysaccharides qui lient les particules minrales et contribuent la stabilit des micro-agrgats.

- Les champignons

Les champignons sont de natures ubiquistes et htrotrophes. Ils constituent environ 85-90% de la biomasse du sol. Les champignons saprophytes sont des dcomposeurs et vivent dans de la matire organique morte. Ils jouent un rle important dans le recyclage des nutriments. Les champignons se distinguent des bactries par leur taille et leur structure qui est de type eucaryote. Les champignons peuvent constituer une association mutualiste avec les algues ou les cyanobactries mais ils peuvent aussi tre bnfiques la croissance des vgtaux en formant des associations symbiotiques avec des racines quon appelle mycorhizes. Il existe de nombreux types dassociations mycorhiziennes. Diffrents types de mycorhizes sont ubiquistes sur la plupart des plantes herbaces et des espces arbores, et ceci, dans une vaste gamme dhabitats, dont les systmes agricoles.

b. La faune du sol

De nombreuses tudes ont montr que la faune du sol participe activement la dcomposition de la matire organique (Agbogba & Roy-Nol, 1982 ; Lavelle et al., 1992). Elle assure une aration du milieu prospect par ses dplacements en crant des microsites nouveaux pour les activits bactriennes et fongiques. Selon leur taille on distingue :

- la microfaune qui est essentiellement reprsente par les arthropodes et les nmatodes. Les arthropodes vivent essentiellement dans la litire dont ils se nourrissent. Ils fractionnent de faon active la matire vgtale, crent des structures o se dveloppe une forte activit microbienne. Les nmatodes sont nombreux dans le sol et dans les litires (500 000 espces ; Hawkswroth, 1991). Ils peuvent tre saprophages, phytophages, bactriophages (Djigal et al., 2003) ou fongivores.

- la macrofaune trs dense et diversifie est domine par les termites, les vers de terre et les fourmis. Ils jouent un rle important dans la transformation et lhumification des dbris vgtaux ainsi que dans la constitution morphologique, physique et chimique des sols (Wood, 1988). Ils interviennent aussi dans la concentration et le stockage des nutriments (azote et phosphore). Les vers de terre influencent la structure et la fertilit du sol travers leurs activits de fouissage et dingestion de matire organique. Les fourmis construisent des nids avec des particules provenant des horizons profonds. Ces nids sont gnralement de grande taille et modifient la texture des sols environnants.

1.1.2 La phase liquide

Leau et les substances dissoutes du sol ont une importance considrable sur la nutrition des plantes. Elles interviennent directement en tant que vhicules des lments nutritifs dissouts. Ce sont les principaux facteurs dans le processus de la pdogense. Les sources principales de leau du sol sont : leau de gravit et leau de rtention.

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- Leau de gravit est reprsente par leau qui circule dans les pores grossiers et moyens (> 10 m). Elle est entrane par la pesanteur, et circule le plus souvent verticalement ou obliquement dans les sols peu permables.

- Leau de rtention est leau retenue par le sol au cours de linfiltration des pluies. Elle occupe les pores fins et trs fins (< 10 m). Leau retenue se subdivise en deux parties :

Leau capillaire dont une partie est retenue sous forme de film assez pais autour des particules de sol ou dans la microporosit. Elle constitue la rserve utile qui est leau facilement disponible pour les plantes et les microorganismes. Les mouvements de leau capillaire se font en direction des zones dvaporation soit par remonte vers la surface (vaporation), soit par les mouvements vers les racines (vaporation-transpiration des plantes).

Leau lie appele aussi eau dabsorption qui forme une fine pellicule la surface des particules du sol (pores trs fins, diamtre < 0,2 m), et qui retenue trs nergiquement, nest pas absorbable par les racines.

Il est important de noter que les argiles sont le principal support de leau dans le sol. Ce sont des phyllo silicates (Si4O10)

4-, cest--dire des minraux base de silice qui, comme les micas, prsentent une structure en feuillets. Cette capacit de fixation des molcules deau est une composante de la capacit dchange cationique (CEC). Cest cette mme proprit qui explique la fixation du calcium sur largile pour crer un pont calcique avec lhumus et former ainsi le complexe argilo-humique.

1.1.3 La phase gazeuse

La phase gazeuse du sol, appele atmosphre du sol, est plus enrichie en CO2 que latmosphre proprement dite et moins riche en O2 (< 21%). Ceci pour deux raisons :

- loxygne est consomm par toute une srie de phnomnes se droulant dans le sol respiration des vgtaux suprieurs, mtabolismes des microorganismes arobies, minralisation de la matire organique

- le renouvellement de loxygne partir de celui de latmosphre est lent, le cheminement suivi par les gaz peut tre tortueux, ralenti, bloqu par le fait que certains pores sont occups par de leau. Les caractristiques de la porosit du sol (son importance et son organisation), en particulier dans ses horizons superficiels, jouent donc un grand rle sur les teneurs en O2 et CO2 de latmosphre du sol.

1.1.4 Lorganisation du sol

Lorganisation des constituants du sol est fonction de la taille des particules minrales et organiques et des contraintes physiques subies par le sol. Trois principaux lments sont habituellement retenus pour dcrire les proprits physiques dun sol. Il sagit de la texture, de la structure et de la porosit.

1.1.4.1. La texture

La texture dun sol ou sa composition granulomtrique est la caractristique qui fait rfrence la taille des lments minraux qui la compose. La texture peut tre dfinie par la proportion de chaque classe de grosseur des particules minrales lmentaires du sol. Les lments constitutifs intervenant dans la dfinition de la texture dun sol sont les sables, les

http://crdp.ac-amiens.fr/edd/sols/sol_maj_detailp2_1.htm##

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limons, et les argiles. La proportion relative de chacun de ces trois lments permet de dfinir la nature du sol.

La texture est dfinie par un nom lorsquun seul des lments est nettement dominant. On parle dans ce cas de texture argileuse, limoneuse, ou sableuse. La texture peut tre dfinie par deux noms quand un lment ne domine pas de faon trs nette; elle est ainsi nomme par les deux lments les plus importants. Dans ce cas, on parle par exemple de texture argilo-limoneux, argilo-sableux, limono-sableux etc. Le premier constituant nomm indique le caractre le plus marqu.

La texture peut avoir une influence importante sur lagrgation du sol. Dans les sols texture sableuse, le contenu en carbone organique du sol influence la structure, puisque le sable nest pas une fraction chimiquement active. Contrairement aux sols sableux, les sols argileux en particulier le type dargile jouent un rle trs important dans la formation des agrgats. Les proprits et la nature des argiles en font un lment important de la structure du sol (Oades, 1993). Les argiles ont une grande proprit lectrostatique et une capacit de se gonfler en prsence deau. Cette plasticit des particules dargiles leur confre une capacit de rtention deau leve. Leur charge ngative leur permet de nouer des liaisons chimiques avec les cations comme les ions magnsium, fer, calcium, etc. Ils peuvent constituer par l une rserve importante en lments minraux en assurant la rgulation et lapprovisionnement de la phase liquide du sol. Une augmentation de la concentration en argile est souvent associe une augmentation de la stabilit du carbone organique du sol.

1.1.4.2 structure

La structure et la porosit, contrairement la texture qui ne se modifie pas facilement, sont des lments dynamiques des proprits physiques dun sol. La structure traduit le mode dassemblage des particules solides (sables et limons) avec les agents liants organiques ou minraux (humus et argiles).

La structure dun sol fait rfrence la taille, la forme et larrangement des particules minrales lmentaires, la continuit des vides ou pores, la capacit retenir et transmettre les substances organiques et inorganiques, et supporter la vigueur et le dveloppement des racines (Lal et al., 1991). Les substances humiques peuvent se lier la fraction minrale du sol pour former des complexes et des agrgats qui caractrisent la structure du sol. Les agrgats constituent les lments structuraux de base du sol. Ils rsultent de lassociation entre les particules de sables et des limons avec les ciments minraux et les liants organiques. Lagrgation des particules du sol ainsi que lincorporation de la matire organique rsultent la fois de phnomnes biotiques et physico-chimiques. Des facteurs biotiques comme les exsudats des racines, laction des vers de terres, ou les hyphes des champignons jouent un rle prpondrant dans la structuration du sol en particulier dans la formation des agrgats. Ainsi la formation de la structure dun sol est due principalement lagrgation des particules par les vers de terres et la cration de pores par les rseaux forms par les racines et les hyphes des champignons. Ces agrgats ont une certaine rsistance physique aux agressions mcaniques naturelles (rosion, gouttes de pluies etc.) ou artificielles (actions anthropiques comme les pratiques agricoles). La capacit dun sol rsister ces agressions constitue la stabilit structurale. Cette stabilit des agrgats est importante sur les processus qui maintiennent une agriculture durable par la formation de rservoirs de nutriments. Une bonne structure dun sol traduit une porosit leve et des agrgats grumeleux, ce qui amliore les rserves en eau, laration et la permabilit,

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lenracinement et la rsistance aux agressions. La structure peut tre un indicateur de ltat de sant dun sol. La dtrioration de la structure est un symptme de dgradation dun sol. La stabilit des agrgats est souvent utilise comme un indicateur de la structure du sol (Six et al., 2000). Les pratiques agricoles inadaptes et la baisse du stock de matire organique suite une minralisation accrue sont lorigine de la dstructuration des sols.

1.1.4.3 La porosit

La porosit est la quantit de vides qui rsulte de lempilement des particules de sol dans les agrgats, et celui des agrgats dans le sol. Cest la fraction du volume de sol qui nest pas occup par la matire solide. Elle dpend du mode darrangement des constituants solides du sol et de leur nature. La porosit est une proprit physique trs importante. Elle contrle la circulation des fluides et des gaz dans le sol et exerce ainsi une influence sur lactivit biologique.

Lorganisation des espaces vides dans le sol dfinit des pores de diamtre diffrent qui peuvent tres rpartis en trois groupes. Les macrospores dont le diamtre est compris entre 200 m et 6 m), les micropores de diamtre compris entre 6 m et 0,2 m, et la porosit matricielle forme de pores trs fins de diamtre infrieur 0,2 m (Callot et al., 1982).

La macroporosit caractrise les pores les plus gros dans lesquels leau circule librement sous leffet de la gravit. Elle rsulte de lactivit biologique et des mouvements internes lis au gonflement et la dessiccation du sol. Elle ne retient pas leau sauf dans le cas des sols hydromorphes et permet les changes gazeux. Contrairement la macroporosit, la microporosit retient lessentiel de la rserve en eau utilisable par les plantes. Ses pores sont accessibles aux bactries et peuvent permettre la pntration des poils absorbants. La phase liquide retenue dans la microporosit contient lessentiel des soluts provenant des phnomnes de dissolution ou dchanges avec les lments de la phase solide environnante. La porosit matricielle est difficilement exploitable par les racines. Dans ce cas, lextraction de leau ne peut se faire que par succions infrieures a -15 bars (Callot et al., 1982).

1.1.5 Le fonctionnement du sol

Le sol est la fois un support physique et un rservoir deau et de nutriments pour les plantes. Lutilisation agricole du sol organise en systmes de culture entrane des modifications de ses proprits physiques et chimiques et influence le dveloppement des organismes prsents dans le sol. Ces derniers (vgtaux, faune et microorganismes) y jouent des rles importants. Les plantes influencent le fonctionnement du sol en synthtisant partir du CO2 atmosphrique et de lnergie solaire lessentiel des substances hydrocarbones (Beare et al., 1995). De plus, elles jouent un rle actif dans les mouvements deau et dlments minraux. A linstar de la faune du sol, les plantes contribuent aussi la structuration du sol. Les lments de cette faune participent la dissmination, au contrle et la redistribution des substrats et des microorganismes.

Les microorganismes jouent un rle dans les processus cologiques de base des cosystmes terrestres (Babich & Stotsky, 1983). Ils transforment la majorit des dchets organiques, contrlent les cycles des bio-lments en particulier ceux du carbone, de lazote, du phosphore, du soufre (Alexander, 1977). Parmi ces microorganismes, les bactries accomplissent un rle important puisque delles dpendent en partie la croissance vgtale et donc la nutrition des animaux. On peut dire que ce sont les bactries qui font fonctionner le sol (Gobat et al., 1998). Elles sont impliques, entre autres, dans des processus biogochimiques (cycle des nutriments Carbone, Azote et Phosphore par exemple) privant ou mettant la disposition des plantes

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certains lments ncessaires leur croissance. Lazote tant parmi ces lments le facteur le plus important pour le dveloppement des plantes.

1.1.5.1 Le cycle de lazote

Le recyclage de lazote prsent dans la matire organique joue un rle essentiel dans la vie sur terre. Une partie de lazote prlev annuellement du sol par les plantes lui est restitu sous forme organique par la litire ou la mort des organismes. Ainsi lazote est transfr dune composante lautre du systme sol-plante. Au cours de ces transferts, lazote subit des modifications, qui constituent le cycle de lazote. Les caractristiques principales de ce cycle sont donc le passage de la phase minrale la phase organique et le transfert biosphre/atmosphre o sinscrivent les processus de nitrification et dnitrification (Figure 1).

1.1.5.1.1 Fixation non symbiotique de l'azote molculaire

Ce phnomne, ralis par des microorganismes spcifiques, consiste en une fixation biochimique de l'azote molculaire sous forme de NH3, lequel se trouve ensuite intgr dans des composs organiques prforms.

Les microorganismes fixateurs d'azote appartiennent deux groupes d'organismes :

- les bactries htrotrophes : arobies ou anarobies

- Les organismes photosynthtiques : bactries photosynthtiques, cyanophyces.

Le mcanisme du processus biochimique de la fixation met en uvre :

- des substances rductrices du mtabolisme cellulaire gnral, et, en particulier,

l'acide pyruvique (CH3-CO-COOH) ;

- des systmes oxydo-rducteurs intermdiaires,

- une source d'nergie reprsente par l'ATP,

- un complexe enzymatique comprenant : un systme donneur d'hydrogne ; une

nitrognase, contenant du molybdne, qui catalyse la rduction N NH3,

- des molcules organiques carbones sur lesquelles se fixe NH3.

Figure 1: Cycle de l'azote dans le sol. D'aprs Recous et al., (1995).

1.1.5.1.2 Lammonification

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Lammonification est le processus de transformation de lazote de la matire organique (protines, sucres amins, bases puriques et pyrimidiques) en azote ammoniacal. Le processus dammonification est dirig essentiellement par des peptidases et des protases (Stevenson, 1986). En fonction du pH du milieu, lammoniaque peut tre ionis (NH4

+) ou non ionis (NH3). Lazote ammoniacal nest quun tat transitoire entre lazote organique et lazote nitrique.

L'organisation ou limmobilisation se produit lorsque les bactries utilisent lazote disponible du sol pour dcomposer du matriel riche en carbone (> 40 C/N). Il est important de noter que limmobilisation sous-entend une multiplication bactrienne et donc, que les conditions doivent tre adquates, notamment quant la temprature et lhumidit du sol.

1.1.5.1.3 La nitrification

La nitrification est un phnomne biologique par lequel la forme ammoniacale de l'azote est transforme en forme nitrique. Phnomne gnral dans tous les sols normalement ars, il est complmentaire des processus de minralisation. La nitrification se droule en deux tapes successives : l'oxydation de l'ammonium (plus prcisment de l'ammoniac) en nitrite et l'oxydation du nitrite selon le schma suivant :

NH4+ AMO NH2OH

HAO NO2- NOR NO3

-

Figure 2: Diffrentes tapes de la nitrification

La premire tape, appele nitritation, est principalement ralise par les bactries du genre Nitrosomas et est catalyse par les enzymes ammoniac-mono-oxygnase (AMO) et hydroxylamine oxydorductase (HAO).

La seconde tape, nomme nitratation, est effectue par les Nitrobacters et est catalyse par l'enzyme nitrite oxydorductase (NOR). Les Nitrosomas et les Nitrobacters sont des organismes autotrophes, arobies, qui utilisent le CO2 comme source de carbone et obtient leur nergie partir de l'oxydation respectivement de l'hydroxylamine (NH2OH) et du nitrite NO2

- (Colliver & Stephenson, 2000). Certains organismes htrotrophes, qui utilisent les composs organiques au lieu du CO2, peuvent aussi participer au processus de nitrification mme s'ils sont considrs comme quantitativement moins importants que les bactries autotrophes (Bremner & Blackmer, 1981).

En conditions sub-optimales d'oxygne, l'oxydation est incomplte et une partie du NH4+

contribue la formation de NO et N2O (Poth & Focht, 1985). Certains rsultats exprimentaux (Bremner & Blackmer, 1981) montrent pourtant, que mme dans des sols sous conditions nitrifiantes (sols bien ars), la production d'une quantit importante de N2O peut avoir lieu, indpendamment de la concentration en nitrate et de faon croissante avec l'augmentation de NH4

+. La nitrification peut donc tre responsable de la production et de la libration dans l'atmosphre de quantits importantes de N2O (Jaffe, 1992).

Les principaux facteurs affectant la nitrification dans le sol sont la population bactrienne nitrifiante, la temprature, l'humidit, le pH et les substrats NH4

+ -N, O2 et CO2 (Montagnini, et al., 1989). Les conditions de nitrification sont optimales des tempratures comprises entre 25 et 35C, pH lgrement acide et en condition d'humidit du sol intermdiaire (Bertsch, 1998).

1.1.5.1.4 La dnitrification

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La nitrification peut tre suivie de la dnitrification qui permettra de boucler le cycle de lazote avec la production dazote molculaire lorsque le milieu devient anoxique. La dnitrification est une rduction anarobie du nitrate en N2O et N2, ralise par l'intermdiaire de bactries anarobies facultatives qui transforment la matire organique, selon les tapes suivantes :

Les trois enzymes impliques dans le processus de dnitrification sont la NO3

- rductase, la NO2-

rductase et la N2O rductase. Les sources d'nergie des dnitrifiants incluent trois classes connues : organique (organotrophes), inorganique (lithotrophes) et limuneuse (phototrophes). Le substrat organique est la source d'nergie la plus commune. Outre les dnitrifiantes, certaines bactries htrotrophes, les NO3

- rducteurs d'aprs Tiedje (1988) sont capables de raliser la premire tape de dnitrification, c'est--dire la rduction de NO3

- en NO2-.

Le taux de dnitrification est dtermin par 5 principaux facteurs :

- la prsence de micro-organismes dnitrifiants,

- le taux d'O2 du sol. Il a d'ailleurs t montr que la dnitrification, longtemps considre

comme exclusivement anarobie, pouvait avoir lieu en condition arobie (Bell et al., 1990).

- la prsence de nitrate comme accepteur d'lectrons mme si certaines bactries

dnitrifiantes ont aussi la capacit d'utiliser NO2- et/ou N2O comme accepteurs d'lectrons

en absence dO2.

- la quantit de carbone assimilable (qui est le donneur d'lectrons).

- le pH qui serait favorable aux activits microbiennes dnitrifiantes une valeur neutre et

pourrait inhiber la N2O rductase pH infrieur 5 (Knowles, 1982).

La quantit de N2O libre par dnitrification dpend non seulement du taux de dnitrification, mais aussi du rapport entre les volumes de N2O et de N2 produits. La proportion de N2 produit par rapport celle de N2O dpend dans le sol des espces de bactries dnitrifiantes impliques, du degr d'anarobiose, de la quantit de carbone, du contenu en nitrate et du pH (Skiba & Smith, 2000).

1.1.6 Activits biologiques du sol

Les microorganismes du sol (champignons et bactries) reprsentent la communaut la plus importante tant en terme de fonctions (cycle des nutriments) quen terme de diversit (4000 squences diffrentes dans 1 gramme de sol ; Torsvik et al., 1990).

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De nombreuses tudes ont montr que les plantations darbres peuvent entrainer des modifications des proprits chimiques du sol (Priha et al., 1999 ; Marschner et al., 2005), des activits biologiques notamment la minralisation du C et du N du sol (Chaussod, 1996, Marschner et al 2005 ; Berg et al., 2008, Ndour et al., 2001 ; Duponnois et al., 2001 ; Kourtev et al., 2002 ; Ehrenfeld et al., 2001), des structures gntiques des communauts microbiennes (Kourtev et al., 2003 ; Priha et al., 1999).

La respiration du sol, encore appele minralisation du C, est loxydation biologique de la matire organique en CO2. Cette analyse permet dvaluer lactivit mtabolique des microorganismes.

1.1.7 Structure gntique des communauts microbiennes

Le dveloppement rcent de nouvelles mthodes de type empreinte molculaire appliques directement partir de lADN extrait du sol a t lorigine de nouvelles approches. Ces approches ont permis de caractriser toute la diversit des communauts microbiennes dans les sols tout en saffranchissant des biais dus aux techniques de cultures (Ranjard et al., 2000).

Lavnement des outils de biologie molculaire a permis de contourner cet obstacle de culture et a permis de caractriser toute la diversit microbienne dans les sols. Lapproche utilise consiste extraire les acides nucliques (ADN ou ARN) directement partir des chantillons environnementaux, puis valuer la variabilit des squences dune partie plus ou moins conserve du gnome prsente chez toutes les bactries (par exemple la rgion V3 de lADNr 16S pour ltude de la communaut bactrienne totale).

La technique PCR-DGGE Polymerase Chain Reaction & Denaturing Gradient Gel Electrophoresis dcrite par Muyzer et al., (1993) a t utilise en cologie microbienne pour caractriser cette diversit des communauts microbiennes. Daprs ces auteurs, la DGGE permet dapprhender toutes les populations bactriennes reprsentant au moins 1% des effectifs totaux. Lutilisation de la DGGE pour lanalyse de la diversit gntique des communauts permet de suivre la distribution et labondance relative des espces dominantes.

Les microorganismes interviennent de manire trs importante dans les cycles biogochimiques des lments majeurs (C, N, P, S) et des oligolments. Ils sont impliqus dans les diffrentes fonctions du sol entre les diffrents compartiments qui structurent le systme sol-plante-atmosphre. La structure des communauts fonctionnelles (notamment fixatrices libres dazote, nitrification et dnitrification) dans les sols a pu galement tre caractrise grce aux outils molculaires en ciblant des gnes fonctionnels impliqus dans ces processus du sol. Webster et al., 2002, Enwall et al., 2007 en ciblant le gne amoA 16S rRNA a montr la diversit des communauts nitrifiantes dans les sols sous diffrents amendements organiques. Les travaux de Diallo et al., (2007) ont montr limpact dAcacia tortilis ssp. raddiana et de Balanites aegyptiaca sur la diversit des communauts diazotrophes dans les sols en ciblant le gne fonctionnel nifH. Braker et al (1998) et Bremer et al., (2007) ont utilis le gne nirK pour tudier limpact de diffrentes espces de plantes sur la structure des communauts dnitrifiantes dans les sols de fort.

1.2 ACACIA SENEGAL 1.2.1. Introduction

Acacia senegal encore appel gommier blanc est une espce darbre ou d'arbuste originaire d'Afrique. Selon la classification, il appartient :

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Rgne : Plantae ;

Sous-rgne : Tracheobionta ;

Division : Magnoliophyta

Classe : Magnoliopsida ;

Sous-classe : Rosidea ;

Ordre : Fabales ;

Famille : Mimosaceae ;

Sous-famille : Mimosoideae ;

Genre : Acacia

1.2.2. Description botanique

Acacia senegal (figure 4) est un arbre ou arbuste pineux, de 2 6 m (rarement 8 m) avec couronne en parasol. Trs rameuses, les branches sont trs ramifies, les rameaux suprieurs sont divergents et ascendants. Lcorce est gris clair brun clair et lisse sur les jeunes rameaux. La tranche est marbre rouge et blanche. Les pines sont par trois et les griffes acres, les deux latraux sont courbs vers le haut et la mdiane vers le bas. Les feuilles, petites vert gris sont bipennes avec 3 6 paires de pinnules ayant 10 20 paires de foliolules ovales de 3 6 mm de long et 1 2 mm de large. Les fleurs sont situes sur les pis de 3 8 cm, blancs, pdonculs, insrs par 2 ou 3 par fascicules axillaires. Les gousses de 7 10 cm de long, de 2 cm de large, sont aplaties finement pubescentes, gristres, et contenant 3 6 graines aplaties, rondes, brun clair. La priode de floraison se situe avant les premires pluies, mais parfois aussi en fin de saison de pluies.

Figure 4: Photo d'Acacia senegal (source K. Assigbets) Dahra, 2009.

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1.2.3. Rpartition et Habitat

Acacia senegal est un arbre typique du sahel, il est caractristique des zone sches situes au sud du Sahara, depuis les ctes mauritaniennes et sngalaise jusqu la Somalie. Il est galement prsent en Afrique du Sud et orientale avec diffrentes varits. Cest une espce trs rsistante au sec, poussant sous 100 800 mm des pluies, de prfrence avec 300 400 mm et une priode de scheresse de 8 11 mois. A. senegal prfre les sols sableux et les dunes rouges. Il prospre aussi sur les sols limoneux lgers, les sols bruns argileux, sur les grs argileux et mmes sur les lithosols. L'espce ne pousse qu'exceptionnellement sur des sols argileux lourds avec 800 mm de pluie par an. Les peuplements conomiquement intressants se situent en Mauritanie, au Mali, au Niger au Tchad et au Soudan (Sall, 2007).

1.2.4. Utilisations

A. senegal fournit 90 % de la gomme arabique mise sur le march international. Il surpasse en qualit tous les autres Acacias. La gomme est un produit d'exportation trs important. Les quantits vendues dpendent beaucoup du climat. Le rendement varie beaucoup d'un arbre lautre et d'une anne l'autre et oscille entre 100 et 1000 g (jusqu' 10 kg au Soudan), mais avec une moyenne de 250 g au moins dans un bon peuplement (au Cordofan 500 2000 pieds par ha).

La population locale consomme des quantits importantes pour la prparation des plats spciaux et pour la mdecine humaine ou vtrinaire, ainsi que pour des cosmtiques et des uvres d'art. La gomme arabique est particulirement utilise dans lindustrie agro-alimentaire, dans le domaine du textile, elle est aussi utilise comme mulsifiant pour les huiles dagrumes, dans lindustrie du papier (collage des tiquettes, enveloppes). A. senegal convient particulirement dans les projets de revgtalisation et pour la fixation des dunes (agroforesterie), pour lamlioration des sols par lapport de litire organique et par la fixation de l'azote. Au Soudan, A. senegal a toujours contribu de faon significative laugmentation des recettes dexportation du pays (Sall, 2007).

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Chapitre 2 : MATERIEL ET METHODES 2.1 MATERIEL

2.1.1 Prsentation du site d'tude

Le site de notre dispositif d'tude est situ dans la station exprimentale de lISRA (Institut Sngalais de Recherches Agricoles) de la ville de Bambey. La ville de Bambey est situe dans la rgion de Diourbel, au centre-ouest du pays dans l'ancien bassin arachidier sngalais. Bambey est situ sur une longitude 1646' O et une latitude 1471N. Les habitants sont pour la plupart des Srres, des Wolofs, des Laobs, et des Peuls, avec une densit de 187 hbts/km2. L'agriculture est la principale activit locale, avec la culture du mil, d'arachide, de mas et de la canne sucre. Ensuite, viennent comme activits secondaires l'levage extensif, l'artisanat et le commerce.

Figure 5 : Situation gographique du site de lexprimentation.

Le climat est de type sahlo-soudanien tropical, plutt sec, avec deux saisons:

- une saison sche trs longue qui va de Novembre Mai,

- une saison pluvieuse de Juin Octobre.

La pluviomtrie est faible, en moyenne 400 500 mm par an et les tempratures extrmes sont comprises entre 19C et 40C. Bambey est situ sur un sol plat presque sans relief. Le sol est ferrugineux tropical peu lessiv, de type sableux avec 3,86% d'argile, 5,52% de limon et 24,9% de sable. Ce sol ragit de faon spectaculaire au chaulage.

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La vgtation est forme d'espces ligneuses domines par des pineuses comme Acacia albida, Balanites aegyptica et Adansonia diditata. La verdure est trs marque pendant la saison des pluies.

2.1.2 Dispositif exprimental et chantillonnage

Les tudes ont t ralises sur des plantations dA. senegal de diffrentes provenances mises en place en 1994 par le CNRF (Centre National de Recherches Forestires). Lessai est un dispositif en 3 blocs compltement randomiss avec 16 traitements. Les traitements correspondent aux provenances dA. senegal originaires de 9 pays (Tableau 1).

Les blocs sont diviss en parcelles et sur chaque parcelle on a plant 25 individus dune seule provenance dA. senegal. Sur chaque parcelle, les prlvements de sol ont t effectus sous 5 arbres avec 3 points de prlvements de sol autour de chaque arbre. Les sols sont ensuite mlangs pour en faire un chantillon composite. Les sols sont prlevs dans l'horizon 0 25 cm en 2008.

Tableau 1: Liste des Provenances dA. senegal et pays dorigine

Provenances Pays dorigine

Bissiga Burkina Faso Burkina Sodra Ethiopie

Djigueri Mauritanie Kankossa Karofane Niger

Diamnar

Sngal Kidira Ngane Daiba Ait

Mali Kirane Somo Tchad Tchad

Soudane Soudane Pakistan Pakistan

2.2 METHODES

Pour chaque technique applique, nous avons utilis 3 rptitions d'chantillonnage.

2.2.1 Proprits physiques du sol : la granulomtrie

Les particules minrales dun sol peuvent tre isoles, tries et classes suivant leur taille, cest le principe de lanalyse granulomtrique. Cette analyse est effectue au LAMA (Laboratoire des Moyens Analytiques) de l'IRD/Bel-Air. Dix grammes de sol tamiss 2 mm sont mis dans

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un erlen de 250 ml, humects avec un peu d'eau dminralise, et sont attaqus par 50 ml d'eau oxygne (H2O2) dilue (30%) pour la destruction de la matire organique. Lextrait est transvas dans un flacon rempli au trois quarts avec de l'eau dminralise. Vingt cinq ml de pyrophosphate de sodium 65 g/l sont ajouts. La solution obtenue est transvase dans une allonge ; puis ajuste un litre et bouche. Les argiles (limons grossiers et les limons fins) sont obtenues par prlvement, tandis que les sables par tamisage ( 200 m et 50 m).

2.2.2 Proprits chimiques du sol

Le carbone total, l'azote total et le phosphore total, ainsi que le pH du sol et la capacit d'change cationique (CEC) ont tudis au Laboratoire LAMA (Laboratoire des Moyens Analytiques) de l'IRD/Bel-Air certifi Iso 9001-2008.

2.2.2.1 pH du sol

La mesure du pH dun sol permet de dfinir son tat dacidit ou dalcalinit (ou son statut acido-basique). Le pH du sol a t mesur selon le ratio 1:2,5 (poids : volume) avec de leau ou du KCl 2 M. Ainsi, on dtermine le pH dans la suspension forme laide dune lectrode combine un pH-mtre (Mettler Toledo 320).

2.2.2.2 Dosage du phosphore total

Le phosphore total a t dtermin par colorimtrie selon la mthode de Murphey & Riley (1962). Un gramme (1 g) de sol est vers dans 10 ml d'acide nitrique concentr et 5 ml dacide chlorhydrique concentr bullition pendant 5 heures. Le phosphore total est dos par colorimtrie automatique avec formation d'un complexe jaune de phosphomolybdate qui est rduit par l'acide ascorbique et prend une couleur brune.

2.2.2.3 Dosage du carbone total et de l'azote total

Les dosages de C et N sont effectus par oxydation catalytique l'aide d'un analyseur lmentaire CHN EA1112 Thermofinnigan Series.

Les chantillons de sol (40 60 mg) broys et tamiss (0,2 mm) sont mis l'tuve (environ 105C) une nuit pour y tre schs. Ils sont ensuite mis refroidir 1 h dans un dessiccateur. Le dosage seffectue laide de l'appareil CHN o l'limination des matires organiques est assure par un brleur atteignant une temprature de 900C, accentue par l'utilisation de nacelles en tain (la temprature atteint alors 1800C). Cette combustion permet d'obtenir du carbone et de l'azote. Ces deux composs passent ensuite dans un catalyseur d'oxydation (900C) o le carbone est transform en gaz carbonique (CO2). Ce CO2 et l'azote sont transfrs dans une colonne de rduction chauffe 750C dans laquelle le monoxyde d'azote (NO2) va tre transform en N2.

La sparation des deux composs est faite par chromatographie en phase gazeuse utilisant lhlium comme gaz vecteur qui acclre lextraction des gaz (CO2 et N2). Dans le chromatographe, les diffrents constituants gazeux sont spars par le dtecteur conductibilit thermique. Les quantits de carbone et d'azote sont calcules avec le logiciel EAGER 300 for EA 1112.

2.2.2.4 Extraction des cations changeables

La capacit d'change dun sol correspond la quantit totale de cations que le complexe d'change du sol peut fixer. Les cations changeables (K+, Na+, Ca2+, Mg2+) du sol sont dplacs

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par percolation avec une solution normale d'actate dammonium pH 7. Les cations extraits sont doss au spectrophotomtre par absorption atomique.

2.2.3 Densit et activit microbiologique

2.2.3.1 Biomasse microbienne

La biomasse microbienne est lensemble des micro-organismes du sol. Ces micro-organismes participent notamment la dgradation de la matire organique en lments minraux assimilables par la plante. Elle a t dtermine par la mthode fumigation extraction (Amato et Ladd, 1988). Cette mthode repose sur le dosage colorimtrique de l'azote -amin des parois bactriennes. Le dosage est effectu T0 et aprs une incubation de 10 jours (T10) d'un chantillon de sol humide dans un milieu satur en chloroforme (fumigation). La diffrence entre le T0 et le T10 reprsente l'azote -amin apparu au cours de la fumigation et provenant de la lyse des micro-organismes du sol par le chloroforme. Cet azote -amin est fonction de la quantit de micro-organismes prsents dans le sol avant la fumigation. La raction est base sur la formation d'un compos de couleur pourpre qui apparat lorsque l'azote est mis en prsence de ractif la ninhydrine. La lecture de la densit optique se fait la longueur d'onde de 570 nm pH 5,5. La quantit de carbone prsent dans la biomasse est calcule en multipliant le gain d'azote -amin libr lors de l'incubation par le facteur 21 (Amato et Ladd, 1988). Les rsultats sont exprims en mg C/g de sol.

2.2.3.2 Minralisation du carbone

La minralisation du carbone est loxydation biologique de la matire organique en CO2. Elle permet dvaluer lactivit biologique des micro-organismes du sol, et est base sur la mesure du dgagement du CO2 par rapport au volume total d'air en fonction du temps. Les chantillons de sol sont pess (25 g/ flacon) et humidifis 5 % de la capacit au champ (1,25 ml d'eau pour 25 g de sol). Ils sont ensuite enferms hermtiquement dans des flacons en verre de 120 ml munis de bouchons tanches.

Au temps T0, les flacons sont dgazs (flush) l'air comprim puis incubs l'tuve 28C pendant 15 jours. Le flux de CO2 est mesur tous les jours par injection directe dans un chromatographe phase gazeuse de type SRA (Analytical Instruments, MTI P200, Microsensor Technology Inc.), coupl un ordinateur, pilot par un logiciel EZCHROM 200/400. Les rsultats exprims en % du volume du flacon sont calculs en tenant compte des valeurs de T0.

2.2.4 Structure gntique des communauts bactriennes totales et spcifiques

Ltude de la structure des communauts bactriennes permet de connatre la diversit structurale de ces communauts en terme de prsence ou dabsence. La diversit de la communaut bactrienne totale a t tudie par la technique PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) applique au gne ribosomal 16S (16S rDNA PCR-DGGE). Les communauts dites fonctionnelles nitrite rductase, ammonium-mono-oxygnase et diazotrophes ont t caractrises respectivement par la PCR-DGGE en ciblant les gnes nirk, amoA et nifH. Cette caractrisation de la diversit structurale des communauts microbiennes se fait en plusieurs tapes : extraction de lADN du sol suivie de la PCR puis de la DGGE.

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2.2.4.1 Extraction de lADN du sol

Le principe de l'extraction de l'ADN (acide dsoxyribonuclique) total du sol repose sur une lyse physique des cellules directement dans la matrice du sol, suivie d'une limination partielle des principaux contaminants (protines, polysaccharides, acides humiques). Ce premier extrait d'ADN est alors concentr puis purifi une deuxime fois par l'usage d'un kit commercial. La mthode utilise ici a t initialement dveloppe par Porteous et al., (1997) et modifie (Assigbets et al., 2005) (annexe 1).

Pour un chantillon de sol donn, 3 extractions indpendantes ont t ralises puis les 3 extraits ont t pools.

Un chantillon de 0,5 g de sol broy et tamis 0,2 mm est ajout 0,5 g de billes de zirconium striles (diamtre 0,1-0,75 mm) auquel on rajoute 1 ml de tampon de lyse (NaCl 0,25 M ; EDTA 0,1 M ; pH 8). Deux passages alterns, agitateur bead-beater-bain marie (65C), assurent la dispersion physique et l'clatement des cellules. Ensuite, une centrifugation (13000 g, 15 min, 4C) permet de sparer la phase aqueuse (contenant entre autres les acides nucliques en solution) de la phase solide (sol et dbris). Cette phase aqueuse est alors rcupre par pipetage (600 l) et les acides nucliques prcipits l'actate de potassium (CH3COOK) 5 M (75 l) et au polythylne glycol 8000 40% (250 l) pendant 2 heures -20C. Aprs centrifugation (13000 g, 15 min, 4C), le culot dADN est incub 68C en prsence d'une solution (600 l) de CTAB 2% (1,4 M NaCl; 0,1 M EDTA; CTAB 2%) jusqu' dissolution complte. La purification se poursuit par agitation modre en prsence de chloroforme (600 l), suivie d'une centrifugation 13000 g pendant 10 min la temprature ambiante. La phase suprieure qui contient lADN est remise dans 600 l disopropanol (CH3CHOHCH3) et conserve -20C pendant 15 mn afin de prcipiter les acides nucliques. Aprs centrifugation du mlange (13000 g, 15 min, 4C) et limination du surnageant, le culot est lav avec 450 l d'actate d'ammonium (CH3COONH4) 2,5 M et 1 ml d'thanol (CH3CH2OH) 95 puis prcipit -20C pendant 15 mn. Le mlange est ensuite centrifug 13000 g pendant 15 min 4C et le culot est lav avec de l'thanol 70. Enfin, le culot dADN rcupr aprs centrifugation 13000 g pendant 5 min 4C est sch dans une cloche vide partiel, puis suspendu dans un volume variant entre 10 et 50 l de TE 1 X (Tris-HCl 10 M, EDTA 1 mM, pH 8,5). L'extrait brut obtenu est purifi l'aide du kit commercial Wizard DNA Clean-Up System. Lextrait dADN est ensuite quantifi laide des gammes talons (dilution srielle 1/2 d'ADN de thymus de veau de 400 12,5 ng/10 l) (annexe 2) afin de mesurer sa concentration dans chaque chantillon. L'ADN est conserv -20C jusqu' utilisation pour les amplifications PCR.

2.2.4.2 Etude de la structure des communauts bactrienne totale et fonctionnelles

Ltude de la structure des communauts bactriennes totales et fonctionnelles permet de caractriser la diversit structurale des communauts bactriennes du sol. Cette tude se fait par des mthodes de fingerprint molculaire. Nous avons choisi la mthode de PCR-DGGE pour cette tude de structure des communauts.

2.2.4.2.1 La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) La technique PCR dcrite par Mullis et al., (1985) permet d'amplifier des squences

d'ADN de manire spcifique et d'augmenter de manire considrable la quantit d'ADN dont on dispose initialement. Elle ncessite de connatre la squence des rgions qui dlimitent l'ADN amplifier. Ces squences serviront synthtiser des amorces oligonuclotidiques

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complmentaires (de longueur de 20 30 nuclotides en gnral). Ces oligonuclotides serviront dlimiter la portion d'ADN amplifier. L'ADN polymrase les utilisera comme amorces.

Cette technique a pris un essor considrable avec l'introduction d'une ADN polymrase rsistante la chaleur. Cette ADN polymrase ou Taq polymrase est extraite d'une bactrie thermophile (Thermus aquaticus). Elle permet une automatisation des diffrents cycles (dans des appareils appels thermocycleurs). Le nombre de cycles est gnralement compris entre 30 et 40. Cette mthode permet d'amplifier l'ADN compris entre les deux amorces d'un facteur de 105 106. Les rsultats doivent tre optimiss en fonction d'un certain nombre de paramtres: concentration en MgCl2, concentration en amorces, spcificit des amorces etc...

Le choix des amorces est particulirement crucial pour obtenir des rsultats satisfaisants (spcificit, taille, paramtres physico-chimiques.....).

Les ractions de PCR sont constitues de plusieurs cycles PCR permettant la rplication dune matrice dADN double brin. Ainsi, les produits PCR obtenus la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant. Lamplification est donc dite exponentielle.

La technique PCR comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois phases :

- une phase de dnaturation par la chaleur pour sparer les deux brins d'ADN (92-95C) (30 sec 1 min).

- une phase d'hybridation avec les deux amorces spcifiques entre 55-60C. La premire amorce se fixe sur un brin d'ADN, l'autre sur le brin complmentaire (30 sec 1 min).

- une phase d'extension par l'ADN polymrase partir des amorces 70-72C (1-2 minutes). Au cours de cette tape les brins complmentaires dADN sont alors synthtiss partir des extrmits 3OH des amorces hybrids.

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Figure 6: La raction en chane par polymrisation (PCR), (Vierstraete, 1999).

Toutes les ractions de PCR sont automatises et ralises l'aide des thermocycleurs GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France).

a. Structure de la communaut bactrienne totale

Pour ltude de la structure de la communaut bactrienne totale, la rgion variable V3 de lADN ribosomique 16S commune toutes les bactries a t amplifie en utilisant un couple damorces GC338f (Ovreas et al., 1997) et 518r (Muyzer et al., 1993).

Un mlange ractionnel de 25 l est prpar pour la PCR. Il est compos de :

- 1,25 ng dADN une concentration de 2,5 ng/l,

- des amorces (2,5 l/amorce) GC338f et 518r une concentration finale de 10 M.

- Taq Ready-to-Go (PuRe Taq Ready-To-Go, Amersham, France) (Annexe 3)

Le cycle thermique dit Touchdown PCR a t utilis pour lamplification de lADNr 16S des communauts bactriennes totales. Elle comprend plusieurs cycles de temprature :

- une premire tape de dnaturation de lADN de 2 mn 94C afin d'activer l'ADN

polymrase du mix Taq Ready-to-Go.

- 20 premiers cycles constitus de :

o 30 sec 94C (dnaturation)

o 30 sec de 65C (hybridation ; cette temprature dhybridation diminue de 0,5C chaque cycle jusqu atteindre 55C

PCR: Raction de polymrisation en Chane

Etape 1 : dnaturation30 sec 94C

Etape 2 : Hybridation desamorces 30 sec 55C

forward (sens) and reverse(anti-sens) primers

Etape 3 : longation12 min 72C

dNTPs

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o 1 mn 72C (longation ou synthse)

- 10 derniers cycles constitus de :

o 30 sec 94C (dnaturation)

o 30 sec 55C (hybridation)

o 1 min 72C (synthse)

- un dernier cycle de synthse finale 72C pendant 15 mn.

Toutes les ractions de PCR sont automatises et ralises l'aide des appareils thermocycleurs GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)

Les fragments dADN amplifis (environ 220 pb) sont spars sur un gel dagarose 1,5% pendant 30 mn 100 V. Les gels sont ensuite colors pendant 30 mn au bromure dthidium (1 g/ml), rincs leau dminralise puis photographis sous UV laide du logiciel BIO-Capt (Ets Vilber Lourmat, France).

La figure 7 prsente une description schmatique des diffrentes tapes du cycle thermique PCR utilis lors de lamplification du gne ADNr 16S de la communaut bactrienne totale.

Figure 7 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne ADNr16S marqueur de la communaut bactrienne totale

b. Structure de la communaut bactrienne dnitrifiante

Le gne nirk (gne marqueur dune partie des communauts bactriennes dnitrifiantes) a t amplifi en utilisant le couple damorce R3Cu-GC et F1aCu (Throbck et al., 2004). Ces amorces gnrent des fragments denviron 472 pb.

Le mlange ractionnel de 25 l est compos de :

- amorces une concentration finale de 10 M,

- lADN une concentration de 2,5 ng/l,

- Taq Ready-to-Go (PuRe TaqReady-To-Go) .

Le cycle thermique (Figure 8) comprend les phases suivantes :

- une phase de dnaturation de lADN de 2 min 94C.

- 10 cycles damplification constitus chacun :

o dune dnaturation de 30 sec 94C,

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o une hybridation par touch down de 30 sec de 62C (le touch-down consiste en une diminution de la temprature dappariement de 0,5C chaque cycle),

o longation de 45 sec 72C.

- 25 cycles damplification constitus chacun :

o dune dnaturation de 30 sec 94C,

o suivi dune hybridation de 30 sec de 57C,

o une longation de 45 sec 72C.

- un dernier cycle de synthse finale 72C pendant 5 min.

Les fragments dADN amplifis (environ 400 pb) sont spars sur un gel dagarose 1,5% pendant 30 mn 100 V. Les gels sont ensuite colors pendant 30 mn au bromure dthidium (1 g/ml), puis rincs leau dminralise et photographis sous UV laide du logiciel BIO-Capt (Ets Vilber Lourmat).

La figure 8 prsente une description schmatique des diffrentes tapes du cycle thermique PCR utilis lors de lamplification du gne nirk.

Figure 8 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne nirk (nitrite rductase) marqueur des communauts dnitrifiantes

c. Structure de la communaut bactrienne nitrifiante

Le gne amoA a t amplifi en utilisant le couple damorces amoA1F-GC (Rottauwe et al., 1997) et amoA-2R (Rottauwe et al., 2003). Ces amorces gnrent des fragments denviron 491 pb du gne codant une sous-unit de lammonium monooxygnase.

Le mlange ractionnel de 25 l est compos de :

- amorces une concentration finale de 10 M,

- lADN une concentration de 5 ng/l,

- Taq Ready-to-Go (PuRe TaqReady-To-Go),

- 0,5l de BSA.

Le cycle thermique (Figure 9) comprend les phases suivantes :

- une phase de dnaturation de lADN de 2 min 94C.

- 35 cycles damplification constitus chacun :

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o dune dnaturation de 30 sec 94C,

o une hybridation de 30 sec 60C,

o longation de 45 sec 72C (le touch-down consiste en une augmentation de la temprature dappariement de 1C chaque cycle),

- un dernier cycle de synthse finale 72C pendant 15 min.

Les fragments dADN amplifis (environ 491 pb) sont spars sur un gel dagarose 1,5% pendant 30 mn 100 V. Les gels sont ensuite colors pendant 30 mn au bromure dthidium (1 g/ml), puis rincs leau dminralise et photographis sous UV laide du logiciel BIO-Capt (Ets Vilber Lourmat, France).

La figure 9 prsente une description schmatique des diffrentes tapes du cycle thermique PCR utilises lors de lamplification du gne Amoa.

Figure 9 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne amoA marqueur des communauts ammonifiantes

d. Structure des communauts diazotrophes

La structure des communauts diazotrophes a t tudie en ciblant le gne nifH des microorganismes fixateurs libres dazote dans le sol. Ce gne a t amplifi en utilisant 2 couples damorces FGPH 19 (Simonet et al., 1991), PolR (Poly et al., 2001) et AQER (Poly et al., 2001) et PolF-GC (Poly et al., 2001). Ltude consiste faire une premire PCR ciblant une rgion prcise avec les amorces FGPH 19 et PolR afin daugmenter la sensibilit pour lidentification du gne marqueur. Les fragments dADN obtenus denviron 429 pb servent dADN matrice pour une deuxime amplification du gne cible en utilisant le couple damorces AQER et PolF-GC. Cette dernire amplification gnre des fragments denviron 320 pb.

Pour chaque PCR, le mlange ractionnel (25 l) contient :

- 10 M de chaque amorce,

- la Taq polymrase Ready-To-Go,

- de lADN (5 ng/l) dADN pour la premire PCR et une dilution au 1/100 du produit de la premire PCR (ADN matrice pour la deuxime PCR).

- BSA 0,5 l

Les cycles thermiques (Figure 10) comportent les phases suivantes :

- une premire phase de dnaturation de lADN de 5 min 94C.

- 30 cycles constitus chacun :

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o de 1 min 94C de dnaturation,

o de 1 min 55C pour la premire PCR et 48C pour la deuxime PCR pour lhybridation

o et de 2 min 72C dlongation ou de synthse.

- un dernier cycle dlongation finale 72C pendant 5 min.

Les fragments dADN amplifis (environ 400 pb) sont spars sur un gel dagarose 1,5% pendant 30 mn 100 V. Les gels sont ensuite colors pendant 30 mn au bromure dthidium (1 g/ml), puis rincs leau dminralise et photographis sous UV laide du logiciel BIO-Capt (Ets Vilber Lourmat, France).

La figure 10 prsente une description schmatique des diffrentes tapes du cycle thermique PCR utilises lors de lamplification du gne nifH de la communaut bactrienne diazotrophe.

Figure 10 : Cycle thermique pour lamplification PCR du gne nifH marqueur des communauts diazotrophes

Le tableau 2 prsente lensemble des gnes cibls, leur fonction et les squences des amorces qui permettent de les amplifier.

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Tableau 2: Squence des amorces et gnes cibles des communauts microbiennes tudies.

Fonction cible

Gnes cibls

Amorce Squences Taille Commu-nauts

Auteurs

16S rDNA

GC338f 518r

5 CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGGATC CCTACGGGAGGCAGCAG 3 5ATT ACCGCGGCTGG 3

220 pb

Bactriennes totales

Ovreas et al., (1997) Muyzer et al., (1993)

Nitrification AmoA AmoA1F-GC AmoA-2R

5 CGC CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG GGGTTTCTACTGGTGGT-3 5 CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC 3

491 pb

Bactriennes nitrifiantes

Rotthauwe et al.,(1997) Rotthauwe et al., (1997)

Dnitrifica-tion

Nirk R3Cu-GC F1aCu

5 GGC GGC GCG CCG CCC GCC CCG CCC CCG TCG CCC GCC TCG ATC AGR TTG TGG TT 3 5ATCATGGTSCTGCCGCG 3

472 pb

Bactriennes dnitrifiantes

Throbck et al., 2004 Throbck et al., 2004

Fixateurs libres

nifH PolR PolF-GC FGPH19 AQER

5 ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA 3 5 CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTG CGA YCC SAA RGC BGA CTC3 5 TAC GGC AAR GGT GGN ATH G3 5 GAC GAT GTA GAT YTC CTG3

429 pb 320 pb

Bactriennes diazotrophes

POLY et al., 2001 POLY et al., 2001 Simonet et al., (1991) POLY et al., 2001

2.2.4.2.2. La DGGE (Gel Electrophorse en Gradient de Dnaturation)

La DGGE est une technique dempreinte gntique qui consiste en une sparation des squences amplifies par PCR sur un gel dacrylamide contenant un gradient linaire de dnaturants de lADN. Il sagit de dnaturants chimiques (ure et formamide) dont le gradient de concentration utilis varie en fonction de la taille des amplifiats sparer. Les variations de squences entre les diffrents amplifiats vont influencer leur dnaturation et par consquent leur distance de migration lectrophortique. Ainsi les squences dADN ayant une plus forte concentration en bases G et C (high G+C avec une triple liaison hydrogne) vont migrer plus loin dans le gel avant datteindre leur point de dnaturation. On obtient ainsi des profils complexes reprsentatifs de la diversit des fragments dADN amplifis.

Dans notre tude, les fragments dADN obtenus aprs amplification par PCR sont spars sur un gel de polyacrylamide 8% [acrylamide-bisacrylamide 40 % (37.5 :1)] contenant

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des gradients de dnaturants chimiques de 45 % 70 % (annexe 4) (100 % dnaturant contient 7 M Ure et 40% formamide). La migration dure 18 h dans une cuve (INGENY phorU) sous une tension de 100V. Elle seffectue dans un tampon TAE 1X (annexe 3) une temprature de 60C. A la fin de la migration, le gel est color au Sybr Green (1/20) pendant 20 mn puis rinc leau pendant 5 mn. La visualisation du gel est faite par photographie sous UV laide du logiciel BIO-Capt (Ets Vilber Lourmat).

Principe de