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immunoglobulines de souris par traitement du sérum dans un tubeHBT® (Heterophilic Blocking Tube). Trois techniques immunomé-triques non isotopiques mettent en évidence de la Tg (valeurscomprises entre 438 et 780 �g/L), alors que la technique IRMA,considérée comme la technique de référence, rend un résultat infé-rieur au seuil de détection.Expertise.— Nous avons contacté le fabricant du kit de dosage IRMAqui a accepté de réaliser une expertise du sérum. La technique Cis-Bio Thyroglobuline® IRMA met en jeu quatre anticorps monoclonauxde capture et un seul anticorps de révélation. En utilisant un autreanticorps de révélation, la société CisBio a montré la présence deTg à un taux élevé, en accord avec les techniques non isotopiques.Conclusion.— L’expertise a permis de conclure à la mise endéfaut de la technique IRMA pour le dosage de la Tg de cepatient qui sera donc suivi au laboratoire par une techniqueimmunométrique non isotopique. La non-reconnaissance de laTg par l’anticorps de révélation du kit est probable. Cet inci-dent a fait l’objet d’une déclaration à l’AFSSAPS de la part dufabricant.

doi:10.1016/j.immbio.2011.03.037

Mise au point du dosage de la témocilline par HPLCpour l’étude de la stabilité de poches de perfusionsC. Rolin , J.D. Hecq , D. Vanbeckbergen , L. GalantiCliniques universitaires UCL Mont-Godinne, 1, avenue Therasse,5530 Yvoir, Belgique

Introduction.— La préparation à l’avance des solutions injectablespar une unité centralisée permet d’améliorer la délivrance de cesinjectables. Cela requiert l’étude de la stabilité du principe actifnécessitant une collaboration entre le laboratoire et la pharma-cie pour la mise au point du dosage de ce principe actif. Le butde notre étude est de mettre au point le dosage de la témocil-line, antibiotique utilisé principalement dans le traitement dessepticémies.Méthodes.— Le système de chromatographie liquide à haute pres-sion (Alliance, model 2690, Waters Association) se compose d’unereverse colonne C18 (Grom-Sil 80 ODS-7pH, 4 �m 150 mm × 4 mm),d’une phase mobile constitué de 15 % d’acétonitrile et 85 %d’acétate d’ammonium à pH = 4 avec de l’acide acétique. Ladétection est réalisée par un détecteur DAD (model 996, WatersAssociation) à 235 nm, le débit est fixé à 1,0 ml/min et la tem-pérature de la colonne à 30 ◦C. Le volume d’échantillon testé estde 10 �l. La stabilité de la témocilline (20 mg/ml) a été étudiéedans 10 poches injectables (5 dans le NaCl 0,9 % et 5 dans le glucose5 %), conservées à 4 ◦C, sur une période de 30 jours. Les solutionsde témocilline sont considérées comme stables si l’intervalle deconfiance inférieure à 95 % de la droite commune de régressionestimée reste supérieur à 90 % du produit initial selon les recom-mandations de la FDA.Résultats.— Le coefficient de variation pour la reproducti-bilité intra-essai (n = 10) est de 3,96 % (0,25 mg/ml), 3,03 %(0,50 mg/ml) et 1,75 % (1,00 mg/ml) et de 3,18 % (0,125 mg/ml),1,89 % (0,50 mg/ml) et 2,34 % (1,00 mg/ml) pour la reproductibilitéinter-essai (n = 16). L’analyse de la régression linéaire de l’aire sousle pic montre un coefficient r2 > 0,999 pour des concentrations de0,125 à 1,50 mg/ml. Afin de confirmer la stabilité dans le temps de latémocilline en perfusion, il est nécessaire d’exclure l’interférenceéventuelle de produits de dégradation. Nous avons ainsi préparéles solutions initiales (pH 7,01) et des solutions acides (pH 2,68)en ajoutant HCL 12 M et alcalines (pH 12,33) en ajoutant NaOH5 M. Chaque solution a été dégradée en chauffant à 100 ◦C pendant

60 min. L’analyse des pics chromatographiques de chacune des solu-tions (initiale, alcaline ou acide avec ou sans chauffage) montre uneséparation des produits de dégradation de la molécule native, per-mettant de confirmer l’absence d’interférence de ces produits surla concentration de la molécule analysée.

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onclusion.— La témocilline peut facilement être dosée par HPLC deanière fiable, permettant la validation de préparation centraliséee perfusions.

oi:10.1016/j.immbio.2011.03.038

esure de la vitesse de sédimentation en cas deyélome actif : sensibilité du Ves-Matic® et duoller® par rapport à la méthode de Westergren. Rolin , H. Mekouar , X. Hernandez , Y. Cornet , F. Mullier , B.hatelain

Cliniques universitaires UCL Mont-Godinne, 1, Avenue Therasse,530 Yvoir, Belgique

ntroduction.— La vitesse de sédimentation (VS) est influencée para présence d’immunoglobulines à forte dose. L’évaluation de laensibilité de la méthode de mesure de la VS, dans le cas des myé-omes, est d’un grand intérêt aussi bien pour le laboratoire que poure clinicien. Le but de cette étude est de comparer la VS obtenuear deux automates, basés sur la mesure optique, par rapport à laéthode de référence chez des patients atteints de myélome actif.éthodes.— Le Roller® 20 de chez ALIFAX-Italie et VES-MATIC®

00 de chez DIESSE-Italie ont été évalués pour la mesure de laS. La méthode de Westergren a été utilisée conformément auxecommandations du « Clinical and Laboratory Standards Institute »CLSI). La VS de 48 échantillons de patients atteints de myélomectif a été mesurée sur les deux automates ainsi que par la méthodee référence. L’analyse statistique des résultats est effectuée entilisant MedCalc®.ésultats.— La régression de Passing et Bablock met en évidence uneorrélation acceptable entre le VES-Matic et la méthode de Wes-ergren (y = -1,9022 + 0,7439 x ; r = 0,76) ; la distribution de Blant etltman montre une distribution homogène des biais. Concernant leoller® 20, la corrélation avec la méthode de Westergren n’est pasatisfaisante (y = 0,3333 + 0,3333x ; r = 0,60), le biais moyen observést de 96 %. Une courbe ROC a été établie afin d’évaluer la sensibi-ité au myélome de chacune des méthodes de mesure. L’étude de’aire sous la courbe (AUC) met en évidence une absence de diffé-ence statistiquement significative entre le VES-Matic et la méthodee Westergren, contrairement à la différence entre l’AUC du Roller®

t celle du Westergren, qui n’est pas statistiquement significative.onclusion.— Une bonne corrélation clinique est retrouvée entre

e VES-Matic et la méthode de Westergren. Le Roller® 20 rend desésultats de VS différents de ceux obtenus avec la méthode deéférence. Une bonne connaissance des limitations des automatestilisés reste indispensable avant chaque changement de techniquet ce dans le but d’assurer une bonne qualité des résultats rendus.

oi:10.1016/j.immbio.2011.03.039

nfluence du nombre de patients sélectionnés poura vérification des valeurs de référence desaramètres de chimie courante. Rolin , L. Galanti

Cliniques universitaires UCL Mont-Godinne, 1, avenue Therasse,530 Yvoir, Belgique

ntroduction.— Les laboratoires adhèrent de plus en plus à desormes de qualité, principalement la norme ISO 15189, lesquellesequièrent la vérification régulière des valeurs de référence. Lesaleurs de référence sont en générales proposées par le fabricante l’automate. La vérification des valeurs de référence proposéesécessitent l’analyse des résultats obtenus chez un certain nombre

e sujets normaux, difficile à obtenir. Selon le guide de validationes méthodes en biologie médicale (Cofrac, juin 2004), une popula-ion minimum de 100 patients est requise, dans laquelle les valeursberrantes sont éliminées. Le but de notre étude est d’évaluer

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e nombre de patient requis pour déterminer ces valeurs de réfé-ence et de valider notre méthode de vérification des valeurs deéférence.éthode.— Nous avons sélectionné un certain nombre de patientson hospitalisés (100—300—500 et 1000), pour lesquels les analysestudiées avaient été prescrites dans le cadre d’une consultation à’hôpital ou par un médecin externe. Selon la méthode de Turkey,ous avons établi les percentiles 25 (P25) et 75 (P75) de la distribu-ion du paramètre sur chaque cohorte de patient. La limite externenférieure est calculée comme étant égale à : P25—3 × (P75—P25)t P75 + 3 × (P75—P25) pour la limite externe supérieure. Tous lesésultats plus grands que la limite externe supérieure ou plusetits que la limite externe inférieure sont considérés comme aber-ants. La moyenne et l’écart-type sont calculés sur l’ensemblees patients desquels les résultats aberrants ont été enlevés. Lesaleurs de référence sont définies comme égales à la moyenne plusu moins deux écart-types.ésultats.— Nous remarquons que, de manière générale, les limitese référence obtenues dans les quatre groupes étudiés (n = 100,00, 500 et 1000) sont relativement proches l’une de l’autre. Maisous pouvons conclure que la vérification sur 100 patients n’estas optimum en raison de variabilités inter-individuelles. Ainsi dansotre étude le fer sérique est plus élevé chez la femme que chez’homme dans le groupe 100 patients mais pas dans les groupes00 et 1000 patients. L’idéal est de vérifier une cohorte plus grande500 ou 1000 patients), afin de limiter l’impact éventuel de cer-ains patients. Il n’existe cependant pas une très grande différencentre les résultats obtenus entre les cohortes 300—500 et 1000 saufour certains paramètres. Certains paramètres montrent une dis-ordance entre la valeur calculée et la valeur de référence pour laimite inférieure, car celle-ci doit être confrontée dans certain casla limite inférieure de quantification de l’automate.onclusion.— La méthode utilisée nous permet de vérifier les valeurse référence de manière assez aisée sur des patients non hospita-isés en effectuant une extraction de données à partir du systèmenformatique.

oi:10.1016/j.immbio.2011.03.040

oexpression des b2a2 et b3a2 (MBCR) et profiltypique sur bioanalyseur Agilent®

. Sanchez , V. Platzer , N. Beaufils , A. Sanson , J. GabertService de biochimie et biologie moléculaire, hôpital Nord,PHM, Chemin des Bourrely, 13915 Marseille cedex 20, France

a maladie de Vaquez, syndrome myéloprolifératif, présente plu-ieurs particularités : 1) son développement lent pourrait permettrea mise en place d’une réponse immunitaire ; 2) elle peut êtreontrôlée par des saignées thérapeutiques sans induire une immuno-uppression par utilisation de drogues cytotoxiques ; 3) la définition’une anomalie quasi constante pose la question de ses conséquen-es éventuelles au niveau des cellules effectrices de l’immunité.nfin, l’incidence élevée de cancers dans la maladie de Vaquezémoigne d’un probable déficit immunitaire. Ainsi, compte tenue la possible implication de dysfonctionnements immunologiquesans l’initiation ou la progression de la maladie, nous allons étudieres populations lymphocytaires ayant un rôle antitumoral, et plusarticulièrement les cellules NK, dans la maladie de Vaquez.ous rapportons des anomalies de la répartition des différentesous-populations lymphocytaires : diminution en valeur absolue desymphocytes totaux (touchant les lymphocytes B et T), diminutionn valeur absolue des lymphocytes T régulateurs et augmentationn valeurs relative et absolue des cellules NK. De même, on note

ne tendance à la diminution du nombre de lymphocytes TCR �/�.’étude des principaux récepteurs activateurs ne montre pas de dif-érences entre les patients et les témoins. Par contre, il existe uneendance à l’augmentation de l’expression des récepteurs inhibi-eurs chez les patients, significative pour le CD158b.

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urnées de biologie de Marseille — 30e Colloque IBS CORATA

es capacités d’activation des cellules NK ont été étudiées parn test de dégranulation du CD107a sur des cellules préalable-ent triées sur colonne. Cela nous permet de montrer un défaut’activation des cellules NK, probablement lié à un défaut intrin-èque, dans la maladie de Vaquez.ar PCR quantitative en temps réel, nous avons retrouvé la mutation617F du gène JAK2 dans les lymphocytes de tous les patients queous avons testés.insi, nous avons montré des anomalies des cellules du système

mmunitaire et notamment des cellules NK dans la maladie deaquez qui pourraient donc être impliquées dans le développe-ent de cette pathologie. Il serait donc intéressant d’explorer ces

ellules NK sous de nouveaux aspects (facteurs de transcription,ctivité des cellules NK sur les progéniteurs hématopoïétiques. . .).

oi:10.1016/j.immbio.2011.03.041

ntérêt des anticorps anti-peptides de gliadineéamidée dans le diagnostic et le suivi de laaladie cœliaque de l’enfant

. Trepsat , P. Rouzaire , C. Guyon , C. Seignovert , A. Lachaux , J.ienvenu , F. Bienvenu

Centre de biologie Sud, laboratoire d’immunologie, 165, cheminu Grand-Revoyet, 69495 Pierre-Bénite, France

ntroduction.— La maladie cœliaque (MC) est une pathologieuto-immune très fréquente, dont la prévalence est estiméectuellement à 1/100. Du fait de sa présentation clinique trèsolymorphe, allant des formes asymptomatiques jusqu’à la dénu-rition sévère, elle est souvent sous-diagnostiquée. Le dépistageérologique repose, aujourd’hui, sur la recherche des anticorps (Ac)nti-transglutaminase tissulaire (TTG). Le but de cette étude este comparer les performances diagnostiques d’un nouveau mar-ueur : les Ac anti-peptides gliadine déamidée (GliD) à celles desc anti-TTG.atients et méthode.— Population constituée de 278 enfants (49 %e filles, âgés de un mois à 20 ans, médiane : 8 ans, 18,1 % < 2 ans)dressés pour recherche d’Ac anti-TTG (287 sérums) devant une sus-icion clinique de MC (n = 120), un terrain à risque de MC (n = 93), unuivi de régime sans gluten (RSG) (n = 22) ; 52 enfants sont non docu-entés cliniquement. Tous les patients ont bénéficié d’un dosage’IgA et IgG anti-GliD (ELiATM GliadinDP, Phadia®), et d’IgA anti-TTGVarelisa Celikey, Phadia®), technique habituelle du laboratoire. Laecherche d’IgG anti-TTG (Varelisa Celikey, Phadia®) a été réaliséeans un sous-groupe comprenant, notamment, les enfants présen-ant un déficit en IgA. La technique Celikey est une technique ELISAn microplaque. La technique ELiATM GliadinDP a été réalisée sur’analyseur Unicap 100 (par fluorescence polarization immunoas-ay : FPIA).ésultats.— (Tableau ci-aprés) :260 des 287 sérums (91 %) présentaient des résultats concordants

égatifs ;Cinq des 287 sérums (2 %) étaient concordants positifs (un nouveau

iagnostic de MC et quatre MC connues suivant mal leur RSG ou enours d’épreuve de réintroduction du gluten) ;

22 des 287 sérums (7 %), sans déficit en IgA avaient des résultatsiscordants répartis en 7 sous-groupes.onclusion.—Ces résultats confirment les bonnes performancesiagnostiques du test IgA anti-TTG (Varelisa Celikey, Phadia®). LesgA anti-GliD (ELiATM GliadinDP, Phadia®), manquent de sensibi-ité (elles sont notamment négatives dans les trois découvertes deC, confirmées par la biopsie). Les IgG anti-GliD (ELiATM GliadinDP,hadia®) sont plus performantes au niveau de la sensibilité et pour-

aient représenter un bon marqueur pour le dépistage de la MC chezes enfants porteurs d’un déficit en IgA totales.

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