Institut des cellules Souches pour le Traitement et l'Etude des maladies Monogéniques

Comment réparer le cerveaux et ses annexes avec les cellules souches pluripotentes humaines

L’équipe

Brigitte ONTENIENTE

Christelle MONVILLE

Jérôme POLENTES Marion BRENOT

Sébastien DUPRAT

De l’équipe s’occupant des Rétinopathies

De l’équipe s’occupant des LésionNeurovasculaire

1_ CulturePourquoi utiliser des cellules souches ?Cellules hES et IPSMefs

2_ DifférenciationCellules RPE ( Retinal pigmented epithelium) Cellules souches neurales ( NSC )→ Immunohistochimie

3_ Les applicationsLes greffesLa thérapie cellulaire

Sommaire

1

2

3

hESC, hiPS

Auto-renouvellement illimité

Pluripotence i.e potentiel de différenciation maximum

I. Culture des cellules pluripotentes

Fécondation in vitro

Embryonsurnuméraire

Blastocyste

Cellules souches embryonnaires humaines

(hES)

Diagnostic Génétique

(D.P.I*)

55

Biopsie, fibroblastes

Reprogrammation

Cellules souches pluripotentes induites

(iPS)

I. Culture des cellules pluripotentes

Les mef (mouse embryonic fibroblast)

Cellules nourricières provenant de la souris

Culture de mefs

I. Culture des cellules pluripotentes

II. Différenciation

Injection

Cellules embryonnaires

humaines

Production in vitro de RPE humains

In vitro

X40

RPE confluentes

Trypsine 5min, 37°C

RPE décollées

comptage

Remise en culture des RPE (500000c/cm2)

10j de culture

Immunocytochimie

Bleu= noyauxVert= membrane cellulaire

II. Différenciation

Ki67 Nest ine DAPI

II. Différenciation

Cellule souche neuraleTuj1: Neurones et GFAP: astrocytes

TUj1 GFAPDAPI

Principe de l'immunofluorescence

L'immunofluorescence sert a vérifier le type de cellule présente dans une culture ou une greffe.Il faut préparer des anticorps primaires qui vont venir se fixer sur les cellules spécifiques aux anticorps dans la culture ou sur la coupe de cerveau ayant subi une greffe.L'anticorps secondaire,contrairement au primaire, est fluorescent.Il va se fixer au anticorps primaires. Il faut ensuite rincer la coupe de cerveau ou la culture dans du PBS ( phosphate Buffer Salt ) pour enlever le surplus d'anticorps.Il ne reste plus qu'à observer au microscope.

Anticorps secondaires

Anticorps Primaires Cellule

Les Greffes

Début de la greffe

Fin de la greffe

Greffe

Avant du cerveau Arrière du cerveau

Coupes de cerveau de rat ayant subi une greffe Colorées au Cresyl Violet

III. Applications

Remerciements

Mme CassiniMme CassiniMme BonafinMme Bonafin

Mme RivièreMme RivièreMr DeroinMr DeroinMme HenezMme Henez