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Interactions entre Interactions entre MycobacteriumMycobacterium tuberculosistuberculosis
et les cellules phagocytaireset les cellules phagocytaires
CCééline line PujolPujol et Franck et Franck BietBiet -- IASP INRA ToursIASP INRA ToursOlivier Olivier NeyrollesNeyrolles
Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale -- ToulouseToulouse
Infectious diseases14.9 million (>25%)45% in developing countries63% in 0-4 yo children
Others
Cardiovascular diseases
Neoplastic diseases
Injuries
Asthma & chronic obstructive pulmonary diseases
Annual deaths (WHO, 2002)
Respiratory infections
HIV / AIDS (2.77 million)Diarrhoeal diseases
Tuberculosis (1.56 million)
Childhood diseases
Malaria (1.27 million)
Others
Annual deaths due to infectious diseases (WHO, 2002)
Emerging diseases
Legionnaire’s diseaseToxic shock syndrome
Lyme diseaseHIV
Nipah virusHantavirusEbola virus
Marburg virusE. coli O157:H7
Re-emerging diseases
CholeraTuberculosisDengue feverYellow fever
Malaria
~4 billion non-infected
~2 billion infected
TB 14 million† 1.6 million
19521957
19621921
Public health measures
2007
Isoniaside
INH
Pyrazinamide
Ethionamide ETHEthambutol
ETMB
Rifampicine
The DOTS strategyDirectly Observed Therapy, Short course
Peru, 1980-2000
1/ Government commitment to sustained TB control activities
2/ Case detection by sputum smear microscopy among symptomatic patients self-reporting to health services.
3/ Standardized treatment regimen of six to eight months for at least all sputum smear- positive cases,with directly observed therapy (DOT) for at least the initial two months.
4/ A regular, uninterrupted supply of all essential anti-TB drugs.
5/ A standardized recording and reporting system that allows assessment of treatment resultsfor each patient and of the TB control programme performance overall.
Estimated number of new TB cases by country (WHO, 2005)
Brazil60/100,00068% DOTS
Paraguay68/100,00054% DOTS
Argentine41/100,000100% DOTS
Bolivia211/100,00047% DOTS
Peru172/100,000100% DOTS
Uruguay28/100,000100% DOTS
Ecuador131/100,00070% DOTS
Colombia45/100,00050% DOTS
Venezuela42/100,000100% DOTS
Chile15/100,000100% DOTS
New vaccine
New drugs
WHO projections by 2020
• 1 billion people newly infected• 200 million people sick• 35 million deaths
Future prospects
The Mycobacterium genus
From Filliol et al. 2006 J Bacteriol
M. canettiiM. africanumM. bovis (incl. BCG)M. microtiM. tuberculosis
W-Beijing lineage
12
34
5
6
Physiopathologie
Caractéristiques cliniques et histologiques conjonction de 2 types de facteurs
Facteurs virulence du bacille Nature et intensité des mécanisme de défense de l’hôte
Tuberculose paradigme des maladies dont l’immunité protectriceest de type cellulaire
Deux axes d’évolutions formation du granulome et la nécrose tissulaire
Contamination (individus contagieux)
Infection des voies respiratoires gouttelettes de « Pflugge » chargées de Bacilles
Véhicule efficace non capturé par le tapis mucociliaire
Survie jusqu’au alvéoles pulmonaire ou elle rencontre le macrophage alvéolaire
Après phagocytose
* tuberculose disséminée, 1-5% la plupart du temps fatale ; la dissémination des cellules infectées se poursuit par le sang dans tout le corps. On voit apparaître de petits tubercules contenant les bacilles qui se multiplient activement. nodules tuberculeux au niveau des alvéoles détectés par une radiographie pulmonaire. Cette forme de la maladie n'apparaît que chez les enfants et des personnes très affaiblies.
* tuberculose latente : 90 % c'est l'issue la plus fréquente dans les pays industrialisés. Les personnes infectées ne sont pas malades. Du point de vue clinique cette phase correspond à une hypersensibilité cutanée. Activation du macrophage, formation de granulome, produit de nécrose appelé caséum (solide) c’est la nécrose tissulaire
* tuberculose active : 5-10 % on observe une extension progressive des tubercules pulmonaires avec une dégénérescence des alvéoles pulmonaires et des sinus (zone de confluence vasculaire) sanguins. Les personnes sont alors contagieuses et la mort survient en absence de traitement. Le diagnostic peut être fait par test cutané, par radio pulmonaire ou par l'observation de crachats et la culture des bacilles qu'ils contiennent. Caséum liquide favorise la multiplication cellulaire
Physiopathologie : Trois évolutions sont possibles
Paroi assimilée à un G+
Interactions avec l’hôte nécessaire à l’infection
Inhibe maturation du phagosome
Résistance à de nd antibiotiques
LAM ou LPS mycobactérien important facteur de virulence
hétérogène de taille et de structure
Impliqué pour la pathogénie
Coiffe de mannose chez les espèces à croissance lente ManLAM
Module la réponse immunitaire induction de nb
cytokines Th1 et inflammatoire TNF-α, GM-CSF IL-1α IL-1b, IL-12 IL-10, TGF-β
Chimiokine IL-8 Gro-α
Paroi Mycobactérienne : clef de la pathogénie tuberculeuse
ETH
INH
EMB
STR
Ethionamide ETH, Isoniazid INH, Ethambutol EMB et Steptomycine STR
Site d’action des antibiotiques utilisés contre les mycobactéries
Les mycobactéries préférentiellement phagocytée par les macrophagespar au moins trois mécanismes:
* en présence des protéines du complément activé la phagocytose facilitée par opsonisation, les protéines du complément se fixent sur la paroi bactérienne (fractions C3b et C3bi) et facilitent ainsi l'adhérence du bacille avec les récepteurs (dits CR) de la membrane du macrophage
* lorsque le complément est inactif le bacille libère lui-même une enzyme (C3-convertase) capable d'activer les fractions du complément nécessaires à sont opsonisation (C3b à partir de C2a)
* enfin, les résidus mannose de la paroi de la bactérie peuvent adhérer àdes récepteurs sépcifiques de la membrane du phagocyte (récepteurs MR).les récepteurs CR et MR +/- exprimés à des moments différents de la maturation et de l'activation du macrophage
Phagocytose des mycobactéries
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 2 4 6 8 10Time post-infection (days)
CFU
s/50
0,00
0 ce
lls
M. tuberculosis(td~25h)
Growth inside macrophages
From DG Russell
N
E. coli
Phagocytosis and degradation
Exocytosis
Phagosome
Late endosomesLysosomes
pH~4,5
Phago-lysosome
N
ER
CMH-II
Proteasome
CMH-I
T CD4+
IFN-γ
T CD8+
Cytolysis / IFN-γ
Phagocytosis and antigen presentation
Phagosome biogenesis
Kiss and Run
Kiss and Run
Recyclingendsome
Late endosomepH 5.5
LysosomepH 4.5-5
EarlyendosomepH 6.3
Golgi
The « kiss and run » model(M Desjardins)
Phagosome maturation
Maturation
phagosome precoce
0-5 min
Kiss and Run
Recyclingendosome
EarlyendosomepH 6.3
Pi3P
* EEA1
Rab5
Tf
Trans-Golginetwork
Phagosome maturation
Maturation
phagosome précoce
phagosome tardif
5-30 min
0-5 min
Kiss and Run
Kiss and Run
Recyclingendosome
Late endosomepH 5.5
EarlyendosomepH 6.3
Pi3P
* EEA1
Rab5
Tf
LAMP1
Rab7
Trans-Golginetwork
Phagosome maturation
Maturation
phagosome precoce
phagosome tardif
phagolysosome
40-60 min
5-30 min
0-5 min
Kiss and Run
Kiss and Run
Recyclingendsome
Late endosomepH 5.5
LysosomepH 4.5-5
EarlyendosomepH 6.3
Pi3P
* EEA1
Rab5
Tf
LAMP1
Rab7
v-ATPase
Cathepsin D
Trans-Golginetwork
Intracellular survival strategies
StrategyMaturation arrest
Escape from phagosome
Other / Unique
PathogenSalmonella
Mycobacteria
Leishmania
Shigella
Listeria
Rickettsia
Trypanosoma
Chlamydia
Legionella
Toxoplasma
MechanismsSPI2-mediated inhibition of vesicle fusion
Modulation of SNARE proteinsInhibition of EEA1 acquisition by ManLAMOthers…
Inhibition of actin depolymerizationLipophosphoglycan-mediated inhibition of fusion
Lysins and phospholipases
Inclusion vacuole
Association with ER
Association with mitochondria and ER
Intracellular survival strategies
StrategyMaturation arrest
Escape from phagosome
Other / Unique
PathogenSalmonella
Mycobacteria
Leishmania
Shigella
Listeria
Rickettsia
Trypanosoma
Chlamydia
Legionella
Toxoplasma
MechanismsSPI2-mediated inhibition of vesicle fusion
Modulation of SNARE proteinsInhibition of EEA1 acquisition by ManLAMOthers…
Inhibition of actin depolymerizationLipophosphoglycan-mediated inhibition of fusion
Lysins and phospholipases
Inclusion vacuole
Association with ER
Association with mitochondria and ER
N
M. tuberculosis
LE/Ly
pH~6.3 RE
TfR/Tf
vATPase
M. tuberculosis: « the indigestible microbe »
pH~6.3
vATPase
Mtb / vATPase Mtb / DAMP
pH~5.0-5.5
vATPase
Killed Mtb / DAMP
M. tuberculosis blocks phagosome acidification
The latex bead phagosome(M. Desjardins)
The Mycobacterial phagosome
SapM
Mycobacterial attributes contributing to phagosome maturation arrest
PknG
PI3P PI
↑[Ca2+]c/CaM
hVPS34 (p150)
PI3P-EEA1
Phagosome maturation
From Walburger et al. 2004. ScienceVergne et al. 2005. PNAS
Verge et al. 2003. J Exp MedFratti et al. 2003. J Biol Chem
Cavalli et al. 2001 Mol CellFratti et al. 2003 PNAS
Bach et al. 2008. Cell Host Microb
Vps33B-[P]
Vps33B
PtpA
Man-LAM
p38MAPK
GDIGDP
Rab5-GDP
EEA1-PI3P/Stx6-
mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery
PI3P is necessary for phagosome maturation
LAMP1 (-WT)
LAMP1 (+WT)
From Vieira et al. 2001 J Cell Biol
SapM
Man-LAM inhibiting Pi3P formation
PknG
Man-LAM
PI3P PI
↑[Ca2+]c/CaM
hVPS34 (p150)
From Vergne et al. 2005. PNASVerge et al. 2003. J Exp MedFratti et al. 2003. J Biol Chem
Cavalli et al. 2001 Mol CellFratti et al. 2003 PNAS
Vps33B-[P]
Vps33B
PtpA
hVPS34 (p150)
PI3P-EEA1
Phagosome maturation
p38MAPK
GDIGDP
Rab5-GDP
EEA1-PI3P/Stx6-
mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery
SapMPknG
PI3P PI
↑[Ca2+]c/CaM
hVPS34 (p150)
Vps33B-[P]
Vps33B
PtpA
hVPS34 (p150)
PI3P-EEA1
Phagosome maturation
Man-LAM
Mycobacteria secrete a PI3P-hydrolizing phosphatase (SapM)
EEA1
From Vergne et al. 2005 PNAS
p38MAPK
GDIGDP
Rab5-GDP
EEA1-PI3P/Stx6-
mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery
Mycobacteria secrete a PI3P hydrolizing phosphatase (SapM)
From Vergne et al. 2005 PNAS
SapM
PknG
(ser/thr kinase)
PI3P PI
↑[Ca2+]c/CaM
hVPS34 (p150)
From Walburger et al. 2004. Science
Vps33B-[P]
Vps33B
PtpA
hVPS34 (p150)
PI3P-EEA1
Phagosome maturation
Man-LAM
Protein Kinase G promotes mycobacterial survival wthin macrophages
p38MAPK
GDIGDP
Rab5-GDP
EEA1-PI3P/Stx6-
mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery
A M. tuberculosis Ser/Thr kinase (PknG) confers resistanceto P-L fusion when introduced into M. smegmatis
From Walburger et al. 2004 Science
SapMPknG
PI3P PI
↑[Ca2+]c/CaM
hVPS34 (p150)
Bach et al. 2008. Cell Host Microb
Vps33B-[P]
Vps33B
PtpA
hVPS34 (p150)
PI3P-EEA1
Phagosome maturation
Man-LAM
PtpA is a tyrosine phosphatase dephosphorylating VPS33B
p38MAPK
GDIGDP
Rab5-GDP
EEA1-PI3P/Stx6-
mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery
Frmo Bach et al. 2008. Cell Host Microb
PtpA colocalizes with VPS33B and inhibits P-LE fusion
From Cole et al. 1998 Nature
The M. tuberculosis genome
699
2190102
1200
444
Sequences with a 3DhomologueFunction assigned by clearhomologyFunction assigned bytentative homologyHomologue found but nofunction assignedNo homologue found
Function unknown41%
The M. tuberculosis genome
Genome comparison Mutant library screening Transcriptomics & proteomics
Gene candidate
High throughput drug screeningKnowledge-based approach
Genomics for virulence gene & drug target discovery