Int. J. htsec't Morphol. & Emhrvol. , Vol. 17. No. 3. pp, 221 230, loeSS t102(I 7322/88 $3.tl0 + .q)/I Printed in Grea t Britain Pergamon Pre~s pie

I N T E R V E N T I O N POSSIBLE D ' U N F A C T E U R C E P H A L I Q U E D A N S LA R E G E N E R A T I O N DES PATTES

C H E Z LES E M B R Y O N S D U P H A S M E , CARAUSIUS M O R O S U S BR. ( P H A S M I D A • L O N C H O D I D A E )

BERNARD FOURN1ER* et JANINE ROGUEDA~

*Laboratoire de IXeuroendocrinologie et U.A. 1138 du C.N.R.S. et tLaboratoire de Zoologie exp6rimentale, Universit6 de Bordeaux I, Avenue des Facult6s, 33405 Talence, France

(Accepted 22 January 1988)

Abstract--Suppressions of endocrine cephalic areas (which contain the presumptive endocrine glands) were performed on young (stage IV3-V1) or differentiated (stages Via, or VII~) embryos of Carausius morosus Br. (Phasmida : Lonchodidae). In all these operated embryos (= cephaloprives), amputation of a thoracic leg during the second cuticle formation (stage VIs), or even after this event (stage VIL), prevented regeneration. On the other hand, regenerative abilities were preserved when the amputation of the leg was made on embryos deprived of abdominal segments, with similar conditions as for cephaloprives. Consequently, operative shock did not modify regenerative abilities. Because very similar ecdysteroid levels were assayed both in cephaloprives and normal eggs, interference of a possible cephalic factor (perhaps neurosecretion) in the regeneration of the embryonic leg could be envisaged.

Index descriptors (in addition to those in title): Development, microsurgery, cephaloprives, abdominoprives, ecdysteroids, cuticulogenesis.

I N T R O D U C T I O N LES PATTES e m b r y o n n a i r e s des Insec tes sont capab les de r6g6n6rer leur po r t ion m a n q u a n t e , apr6s une a m p u t a t i o n . L ' e x e m p l e est donn6 par les Blat tes (Bul l i6re et al . ,

1969: Bul l i6re et Bul l i~re , 1970) et les Phasmes (Fourn i e r , 1969, 1973). Chez les Bla t t es , Bul l i6re et Bul l i6re (1974), Bull i6re (1977) et Bull i6re et Bul l i6re

(1977) ont d 6 m o n t r d tout d ' a b o r d que la capaci t6 de r6g6n6rer 6tait une "propr i6 t6 in t r ins6que des cel lules 6p ide rmiques des append ices" . Ces au teurs conc luent l ' i ncompa t ib i l i t 6 d ' e x p r e s s i o n s imul tan6e du p r o g r a m m e de r6g6n6rat ion append icu la i r e et du p r o g r a m m e de cu t icu logen6se . Ce de rn i e r p r o g r a m m e n6cessi tant des taux 61ev6s d ' e c d y s t 6 r o i d e s , la r6g6n6ra t ion ne peu t alors s 'e f fec tuer . Par ai l leurs , les m6mes au teu r s 6tablis'~;ent que les h o r m o n e s de mue de sont pas exc lus ivement p rodu i t e s pa r les g l andes sp6cial is6es ( = g landes p ro tho rac iques ) de ces insectes.

A u con t r a i r e , l ' e m b r y o n du Phasme Carausius pr6sente la s ingulari t6 de pouvo i r

* To whom all correspondence should be addressed.

221

222 B. FOURNIER et J. ROGUEDA

r 6 g 6 n 6 r e r u n e p a t t e si ce l le -c i a 6t6 s e c t i o n n 6 e jus t e avan t et m 6 m e p e n d a n t les 2

p r e m i O r e s s6c r6 t ions cu t i cu la i r e s : s t ades I V t - I V 3 et V I s - V I I 1 ( F o u r n i e r , 1969, 1971,

1973). D ' a u t r e pa r t , les e m b r y o n s pr iv6s de g l andes e n d o c r i n e s c 6 p h a l i q u e s et m 6 m e

d ' a b d o m e n (ce qu i 6 q u i v a u t h s u p p r i m e r u n e g r a n d e pa r t i e des o e n o c y t e s ) p e u v e n t

s6c r6 te r u n e cu t i cu l e p lus 61abor6e (de type l a rva i r e ) en p r 6 s e n c e de fa ib les t aux

d ' e c d y s t ~ r o i d e s ( F o u r n i e r e t R a d a l l a h , 1983; R a d a l l a h e t F o u r n i e r , 1987).

C o m p t e t e n u de t o u s ces rOsultats , on p e u t se d e m a n d e r : (1) j u s q u ' ~ q u e l degr6 les 2

p r o c e s s u s - - r 6 g 6 n 6 r a t i o n de pa t t e et c u t i c u l o g e n 6 s e e m b r y o n n a i r e s - - p e u v e n t 6t re

d issoc i6s ou s u p e r p o s 6 s ; (2) si dans le cas plus p a r t i c u l i e r du P h a s m e , le d 6 c l e n c h e m e n t

de la r 6 g 6 r a t i o n t o u t c o m m e le contr61e de ce p h 6 n o m ~ n e s e r a i en t une p rop r i6 t~

i n t r i n s ~ q u e des a p p e n d i c e s , ou b i en s ' i ls d O p e n d r a i e n t d ' u n f ac t eu r c 6 p h a l i q u e ?

N o u s a v o n s d o n c p r o c 6 d 6 ~ l ' a b l a t i o n ( p r 6 c o c e ou h un s t ade avanc6) de t e r r i t o i r e s

c 6 p h a l i q u e s c h e z des e m b r y o n s de C a r a u s i u s , puis ~ I ' a m p u t a t i o n d ' u n e pa t t e t h o r a c i q u e

p e n d a n t o u aprOs la deux iOme sOcr6tion cu t icu la i re . C e t t e d e r n i 6 r e opOra t ion a

6 g a l e m e n t 6t6 r6a l i s6e sur des e m b r y o n s pr iv6s de t e r r i t o i r e s a b d o m i n a u x de m a n i 6 r e

m i e u x a p p r 6 c i e r l ' i n f l u e n c e 6 v e n t u e l l e du c h o c o p 6 r a t o i r e dans nos exp6 r i ences . Le

t r ava i l a 6t6 c o m p l 6 t d p a r une 6 tude des t aux d ' ecdys tOro ides c o n t e n u s dans les

d i f f 6 r e n t e s c a t 6 g o r i e s d ' o e u f s op6r6s au cour s du d 6 v e l o p p e m e n t p o s t - o p d r a t o i r e .

M A T E R I E L E T M E T H O D E S

Les oeufs de Caurausius d6barrassOs de leur exochorion sont plac6s dans un verre de montre contenant de l'huile de paraffine vierge (Nujol), puis ils sont op6r6s et conserv6s sous oxygenation quotidienne (Vignau. 1967). Nous avons effectu6 2 s6ries d'op~rations microchirurgicales: ablation des territoires c6phaliques (Fig. 1) entralnant la suppression des glandes endocrines cOphaliques (= embryons "c6phaloprives") et amputation de patte d'une part, ablation de territoires abdominaux (= embryons "'abdominoprives") et section de patte d'autre part.

La suppression des territoires cOphaliques ou abdominaux est faite aux stades IV3-Vj (stade pr6coce: avant la formation des glandes endocrines; voir Haget et al., 1981, 1982), ou VIs (avant la fermeture dorsale, i.e. pendant la s6cr6tion de la 26me cuticule embryonnaire), ou encore VII1 (la 2 Ome s~cretion cuticulaire achev6e). L'amputation de patte est toujours rdalis6e aux stades VI~ ou VII1, e t a un niveau favorable, i.e. h la base du f6mur (Fournier, 1973) ou ?a titre de v6rification au niveau du tarse. Lorsque ['ablation de territoires c6phaliques est pr6coce, un dOlai de un mois environ s'6coule entre cette op6ration et I'amputation de patte.

Les op6rOs sont ensuite cultiv~s jusqu'~ ce qu'ils aient atteint au moins le stade VIII~ (i.e. le moment ofJ, chez un embryon normal, la patte amput6e pr6sente un r6g6n6rat typique = 20 jours environ). Toutefois, nous avons fix6 certains operas avant qu'ils n'atteignent ce stade. Nous avons donc pu disposer d'un large 6ventail de piOces fix6es au Bouin-Hollande (stades compris entre VII~ et VIIv).

Les caract6res morphologiques des embryons d6capit6s, pr6cisOs dans des publications ant~rieures (Cavallin et Fournier, 1981; Fournier et Radallah, 1983; Fournier, 1985; Radallah et Fournier, 1987) et que nous avons dgalement retenus ici sont les suivants: niveau de la fermeture dorsale, morphologie externe des appendices thoraciques, pigmentation du corps, s~cr6tions cuticulaires.

Nous avons pr6par6 4 s6ries de t6moins. Une premiere s6rie comprenait des oeufs avec des embryons intacts et mis en culture sous Nujol aux stades IV3-V~, VI~ et VII1. Les deuxi6me et troisi~me s6ries 6taient constituOes de c~phaloprives et d'abdominoprives opOr6s aux stades pr6cit6s, tandis que la quatri~me s6rie (= t6moins) correspondait h des oeufs contenant des embryons seulement amput6s d'une patte aux stades VIs-VII~. Nous avons observ6 et photographi6 les pi~ces d'op6rations aprOs utilisation de techniques classiques de microscopie photonique (fixations au Bouin-Hollande et colorations des sections s6ri~es h l'h~malum- 6osine; ou coloration ~ l'azan, d'aprOs Heidenhain, dans Gabe (1968) et de microscopie electronique, en utilisant comme agents contrastants le nitrate d'uranyle h 10% dans l'6thanol h 50 ° GL (Saito et Matsunaga, 1966) et le citrate de plomb (Venable et Coggeshall, 1965).

Nos dosages radio immunologiques (RIA) des ecdyst6roides ont 6t6 faits selon la mOthode de De Reggi et al. (1975), les d~riv6s iodOs et l'anticorps (anti-20-hydroxyecdysone-succinyl-HSA serum, r6f6rence L.III, 16-10- 74; dilution 1/50.000) 6tant gracieusement fournis par Immunotech Marseille, France.

R6g6n6ration des Pattes chez les Embryons du Phasme 223

a b o

FtG. 1. Diff6rents types d'op6rds (cephaloprives). (a) embryons priv6s de leurs lobes proc6phaliques (pl); (b) embryons priv6s de leurs lobes proc6phaliques et de leurs segments mandibulaire (md) et maxillaire (mx); (c) embryons priv6s de leur t&e enti6re. Grossissement 0.16mm indiqu6 par la barre

horizontale.

R E S U L T A T S 1. Embryons pr~cocement priv(s de leurs formations endocrines c~phaliques (aux stades IV3-V1) et amFuMs de la patte mOtathoracique droite (aux stades VI,s ou VII1)

Au total, 118 embryons sur 420 ont surv6cu aux 2 interventions (28,5% des cas), r6partis comme suit:

31 privOs de ieurs lobes proc6phaliques + segment mandibulaire, i.e. priv6s du cerveau (donc des cellules neuros6cr6trices de la pars intercerebralis) et des corps cardiaques,

27 privOs des lobes proc6phaliques, du segment mandibulaire et du segment maxillaire, i.e. priv6s 6galement des corps allates en plus des formations pr6c6demment citOes;

60 entiOrement dOcapit6s, i.e. priv6s de toutes leurs formations endocrines c6phaliques (Fig. 2). Cette op6ration comprend aussi l 'ablation du labium; ce qui entraine la suppression des glandes ventrales (= "glandes de mue", 6quivalentes chez d'autres insectes aux glandes prothoraciques).

Dans tous les cas, les sections d'appendices n'ont 6t6 suivies d'aucune rOg6n6ration. Etant donn6 le caract6re trbs pr6coce des ablations, r6alis6es avant mOme que les composants du syst6me neuroendocrine de la t6te soient form6s (Vignau, 1968; Haget et al., 1981, 1982), on peut garantir que les tissus de l 'embryon n'ont jamais subi l'influence d 'hormones symh6tis6es par ce syst6me.

2. Embrvons opOrOs aux stades VI8 et VII1 et subissant ~ la fois les 2 types d'ablations Suppression des formations endocrines c6phaliques et amputation de patte. (146

survivants pour 155 op6r6s = 94% des cas). Deux embryons seulement pr6sentent au stade VII4 un d6but de r6gOnOrat; ils avaient 6t6 imparfaitement amputOs de leurs lobes proc6phaliques (une moiti6 de ces territoires subsistant).

La proport ion d 'embryons c6phaloprives incapables de r6g6n6rer leur patte est 6crasante = 99% des cas.

224 B. FOVRNJER et J. ROGUEDA

FIG. 2. Embryon parvenu au stade VII4; il a 6t6 priv6 de tout son complexe neuroendocrine cdphalique au stade Vl, et, au stade VII~, la patte prothoracique gauche (fl6che) a 6t6 amputde/~ la

base du f6mur (fl~che). Grossissement 0.5mm indiqu6 par la barre horizontale.

3. Embryons priv(s d'une partie de leur abdomen puis amput~s d'une patte aux stades VIs ou VIII

Deux stades op6ratoires ont 6t6 retenus la suppression de l 'abdomen : IV3-VI, ou VIs -VII 1.

Le tableau 1 r6sume les r6sultats obtenus. Lorsque Fablation de l 'abdomen est faite pr6coeement, 30% des op6rOs survivent, alors que si l 'op6ration est faite au moment de la fermeture dorsale, on observe 60% de survivants.

Les capacit6s de r6g6n6ration varient en fonction des stades op6ratoires (Tableau 2), mais elles sont toujours sup6rieures ~ 20% des survivants. Les meilleurs r6sultats sont obtenus lorsque l 'amputation de patte a 6t6 r6alis6e au stade VIII1 (60% des cas).

On constate 6galement que le volume de territoire abdominal enlev6 a peu d'incidence sur les capacit6s r6g6n6ratrices des pattes.

4. Examens histologiques et ultrastructuraux des pi~ces d'op&ations Par rapport aux diff6rents t6moins, les op6r6s (c6phaloprives ou abdominoprives)

pr6sentent un retard de d6veloppement assez important, d6ja d6crit dans des publications ant6rieures (Fournier et Radallah, 1983; Fournier, 1985; Radallah et Fournier, 1987).

Les embryons privds ~ un stade prdcoce (IV3-Vl) de t6tes ou d 'abdomens effectuent leur fermeture dorsale et sdcr6tent leur deuxi~me cuticule embryonnaire respectivement 65 jours ou 56 jours apr6s la ponte, alors que les embryons contenus dans les oeufs intacts l 'atteignent au bout 46 jours (50 jours pour les oeufs d6chorionnds et cultivds sous Nujol, ~ partir du stade V1). Ce ddcalage est consid6rablement accru en fin de ddvelop- pement. Ainsi, le stade VIITb (= sdcrdtion de la cuticule larvaire) est seulement atteint

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226 B. FOURNIER et J. ROGUEDA

T A B L E A U 2 . S U R V I E ET CAPACITES REGENERATRICES DES PATI~ES C H E Z [.ES ABDOMINOPRIVES EN FONCTION DES

ST A D E S OPERATOIRES*

Stades d'ablation Stades d'amputation Nombre de Nombre de % Rdg6n6ration de I'abdomen des pattes survivants r6g6n6rats de patte

VI~ 38 8 21% IV3-V 1

VII1 17 11 64%

VIs VIs 30 12 40%

VIII VIIi 15 9 60%

*Le nombre des op6r6s est mentionn6 dans le tableau 1.

vers 152 jours pour les c6phaloprives et 98 jours pour les abdominoprives, au lieu de 76 jours chez les t6moins intacts.

5. Dosages radioimmunologiques L'examen des r6sultats (Fig. 3) permet de constater que t o u s l e s types de

c6phaloprives 6tudi6s ici produisent des ecdyst6ro'/des et pr6sentent~ comme les oeufs t6moins intacts, un pic d'ecdyst6ro'/des au stade VI8 et une chute du taux de ces substances dans la p6riode qui suit. A la fin du d6veloppement post-op6ratoire, les oeufs contenant les embryons priv6s de leurs lobes proc6phaliques montrent des taux d'ecdyst6ro'/des net tement plus b a s q u e les t6moins intacts et une brusque mais tardive remont6e de ces taux. En revanche, les 2 autres types d'op6r6s montrent une 61~vation progressive et importante des concentrations en edyst6ro'/des, plus pr6coce que les t6moins.

D I S C U S S I O N Les embryons de Carausius priv6s de leurs seuis lobes proc~phaliques puis amputfis

d 'une patte aux stades VI8 et VIIL sont incapables de r6g6n6rer celle-ci, quel soit le stade choisi pour l 'ablation de la t6te. Les r6sultats sont tout ~ fait identiques si i 'ablation des lobes proc6phaliques 6tait accompagn6e d 'autres territoires de la t~te. En revanche, chez les embryons du Phasme priv6s d 'une grande partie de l 'abdomen, les aptitudes r6g6n6ratrices des pattes amput6es aux stades VI8 et VII1 sont conserv6es chez les embryons du Phasme priv6s d 'une grande partie de l 'abdomen. L ' importance du choc op6ratoire subi par les op6r6s ne peut donc expliquer I 'absence de r6g6n6ration appendiculaire chez les c6phaloprives. Ce r6sultat est ~ premiere vue contradictoire de celui obtenu chez la Blatte par la m6thode des ligatures (Bulli6re et Bulli~re, 1974). D 'au t re part , le stade de la section de la patte n'est donc pas en cause (que ce soit pendant , ou aprbs une s6cr6tion cuticulaire), ni bien stir le niveau de la section.

Chez Carausius, on peut certifier que les tissus appendiculaires des jeunes embryons priv6s de lobes proc6phaliques n 'ont iamais 6t6 soumis/~ l 'action d 'hormones s6cr6t6es par le cerveau et (ou) les corps cardiaques (= neuros6cr6tions), les ablations de territoires c6phaliques ayant 6t6 faites ~a un stade pr6coce (IV3), c'est-~-dire bien avant la diff6renciation des glandes 6voqu6es (Vignau, 1968; Haget et al., 1981; 1982). De m6me,

Rdgdn6ration des Pattes chez les Embryons du Phasme 227

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FIG. 3. Niveaux des ecdyst6roides immunor6actifs (globaux) au cours du d6veloppement des oeufs de Carausius contenant soit des c6phaloprives, soit des embryons normaux (courbe ~_ tiret6s). L'~tge (en jours) atteint par les diff6rents types d'embryons est indiqu6 sur les courbes pour les op6r6s, ou en abscisse pour lcs t6moins. Les r6sultats fournis pour chaque stade correspondent 'a la moyenne statistique (6carl:s-types figur6s par des barres) des donn6es ~ partir d'un minimum de 8 6chantilhms. Les p6riodes de s6cr6tions cuticulaires (26me et 36me cuticulogen~:se, la 36me de type larvaire) sore

indiqu6es sur les figures, pmol/g: picomoles de 20-hydroxyecdysone 6quivalents par gramme.

228 B. FOURN1ER et J. ROGUEDA

les cdphaloprives totaux (i.e. ceux entihrement privds de leur t6te) n'ont jamais dtd soumis h l'action d'ecdyst6roides produits par les glandes spdcialis6es.

Chez Blabera, les opdrations de ligatures et ies sections de pattes ont 6t6 rdalis6es aprhs la fermeture dorsale (Bullihre et Bullihre, 1974). Rien n'emp6che de supposer qu'h ce stade opdratoire les glandes endocrines cEphaliques aient dEj~ sEcrEtE des substances hormonales dont la diffusion aurait trhs bien pu dEpasser le niveau de la ligature, pour 6tre m6me stockEes (?) dans un territoire du corps plus postErieur. I1 parait tout/~ fait Evident que l'ablation prEcoce des territoires cEphaliques est une operation plus radicale et plus st?re que ia pose de ligatures, aussi bien faite soit-elle. Les rEsultats opposes obtenus chez les embryons de Carausius et ceux de Blabera pourraient donc dEcouler d 'un protocole experimental different chez les deux insectes.

Selon Bullihre et Bullihre (1977), l 'aptitude ~a la rEgEnEration de la patte embryonnaire chez la Blatte est une propriEtE intrinshque des cellules Epidermiques de l 'appendice, et le facteur responsable du dEclenchement du processus serait la section elle-m6me. Par ailleurs, ces auteurs dEmontrent que l'61Evation des taux d'ecdystEroides au cours de la phase prEparatoire ou pendant la sEcrEtion d'une cuticule annule les capacitEs rEgEnEratrices.

Les oeufs de Carausius contenant des embryons cEphaloprives (et en particulier ceux wives des seuls lobes procEphaliques) prEsentent des taux d'ecdystEroides voisins de ceux des oeufs intacts, pendant une grande pattie du dEveloppement post-opEratoire, et principalement jusqu'aux stades VII3-VII4. En particulier, le taux de ces substances baisse trhs net tement au stade VIII, ce qui confirme des rEsultats antErieurs (Cavallin et Fournier, 1981; Fournier, 1985), laissant supposer qu'une substance stimulatrice de la production des ecdystEroides serait prEsente dhs le stade VIII dans les lobes procEphaliques. Nous renvoyons aussi ~ une publication rEcente (Radallah et Fournier, 1987) pour l 'explication des Eldvations progressives des taux d'ecdystEroides en fin de dEveloppement. Chez les oeufs contenant des embryons privEs au stade VIII de leurs seuls lobes procEphaliques et dont les pattes ont Et6 amputees au mEme stade (i.e. aprhs la sdcrEtion cuticulaire) il n'y a pas rEgEnEration. I1 s'agit lfa encore d'un rEsultat totalement diffdrent de celui obtenu avec la Blatte.

L'ensemble des rEsultats obtenus chez Carausius laisse donc supposer que le dEclenchement de la rEgEnEration (h l'inverse de l'aptitude ~ la rEgEndration) n'est pas une propriEtE intrinsbque des cellules Epidermiques. Certes, la section d'une patte peut constituer un stress stimulateur de dEclenchement d'une morphogenhse, mais dans la mesure o6 un autre facteur (peut-4tre d'origine nerveuse ou endocrine et localisE dans les lobes procEphaliques) serait present. Le r61e du systhme nerveux dans la rEgEnEration chez les Insectes est trhs controversE par les diffErents auteurs ayant abordE ce problEme,

I'inverse de ce qui est connu notamment chez les VertEbrEs. Si certains auteurs Emettent l 'hypothhse de Fintervention des seuls facteurs humoraux (comme les hormones de mue), d'autres au contraire attribuent un r61e prEpondErant au systhme nerveux (Niiesch, 1968; Boubersaoui et al., 1974). Chez Carausius, nos observations sont

FIGURE DU HAUT. Embryon privds de leurs seuls lobes procdphaliques (A) , i.e. de leur cerveau (cellules neuros6crdtrices + corps cardiaques).

FIGURE DU BAS. Embryons priv6s des lobes procdphaliques et de leurs segments mandibulaire et maxillaire ([]), i.e. de leur cerveau, des corps cardiaques et des corps allates; embryons priv6s de

toute leur t6te ((7)), i.e. de tout leur complexe neuroendocrine cdphalique.

R6g6ndration des Pattes chez les Embryons du Phasme 229

confor t6es par des r6sultats anciens m o n t r a n t l ' impor tance des nerfs moteurs (et plus pr6cis6ment celle des axones moteurs) dans la morphogen6se normale des pat tes e m b r y o n n a i r e s du Phasme (Fourn ie r , 1971). Le d6c lenchement du ph6nom6ne de r6g6n6ra t ion pour ra i t fitre tout s implement la cons6quence de la section du neff crural de la pat te .

En en l evan t le cerveau et les corps cardiaques, nous aur ions en quelque sorte rompu l ' int6gri t6 d ' u n syst6me de r6gulat ion faisant in te rveni r d ' une part l ' i n fo rmat ion en p rovenance du n iveau de l 'op6ra t ion , d ' au t re part la r6ponse favorable t ransmise par le cerveau dans les axones moteurs pour l ' accompl issement du ph6nom6ne de r6g6n6rat ion. T o u t ceci b ien stir s 'e f fectuant ~ l 'a ide de substances chimiques comme les neu ro t r ansme t t eu r s . L 'exis tence d ' u n tel facteur c6phalique agissant sur le d6clenche- m e n t de la morphogen6se r6g6n6ratr ice d ' une patte pourrai t 6tre faci lement v6rifi6e en tes tant (sous cer ta ines condi t ions) l 'act ion d 'extrai ts de lobes proc6phal iques (cellules

neuros6cr6tr ices du cerveau, ou corps cardiaques?) sur des embryons c6phaloprives amput6s d ' u n e patte .

Toutefo is , si nous sommes certains que chez les c6phaloprives les taux d 'ecdyst6roides sont comparab les ~ ceux des t6moins , il convient encore de d6 te rminer le n iveau de ces subs tances dans ies oeufs dont les embryons ont subi la double in te rven t ion microchirurgicale: suppress ion de la t6te et amputa t ion de patte. Des recherches sont en cours sur ce probl~me.

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