SHORT COMMUNICATIONS I()9

Isolement d'une polynucl6otide phosphorylase d'une bact6rie ana~robie stricte

Au cours des recherches concernant le r61e physiologique des polyphosphates d'Eub. sarcosinogenum, Ls 1 nous avons ~t6 amends ~ ~tudier la polynucl6otide phosphorylase, enzyme capable de catalyser in vitro la synth~se des polynucl6otides et leur phos- phorolyse en mononucl~otides 2

n X D P --,~ (XMP)n + nPm (I)

Nous dficrirons ici la m~thode de purification partielle de cette enzyme, extraite pour la premiere fois d'une bact~rie ana~robie stricte (Eub. sarcosinogenum, Ls) et (,tudierons quelques unes de ses propri6t~s.

Le milieu et le mode de culture ont 6t6 les mfimes que ceux indiqu6s ant6rieure- ment 1. Toutefois, la cr6atirdne a 6t6 remplac6e par le saccharose et un sel d 'ammonium a fit(~ employ6 comme source d'azote.

Les extraits bact~riens ont 6t~ pr@ar~s en soumettant des suspensions cellulaires (5 g (p.h.)/IO ml tampon Tris o.I M, pH 7.4) "k Faction du son (Raytheon 9 kc/sec) pendant 2o min. Aprbs centrifugation de IO min 5 2o,ooo ~. g, le surnageant a (td dialys6 contre un tampon phosphate o.oi M, pH 7.4.

L'activit6 enzymatique a 6t6 mesur6e, soit: (a) par l ' incorporation du a2P-orthophosphate dans les nucl6osides diphosphates

("r6action d'~change")2; (b) par l ' incorporation du [14C]ADP dans le polynucl6otide ad~rtylique a. L'activit6 sp6eifique a 6t6 exprim~e, soit par le nombre de t,moles de a2P-ortho-

phosphate* (test a), soit par le hombre de t,moles de [14C]ADP (test b) incorpor6s/mg prot6ine/h.

Consid~rant au d6but de ce travail que la "r6action d'~change" et la poly- m~risation 6taient catalys6es par la mfime enzyme, nous avons utilis6 cette premi~re r6action comme base de purification.

La purification partielle de l 'enzyme a 6t6 effectu6e par un fractionnement au sulfate d 'ammonium, suivi d'une chromatographic sur DEAE-cellulose, l'61ution 6tant faite avec un gradient de NaC1 en milieu neutre. Les fractions les plus actives ont dt( ~ r6unies et dialys6es contre une solution satur6e de sulfate d 'ammonium. Le pr6cipitd ainsi obtenu a 6t~ collect6 par centrifugation dans du tampon Tris o.oi M, pH 7.4.

Cette m6thode, qui n 'a donn6 qu'une purification d'ertviron IO fois pour l 'activit~ d ' "6change" et 2 fois seulement pour celle de l'incorporatiort du [~C]ADP dans les polynucl6otides, a fit6 cependant suffisante pour mettre en 6vidence la formation des diff6rents polym~res.

Le Tableau I montre les activit6s sp6cifiques de cette pr@aration mesur('e par les tests (a) et (b) en pr6sence de chacun des nucl~,osides diphosphates.

Les activit6s sp~cifiques d6termin~es sur chaque fraction ~ la sortie de la colonne de DEAE-cellulose ont montr6 que les maxima d'activit6 mesur~,e par 1' "6change" et

Abbr6viations: ADP, ad6nosine diphosphate; ATP, ad6nosine triphosphat:.; Tris, tris- (hydroxym6thyl)aminom6thane; DEAE-, di6thylamino6thyl-; UDP, uridine diphosphate; GDP, guanosine diphosphate; ARN, acide ribonucMique; s-ARN, soluble ARN; IDP, inosine di- phosphate: CDP, cytosine diphosphate.

* L'expression suivante a 6t6 utilisde pour le calcul de l '"~change" du a2p: coups/min in- corpor(" (/,moles P + /,moles ADP)/coups/min phosphato.

13iochim. ldiophys, dcta, 47 (1961) L99 2oz

2 0 0 SHORT C O M M U N I C A T I O N S

TABLEAU I

SP]~CIFICIT~ DE LA POLYNUCL~OTIDE PHOSPHORYLASE

Le m61ange r6actionnel (a) contenait: l'enzyme (environ i mg de prot6ine; tampon Tris, pH 8.i, ioo/2moles; K2HPO4, 5 /zmoles; 32p-orthophosphate, 2oo,ooo coups/rain; ADP (ADP/Pm = 0.7), 4/,moles; EDTA, 0. 5/zmole; MgC12, IO/,moles; volume final, 0.9 ml. Lorsqu'on a employ6 IDP, CDP, UDP ou GDP, leur rapport ~. l'orthophosphate 6tait de I.O pour les deux premiers et o.17 pour les deux derniers nucl6osides. Apr~s incubation de 20 min A 37 °, la r6action 6tait arr6t6e par addition de o.1 ml d'acide trichloroac6tique ~ 4 ° %. L'orthophosphate incorpor6 a 6t6 d6termin6 sur le surnageant, aprbs centrifugation, par la m6thode de BERNBLUM et al. a modifi6e a. Le m61ange r6actionnel (b) contenait : l'enzyme (environ 200/~g de prot6ine) ; tampon Tris, pH 8.1, 5 ° #*moles; [I~C]ADP ou [14C]ATP (Schwarz), 0.8/~mole, 2o,ooo coups/min//~mole; MgCla, I /zmole; volume final, 0.25 ml. Apr~s incubation de io min /~ 37 °, l'incorporation du

~I~C]ADP dans le polym~re a 6t6 d6termin~e par la m6thode de LITTAUER ET KORNBERG 3.

Incorpord Nucldotide ~ P " dchangd"

[~C]ADP [~*C]ATP

ADP 6.1 0.67 - - UDP 3.9 - - - - CDP 8.2 - - - - IDP 7.9 - - - - GDP 5.i - - - - ATP o - - o GTP 0.06 - - - - AMP o - - - -

par l ' incorpora t ion du I14C]ADP dans le polynucl~otide, se t rouven t dans des fractions

diff~rentes. Bien que la sfiparation complbte de ces deux activi t~s ne soit pas achev~e

par cet te m~thode, ce r6sultat semble indiquer n~anmoins que l 'on est en presence de

deux enzymes diff~rentes. Ceci est encore renforc6 par le fait que le rappor t 32p

~chang~/[14CJADP incorpor~, in i t ia lement ~gal ~ 1.4, devient ~gal ~ IO apr~s fract ion-

nement sur la colonne de cellulose*.

I1 est peu vra i semblable que la pr6sence de nucl~ase soit ent i~rement responsable

de cet ~cart, car, comme on le ver ra par la suite, cet te prepara t ion catalyse toujours la

format ion des polym~res, soit ~ par t i r de I 'ADP, soit £ par t i r des nucl~osides di-

phosphates ~ 4 bases diff~rentes.

Le Mg +÷ est indispensable pour les deux act ivi t6s: le m a x i m u m d 'ac t iv i t6 pour la

r~actiolt d '~change est obtenu avec un rappor t Mg++/ADP 6gal ~ 2.5. Ce rappor t

est de 0.2-0. 3 pour la synth~se m a x i m u m du polym~re.

Le N a F inhibe les deux act ivi t6s enzymat iques : i la concentra t ion de 5" lO-2 M,

il inhibe k IOO % la r6action d'6change, mais il faut une concentra t ion double pour obtenir cet te m~me inhibi t ion de la polym6risation. Cette inhibi t ion est ind6pendante

de la concent ra t ion en Mg ++. Les deux activit6s enzymat iques ont leur pH opt ima

situ6s dans des zones diff6rentes : aux environs de 8.0 pour 1' "6change" et de 9.0 pour l ' incorpora t ion du [14CJADP.

Les pr~parat ions enzymat iques conservent leur act ivi t6 pendant 4-5 mois ~ tous

les stades de la purification. La Fig. i mont re les cin6tiques de polym6risat ion ~, par t i r de I 'ADP, d 'une part ,

et du m61ange des nucl6osides diphosphates ~ 4 bases diff6rentes, d ' au t re part . Cette

* Une enzyme "d'~change", d6pourvue d'activit6 polym6risante a 6t~ r6cemment isol~e de la levure ~.

Biochim. Biophys. Acta, 47 (196I) 199-2o2

SHORT COMMUNICATIONS 2OI

polym6risation est mesur6e par la lib6ration du P min6ral au cours de la r6action en fonction du temps (r6action I), Le poureentage de phosphore lib6r6 est de 73 % k partir d 'ADP et environ de 5o % & part i r d 'UDP ou k par t i r d 'un m61ange & 4 nucl6otides (AGUC).

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2~ 40 g o = o Heures

Fig. 1. L i b d r a t i o n de Vor thophospba te au cours de la po lymdr i sa t ion . Le m61ange d ' i n c u b a t i o n con t ena i t : t a m p o n Tris, p H 8.1, 75 /zmoles; MgC12, 15/zmoles ; E D T A , 0. 5 /~mole; enzyme , 520 /zg de pro t6 ines (activit6 sp6cifique de 9 d ' ap r6s le t e s t (a) et 0.87 d ' ap r6s le t e s t (b)); la concen t r a t i on en nucldot ides 6 ta i t de: 2o / ,moles pou r chacun d ' en t r e eux, 5. l ' excep t ion de l 'essai 3 dans lequel on a mis s e u l e m e u t 4 / ,moles de G D P ; v o l u m e final, o. 5 ml. Une gout - te de to luene a 6t6 a joutde & c h a q u e tube . In- c u b a t i o n ~ 3 o°. Les prises son t effectu6es 5. dif- f6rents in te rva l les de t e m p s pour la d6 te rmi-

na t ion du P min6ral .

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Heures

Fig. 2. Inco rpora t ion du 3~P-or thophospha te au cours de la phosphoro lyse . Le m61ange d ' incu- ba t ion con tena i t : enzyme, 13o /~g protdines ; t a m p o n 32po4, p H 7.4 (3oo, °oo coups /min) ,

2 / , m o l e s ; MgC12, o. 5/zmole; poly A, o.35 #mole ; ou poly AGUC, o-3 m g ( tous l e s d e u x isoMs d'Eub. sarcosinogenum) ou A R N commerc ia l , 0 . 32 / ,mo l e ; ou s - A R N de levure, o. 4 #mole ; vo lume final, 0.2 ml. I n c u b a t i o n 5. 4 o°. Les prises son t effectu4es 5. diff4rents in terval les de t e m p s pour la

d6 t e rmi na t i on du 3~P-or thophospha te incorpor6 dans les nucl6otides.

Les diff6rents polym6res ainsi form6s ont 6t6 caract6ris6s par les faits suivartts: ils pr6cipitent en milieu acide et par l'alcool 6thylique; ils restent & l'origine du chromatogramme (solvant KREBS ET HEMS *) et ne sont pas dialysables corttre un tampon citrate-salin.

Les polym6res ont 6t6 ensuite isol6s par pr6cipitation 2 et, apr6s hydrolyse (I h dans HCl I N k IOO ° dans tubes scell6s), analys6s pour le contenu en bases par chromatographie sur papier 7. De m~me que dans le cas des enzymes d'Azotobacter 2 et de E. coli 3, il rt 'y a pas formation de polym6re & part ir de GDP seul, mais le polym6re form6 k par t i r de 4 nucl6osides diphosphates diff6rents (AGUC) contient les 4 bases, raises en 6vidence par chromatographie sur papier.

On voit sur la m4me figure qu'il y a une phase de latence lors de la poly- m6risation en pr6sence de 4 nucl6osides diphosphates k bases diff6rentes et que la diminution du GDP par rapport aux trois autres nucl6otides augmente la vitesse de la polym6risation.

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202 SHORT COMMUNICATIONS

La Fig. 2 montre ]a vitesse de phosphorolyse (rSaction I, de droite ~ gauche) des poly A, poly AGUC et de I 'ARN de diff6rentes sources. Le poly A est phosphorolys6 ~i 9O-lOO %, le polynucl~otide k 4 bases (poly AGUC) "X 20-25 ~o, I 'ARN commercial de levure ~ 4o-6o ~/o et le s-ARN de levure h 2o-3o %. 011 voit que la vitesse de la phosphorolyse de poly A est environ 4 £ 5 fois plus rapide que celle observ6e avec les polym~res £ 4 bases, ou que celle de diff~rents ARN naturels. Des observations similaires ont 6t6 faites avec la polyllucl6otide phosphorylase d'Azotobacter 8.

La purification ailtsi que l '6tude d 'autres propri~t6s de ces enzymes seront rap- port6s ult6rieurement.

lnstitut de Biologie Physico-chimique, Foundation Edmond J. TYSEN TILDON* de Rothschild, Paris (France) JEKISiEL SZULMAJSTER

1 j . SZULMAJSTER ET R. C. GARDINER, Biochim. Biophys. Acta, 39 (J96o) 165. 2 M. GRUNBERG-MANAGO, P. J. ORTIZ ET S. OCHOA, Biochim. Biophys. Acla, 20 (1956) 269.

U. Z. LITTAUER ET A. KORNBERG, J . Biol. Chem., 266 (1957) IO77. 4 I. BERENBLUM ET E. CHAIN, Biochem. J. , 32 (1938) 295. 5 M. GRUNBERG=MANAGO ETA. DEL CAMPILLO, communica t ion personelle. 6 H. A. KREBS ET R. HEMS, Biochim. Biophys. Acta, 12 (1953) I72. 7 g . R. WYATT, dans E. CHARGAFF ET J. N. OAVlDSON, ed., The Nucleic Acids, vol. I, Academic

Press, Inc., New York, I954. 8 M. GRUNBERG-MANAGO, J. Mol. Biol., 1 (1959) 24 o.

* Boursier Fullbright.

Re~u le 30 september 196o Biochim. Biophys. Acla, 47 (196I) 199-2o2

Reduction of viability of T2 bacteriophage with polyaldehydes

An irreversible inactivation of T2 bacteriophage was observed when the phage was incubated in the presence of polyaldehydes at somewhat elevated pH (8.5-1o.o) prior to contact with the host Escherichia coli cell. The presence of carbohydrate aldehydes in the cell wall of E. coli might make this observation pertinent regarding the mechanism of transfer of phage DNA to the bacterial cell.

The experiments were carried out in such a manner that the effect of the poly- aldehydes was restricted to the bacteriophage. The T2 bacteriophage was incubated in the presence of the various aldehydes in o.i M borate buffer solutions and this was followed by dilution and plating in normal a t tachment media. Incubation of E. coli with the amount of dialdehydes present after dilution, prior to uniting with untreated phage, did not result in decrease of viability of the bacteriophage.

The dialdehyde inhibitors were prepared from glucose or from polyglucose by periodate oxidation as described elsewhere 1. Periodate oxidation cleaves the carbo- hydrate structure between neighboring hydroxyls introducing two aldehydes into the molecule at each point of attack. Such characteristic structures, containing at least two aldehydes connected by covalent linkages, were found necessary to produce this inactivation; this was true whether compounds of low or high molecular weight were

Abbrevia t ion: DNA, deoxyribonucleic acid.

Biochim. Biophys. Acta, 47 (1961) 202-205