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JIB 2008 : Avancées en biologie moléculaire

Les JIB ont accueilli, en novembre 2008, la première Journée BioMi (Biologie Moléculaire Initiatives) accor-dant ainsi une place nouvelle et distincte à la biologie moléculaire dans ce cénacle de la biologie médicale. À la pointe de l’innovation, le diagnostic moléculaire a été évoqué dans ses multiples aspects scientifiques et sociétaux.RFL saisit cette opportunité pour présenter un dossier spécial dédié aux problématiques liées aux avancées en biologie moléculaire.

Lorsque Karl Mullis décida de mettre dans un même tube ADN nucléotides et ADN polymérase, il obtint la possibilité de repro-duire in vitro le savoir-faire d’une cellule vivante : l’hybridation et la polymérisation en chaîne. Ainsi, en jouant sur des variations rapides et importantes de température, et avec quelques artifices supplémentaires, des cycles répétitifs (amorçage, hybridation, polymérisation) étaient possibles. « L’aiguille cherchée dans une botte de foin devint une botte d’aiguilles » (sic), plus facile à étudier. La PCR était née.Moins de 20 ans plus tard apparaissent les puces (chips) permet-tant d’analyser l’expression de l’ensemble des gènes (transcrip-tome) ou les variants (polymorphisme simple nucléotide : SNP). De nombreuses sociétés (Affymetrix, Genechip Instrument System, Nanogen, deCODE, Agilent, Nimblegen), dominent ce nouveau marché évalué à plus de 4 milliards d’euros en 2010 !

Puce à ADN, principe, R & DUne puce est un support solide : verre, polymère, silicium, sur lequel plusieurs milliers de fragments d’ADN sont déposés par un robot miniature. Ils font office de sondes et seuls pourront s’y hybrider les fragments d’ADN-cibles complémentaires issus d’échantillons biologiques préalablement marqués en fluores-cence. Ainsi, une lecture optique (laser) est possible et quantifia-

ble sur une chaîne d’outils sophistiqués : microscope confocal, scanner, logiciel d’analyse et d’aide à l’interprétation.Ce concept de puces a évolué vers trois grandes classes :

arrays) avec dépôt direct de molécules-cibles sur le support ;

in situ des sondes ;

Lab on Chip) à micro-canaux à fluidique commandée par des microvalves, et sur lesquels s’effectuent les différentes étapes analytiques. À leur terme, il faut disposer d’un scanner dont le débit actuel est faible et le coût prohibitif. Alternative proposée : des transistors à effet de champ, trans-formant le signal biologique (hybridation) en signal électrique.Les techniques qui en dérivent sont déjà là : CGH : Comparative Genomic Hybridization, ChIP-chip : Chromatin Immuno Precipi-tation on chip, CGS : Comparative Genome Sequencing.La vraie révolution (déjà !) est dans la nouvelle approche : NGS pour Next Generation Sequencing. En deux mots cela signifie : 1 giga-bases simple brin séquencées en un seul run, ou encore 200 exons séquencés pour 100 personnes en simultané.

Arrêt sur imageLe profane est admiratif de ce génie humain qui lui offre un espace d’espérance : génétique et prédiction, voire guérison avant d’être malade. Le lecteur averti, scientifique et prudent, voit poindre plusieurs difficultés d’ordre scientifique, législatif, financier, éthique et épidémiologique.Les nanotechnologies délivrent tant d’informations que seuls des algorithmes puissants peuvent les colliger et les analyser. L’interprétation finale reste humaine et doublée d’une néo-compétence : le bio-informaticien, en attente d’une structure universitaire à la hauteur (telle qu’elle existe à la Faculté d’Or-say). Le bio-informaticien est obligé de limiter lui-même son champ d’action puisqu’il doit être en mesure de maîtriser la pathologie moléculaire des gènes explorés. Or la connaissance

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connaissance du résultat modifie-t-elle le comportement déci-sionnel ? Le délai de réponse est-il compatible avec la prise en charge ? Quelles sont les répercussions psychologiques et sociales de l’annonce ? Quel est l’impact de la prise en charge ? Quel est l’impact sur l’amélioration de la qualité de vie ?

-rable ? Le dispositif de soutien aux techniques innovantes et coûteuses (STIC) permet la mise en œuvre d’études médico- économiques.C’est en partie sur appréciation du service attendu que sont définies les conditions d’inscription à la NABM, et le rembour-sement d’actes. La procédure démarre par saisine de l’HAS, passe par la Commission de hiérarchisation des actes de biologie médicale (UNCAM), puis par le ministère (délai : 45 jours) avant publication au JO, procédure que les scientifiques eux-mêmes jugent trop longue.

Éthique et génomique, couple infernalLe bénéfice attendu concerne plus une population ou un groupe homogène qu’un individu. Ainsi, notre médecine basée sur la preuve est informative pour le groupe ET pour l’individu, elle efface l’ignorance, mais non l’incertitude : quels sont les sujets concernés ?Il y a en effet une distance entre la mise en évidence d’un facteur de risque et la démonstration de la morbimortalité qu’il impli-que… sauf pour un test à réponse binaire. Un cholestérol élevé n’implique pas un accident coronarien aigu, non plus qu’une élévation de la pression artérielle implique un accident vasculaire cérébral (AVC). Dans un contexte multifactoriel, tout est affaire de probabilité pour le groupe étudié, mais sûrement pas pour l’individu considéré dans son environnement propre.Ainsi, l’induction d’une maladie neurodégénérative de la souris est totalement maîtrisée. En revanche, si la souris modifiée est sortie de son morne univers d’animal d’expérience pour être placée dans une cage disposant d’une roue ou d’un labyrinthe d’accès à la nourriture, elle ne développe pas la maladie induite (et attendue), par absence des lésions supposées ou par absence de leur traduction clinique.Chez l’humain, cela suppose respect de son consentement éclairé (droit de savoir ou de ne pas savoir) et respect de son exigence de confidentialité, inscrits dans la qualité du dialogue médecin/ patient. Qualité d’autant plus assise sur la confiance réciproque que la connaissance médicale est large et robuste. Pour cela, il semble indispensable d’organiser une véritable coordination entre compréhension du mécanisme pathologique, développement de la molécule thérapeutique, test diagnostique et prise en charge globale.A contrario, la valorisation de la recherche impose une com-mercialisation la plus rapide possible pour répondre au double objectif du retour sur investissement et du développement de nouveaux axes de recherche. Dans cette course à l’innovation, plusieurs acteurs interviennent, dont les rôles sont parfois com-plémentaires et parfois contradictoires :

et plus vite,

risque de disparaître,

une politique forte d’innovation et de progrès, à son service.

scientifique et médicale actuelle est en retard sur l’information délivrée, d’autant que demain, l’état et le mode d’organisation du génome humain pourront être évalués en une seule phase d’analyse.Des offres de tests génétiques paraissent sur le Web : Navige-nics, 23andMe, deCODE…proposent à partir d’un écouvillon de salive un horoscope génomique. La prédiction hasardeuse, voire arnaqueuse, devient sinon arme de prévention du moins cause d’inquiétude ou d’incompréhension chez l’acquéreur du test (fort cher), induisant au moins une consultation du médecin traitant, non préparé. Sans oublier les recherches en paternité à partir d’un cheveu prélevé sur le cas-index, à son insu évidemment !

Nanotechnologies et tutellesLà encore, le potentiel d’une recherche pluridisciplinaire (phy-sique, chimie, génétique et informatique) donne à la technique une vitesse de croissance et des champs d’application tels qu’ils interpellent une société surprise qui réfléchit en termes économiques, éthiques et épidémiologiques.Force est de constater que les processus décisionnels évoluent lentement dans un contexte d’augmentation des dépenses sans financement corollaire. La directive 98/79/CE du 27 octobre 1998 a défini les DMDIV (dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) et les conditions réglementaires du marquage CE. Son annexe 2 mentionne les listes A et B des produits dont la cer-tification doit être délivrée par un organisme notifié. Le MDEG (Medical Devices Experts Group), groupe de travail sur les technologies émergentes (pré-commercialisation) et nouvelles (post-commercialisation) devrait favoriser l’entrée prochaine des nanotechnologies dans la liste des DMDIV.En France, l’AFSSAPS a mis en place une démarche d’évaluation des technologies médicales (ETM, ou HTA pour Health Tech-nology Assessment). Cette démarche vise 3 objectifs : micro, concernant les pratiques de soins, méso, concernant le mana-gement des établissements de soins, macro, concernant les caractéristiques de la politique de santé. Comme toute innova-tion, pour être inclus dans les soins, le diagnostic moléculaire doit être sûr, coût-efficace, et basé sur des preuves (evidence based medicine). Il s’agit d’évaluer le service attendu par étude méthodique des données disponibles, médicales, juridiques, éthiques et organisationnelles.L’ETM a retenu le modèle de Fryback & Thornbury, processus d’aide à la décision efficace et objectif, proposé en 1991 pour l’imagerie médicale, qui s’appuie sur 4 items d’évaluation :

rapport à la technique de référence ;

de la sensibilité et de la spécificité (VPN et VPP), des seuils de décision (courbes ROC) et de la robustesse ;

Puces à ADN

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Génomique et notion de risqueUne fois encore, si la prévention est la justification de la prédic-tion, encore faut-il distinguer le risque relatif et le risque absolu ; autrement dit raisonner en termes de populations ou de groupes à risque-tout en gardant à l’esprit la notion d’individu. C’est le rôle de l’épidémiologiste généticien, à qui la génomique (diag-nostic moléculaire) pose des questions spécifiques d’utilité et de pertinence face à plusieurs notions.Connaissance de l’importance des risques :

génome donné de développer la maladie à un âge donné,

d’un sujet du même âge et de même sexe sans facteur de risque, il mesure l’impact d’une caractéristique (mutation) au niveau d’une population.Efficacité des critères de dépistage basée sur :

mutées),

d’une mutation est la probabilité conditionnelle qu’un individu soit malade, sachant qu’il porte cette mutation ; la VPN, valeur prédictive négative d’une mutation est la probabilité condition-nelle qu’un individu ne soit pas malade, sachant qu’il ne porte pas la mutation.Existence d’une prévention efficace, même lourde : transplantation hépatique en cas de polyneuropathie amyloïde, annexectomie bilatérale, mastectomie bilatérale en cas de cancer du sein, dans des concentrations familiales de mutations BCRA1/BCRA2.Dans le cas des maladies à transmission mendélienne, le diag-nostic moléculaire a montré son utilité (maladies monogéniques du métabolisme), de même pour les formes héréditaires de maladies communes sous entité mendélienne (cancer du sein). Autant le diagnostic moléculaire (BCRA1/2) n’a guère d’intérêt – pour le diagnostic de la maladie – autant le diagnostic de prédisposition permettra aux individus indemnes une prise en charge adaptée (consultation de conseil oncogénétique).

Le diagnostic moléculaireQu’en est-il des facteurs génétiques de susceptibilité, dans quelle mesure le diagnostic moléculaire apporte-t-il une réponse utilile ?On peut considérer que le typage génétique n’a pas d’utilité médicale pour les individus indemnes trouvés porteurs de cette susceptibilité, du fait de la faible pénétrance en population. Ainsi, la majorité des cancers du sein est sporadique (absence de tout contexte familial), dans 5 à 10 % des cas une hérédité génomique dominante existe, liée à la transmission d’un gène majeur de fréquence allélique rare et de pénétrance forte (muta-tions de BCRA1/BCRA2).Des études genome wide sur le cancer du sein ont cependant désigné d’autres gènes candidats. BCRA1 et BCRA2 sont deux gènes suppresseurs de tumeurs (impliqués dans la réparation de l’ADN), localisés sur les chromosomes 17 et 13 respectivement. Hommes et femmes peuvent hériter et transmettre la mutation constitutionnelle de prédisposition au cancer du sein sur le mode autosomal dominant. Mais cette prédisposition n’explique que 5 à 10 % des cancers du sein (et de l’ovaire).L’étude de familles à risque héréditaire de cancer du sein non lié à BCRA1/BCRA2 suggère l’existence d’un système poly-génique complexe, non mendélien, pour expliquer le risque

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Représentation hélicoïdale de l’ADN.

Observation d’une puce ADN au microscope inversé.

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Bioingénérie : Dimère de RNase devenu insensible à l’action d’un inhibiteur de RNase.

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résiduel familial. La recherche d’un gène BCRA3 a jusqu’alors échoué. En revanche des gènes candidats de susceptibilité au cancer du sein ont été récemment découverts : CHECK2, ATM, PALB2, FGFR2.Gène ATMLocalisé en 11q 22-23, il code la protéine ATM qui participe avec BCRA1 (phosphorylation de la protéine BCRA1) à la réparation des cassures double brin de l’ADN par les radiations ionisantes. La mutation ATM homozygote est à l’origine de l’ataxie-atélan-giectasie ; il convient de proposer un test d’hétérozygotie aux femmes apparentées (mutation V2424G), quand une mutation de BCRA1 a été décelée.Gène PALB2La protéine PALB2 est partenaire de la protéine BCRA2 (stabi-lisation et localisation nucléaire). Elle contrôle la croissance et la division cellulaire. Des mutations mono-alléliques de PALB2 confèrent une susceptibilité accrue au cancer du sein (risque x2). Une dizaine de mutations de PALB2 ont été identifiées chez des sujets atteints de forme familiale de cancer du sein, avec pour conséquence la production d’une version tronquée de la protéine PALB2, de sorte que cette protéine défective ne peut plus participer à la réparation de l’ADN en association avec la protéine BCRA2.Gène FGFR2Il code une protéine qui s’insère dans la membrane cellulaire et participe au processus de signalisation de la croissance cellu-laire. Le gène altéré présente une affinité de liaison accrue avec des protéines intervenant dans la régulation transcriptionnelle, conduisant à une surexpression de la protéine FGFR2. Les mutations en cause n’apparaissent pas dans la partie codante du gène, de sorte que la protéine FGFR2 est sauvage, mais produite en quantité excessive, elle perturbe l’équilibre de la croissance cellulaire, augmentant le risque de cancer.

Nanotechnologies, génomiques structurelle et fonctionnelleLa génomique structurelle a pour objectif de déterminer l’en-chaînement des nucléotides constituant le génome de tout être vivant procaryote ou eucaryote. Ces séquençages sont ensuite intégrés dans des bases de données à la disposition de la communauté scientifique internationale, via le web. Le HGP (Human Genome Program) en est le meilleur exemple. Les puces à ADN permettent également sur un grand nombre d’individus d’analyser des séquences-cibles connues (reséquençage) afin d’en étudier le polymorphisme simple nucléotide (SNP).La génomique fonctionnelle, encore plus ambitieuse, consiste à découvrir le relationnel intergénique, c’est-à-dire mettre en évidence les dispositifs de régulation gouvernant l’expression génique et la fonction observée. Exemples.OncologieLe programme CIT® (Carte d’Identité des Tumeurs) a pour but d’identifier les altérations génétiques liées au développement des cellules tumorales, pour chaque tumeur et pour chaque patient. La base de données Annotator® collige les données cliniques, biologiques et les résultats des analyses génomiques par puces transcriptome et par puces CGH :

gènes sous forme d’ARNm : pour un gène déposé sur la biopuce Affymetrix, la réaction se mesure par un point de couleur, rouge en cas de surexpression, vert en cas de sous-expression du gène correspondant dans la cellule tumorale,

Comparative Genomic Hybridization) permettent d’identifier des altérations de structure en termes d’amplification (point vert) ou de délétion (point rouge) du génome de cellules tumorales comparées à des cellules normales, les ADN sain et tumoral étant marqués par des fluorophores différents, les points jaunes correspondant à des régions où n’existe pas de différence entre cellules saines et cellules tumorales.Pharmacogénétique et pharmacogénomiqueLa pharmacogénétique permet l’étude des variations interin-dividuelles (polymorphisme simple nucléotide), HLA B57 01/ABACAVIR par exemple et la totalité des gènes codant le méta-bolisme des médicaments. À l’échelle de l’individu, elle exploite son génotype (carte des SNP) pour personnaliser le traitement (le bon médicament à posologie appropriée).Autres applications

-tiques par criblage médicamenteux à haut débit (HTS : High Throughput Screening),

-tise médico-légale,

détection de traces d’OGM (sécurité alimentaire).

ConclusionsLa génomique est un fabuleux instrument de recherche, qu’il faudra savoir protéger de toute utilisation déviante. Rapidité et densité des informations colligées doivent être pondérées par un contrôle serein de la communauté scientifique, qui doit lui-même être reconnu par les tutelles et justifié par inscription à la NABM d’actes scientifiquement validés. Il n’est que temps d’y penser et d’agir. En revanche, les propositions de diagnostic génétique en libre accès devront être proscrites, car inutiles et dangereuses à la fois pour l’individu.

Claude NaudinBiologiste

(1) D’après les conférences présentées au symposium BioMi des JIB 2008 organisé par le Pr M. Vidaud, avec les Drs et Prs C. Montagnier-Pétrissans (CEDIT, APHP), C. Bonaiti-Pellié (INSERM U 535, Villejuif), M. Delpech (Biochimie et génétique moléculaire, CHU Cochin) et J.-C. Ameisen (Comité consultatif national d’éthique).

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