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1 JOURNEES SCIENCES ET TECHNOLOGIE LycéeBuffon PARIS 15 ème 13 14 MARS La biologie de synthèse, ou biologie synthétique, est un domaine scientifique et biotechnologique émergeant qui combine biologie et principes d'ingénierie, dans le but de concevoir et construire (« synthétiser ») de nouveaux systèmes et fonctions biologiques. Les domaines d’applications déjà très nombreux investissent les secteurs des recherches fondamentales et appliquées notamment la santé, l’agronomie, l’énergétique, mais également le domaine en plein essor des nanobiotechnologies. La biologie synthétique est donc un outil de recherche afin d’améliorer notre compréhension des principes gouvernant le fonctionnement du vivant : apprendre en construisant ; c’est aussi une stratégie pour construire de façon fiable des organismes accomplissant des fonctions biologiques complexes et répondant à diverses applications. Laurent BACRI (laboratoire Cergy-Evry) Thème de la conférence : Etude du transport d’objet biologique à travers des pores nanométriques. 1- Principe : Les pores nanométriques appelés aussi nanopores sont des protéines du type protéine canal insérées dans une membrane. L’ensemble permet de délimiter deux compartiments qui ne communiquent que par les substances pouvant traverser les pores formés par les protéines. L’α hémolysine de Staphylococcus aureus est une des protéines canal qui est la plus utilisée. Cette protéine synthétisée in vitro est intégrée dans une membrane lipidique qui sépare alors deux compartiments. Si on applique une différence de potentiel de l’ordre de 100mV entre ces deux compartiments contenant du KCl, on peut alors mettre en évidence la présence d’un courant d’une intensité voisine de 100pA : les ions K + et Cl - sous l’influence du champ électrique, traversent le pore formé par l’α hémolysine. Ce système peut être utilisé en plaçant dans un des compartiments une molécule capable de se faufiler dans la protéine canal. On mesure durant le temps du passage de la molécule, une baisse de l’intensité du courant du au caractère moins conducteur de la molécule comparé aux ions K + et Cl - . On parle alors de blocage du courant. Le temps de passage de la molécule, ainsi que la baisse de l’intensité du courant mesurée, sont caractéristiques de la molécule qui traverse le pore. Grâce à cette technique utilisant les nanopores et le blocage de courant, il est possible d’analyser et/ou de détecter une seule molécule spécifique. 2- Exemples de molécules transférées et applications : o Les acides nucléiques En 1996 : transfert d’une molécule de polyU. Selon le type de blocage, le sens de transfert de la molécule (3’ vers 5’ ou 5’ vers 3’) peut être déterminé. En 2006 : construction d’un nouveau nanopore. Il est constitué d'α hémolysine dans laquelle un adaptateur, la cyclodextrine, a été rajoutée. Cet adaptateur interagît de manière différente avec chaque base azotée créant ainsi des blocages différents selon le nucléotide qui traverse ce nanopore. Grâce à ce

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JOURNEESSCIENCESETTECHNOLOGIELycéeBuffonPARIS15ème1314MARSLa biologie de synthèse, ou biologie synthétique, est un domaine scientifique etbiotechnologique émergeant qui combine biologie et principes d'ingénierie, dans le but deconcevoir et construire («synthétiser») de nouveaux systèmes et fonctions biologiques. Lesdomaines d’applications déjà très nombreux investissent les secteurs des recherchesfondamentalesetappliquéesnotammentlasanté,l’agronomie,l’énergétique,maiségalementledomaineenpleinessordesnanobiotechnologies.Labiologiesynthétiqueestdoncunoutilderechercheafind’améliorernotrecompréhensiondesprincipesgouvernant le fonctionnementduvivant:apprendreenconstruisant;c’estaussiunestratégie pour construire de façon fiable des organismes accomplissant des fonctionsbiologiquescomplexesetrépondantàdiversesapplications.LaurentBACRI(laboratoireCergy-Evry)Thèmedelaconférence:Etudedutransportd’objetbiologiqueàtraversdesporesnanométriques.1-Principe:Les pores nanométriques appelés aussi nanoporessont des protéines du type protéine canal inséréesdans unemembrane. L’ensemble permet de délimiterdeuxcompartimentsquinecommuniquentqueparlessubstancespouvanttraverserlesporesformésparlesprotéines.L’αhémolysinedeStaphylococcusaureusestunedesprotéines canalquiest laplusutilisée.Cetteprotéinesynthétisée invitro est intégréedans une membrane lipidique qui sépare alors deux compartiments. Si on applique unedifférencedepotentieldel’ordrede100mVentrecesdeuxcompartimentscontenantduKCl,onpeut alorsmettre en évidence la présenced’un courantd’une intensité voisinede100pA: lesionsK+etCl-sousl’influenceduchampélectrique,traversentleporeforméparl’α hémolysine.Cesystèmepeutêtreutiliséenplaçantdansundescompartimentsunemoléculecapabledesefaufilerdanslaprotéinecanal.Onmesuredurantletempsdupassagedelamolécule,unebaissedel’intensitéducourantduaucaractèremoinsconducteurdelamoléculecomparéauxionsK+et Cl-. Onparle alors de blocagedu courant. Le tempsde passagede lamolécule, ainsi que labaisse de l’intensité du courantmesurée, sont caractéristiques de lamolécule qui traverse lepore.Grâceàcettetechniqueutilisantlesnanoporesetleblocagedecourant,ilestpossibled’analyseret/oudedétecteruneseulemoléculespécifique.2-Exemplesdemoléculestransféréesetapplications:

o LesacidesnucléiquesEn1996:transfertd’unemoléculedepolyU.Selonletypedeblocage,lesensdetransfertdelamolécule(3’vers5’ou5’vers3’)peutêtredéterminé.En2006:constructiond’unnouveaunanopore.Ilestconstituéd'α hémolysinedanslaquelleunadaptateur,lacyclodextrine,aétérajoutée.Cetadaptateurinteragîtdemanièredifférenteavecchaque base azotée créant ainsi des blocages différentsselon le nucléotide qui traverse ce nanopore. Grâce à ce

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nouveausystème,ilestdésormaispossibledeséquencerdessimplesbrinsd’ADN.En2015,cesnouveauxnanoporessontintégrésdansdepetitsappareilsportatifs.

Photo du séquenceur MinION (Oxforf nanopore technology®): séquenceur à usage uniqueintégrédansunecléUSBdontiltiresonalimentation.Laséquencedel’ADNissueparexempledu sang est directement transférée sur l’ordinateur (le tout 900$). La même technologie estdéveloppée chez le SmidgION (Oxforf nanopore technology®)qui lui se relie à un téléphoneportable.

o LesnanoanalysesetbiocapteursoubiomarqueursLes microARN (ou miARN) sont des ARN de petites tailles (18-24 nt), présentsnaturellement dans les cellules saines, qui sont capables de réguler l’expression post-transcriptionnelle des gènes. Ces petitsARN sont capables de s’hybrider auxARNmetd’empêcher alors la traduction de la portion correspondante de l’ARNm. Ces miARNinterviennent par exemple dans les cellules de peau où, en s’hybridant avec l’ARNmcodantpourdesprotéinesimpliquéesdanslaformationdusucgastrique,ilsempêchentsa formation. Inversement, dans les cellules de l’estomac, desmiARN s’hybrident avecl’ARNmcodantpouruneenzymepermettant la synthèsede lamélanine,etempêchentdonclasynthèsedelamélanine.Des travaux récentsmontrent que l’expression défectueuse de gènes dans les cellulescancéreusespourraitprovenirdel’absenceoudelasurabondancedecesmicroARN.Ilsemble que, pour un cancer donné, et à chaque étape de son évolution, les cellulescancéreusesprésententunesignaturedemiARNspécifiques.CesmiARNsontretrouvésdanslecytoplasmedescellules,maiségalementdanslesliquidesextracellulairescommel’urineoulesérum.Unesimpleanalysed’urinepourraitrévéler,grâceàl’analysedescesmicroARN, la présence d’un cancer et son stade de développement. L’intérêt de latechniqueutilisantlesnaoporesestqu’ellenenécessitepasl’amplificationpréalabledesmiARNetqu’elleestcapablededétecterlaprésenced’unetrèsfaiblequantitédemicroARN(del’ordred’unepicomole).Exemple:détectiondustadeprécoceducancerdupoumonà l’aidedecette techniqueavecunesensibilitéde81%etunespécificitéde87%grâceàlamiseneévidencede3miARN.o Applicationsfutures

Séquençagedeprotéines,séquençagedepolysaccharides.

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BernardLEBLEU(Professeur Emérite des universités)Thèmedelaconférence:«Nouvellesmodalitésderégulationdel’expressiondesgènesetdéveloppementdesbiotechnologiespourlasanté»Les mécanismes d’expression des gènes ont été découverts chez la bactérie E.coli (cf larégulation de l’opéron lactose par Jacob, Monod et Lwoff 1965). Chez les eucaryotes, desmécanismesderégulationdifférentsexistent.Ils’agit:

- des mécanismes permettant le contrôle épigénétique de l’expression des gènes(mécanismes conduisant à la décompaction de la chromatine pour permettrel’expressiondesgènes);

- del’épissagealternatifdesgènesquisontmorceléschezleseucaryotes;

- del’actiond’ARNinterférence.IlexistedanslescellulesdepetitsARNinterférents.Ils’agitdessiARN(ouSmallinterferingRNAcorrespondant à des petits ARN double brin) oumiARN (oumicro ARNcorrespondants à depetitsARNsimplebrin)quisontcomplémentairesd’ARNm.Ens’associantparcomplémentaritéà leurcibleetenrecrutantdesprotéines(complexeRISC), lescomplexesformésempêchentlatraductionouprovoquentladestructiondel’ARNmcible.(Pourplusd’information,consulterlavidéodelarevueNaturereviewgenetics:http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html ou http://svt.ac-creteil.fr/archives/Big_mag/Actualite/arn/arn.htm#)1-LesbiomoléculescommemédicamentsL’intérêtdesbiomoléculescomparéesàdessubstanceschimiquesbanales,c’estqu’ellespeuventagir demanière spécifique sur leur cible. Leur inconvénient, c’est qu’elles sont sensibles à ladégradation, qu’elles ne passent généralement pas les membranes, et que leur coût deproductionestrelativementélevé.Lespremièresbiomoléculesquiontétéutiliséescommemédicamentssontlespolypeptidesavecl’insulinerecombinante(voirtouteslesformesd’insulineproduites(lentesetrapides).Marchéenpleinessoravecl’augmentationdunombredediabétiquedanslemonde).Recherchesalternatives: insulineparvoieorale/pancréasartificiel/ transplantationd’ilotsdeLangerhans(thérapiecellulaire))2-LesacidesnucléiquescommemédicamentsDesADNpeuventêtreutilisésdansunbutdethérapiegénique.L’objectifestalorsderemplacerlegènedéfectueuxparungènesain.Exemple duGlybera (sociétéUniQure) pour le traitement d’un déficit familial en lipoprotéinelipase.Lathérapiegéniqueconnaitundéveloppementrécentgrâceàl’essordelatechnologieCRISPR-CAS9:cettetechniquepermetd’éviterlesinsertionsnoncibléesdugènemédicamentintroduitpuisquebaséesurleprincipederecombinaisonhomologue.Lastratégiedesanti-sens

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Cettetechniquepermetd’inactiverunecible.Lafixationd’unARNanti-senssurl’ARNmdontilest spécifique entraine le blocage de la traduction et/ou la destructionde l’ARNm (clivage del’ARNdoublebrinparlaRNAseH).Unedescontraintesmajeuredecettetechniqueestl’accessibilitédelacible(entréedel’ARNouADNmédicamentetnonaccèsdelaciblesireploiementdel’ARNm).Applications:Traitementdel’hypercholestérolémieavecdesARNanti-sensinhibiteurdel’ApoBTraitementdelaDMLAavecdesARNanti-sensquiseliespécifiquementaurécepteurdufacteurdecroissanceVEGF.Lerécepteurestalorsinactivéetl’angiogenèseinhibée.Lesoligonucléotidesetlacorrectiond’épissageL’objectificiestd’orienterl’épissagealternatifdel’ARNprémessageretderendresafonctionàlaprotéine.Application:chez10%despatientatteintdeladystrophiemusculairedeDuchenneilyapertedel’exonn°50cequientraineundéphasageducadredelectureetl’apparitiond’uncodonSTOP.Laprotéinerésultanteesttronquéeetn’estdoncplusfonctionnelle(ellenepeutplusformerunpontentre l’actineet lamembraneplasmique).L’idéeest icidediriger l’épissageà l’aided’unARNanti-senspourquel’exon51incompletsoitéliminéetquelaphasedelecturedetraductiondugènesoitconservée.Ladystrophineissudelatraductiondugènemodifiéestlégèrementpluspetitequelasauvagemaisconservenéanmoinssafonction.LesaptamèresC’estunoligonucléotide(environ20mers)quiprenduneconformationluipermettantdeselierà une autre molécule. Pour concevoir un tel aptamère, on construit une banqued’oligonucléotides synthétiques (il faudra par exemple synthétiser 420 oligonuclétides de 20nucléotidesdifférents).Onmélangeà cettebanque la cibleque l’on souhaiteneutraliser etonsélectionnepuisidentifiel’oligonucléotidequiinteragîtavecelle.Applications:anti-coagulant(aptamèredirigécontrelefacteurIXautilisépourletraitementdesthromboses),anti-inflammatoiresetc…

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LudovicJULIEN(Ecole normale supérieure Département de chimie)Thèmedelaconférence:«Défitschimiquesdelavie»LudovicJuliennousproposederéexaminerdesobjetsbiologiquesavecleregardd’unchimiste.1-Lacellulevueparunchimiste…Ilobservelacelluleets’interrogesurladéfinitionqu’unchimistepourraitdonnerdelacellule:

! Unecelluleestconcentrée;! Unecellulen’estpasuncorpspurmaisunmélangecomplexe;! Unecelluleestfragile:ellesynthétiseetdégradeàlafois;! Unecellulen’estpasconstante:elles’adapteauxcontraintesdumilieuextérieur;! Une cellule consomme en permanence de l’énergie: on a besoin de la nourrir pour

qu’elleexiste!(lechimistes’étonnecarlamatière,commeparexemplecelleconstituantlatablen’apasbesoind’êtrenourriepourexister).

! Unecelluleévolue,aunedynamiquesingulière(ellen’estpasfigéecommeduverre,pastotalementchaotique,maisenévolutioncontrairementàuncristaldeNaClparexemplequi lui ne change pas); Une cellule résulte donc d’une longue expérience chimique etcontinueàévoluer.

Unchimistesaitfabriquerdesmédicaments,synthétiserdessubstances….maisunecelluleàquoipeutellebienservirpourlechimiste?2-Lacellulevivanteest-elleuneciblechimiqueattractive?Enutilisant lespropriétésde lacelluledéfiniesprécédemment, lechimistepourraitutiliser lescellules pour fabriquer des biomatériaux auto-adaptatifs, des systèmes autonomes. Ellespeuvent être également utilisées pour effectuer des analyses (par exemple la qualité de l’air,qualitédel’eau).D’unpointdevufondamental, lacelluleestunobjetd’étudeintéressant:ellestocke l’information génétique et résulte d’un processus évolutif complexe: son étude peutpermettredecomprendresonhistoirephysico-chimiquecequirevientàcomprendrel’histoiredelaTerre!Ilestdoncintéressantpourunchimistedeconstruireunorganismechimiquevivant.3-LaviecommeundéfichimiquePourreproduirelavie,lesscientifiquesontcommencéparessayerdereproduirelesmoléculesquilaconstituent.Maiscen’estpassuffisantcarsionmélangecesmoléculesensemble,ilnesepasserien.Onnecréepasunestructure«vivante».Uneautrefaçond’étudierlavie,c’estdes’intéresseràl’organisationdel’énergie.L’objectifétantalorsdecomprendrelesréactions,lestransports,quigouvernenttoutescesmoléculesdansunsystèmevivant.Laviepeutêtredéfiniparunchimistecommeunmoyendedissiper,relaxerdel’énergie.Dans un système vivant,l’énergie se propage au travers dumétabolisme à partir desources primaires identifiées. Le métabolisme fait intervenir des catalyseurs qui ont pourobjectif de gouverner la cinétique des réactions chimiques et ainsi de changer le destin desmolécules.Cescatalyseursontpourrôled’orienter lesréactionschimiquesetde lesmaintenirdansunétatdistinctdel’étatthermodynamiquementstable.Lechimisteconsidèrealorsquedescycles,commelecycledeKrebs,nesontquedescatalyseurssurdimensionnésquipermettenticide dissiper l’énergie (ATP"ADP+Pi). Si on s’intéresse à la vie comme forme d’organisationd’énergie, elle peut donc prendre différentes formes et ne fera donc pas forcément appel auxmêmesbiomoléculesquecellesquel’onconnaîtsurTerre.Laquestionqu’onestendroitdeseposerest la suivante: quedoit-on rechercher surdesexoplanètespourmettreenévidence lavie?Pourlechimiste,onpeutconcevoirdesêtreschimiquesvivantssansforcémentfaireappelàunecellule, à une membrane: il suffit juste de fabriquer un système composé de réactifs et de

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produitsmaintenusdansletempshorséquilibre.Pourmaintenircetétat,cesystèmeconsommedel’énergie,énergieprimairefourniedansl’expérienceproposéeparlalumièred’unelampeparexemple.Latransitionentrelazoneéclairéeetlazonesombredélimitelesystèmeenévolutionpermanente.Oncréeainsiunevieminérale.Pourvoirlaconférence:https://webcast.in2p3.fr/videos-physique_et_chimie_de_la_vie

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Jean-LoupFAULON(Directeurderechercheàl’INRAdeJouyenJosas)Thèmedelaconférence:«Conceptionrationnelleenbiologiedesynthèseetingénieriemétabolique»1-LabiologiedesynthèseLa biologie de synthèse est avant tout une pratique dont l’objectif est de créer de nouvellesfonctionsbiologiques,encoreinexistantesdanslanature.Ellecomporteplusieursétapes:

1. Conceptiondelamoléculeàsynthétiserquis’effectueàl’aidedelogiciels;2. Constructionou synthèsequi s’effectue à l’extérieurdu laboratoireparune entreprise

privée3. Vérificationduproduitobtenu4. etéventuellementboucled’apprentissagepourmodifierlamoléculeconçueaudépart.

La biologie de synthèse est apparue dans les années 2000. Elle englobe un ensemble dedisciplines comme l’ingénierie métabolique, les bionanosciences; l’ingénierie des protéines;ingénierie des génomes (synthèse complète de génome), de génomes modifiés (XNAengineering),oudeminimalgénome; larégulationdescircuits; l’ingénieriedesgénomes(ex:synthèsedugénomedelevure):utilisationdeprotocellulesoudesystèmeacellulaires(extraitsde l’intérieur de la cellule pour produire des molécules in vitro présentant un intérêt, parexemple,diagnostic).2-L’ingénieriemétaboliqueLadisciplinedelabiologiedesynthèselaplusdéveloppée,etcepourdesraisonscommerciales,c’estl’ingénieriemétabolique.DéfinitionetapplicationsOn peut définir l’ingénieriemétabolique comme une stratégie ayant pour but demoduler lesvoiesmétaboliques existantes enutilisantdes techniques recombinantespour synthétiserdesnouvellessubstances.L’ingénierie métabolique a été utilisée depuis longtemps pour produire des métabolitesd’intérêt(sélectiondes souches de levures Sacharomyces cervisiae pour produite de la bière;sélection des souches de Clostridium pour produire de l’acétone). Les applications del’ingénieriemétaboliquesontaujourd’huinombreuses.Onpeutciterparexemples:

- lasynthèsedemédicaments- de biocapteurs (outils diagnostics) puis médicaments intelligents (synthèse de

médicamentsietseulementsilebiocapteurdétecteuneanomalie)- de biocarburants (pour faire du bioéthanol, les industriels utilisent la cellulose des

plantes. L’objectif est demodifier les plantes pour diminuer la lignine voire l’éliminerafind’obtenirunecelluloseplusaccessibleparlescellulases).

- Détectiondepolluantparlesbiocapteursetsiprésent,dégradationactivée.ExempledesbiosensorsLesbiosensorsontdessystèmesbiologiquespermettantladétectiondesubstancesspécifiques.Jean-LoupFaulonnousadécritdeuxtypesdebiosensorsoubiocapteurs:

! UnesubstanceXenseliantspécifiquementàunfacteurdetranscriptionmodifiépermetl’activation d’un promoteur qui contrôle l’expresion d’une protéine rapporteur parexempleleGFP.L’apparitiond’unefluorescencesignelaprésencedelamoléculeXdansunéchantillon.

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! Unaptamèreestunepartied’unARNmcapabledese lierdemanièrespécifiqueàuneautrepetitemolécule(unmétabolite).Cetteliaisonentrel’ARNetlemétabolitechangelastructuresecondairede la régionde l’ARNsituéeàproximité.Cette régionestappeléeplateforme. Le changement de la plateforme va moduler l’expression du gène dontl’ARNm est issu. L’ensemble aptamère et plateforme constitue un riboswitch. Lesbiocapteursbaséssurdesaptamèressontappelésaptosensors.

CouplageoutilsdiagnosticetmédicamentLa concentration en acide urique augmente dans le cas de crise de goutte. Des systèmesbiocapteurs/médicamentsontétédéveloppésdanslebutdedétecterpuisdeneutraliserl’acideurique présent dans les cellules. Ces systèmes sont constitués d’un facteur de transcriptionbactérienmodifiécapabledefixerspécifiquementl’acideurique.Unefoisformé,lecomplexesefixesurlepromoteuretactivel’expressiond’ungènecodantpourl’urateoxydase.L’acideuriqueestalorsdétruitparoxydation.CessystèmesontétéintroduitdansdescellulesHeLaetvalidéschezlasouris.3-Ingénieriemétabolique:lesdifférentesétapesdelarétro-synthèseOn part d’une molécule non naturelle, et on cherche les voies métaboliques permettant defabriquercettesubstance.3.1Premièreétape:ledesignaidéparordinateur(computerassisteddesign)On utilise les bases de données existantes (bases de données contenant toutes les enzymesconnues,leurssubstratsetl’affinitécoresspondante,l’organismecapabledelesfabriqueretc…)et la CAO (conception aidée par l’ordinateur). Les logiciels développés permettent de choisirsoit:lasuccessiondesvoiesmétaboliquespermettantàpartirdesubstratsnaturels,d’aboutiràlamoléculeXdésirée(voieforward)oulasuccessiondesvoiesquipartentdelacible(moléculeX)etquipermettentderemonteràdesmétabolitesnaturels(voieretro).On choisit ensuite les voiesmétaboliques lespluspertinentes en fonctionde critèresque l’onfixe.Deslogicielsadaptéspermettentdefairecechoix.Lescritèresretenusàclasserparordredeprioritésontlessuivants:Chezquelsorganismessontproduitslesenzymesintervenantdanslesréactionschoisies?Avecquellevitesselesréactionsont-elleslieu?Lesproduitsintermédiairessont-ilstoxiquespourlasouche?Lavoiechoisitproduit-ellelamoléculeXavecunbonflux?3.2Deuxièmeétape:lasynthèsedesenzymesCetteétapeestlaplupartdutempsenpartiesoustraitée.LesséquencesADNdesenzymessontobtenuesdanslesbanquesetfabriquéespardesentreprises.Lesenzymessontsynthétiséespargéniegénétique.3.3Troisièmeétape:laphaseanalytiqueetl’optimisationLesquantitésdemoléculesXproduitessontgénéralementfaibles.Lapremièreétape(design)doitdoncêtreaméliorée/optimisée:

- en détruisant par exemple certains gènes ce qui permettrait d’inactiver une voiemétaboliqueconcurrenteetainsid’augmenterlefluxdesynthèsedenotremoléculeX;

- en modifiant certaines enzymes ce qui permettrait d’augmenter la concentration deproduitsintermédiaires.

Avec l’automatisation de la phase analytique (robot pipeteurs), on peut désormais tester unecentainedevoiesmétaboliquesen15jours!

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4-Applications:L’ingénieriedebiocapteurs(Biosensorsengeneering)Onutilise lamêmedémarcheenutilisantdesbanquesdedonnéesquiregroupentdesfacteursdetranscriptioncapablesd’interagiravecdesmoléculesXquel’onsouhaitedétecter.Onutilisepourfabriquercesbiocapteurs:- un vecteur permettantla synthèse d’une enzyme capable de modifier la molécule que l’ondésire mettre en évidence et la synthèse du facteur de transcription liant la molécule ainsimodifiée.- un autre vecteur contenant un système de détectionc’est à dire un gène rapporteur dontl’expressionestactivéeetvisible(fluorescenceparexemple)lorsquelefacteurdetranscriptionaliéledérivédelamoléculerecherchée.Cesystèmeestutilisépourdétecterlacocaïne.Modifiéeparuneenzyme,ellesetransformeenacidebenzoïquequiestcapabledeselieràunfacteurdetranscription.Il existe aussiunbiocapteurde lanitroglycérinedéveloppé. Lanitroglycérine est transforméeparuneenzymeNemA.Leproduitforméestcapabledeselierspécifiquementsurunfacteurdetranscriptiond’E.coli.

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LaurentBLANCHOIN(DirecteurderechercheauCNRSCytomorphoLab,laboratoiredephysiologiecellulaireetvégétale,InstitutdeBiosciencesetdeBiotechnologie,CEAGrenoble)Thèmedelaconférence:«Delaconnaissancedel’auto-organisationduvivantàlaperspectivedebiologiesynthétique»1-L’auto-organisationduvivantTrois exemples peuvent illustrer la complexité, la diversité mais aussi la beauté de l’auto-organisationduvivant:L’organisationdesstéréocilsdel’oreille(400nm)faisantintervenirunréseau d’actine et demyosine : ces structures sont indispensables àl’audition. (si mutation dans le gène codant pour la myosine, lesstéréocilsnebougentplus,etl’animaldevientsourd).L’organisation à l’échelle de la cellule: les cellules nerveuses(celluleglialede30µm);Organisationàl’échelledel’organisme:lechouxromanesco(organisationfractale)Organisationà l’échelledeplusieursorganismes: bancdepoisson(structuredequelquesm)Principesgénérauxdel’organisationduvivantUn gène va permettre la synthèse d’une protéine qui se replie. Ces protéines s’assemblent etformentdanslacelluledesstructurescomplexes.Comment la dynamique de ce système est-il contrôlé? Comment ce phénomène est-ilcoordonné?Commentunobjetdequelquesnmvapouvoirgénérerdesstructuresdeplusieurscentainedeµm,dynamiquesetcoordonnées?Pour ces structurespuissent évoluerdans le temps, il fautmaintenir ces auto-assemblagesdemonomèreshorséquilibreetparconséquentapporterdel’énergieausystème.Exemple:pourcréer1µmdefilamentd’actineilfaut360moléculesd’ATPàlacellule.Trois principes vont intervenir dans le contrôle de l’assemblage du cytosquelettec’est à diredanslacréationd’uneauto-organisation:

1. Lacompétitionpourunnombrelimitéd’éléments;2. L’assemblage de polymères qui constituent de véritables routes dans la cellule

permettant le trafic: ces routes changent de direction selon les signaux que reçoit lacellule)

3. Lesforcesreçuesparlacellule.1.1 Lacompétitionpourunnombrelimitéd’élément

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Schizosaccharomycespombeest lemodèlechoisipourmontrer lanotiond’élémentprésenten quantité limitante dans la cellule. L’actine peut être marquée dans cette cellule parfluorescence(GFP-Actine).Troisstructurescomportantdel’actinesontvisibles:despatchesoupoints(intervenantl’endocytose),descables(assurantletransport)etunanneau(pourladivisioncellulaire).Sionajouteuninhibiteurquiempêchelaformationdespoints,alorsles cables serontprésentsenplusgrandnombredans la cellule.Onpeutenconclurequ’ilexisteunstocklimitéd’actinedanslacellulepermettantdeconstruiredifférentesstructures.Lacompétitionpourunnombre limitéd’éléments(ici l’actine)définit la tailleet ladensitédesdifférentesstructures(icicables;patchesetanneau).1.2 L’assemblagedepolymèresbiologiquesLes polymères biologiques ont des structures et donc des propriétés mécaniques etcinétiques différentes. Ainsi le polymère d’actine forme une structure flexible, qui secomporte un peu comme un ressort: il pourra exercer des forces dans la cellule ; Lemicrotubuleformédetubulineaunestructurerigide: il formeradesrailspourletransportdanslacellule;L’ADNluiaunestructurequiluipermetdesecompacter: ilpourrastockerunegrandequantitéd’informationgénétique.Ces trois structures illustrentbien la relationstructure/fonction puisqu’à chaque structure est associée une propriétémécanique et unefonctiondanslacellule.Sions’intéresseauxfilamentsd’actinedanslacellule,onvoitqu’ilspeuventêtreorganisésenréseaux(fibresparallèles)ouIn vitro, si on polymérise de l’actine, il se forme des filaments qui ne sont pas organiséscommedanslacellule.Onobtientdoncunauto-assemblagedel’actineenfilamentsmaispasd’auto-organisation de ces filaments. Il manque donc quelque chose pour organiser lesystème.Si par contre on impose des limites au système, on peut forcer les filaments à s’organiser.Pourcela,onutiliseunelamedeverrerecouvertedepolylysine-PEG(PLL-PEG)quipermetde rendre la surface hydrophobe et donc répulsive à la plupart des protéines. On bruleensuiteavecdesUVlesPLL-PEGsituésunezonedéfinieenutilisantunpochoir.Siondéposel’actine dans les zones dépourvues de PLL-PEG, on observe après polymérisation desfilaments organisés. Selon la forme du pochoir, les filaments peuvent s’organiserdifféremment. La géométrie de la zone délimitée par lesmicropatrons affecte donc l’auto-organisationdesfilamentsd’actine.Micropatronsréalisésenrouge

Auto-organisationdesfilamentsd’actineobtenus

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L’étape suivante consiste à construire un modèle mathématique, prenant en compte lesdifférentes contraintes du système (initiation, élongation, interactions) et qui permet deprédire comment les filaments vont s’auto-organiser en fonction du micropattern créé. Ilsuffitensuitepourvaliderlemodèle,decomparerlesrésultatsobtenusdansl’expérienceetleasimulation.Expériencedesimulation(enhaut)etexpérienceconfortantlemodèle(enbas)

Cemodèlepeut-ilprévoirl’auto-organisationdesfilamentsàl’intérieurdescellules?Siondisposeunecellulesuruntapisdeprotéineayantuneformedonnée(circulaireouenforme de croix), on peut voir que l’on contraint alors l’organisation des filaments d’actinedanslacellule.

1.3 L’utilisationdeforcesSi on exerce des forces sur une cellule (si on la presse), la cellule réorganise alors soncytosquelettecequiconduitàsondéplacement.

Comprendreces troisprincipesestdonc fondamentalpourcomprendre l’auto-organisationetladynamiqueduvivant.

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Levivantpeutêtredétournerpourgénérerdenouvellesstructures,denouveauxmatériauxquel’ondénommematériauxbioinspirés.2-Biologiesynthétique:Auto-organisationetbioinspirationEn2016,desfibresmusculairesontétésynthétiséesàpartirdetubesconstruitsàpartirdemolécules d’ADN (qui remplacent les filaments de myosine) et de kinésine (moteurmoléculaire).On peut imaginer utiliser les kinésines le long de filaments d’actine pour transporter deséléments,etlesdélivreràunpointprécis(précisiondel’ordredunm).L’auto-organisationdesfilamentsd’actinepeutêtreutiliséepourcréerdesformesen3D,quisontensuitemétalliséesetutiliséescommeconnecteursélectriques.

Conférenceenpartievisibleàl’adressesuivante:https://webcast.in2p3.fr/videos-physique_et_chimie_de_la_vieAvoir..unecoursedecellules!(Vmax=10µm/min)https://www.youtube.com/watch?v=RjYmy31znlI

ExtraitdeBio’actif(larecherchedeladirectiondessciencesduvivantduCEA)n°12/septembre2012