Kit du Débutant en « transparisation - RTMFMrtmfm.cnrs.fr/IMG/pdf/kit_du_debutant_en_transparisation... · 2019. 7. 8. · 2 CHARTE d’Utilisation du Kit du Débutant Ce document

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Kit du débutant

Kit du Débutant

en « transparisation »

Cellules tyrosine hydroxylase positives d’une glande surrénale d’embryon de souris « transparisée »

© David GODEFROY-Université de Rouen- Laboratoire Différenciation et Communication Neuronale et Neuroendocrine

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CHARTE d’Utilisation du Kit du Débutant

Ce document "Kit du débutant en transparisation" est à la disposition de quiconque souhaite s’initier à la transparisation d’échantillons biologiques, académique ou privé. Ce document est issu du travail collectif du Groupe de Travail préparation d’échantillons (sous-groupe Transparisation) du RTmfm (Réseau métier Technologique en Microscopie de Fluorescence Multidimensionnelle).

L’usage et la distribution du Kit sont libres, cependant la mention « clearing protocol have been initiated/facilited by the “ clearing kit for new users” from RTmfm (CNRS, France) » est nécessaire dans la rubrique remerciement des articles scientifiques ayant bénéficiés des conseils de celui-ci et/ou de(s) l'expert(s) de la cartographie.

Les retours d'expériences suite à mise en application des conseils du "kit" et/ou des experts sont vivement souhaités : [email protected]

Le GT Transparisation remercie vivement Matthieu Simion, Elodie Machado (TEFOR, Paris Saclay) pour leur contribution.

Le GT Transparisation :

Pierre Affaticati (TEFOR - Gif-s-Yvette), Geneviève Conéjéro (MRI-Montpellier),Romina D’Angelo (TRI/I2MC -Toulouse), Laurence Dubreil (APEX – Nantes), Orestis Faklaris (MRI-Montpellier), David Godefroy (DC2N-Rouen), Nicolas Goudin (Hôp. Necker-Paris), Thomas Guilbert (Cochin-Paris), François Michel (InMAGIC-Marseille)

Ce document est mis à disposition selon les termes de la Licence Creative Commons

Attribution - Pas d’Utilisation Commerciale - Partage dans les Mêmes Conditions 4.0

International.

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Table des matières

Accéder au monde de la transparisation.

Table des matières

A - Prologue ................................................................................................................................................... 4

B - Accéder au monde de la « transparisation » ............................................................................................ 6

1-Déshydratation et délipidation par les solvants organiques .................................................................. 6 1-1 - Solvants: 3DISCO et iDISCO+ .......................................................................................................... 6

2-Hyperhydratation .................................................................................................................................... 9

2-1 – CUBIC-1 .......................................................................................................................................... 9

3-Gel embedding + hyperhydratation ......................................................................................................14

3-1 – CLARITY ........................................................................................................................................14

4 –Simple immersion : RIMs refractive index matching solutions ...........................................................22

4-1 – TDE ..............................................................................................................................................22

4-2- RapiClear .......................................................................................................................................24

C –Et pour les plantes ? ................................................................................................................................26

1-Protocoles de transparisation pour les plantes : ..................................................................................26

1-1 ClearSee ..........................................................................................................................................26

1-2 TDE .................................................................................................................................................27

D – Comment observer les échantillons .......................................................................................................29

BIBLIOGRAPHIE .........................................................................................................................................33

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A - Prologue

Qu’est-ce que la « transparisation ? Pourquoi un échantillon biologique

n’est pas transparent, comment le rendre transparent ?

La « transparisation », dans le domaine de l‘imagerie, consiste à la mise en œuvre

de différents processus pour optimiser le passage de la lumière à travers un échantillon

biologique. On parle aussi de « transparisation » optique des tissus (TOC Tissue Optical

Clearing). En effet, un tissu biologique est opaque à cause de ses propriétés physico-

chimiques, plus particulièrement à cause de sa composition hétérogène en lipides,

glucides, protéines, qui se traduit par une grande diversité des indices de réfraction (IR)

responsable du « scattering » ou diffusion de la lumière. La présence de pigments qui

colorent certains tissus constitue un obstacle pour la lumière dont tout ou partie du spectre

sera absorbée à leur contact. Pour rendre un échantillon biologique transparent, la

stratégie visée dans les différents protocoles de « transparisation » est commune, elle

consiste à homogénéiser l’IR du tissu pour limiter la diffusion de la lumière et le décolorer

pour en limiter l’absorption

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Pourquoi rendre un échantillon transparent ?

La pénétration de la lumière dans le tissu biologique constitue une des limites de

la microscopie optique. Des développements technologiques tels que la microscopie

biphotonique ont permis d’améliorer l’imagerie en profondeur sans toutefois résoudre

entièrement le problème. D’autres stratégies ont été développées pour s’affranchir de

cette contrainte, en particulier en changeant les conditions de préparation des

échantillons. L’idée consiste à rendre transparent ces échantillons en minimisant les

différences d’indice de réfraction (IR) des échantillons par différents procédés chimiques.

Une fois l’échantillon transparent, les limites d’imagerie en profondeur sont repoussées

ce qui autorise l’imagerie tridimensionnelle d’un organe voire d’un animal entier.

Aujourd’hui, il existe plus de quarante techniques de « transparisation » des tissus

(Richardson and Lichtman 2015; Vigouroux, Belle, and Chédotal 2017; Susaki and Ueda

2016; Orlich and Kiefer 2018; Tainaka et al. 2016; Silvestri et al. 2016). Ils se différencient

par la nature chimique des composés utilisés, le degré de « transparisation » optique

atteint, leur capacité à préserver les dimensions d’origine des tissus, leur capacité à

préserver les marqueurs fluorescents. Le choix de la méthode peut varier selon la nature

de l’échantillon (taille, pigmentation, composition lipidique, organisation des protéines),

les techniques d’imagerie disponibles, le type de marquage analysé ou la résolution

attendue. Plusieurs techniques peuvent donner le résultat attendu mais certaines sont à

exclure d’office en raison de leur incompatibilité avec certains tissus ou certains

marquages.

Classiquement, les protocoles de transparisation sont divisés en deux grandes classes :

- ceux à base de solvants organiques les plus utilisés sont les techniques DISCO (Belle

et al. 2014; Renier et al. 2014; Pan et al. 2016; Masselink et al. 2019; Cai et al. 2019;

Dodt et al. 2007; Ertürk et al. 2012)

- ceux à base de solvants hydrophiles et qui comprennent les méthodes

d’hyperhydratation comme Scale/CUBIC (Susaki et al. 2015; Hama et al. 2011; Susaki et

al. 2014; Tainaka et al. 2014; Hama et al. 2015; Tainaka et al. 2018) , CLARITY/PACT

(Tomer et al. 2014; Chung et al. 2013; Yang et al. 2014; Sylwestrak et al. 2016), de simple

immersion comme SeeDB (Ke, Fujimoto, and Imai 2013), FRUIT (Hou et al. 2015), TDE

(Aoyagi et al. 2015; Costantini et al. 2015), ou encore des procédés utilisant des hydrogels

pour stabiliser les tissus (CLARITY/PACT et dérivés (Gradinaru et al., 2018), SWITCH

(Ehman et al. 2017). Une autre classification, « du point de vue du microscopiste » a aussi

été proposée par Silvestri (Silvestri et al. 2016).

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Dans ce « kit du débutant » vous trouverez différents protocoles de « transparisation »

regroupés dans 4 grandes familles, (1) déshydratation et délipidation par les solvants

organiques (2) hyperhydratation (3) simple immersion (4) enrobage dans un gel de

polyacrylamide suivi d’une délipidation.

-

Remarques :

La liste des protocoles proposés dans ce kit n’est pas exhaustive, elle permettra

cependant de donner une base aux utilisateurs souhaitant démarrer ce type d’approches.

Il est important de noter que chaque échantillon a des propriétés spécifiques pouvant

nécessiter une adaptation du protocole décrit dans ce « kit du débutant ».

Une cartographie d'expertise est disponible également sur le lien :

https://tefor.net/experts.html

Pour présenter différents protocoles de « transparisation », notre échantillon de référence

choisi est le cerveau de souris mais nous donnerons également des exemples

d’application sur les plantes.

B - Accéder au monde de la « transparisation »

1-Déshydratation et délipidation par les solvants organiques

1-1 - Solvants: 3DISCO et iDISCO+

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation” 3DISCO, iDISCO+

Les protocoles de « transparisation » 3DISCO (3-Dimensional Imaging of Solvent-

Cleared Organs) et (Immunolabelling-Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs)

utilisent des solvants organiques au cours des différentes étapes. Des précautions dans

l’utilisation de ces produits sont nécessaires, les étapes de changement de solvants

doivent être effectuées sous hotte de protection et les manipulations doivent être réalisées

avec les équipements individuels de protections (gants, blouse).

Les méthodes DISCO préservent mal les protéines de fusion des échantillons à

transpariser. Les protéines fluorescentes peuvent perdre tout ou partie de leurs propriétés

de fluorescence et ces protocoles peuvent nécessiter un contre marquage immunologique

(anti-XFP) afin de retrouver un niveau de signal significatif. Attention néanmoins, les

techniques de délipidation par solvant et de déshydratation, dont les méthodes DISCO,

vont provoquer un léger rétrécissement irréversible de votre échantillon en fonction de

la durée de la « transparisation », de la taille de l’échantillon traité et de la méthode utilisée

https://tefor.net/experts.html

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(de 0 à +/- 25 %). Par ailleurs, le tissu va se durcir et pourra devenir cassant. Un avantage

non négligeable de ce rétrécissement, qui est relativement isotrope, consiste dans la

possibilité de faire les acquisitions plus rapides et plus faciles car moins d’épaisseur en Z

et par conséquent un nombre de tuiles des mosaïques réduit.

b. Préparation des échantillons : Perfusion/Prélèvement/Préparation des tissus/organes

Les souris doivent être perfusées avec du PBS1X et du PFA 4%. Après dissection, les

échantillons sont post fixés une nuit à 4°C dans du PFA 4%, puis rincés dans du PBS1X

à température ambiante puis conservés dans du PBS1X à 4°C.

c. Les étapes du protocole de « transparisation »

c-1. 3DISCO

3DISCO Cerveau de souris

THF 50% 2 heures minimum ou ON

THF 80% 2 heures

THF 100% 2 heures

THF 100% 2 heures

DCM 100% 30 minutes

DBE 100% 3 heures minimum

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c-2. iDISCO+

iDISCO+ Cerveau de souris

MeOH 20% 1 heure

MeOH 40% 1 heure

MeOH 60% 1 heure

MeOH 80% 1 heure

MeOH 100% 1 heure

MeOH 100% 1 heure

DCM (2/3)/ MeOH (1/3) ON

DCM 100% 20 minutes

DCM 100% 20 minutes

DBE 100% 3 heures minimum

d. Considérations pratiques

Les solvants sont dilués dans l’H2O milliQ stérile.

Les échantillons doivent être placés dans 15 ml minimum de solvant.

Toutes les étapes se font sous agitation douce (rotateur, agitateur de plaque etc..).

Les plastiques utilisés doivent être résistants aux solvants utilisés.

Après l’étape de DCM 100%, l’échantillon doit couler au fond du tube.

Les échantillons sont conservés dans le DBE 100%, à température ambiante, à l’abri de

la lumière.

e. Liste des réactifs / matériels

Paraformaldehyde (VWR : 1.04005.1000) 4% dans du PBS1X

Tétrahydrofuran Anhydre≥99.9% (Sigma : 186562) : THF

Dichlorométhane (Sigma : 270097) : DCM

Benzyl éther (Sigma : 108014) : DBE

Méthanol (Fisher : A412SK-4) : MeOH

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f. Références Ertürk, Ali, Klaus Becker, Nina Jährling, Christoph P. Mauch, Caroline D. Hojer, Jackson G. Egen,

Farida Hellal, Frank Bradke, Morgan Sheng, and Hans Ulrich Dodt. 2012. “Three-Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs Using 3DISCO.” Nature Protocols 7 (11): 1983–95. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.119.

Renier, Nicolas, Zhuhao Wu, David J Simon, Jing Yang, Pablo Ariel, and Marc Tessier-lavigne.

2014. “Resource IDISCO : A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging” Im. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.010.

2-Hyperhydratation

2-1 – CUBIC-1

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation” CUBIC

Basé sur scale/CUBIC publiée en 2011 (Hama et al. 2011), la méthode CUBIC-1 publiée

en 2014 (Susaki et al. 2014; Tainaka et al. 2014) et ses variantes sont des méthodes de

« transparisation » optique utilisant historiquement l’urée comme agent de délipidation.

L’avantage de ces techniques résident dans le faible coût des réactifs, leur faible toxicité

et la simplicité du protocole de « transparisation » car nécessite peu de matériel

spécifique et peu de préparation de l’échantillon. Les méthodes CUBIC préservent assez

bien les protéines de fusion des échantillons à transpariser. Attention néanmoins, les

techniques d’hyperhydratation, dont les méthodes CUBIC, vont provoquer une légère

expansion de votre échantillon plus ou moins réversible en fonction de la durée de la

« transparisation », de la taille de l’échantillon traité et de la méthode CUBIC utilisée.

En 2018 Taikana et al. ont publié une étude comparative afin d’améliorer les méthodes

CUBIC (Tainaka et al. 2018).

La méthode décrite ci-dessous est la méthode CUBIC-1 utilisant un cocktail à base d’urée

comme solution de délipidation, appelé Reagent 1 (R1).


Dans le cas d’une « transparisation » d’organes de souris :

La souris doit être perfusée avec 20-30 ml de PBS1X contenant 10 U/ml d’héparine au

moyen d’une pompe péristaltique. Perfuser ensuite la souris avec 150 ml de PFA 4% en

PBS. Perfuser ensuite la souris avec 20 ml de PBS. Après la dissection, les échantillons

sont post fixés une nuit à 4°C dans du PFA 4%. Rincer les échantillons dans du PBS1X

à température ambiante puis conserver les dans du PBS1X à 4°C.

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Dans le cas d’une « transparisation » de souris adulte :

Perfuser la souris avec 20-30 ml de Reagent 1 (R1) dilué à 1:1 avec dH2O. Prélever les

échantillons d’intérêt et les immerger dans le R1 dilué au ½ pendant 6h sous agitation.

Enfin remplacer le R1 dilué au ½ avec du R1 frais. Incuber les échantillons overnight à

room temperature.

c. Les étapes du protocole

Procédure de « transparisation » rapide avec immuno-marquage (adaptée pour les embryons de

souris précoce d’environ 1 mm).

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Les temps d’incubation dans R1 et R2 peuvent être augmentés pour améliorer la

« transparisation ». Pour les observations microscopiques avec objectifs à indices

refractométriques adaptatif (cf. D) assurez-vous d’avoir ajusté les indices

refractométriques de votre gel d’agarose/R2, le R2 d’immersion du microscope et le R2

d’immersion du protocole de « transparisation ». Astuce : Ajouter de l’eau au R2

diminuera votre indice réfractométrie, le sucrose l’augmentera.


PBS 1X, 4 % PFA, 80 wt% Quadrol : stocker avec une dilution à 80 wt%, 12,5 g H2O

Millipore, 50g Quadrol

Jour étapes CUBIC-1

Jour 1 « transparisation »

4h en reagent-1 à 37°C

Bain PBS1X 3x >2h , ou 1x 2h et toute la nuit et le jour suivant à nouveau 2h

Jour 2 Immunomarquage Anticorps primaire

rinçage au PBS 1X

Blocage dans sérum de cheval (dilué à 10% dans du PBS/0.5% Triton) ou TNB

Incubation de l'anticorps primaire à 4°C dans du serum de cheval, ou à RT dans du TNB pendant 48h

Jour 4 Immunomarquage

Anticorps secondaire

Bain PBS1X/0.1% ; Triton 3x 10-15 min

L'anticorps secondaire seul ou avec DAPI est mis en solution de blocage à 4°C (sérum de cheval) ou RT (TNB) 24h

Jour 5 "transparisation"

Bain PBS1X/0.1% triton 3 x 10-15 min

Incuber l'échantillon dans le reagent-2 minimum 4h à 37°C

Jour 6 "transparisation"

Inclure les échantillons en gel agarose/ reagent-2

Conserver à 4°C overnight

Jour 7 Observation

Imagerie

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Four à 37°C, enceinte pour faire le vide.

Reagent-1 (R1) : mélange à 25 wt% urea, 25 wt% Quadrol, 15 wt% Triton-X-100 et dH2O

Solutions mères ou poudres C final ajouter unité

Urée 25% 12.5 g

Quadrol 80% 25% 15,6 g

dH2O 14,4 g

Solubiliser sous agitation en chauffant (~50°C) jusqu’à dissolution complète : obtention

d’une solution claire (minimum 30min)

Attendre que la solution soit à température ambiante avant de continuer

Triton X100 15% 7,5 g

Masse totale 50 g

dégazer la solution sous vide toute la nuit

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Reagent-2 (R2): mélange à 25wt% urea, 50 wt% sucrose, 10 wt% triethanolamine,

dH2O


Urée 25% 12.5 g

Sucrose 50% 25 g

dH2O 7,5 g

Solubiliser sous agitation en chauffant (~60°C) jusqu’à dissolution complète :

obtention d’une solution claire (minimum 30min)

Attendre que la solution soit à température ambiante avant de continuer

triethanolamine 10% 5 g

Masse totale 50 g

dégazer la solution sous vide toute la nuit

Agarose gel/R2 : milieu d’inclusion pour l’observation microscopique

Préparer 10% agarose en H2O (20ml)

Bien mélanger l’agarose dans l’eau sous agitateur

Faire fondre au micro-onde

(Après utilisation il peut être stocké et réutilisé après préchauffage à 70°C au bain marie)

Préparer e.g. 20ml du mélange agarose/R2 (peut être réutilisé plusieurs fois, juste

préchauffer le mélange à 60°C au bain marie)

Ajouter l’agarose liquide au R2 préchauffé et bien mélanger (amplitude d’agarose ajouté

entre 4 et 15%)

f. Références

Adapté de Gomez-Gaviro et al.

Remerciements pour Johanna Eiblweiser et Lara de Tomasi.

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3-Gel embedding + hyperhydratation

3-1 – CLARITY

a. Généralités (Différences entre CLARITY/PACT/PARS)

La méthode CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamid-hybridized Rigid Imaging-

compatible Tissue hYdrogel) publiée en 2013 (Chung et al. 2013; Tomer et al. 2014) et

ses variantes (Gradinaru et al. 2018; Yang et al. 2014; Sylwestrak et al. 2016) sont des

méthodes de « transparisation » optique des tissus. Classiquement elles sont

catégorisées dans les méthodes utilisant des composés hydrophiles (par opposition à

celles à base de solvants organiques) et ne requièrent pas d’étapes de déshydratation

des tissus. Le principe de base consiste en une élution (partielle) des lipides par le SDS

tout en assurant la préservation du contenu cellulaire en protéines et acides nucléiques

par pontage chimique. Ce pontage ou hybridation est obtenu par la polymérisation à 37°C

d’un hydrogel à base d’acrylamide. Dans sa version originale, l’élution des lipides étaient

réalisées activement par un système d’électrophorèse. Les protocoles dérivés utilisent

une élution « passive » des lipides soit par perfusion-recirculation (PARS) pour

« transparisation » les individus entiers soit par incubations longues (PACT). Ces

méthodes ont été optimisées pour les applications sur le système nerveux de mammifère,

classiquement sur cerveau adulte de souris. Néanmoins, ces méthodes ont été testées

avec succès sur de nombreuses autres espèces ou tissus. Il a été montré que les

échantillons traités subissent une légère expansion des tissus qui est réversible. Si le

but est de détecter une fluorescence endogène, les méthodes CLARITY/PACT/PARS

peuvent être utilisées mais elles peuvent altérer le signal. Suivant les situations, une

immunodétection peut être réalisée pour augmenter le signal fluorescent.

L’étape de solubilisation des lipides en SDS peut donc être réalisée activement

(électrophorèse, perfusion) ou passivement par incubation longue. Les principes de

l’électrophorèse (CLARITY) et du passive-CLARITY ou PACT sont décrits ici. Pour la

perfusion de l’animal entier (PARS), se référer à (Treweek et al. 2015).

L’étape de formation du gel d’hydrogel est commune aux différentes techniques.


Les monomères d’hydrogel (PFA, acrylamide, bis-acrylamide, VA-044 en PBS) sont

délivrés par perfusion cardiaque, l’organe d’intérêt est alors prélevé et laissé en incubation

pendant quelques jours dans une solution d’hydrogel pour permettre une distribution

homogène des molécules de l’hydrogel. Pour les petits organes ou échantillons il est aussi

possible de fixer les tissus frais en PFA sans perfusion, mais la perfusion assure une

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meilleure distribution des fixateurs et monomères d’hydrogel dans les tissus que la simple

diffusion.


Polymérisation du complexe tissue-hydrogel :

La polymérisation de l’hydrogel est initiée à 37°C par le VA-O44 et en l’absence d’oxygène

(l’oxygène qui inhibe la polymérisation est remplacé par de l’azote sous une cloche à

vide).

La taille des pores de la matrice ainsi crée peut-être ajustée en faisant varier les

concentrations d’acrylamide, de bis-acrylamide et de PFA : plus la matrice est réticulée

plus le tissu sera stable et les protéines préservées mais la pénétration des molécules,

notamment des anticorps sera plus lente.

Préparation de l’hydrogel :

Préparer 14 ml de solution d’hydrogel pour chaque échantillon.

Conserver les réactifs et échantillons sur de la glace pour éviter la polymérisation.

Préparer la solution d’hydrogel avec attention (dans la glace et sous hotte). Pour 60ml de solution d’hydrogel :


Acrylamide (40%) 4 % 6 ml

Bis-acrylamide (2%) 0,05 % 1,5 ml

VA-044 Initiator 0,25 % 150 mg

10X PBS 1X 6 ml

16% PFA 1 % 3,75 ml

dH2O 43,25 ml

Volume total 60 ml

Infusion dans l’hydrogel

Le PFA et l’Acrylamide sont des réactifs dangereux (CMR), potentiellement neurotoxique,

irritant, sensibilisant cutané. Eviter l’inhalation et le contact direct. Effectuer

obligatoirement la préparation des solutions sous hotte et avec des protections

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individuelles comprenant blouse de laboratoire, lunettes et gants. L’élimination des

déchets d’hydrogel doit être effectuée conformément aux réglementations

institutionnelles.

Transférer les échantillons dans des tubes coniques de 15 ml. Travaillez sur un

bac à glace. Ajouter 14 ml d’une solution d’hydrogel dans chaque tube.

Incuber à 4 °C sans agitation pendant 48h pour permettre à la solution

d’hydrogel de pénétrer dans l’échantillon.

Polymérisation de l’Hydrogel :

La polymérisation de l’acrylamide est initiée à 37°C (en présence de VA-O44) et permise

par le remplacement de l’oxygène (inhibe la polymérisation) par de l’azote. Pour dégazer

l’échantillon, utiliser un dessiccateur placé sous hotte, muni d’une pompe à vide et relié à

une bouteille médicale d’azote.

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Créer une atmosphère humide dans le dessiccateur en plaçant des petits

containers d’eau chaude dans le dessiccateur.

Ajuster la température à 37°C dans le dessiccateur.

Transférer les échantillons dans une boite de pétri de 60 mm de diamètre et

distribuer les échantillons dans des cassettes en utilisant des pinces ou un

pinceau. Transférer le moins possible de la solution d’hydrogel dans les

chambres. Il est également possible de transférer directement l’échantillon

dans une boite de pétri avec la totalité de la solution d’hydrogel.

Travailler rapidement et déplacer chaque cassette sous le couvercle une fois celle-ci terminée pour éviter le dessèchement. (Vous pouvez construire une petite boîte contenant une éponge humide pour contenir les cassettes et les garder humides).

Ajouter un contrôle de polymérisation dans un petit récipient rempli de solution d’hydrogel

Allumer la pompe à vide et faire le vide jusqu’à 50 bar

Fermer le robinet de la pompe à vide et ouvrir le robinet d’azote

Ouvrir le réservoir d’azote pour remplir complètement la chambre de dessiccation d’azote jusqu’à 0 bar

Répéter cette opération minimum deux fois

Laisser la polymérisation dans cette atmosphère d'azote à 37 ° C pendant 2 heures ou jusqu'à ce que l'hydrogel de contrôle (restant de la solution) soit polymérisé.

Préparation de la solution de « transparisation » :

Préparer une solution de SDS à 4% SDS, acide Borique 200mM = solution de

« transparisation ». Ajuster le pH à 8.5 (NaOH). La concentration de SDS peut varier

selon les applications, par exemple, pour des tranches de cerveau de souris adulte

ayant une épaisseur de 1 mm, on peut utiliser une solution de SDS 8%, acide Borique

200mM sans risquer d’abîmer l’échantillon. Filtrer la solution (0.22µm).

Ingrédient Final C Add unit

Acide Borique 200mM 12,37 g

Sodium Dodecyl Sulfate 4% 40 g

dH₂0 Fill to 1L l

NaOH To pH 8,5 l

Le SDS est un détergent puissant, toxique et irritant pour la peau et les voies respiratoires, il est important d’utiliser une balance de précision sous une hotte aspirante pour peser l’acide borique et le SDS, puis d’ajouter de l’eau distillée et d’ajuster ensuite le pH à 8,5. L’acide borique est classé reprotoxique 2 (CMR) par la Communauté européenne. Son

emploi est désormais règlementé.

https://fr.wikipedia.org/wiki/Reprotoxicit%C3%A9

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Lavage des échantillons :

Cette étape est effectuée pour laver les échantillons après l'étape de polymérisation afin d’éliminer le PFA en surplus, l'initiateur et le monomère non polymérisé.

Facultatif : nettoyer les échantillons avec un pinceau imbibé de solution de « transparisation » en faisant glisser l’échantillon sur un gant pour retirer mécaniquement l’excédent d’hydrogel en fin de polymérisation.

Retirer les cassettes du dessiccateur et les plonger dans un bécher rempli de solution de « transparisation ». Compter par exemple 20 mL par coupe de 1 mm de cerveau de souris adulte. Si les échantillons ont été mis directement avec la solution d’hydrogel, les mettre dans une cassette à cette étape.

Laver les échantillons avec la solution de « transparisation » pendant 24 heures à température ambiante.

Changer la solution et laver les échantillons une fois de plus pendant 24 heures à 37 °C.

Veiller à éliminer avec soin cette solution (risque biologique). A cette étape on peut choisir une élution des lipides active (adaptés aux gros échantillons, plus rapide, plus déformante, plus efficace) par électrophorèse avec les équipements décrits dans (Chung et al. 2013, Tomer et al. 2014) ou commerciaux (X-Clarity Logos biosystems) ou des variantes « maison » comme ici. Il est aussi possible d’opter pour une « transparisation » passive, plus longue (quelques jours à quelques mois !) mais plus respectueuse des tissus et adaptés aux petits échantillons (embryons, organes isolés, poissons-zèbre coupes épaisses de cerveaux). Solubilisation/élution des lipides :

Les lipides sont considérés comme la cause principale de diffusion de la lumière dans

l’échantillon et donc de l’opacité des tissus. La solubilisation et l’extraction des lipides est

réalisée par l’action d’une solution de SDS 4% (en tampon borate ou PBS) soit activement

par électrophorèse (micelles lipides-SDS chargés négativement) soit passivement en

ajustant les conditions de température et d’agitation de l’échantillon. Le temps d’élution

nécessaire à la « transparisation » varie selon la taille et la nature du tissu.

CLARITY : Elutions des lipides (micelles lipides-SDS) par électrophorèse (ETC):

La chambre ETC a été conçue et construite par Patrick Parra (atelier mécanique Neuro-PSI). Notre amélioration par rapport à la chambre proposée par le laboratoire Deisseroth et d'autres membres du forum CLARITY (clarity.org) réside dans l'utilisation de cassettes d'histologie à 6 puits permettant la transparence simultanée de 3 cassettes, soit jusqu'à 18 échantillons différents. Certaines parties sont conçues en impression 3D, d’autres sont usinées (cuve en plexiglass).

Configurer le système ETC comme suit :

19

En utilisant ce système de montage, la chambre ETC est alimentée en solution de « transparisation » par la sortie inférieure du tube, la sortie supérieure retourne dans la solution stock de « transparisation » (fiole Erlenmeyer) par la même pompe péristaltique (réglée sur 35 tours / min) à l'aide de 4 tubes, attention si vous utilisez seulement deux tubes vous videz la chambre ETC.

Vérifier l’étanchéité de la chambre en la remplissant de solution de

« transparisation ». Ouvrir le couvercle avec précaution et placer les cassettes

dans la logette réservée.

Clipser les rebords de la logette.

Insérez le couvercle dans la chambre inférieure, commencez à faire circuler la solution de « transparisation » dans la chambre et connectez l’alimentation en courant continu.

Appliquez 20 V (450-500 mA) sur le tissu à 37 °C pendant au moins 24 heures.

20

Une fois l’ETC terminée, les échantillons peuvent être conservés dans la solution de « transparisation » à température ambiante pendant au moins 2 semaines. Attention le SDS cristallise à froid !

Préparation des échantillons pour imagerie / nettoyage final:

Avant l'imagerie, laver l'échantillon avec 2 bains consécutifs de PBS-triton (0,1% de triton dans 1X PBS) pendant au moins 24 heures.

Incubation de l’échantillon dans le FocusClear/RapidClear ou solution à haut indice

de réfraction éventuellement en gradient.

Monter l’échantillon dans le milieu d’imagerie entre une lame de microscope et une lamelle couvre-objet séparée par un espaceur ou utiliser un objectif plongeant corrigé pour les indices de réfractions élevés.

Elutions passive des lipides (micelles lipides-SDS)

Cette méthode nécessite des tubes en verre de 300 mL et une rôtissoire à 37°C.

Après le lavage suivant la polymérisation, transférer les cassettes contenants les

échantillons dans un tube en verre rempli avec 300 mL de solution clarifiante. Au

maximum, 5 cassettes peuvent être en incubation dans le même tube en verre. Mettre les

tubes sous agitation douce à 37°C.

Vérifier tous les jours le degré de « transparisation » des échantillons en fonction de leurs

tailles. Par exemple, un cerveau entier de poisson zèbre au stade 6 semaine après

fécondation met un peu plus d’une semaine à devenir transparent, une coupe de 1 mm

de cerveau de souris environ 10 jours.

Marquage fluorescent (Optionnel)

Même si une partie de la fluorescence native est préservée dans ces techniques, il peut

être nécessaire d’effectuer un immunomarquage sur les échantillons notamment pour

amplifier le signal. Les anticorps sont des macromolécules qui diffusent très lentement

dans les tissus. Les protocoles de marquage pour les échantillons traités en CLARITY

varient évidement selon la nature (épaisseur, composition en lipide, présence de fibres

myélinisés). Par rapport à un immunomarquage classique sur coupe, les temps

d’incubation, les concentrations en détergent, la température et l’agitation sont augmentés

pour obtenir un marquage homogène du tissu. Par exemple, un immunomarquage sur

coupe 1mm de cerveau de souris peut durer environ 15 jours en fonction des solutions

de blocage et d’anticorps utilisées avec 10 jours d’anticorps primaire et 5 jours d’anticorps

secondaire. Il peut également être nécessaire de renouveler les solutions d’anticorps

21

primaires en fonction du marquage souhaité (épuisement dû à une grande quantité

d’épitope à reconnaitre).

Ces techniques sont compatibles avec l’hybridation in situ (Sylwestrak et al. 2016), dans

ce cas un pontage supplémentaire des acides nucléiques est réalisé grâce à l’utilisation

d’EDC (carbodiimide).

Homogénéisation de l’indice de réfraction

Le degré de « transparisation » finale est obtenue par l’échange de la solution de PBS

(IR=1,33) par une solution à haut indice de réfraction. Historiquement, l’homogénéisation

de l’indice de réfraction est réalisée par incubation dans le Focusclear (diatrizoic acid)

mais de nombreuses autres solutions commerciales ou « maison » sont disponibles et

permettent d’adapter l’indice de réfraction du milieu d’imagerie au tissu étudié et à

l’objectif utilisé.


Attention à la manipulation de l’acide borique, de l’acrylamide et du SDS car ce sont des

produits toxiques.


Acrylamide, SDS, Acide Borique, cassette, pompe à vide, hotte

Dimethyl sulphoxide (DMSO) (Carl Roth, catalog number: 4720.1)

Sodium bicarbonate (Carl Roth, catalog number: 0965.2)

20x PBS (Santa Cruz Biotechnology, catalog number: sc-362183)

16% formaldehyde (w/v), methanol-free (Thermo Fisher Scientific, Thermo ScientificTM, catalog number: 28908)

40% acrylamide solution in H2O (Sigma-Aldrich, catalog number: 01697)

VA-044 initiator (Wako Pure Chemical Industries, catalog number: 017-19362)

SDS pellet (Carl Roth, catalog number: CN30.3)

Boric acid (Carl Roth, catalog number: 6943.1)

Heated vacuum desiccator (VWR, SELECTA, catalog number: SELE4000474)

Vacuum pump (Savant, model: Gel Pump GP 110)

Histology processing cassettes (Simport, model: M503-12)

Refractometer (KRUSS Optronic, catalog number: DR 301-95)

22

4 –Simple immersion : RIMs refractive index matching solutions

4-1 – TDE

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation” (TDE)

Le protocole consiste à immerger l’échantillon dans une solution avec une concentration

croissante de TDE (2,2’-thiodiethanol), un dérivé de glycérol. Ce produit n’est pas toxique

et très peu cher. Il est souvent utilisé comme milieu de montage pour la microscopie de

fluorescence (indice de réfraction à 1.52 pour une concentration de 97%).Le TDE peut

être utilisé soit comme milieu de « transparisation » à lui tout seul, soit comme solution

de montage en fin de protocole CLARITY. A noter qu’il est possible de réaliser une gamme

de solution de TDE entre 60% et 100% pour obtenir des Indices de réfraction entre 1,47

et 1,52. L’utilisation d’un réfractomètre peut permettre d’ajuster l’indice de réfraction d’une

solution de TDE diluée dans du PBS à une valeur donnée.


Fixation de l’échantillon dans du PFA 4% puis immunomarquage ensuite si nécessaire.

Si le protocole est appliqué pour un organe entier comme dernière étape d’un protocole

type CLARITY, il vaut mieux perfuser la souris avec une solution de PFA 4%.

Indice de réfraction/ Concentration en TDE/deformation. Costantini et al., 2015

23


Le protocole est basé sur la simple immersion de l’échantillon dans le TDE. Attention à la

concentration du TDE. Des concentrations élevées peuvent donner un bon degré de

transparence, mais avoir pour conséquence une diminution de l’intensité du signal de

fluorescence. Une concentration de l’ordre 50-60% de TDE dans du PBS est la plus

appropriée.

Dans l’article de Constantini et al. 2015, le protocole débute par un premier bain à 20%

de TDE/PBS d'une durée d'un jour, puis un second bain à 47% de TDE/PBS pour deux

jours. A l'issu de ces trois jours, les échantillons sont conservés dans ce milieu de

« transparisation ».

Le temps d’incubation va dépendre de la taille de l’échantillon. On arrive à un plateau

d’efficacité de « transparisation » après 2 jours d’immersion dans le milieu, mais la

« transparisation » est efficace après 6h d’incubation.


Le protocole est simple et efficace avec une conservation de la fluorescence endogène

de la GFP ou autres protéines fluorescentes. Attention cependant à la concentration

du TDE car il peut être observé une réduction de taille des échantillons pour les

concentrations plus élevées, à noter que si l’imprégnation des échantillons se fait

progressivement dans des solutions de concentration croissante la taille des échantillons

reste inchangée.


Paraformaldehyde (VWR : 1.04005.1000) 4% dans du PBS1X

2,2’-Thiodiethanol (Sigma : 88561) : TDE

f. Références

Costantini, Irene, Jean-Pierre Ghobril, Antonino Paolo Di Giovanna, Anna Letizia Allegra Mascaro, Ludovico Silvestri, Marie Caroline Müllenbroich, Leonardo Onofri, et al. 2015. “A Versatile Clearing Agent for Multi-Modal Brain Imaging.” Scientific Reports 5: 9808. https://doi.org/10.1038/srep09808.

24

4-2- RapiClear

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation” RapiClear

Le produit RapiClear est un produit commercial. Il existe 4 types de RapiClear, avec des

indices de réfraction différents (1.47, 1.49, 1.52, 1.55). Pour des échantillons de petite

taille, ce protocole est très efficace. Il préserve le signal de protéines endogènes

fluorescentes. Il peut être utilisé comme la dernière étape d’une « transparisation » type

CLARITY. Le fournisseur ne communique pas sur les composés de ce produit.


Fixation de l’échantillon dans du PFA 4% puis immunomarquage ensuite si nécessaire.

Si le protocole est appliqué pour un organe entier comme dernière étape d’un protocole

type CLARITY, il vaut mieux perfuser la souris avec PFA 4%. Une post-fixation est

souvent utile (une nuit à 4°C), suivi d’un immunomarquage si pas de protéines

fluorescentes.


Avant « transparisation », une perméabilisation de l’échantillon est utile afin de faciliter la

pénétration du produit dans l’échantillon. Perméabilisation dans 2% TritonX100 (dilution

dans du PBS) une nuit à température ambiante sous une légère agitation. Ensuite

l’échantillon est immergé dans le produit RapiClear à température ambiante. Le volume

du produit doit rester plus important que le volume de l’échantillon. Les tranches fines de

tissu (100 µm) peuvent être observées après deux heures d’incubation. Pour des

échantillons plus épais, le temps minimum d’incubation est d’une nuit et peut être prolongé

plusieurs jours voire une semaine. La solution peut être réutilisée jusqu’à 3 fois. Le temps

d’incubation dépend de la taille et la nature de l’échantillon. Plus l’échantillon augmente

en taille plus on privilégie l’utilisation de RapiClear avec un indice de réfraction élevé (pour

les coupes indice 1.47, petits embryons indice 1.49 et pour de plus grands échantillons

indice 1.52). Les organes transparisés peuvent être conservés plusieurs mois dans la

solution de RapiClear avec conservation de la GFP.

25


Le produit n’est pas toxique. Il est relativement cher. Il peut être utilisé comme milieu

d’immersion pour les objectifs avec une bague d’adaptation. Le produit permet de

conserver la fluorescence endogène des protéines fluorescentes.

Pour économiser le Rapiclear, il est conseillé pour l’observation, d’isoler l’organe

transparisé, baigné dans la solution de Rapiclear en réalisant une chambre fermée. Une

solution pratique de montage consiste à couler une couche de silicone dans une boite de

pétri, attendre la polymérisation du silicone, creuser le silicone pour y mettre l’échantillon.

Recouvrir l’échantillon par une lamelle de verre et fixer la lamelle de verre avec du silicone

dentaire. Dans ce cas le TDE pourra être utilisé comme milieu d’immersion de l’objectif.

On adaptera l’indice de réfraction de la solution de TDE avec celui de l’indice de réfraction

de la solution de RapiClear utilisée pour transpariser (voir la publication de Costantini pour

connaitre la correspondance entre Indice de Réfraction et % de TDE).

Les produits RapiClear avec indice 1.47 et 1.49 n’ont pas d’influence sur la taille de

l’échantillon. Le produit avec indice 1.52 peut induire une légère augmentation de volume

de l’échantillon.

Bilan : Produit très efficace pour des échantillons de petite taille. Pour le reste, il vaut

mieux le combiner avec un autre protocole de « transparisation », comme le CLARITY.


RapiClear : www.sunjinlab.com

26

C –Et pour les plantes ?

1-Protocoles de « transparisation » pour les plantes :

Les tissus végétaux sont des échantillons difficiles pour l’imagerie en profondeur. La

cellule végétale présente en effet, une forte hétérogénéité d’indices de réfraction du fait

de la présence d’une paroi autour de la membrane plasmique, de vacuoles pouvant

stocker des métabolites primaires ou secondaires en grande quantité, de plastes et

d’organites de réserve, de pigments et de différents composés cytoplasmiques qui

interfèrent avec la lumière : par exemple IR = 1,42 dans la paroi, = 1,36 dans le

cytoplasme, ou même =1 dans les poches d’air présentes dans les racines ou feuilles de

certaines plantes.

Si l’hydrate de chloral (réactif de Hoyer) est efficace et a longtemps été utilisé, il ne permet

pas de conserver la fluorescence de la GFP et de ses dérivés. Les principaux protocoles

de transparisation que l’on trouve dans la littérature récente pour les organes végétaux

sont le ClearSee et le TDE. Des résultats intéressants ont été obtenus avec le Rapiclear

ou le Clarity (PEA-Clarity = plant-enzyme-assited) mais sur très peu de modèles

végétaux. Quelle que soit la plante, des essais préliminaires doivent être effectués pour

choisir le protocole le plus adapté, (immunomarquage, protéines fluorescentes, etc).

1-1 ClearSee

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation" ClearSee

Facile à mettre en œuvre, cette méthode permet de diminuer la fluorescence de la

chlorophylle tout en maintenant celle des protéines fluorescentes, et permet l’utilisation

de colorants spécifiques avant observation (CalcoFluor, Nile Red, Direct Yellow….).


Fixation des organes (ou morceaux d’organes) dans une solution de PFA 4% pendant 30

à 120 mn sous vide puis 3 rinçages au PBS 10mM pH 7,4 .

27


Les échantillons sont incubés dans la solution de ClearSee pour une durée de 4 jours à

4 semaines selon l’organe. Ils sont stockés à température ambiante. Une post-coloration

au Calcofluor ou avec le réactif Renaissance permet de colorer les parois avant

observation au microscope.


La solution est un mélange d’urée (25%), de xylitol (10%) et deoxycholate de sodium

(15%)

Références

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immunohistochemical method that does not require sectionning of plant samples.” Scientific reports, Nature‐ DOI:10.1038/srep42203

1-2 TDE

Le TDE peut donner de très bons résultats et est facile à réaliser avec des concentrations

comprises en général entre 50 et 80 %.

a. Ce que vous devez savoir sur cette “transparisation"

Après fixation au PFA 4% pendant au moins 1 heure sous vide et rinçage à l’eau, les

échantillons sont mis à incuber dans la solution de TDE, à température ambiante, mais

dans un premier temps, il est nécessaire de tester différentes concentrations en TDE et

différents temps d’incubation.

Exemple pour la tomate (jeune fruit de 1 à 2 cm de diamètre) : 1 semaine dans TDE 80%

puis acquisition des images sur coupes vibratome de 100 µM avec un multiphoton.

28

Références :

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29

D – Comment observer les échantillons

Objectifs

Pour imager des échantillons « transparisés » beaucoup de solutions d’imagerie sont

envisageables. Pour obtenir des images exploitables il est important d’identifier le matériel

dont on dispose et de vérifier qu’il répond à certains critères indispensables au type

d’échantillons à imager :

- la distance de travail (WD de l'objectif)) pour l’épaisseur d’observation

- l’ouverture numérique pour la précision

- la présence d'une bague de correction sur les objectifs pour les adapter à l'indice du

milieu d’immersion

- les objectifs ne sont pas tous compatibles avec les solvants utilisés.

Objectif bague

adaptative

Comment mesurer l'IR du milieu?

Pour mesurer l’indice refractométrique utiliser un Réfractomètre.

Refractomètre : Refracto 30GS (METLER TOLEDO),disponible aussi dans la valise

métrologique mise à disposition par le Groupe de Travail Metrologie du RTmFm.

30

Montages

Le montage est dépendant du type de microscopie et du type de système à disposition,

souvent ce sont des "fait maison". Nous vous donnons ici quelques exemples.

- Gels d’inclusion pour le Cubic (cf. pagXX)

- Montage pour un microscope droit

Immobilisation dans du Silicone

32

Tudor MANOLIOU, Impression 3D Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Paris

Impression 3D

Spacers

Petri + silicone

Laurence Dubreil Romain Florisson Nantes

Système Mavig : Joints de ≠ épaisseurs

Romina D’Angelo Toulouse

Systèmes Ibidi en silicone à détacher et

poser sur lamelle

Microscope

droit

Microscope

inversé

33

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