1

LA FABRICATION INDUSTRIELLE LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS DES VACCINS ET LEUR CONTRÔLEET LEUR CONTRÔLE

Jean FranJean Franççois SALUZZOois SALUZZOConsultant WHOConsultant WHO

2

1.1. LA FABRICATION DES VACCINS LA FABRICATION DES VACCINS

- La production de principe actif- La production de principe actif

- La mise sous forme pharmaceutique - La mise sous forme pharmaceutique

2.2. LA QUALITE DES VACCINS LA QUALITE DES VACCINS

3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE 3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE VACCINSVACCINS

3

Les Vaccins simples à usage Les Vaccins simples à usage humainhumain

Vaccins

bactériens

Vaccinsviraux

BCG

RougeoleRubéoleOreillonsVaricelleFièvre Jaune

Polio oraleRotavirus

VACCINS VIVANTS

Méningite Typhoïde Pneumocoque Haemophilus*

Coqueluche

Rage Polio inject. Hépatite A Encéphalitejaponaise

Grippe

Papillomavirus

Hépatite B

CoquelucheacellulaireDiphtérie Tétanos

VACCINS INERTES

Typhoïde

4

Fabrication d’un vaccinFabrication d’un vaccin

5

LES ACTEURSLES ACTEURS

Les bactériesLes bactéries

LLes viruses virus

Les cellules eucaryotesLes cellules eucaryotes ::

- pour productions virales

- pour production par génie génétique Hépatite B : levures ou cellules de Hamster chinois

POUR PRODUIRE DES VACCINS DE QUALITE, IL FAUT DISPOSER DE GERMES BIEN CARACTERISES ET DE PROPRIETES CONSTANTES

6

LE SYSTEME DES SEMENCES LE SYSTEME DES SEMENCES PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE

7

LA CULTURE DES BACTERIESLA CULTURE DES BACTERIES

SEMENCE : congelée ou lyophilisée

INOCULUM : repiquage sur milieux nutritifs (liquides ou gélosés)

PRECULTURE : petit fermenteur (quelques dizaines de litres)

- phase de croissance

CULTURE : fermenteurs de plusieurs centaines ou milliers de litres

- phase de croissance

- phase d'expression des antigènes

8

9

10

11

12

13

14

LA CULTURE DES BACTERIES LA CULTURE DES BACTERIES

• Milieux complexes (bactéries fastidieuses)

• Matières premières contrôlées (analyses, origine)

• Stérilité, asepsie

• Maîtrise des paramètres de culture

- temps - pureté pH

- température - numération

- pression - aspect des germes

- mousse - métabolites

- agitation - aération

15

LA CROISSANCE EXPONENTIELLELA CROISSANCE EXPONENTIELLE

16

17

18

Dans la culture des bactéries,Dans la culture des bactéries,on recherche : on recherche :

- de grands volumes

- une très forte aération

- une très forte agitation

- des milieux concentrés pour augmenter les

concentrations bactériennes

19

Les virus sont des êtres rudimentaires, parasites obligatoires des cellules. Leur culture implique nécessairement la culture préalable de cellules animales

Cellules animales

Culture cellulaire

Infection

Culture virale

Virus

LA CULTURE DES VIRUS LA CULTURE DES VIRUS

20

Les cultures de cellules Les cultures de cellules animalesanimales

1) Cultures sur organes

Ensemencement d ’œufs embryonnés de poule

- cavité amniotique : Vaccin oreillons

- cavité allantoïdienne : Vaccin grippe

2) Organes animaux mis en culture (cellules primaires)

- dilacération, trypsination des tissus animaux

(reins de singes, embryons de poulets)

ex. Vaccin rougeole

3) Cellules diploïdes à durée de vie limitée (origine embryonnaire)

Cellules MRC5 (vaccin rage)

21

Les cultures de cellules Les cultures de cellules animalesanimales

4) Lignées de cellules animales (cellules hétéroploïdes)

- cellules immortalisées (vero, MDCK, PERC6)

- multiplication sur des surfaces adhérentes

- ou multiplication sur billes ou en suspension (avenir)

Les lignées de cellules non-tumorigènes ne croissent que sur un support solide, et s'arrêtent de croître au contact les unes des autres

ex. : vaccins polio injectable et oral ; vaccin hépatite B ; vaccin rage ; vaccin rubéole ….

22

23

Dans la culture des cellules Dans la culture des cellules animales, on recherche :animales, on recherche :

- de grandes surfaces

- une faible aération, généralement accompagnée

de CO2

- une agitation faible ou nulle

- des milieux iso-osmotiques, c'est-à-dire dont l'osmolalité est

proche de celle du sang

(# 285 mmol/kg)

24

Récipients de culture virale :Récipients de culture virale :

25

26

27

28

29

30

31

La récolte des culturesLa récolte des cultures

- Soit: Elimination du milieu par centrifugation aseptique (coqueluche cellulaire, levures pour vaccin Hépatite B)

- Soit: Récolte du milieu et sauvegarde ou élimination des cellules par centrifugation ou filtration aseptique (antigènes solubles ou virus excrétés) : vaccin viraux

Note : dans ce dernier cas, on peut parfois effectuer plusieurs récoltes et renouvellements du milieu, si les virus ne sont pas lytiques

32

La concentration des antigènesLa concentration des antigènes

- par précipitation à l'aide de sels (sulfate d'ammonium) ou de solvants (éthanol, polyéthylène glycol) - [ex. anatoxines, polyosides]

- par ultrafiltration sur membranes filtrantes minérales ou organiques, à pouvoir de coupure calibré (pouvoir de retenir les grosses molécules) - 10 000, 50 000, 100 000, 300 000 daltons ex. : vaccin polio; rage.

33

La purificationLa purification

- BUT : Séparer les antigènes recherchés de l'extrait brut concentré obtenu après récolte.

- MOYENS : Procédé effectué par étapes successives, qui s'adressent à des propriétés spéciales de l'antigène, pour le sélectionner parmi la masse des autres composants.

34

La précipitation fractLa précipitation fractionnéeionnée

Exemple : - sels de calcium, d'ammonium

- solvants : éthanol, méthanol

polyéthylène glycol

Ici, on insolubilise tour à tour les différentes molécules présentes dans le mélange.

35

La chromatographieLa chromatographie

Technique Caractère discriminant

- échanges d'ions (propriétés électriques des molécules)

- hydrophobe (hydrophilie des molécules)

- gel d'exclusion (taille des molécules)

- affinité (attirance des molécules par un motif : ligand)

36

37

La purification - 3La purification - 3

L'ULTRACENTRIFUGATIONL'ULTRACENTRIFUGATION

Centrifugeuses soumises à des accélérations de plusieurs dizaines de milliers de fois la pesanteur terrestre ; on peut trier les molécules, en les sédimentant :

- par taille (ultracentrifugation de vélocité)

- par densité (ultracentrifugation isopycnique dans un milieu de densité croissante)

38

39

L'inactivationL'inactivation

Certains antigènes sont inoffensifs

- polyosides bactériens

- germes atténués (virus rougeoleux, BCG)

D'autres sont pathogènes

- toxines (diphtérique, tétanique)

- germes virulents (B. pertussis, virus rabique)

Pour ces derniers, une fois purifiés, il faut inactiver leur pouvoir pathogène, c'est l'inactivation.

40

L'inactivation L'inactivation (suite)(suite)

Par la chaleur (B. pertussis)

Par des agents chimiques (formol, Beta-propiolactone, …)

L'inactivation doit être totale, et respecter les structures immunogéniques de l'antigène.

41

SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000SARSSARS--CCooVV VaccineVaccine Inactivation BPL 1/4000Inactivation BPL 1/4000SARSSARS--COV VACCINE COV VACCINE

INACTIVATIONINACTIVATION

TimeInfectious titer

(Log TCID50/ml)T0 7,355' 6,631h 5,522h 4,344h

8h

24h BP

L In

activ

atio

n 1/

4000

No detectable virus after 8h

After 24 hrs viral amplification: no detectable virus

HPA/P23 (18L scale) Inactivation kinetic BPL 1/4000

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25 30

Time (hour)

infe

ctio

us tite

r (L

og T

CID

50/m

l)Detection limit

Plus de virus détectable après 8 h

Au bout de 24 h, test d’amplification : pas de virus résiduel

TempsTitre

Log TCID50/ml

Tit

re i

nfe

ctie

uxL

og

TC

ID50

/ml

Cinétique d’inactivation

Heure

Limite de détection

42

Les contrôles de qualité des principes actifsLes contrôles de qualité des principes actifsÉtapes Contrôles Qualité

matières premières

semences

cultures

récoltes

purifications

inactivations

ANALYSESANALYSES

ANALYSESANALYSES

ANALYSESANALYSES

ANALYSESANALYSES

ANALYSESANALYSES

ANALYSESANALYSES

Les temps de contrôle représentent souvent plus des trois quarts du temps de cycle de la fabrication

43

44

Le Service des mélangesLe Service des mélanges

- Réceptionne les différentes valences antigéniques

- Fabrique les valences vaccinales

- A l'aide de diluants, de stabilisants et d'adjuvants, formule le vaccin final vrac en un lot homogène qui est soumis aux contrôles d'activité.

L'ORDRE DES MELANGES, L'ASEPSIE, LA PRECISION DES MESURES, SONT PRIMORDIAUX POUR OBTENIR UN VACCIN DE QUALITE

45

46

47

Le Service de répartitionLe Service de répartition

- Lave et stérilise les contenants

- Prépare l'équipement de remplissage

- Connecte le produit vrac désiré

- Remplit le produit dans les récipients finaux : seringues, ampoules, flacons.

L'ASEPSIE DE TOUTES LES OPERATIONS, LA GESTION DES OBJETS DE REPARTITION, LA CHAINE DE FROID, SONT DES FACTEURS CRITIQUES DE LA REPARTITION.

48

49

La lyophilisationLa lyophilisation

Certains antigènes, tels les vaccins vivants, sont trop fragiles pour être gardés en dilution liquide, même au froid. On a alors recours à la congélation (B.C.G., vaccin polio oral) ou, plus souvent, à la lyophilisation.

La lyophilisation est la dessiccation d'une solution, congelée par évaporation de l'eau directement de l'état solide (glace), à l'état vapeur, sans passer par la phase liquide. Menée au froid et sous vide poussé, elle respecte les structures des molécules et des germes.

50

51

52

Le Service de conditionnementLe Service de conditionnement

- Définit l'emballage secondaire du produit

- Approvisionne les blisters, les étiquettes, les notices, les étuis carton

- Prépare les machines (étiqueteuses, emballeuses)

LES VIDES DE CHAINE, LA RIGUEUR DE LA COMPTABILITE DE TOUS LES OBJETS DE CONDITIONNEMENT, LA VERIFICATION DES TEXTES IMPRIMES SONT PRIMORDIAUX POUR ASSURER UNE FIABILITE DU TRAVAIL, PARMI UNE MULTIPLICITE DE PRODUITS FINAUX.

53

54

Caractéristiques propres aux Caractéristiques propres aux fabrications de vaccinsfabrications de vaccins

- Longueur des cycles de production

- Nombreux contrôles

- Origine des matières premières (traçabilité)

- Combinaisons vaccinales multiples

- Médicaments préventifs

Conséquences:

-Absence de génériques (établir une équivalence

biologique ou clinique)

55

Caractéristiques propres aux Caractéristiques propres aux vaccinsvaccins(suite)

- Souches pathogènes

- A-coups de production : (campagnes de vaccinations, épidémies)

- Fragilité des principes actifs complexes

- Asepsie

- Chaîne de froid

56

La chaîne de froidLa chaîne de froid

Les antigènes sont tous des molécules complexes,

fragiles.

La lyophilisation, les stabilisants, le froid visent à

garantir la stabilité, donc la qualité des vaccins.

57

La chaîne de froid s'applique La chaîne de froid s'applique partoutpartout

- Chez le fabricant

- Dans les expéditions

- Dans les entrepôts (grossistes, pharmaciens, médecin)

- Avant la vaccination (particuliers, dispensaires)

58

Lancement d'un nouveau vaccin Lancement d'un nouveau vaccin

6 7 8 9 10 11 122 3 4 510Années

INDUSTRIALISATION

PREUVE DU CONCEPT

PREUVE DU PRODUIT

Recherche

Développement

CONSTRUCTION DES INSTALLATIONS

Lots d'uniformité

Etudes de stabilité

Etudes cliniques phase IIILicence (AMM)

Production

MarketingVentes en Europe

Licences à l'étranger

Ventes à l'étranger

(essais sur animaux)

(cliniques phase I et II)

59