LA LACCASE ACIDE DES CHAMPIGNONS SUPE-

RIEURS. RELATION ENTRE LA PRESENCE DE CET

ENZYME ET LES CONDITIONS DE DEVELOPPE-

MENT CttEZ AGARICUS CAMPESTRIS

par

GILBEt~TE LEGI~AND ~5 GEORGES MARTIN

(Laboratoire de Chimie Agrieole et Biologique (Professeur LAVOL- LAY), Conservatoire National des Arts et M~tiers, 292 rue Saint-

Martin, PARIS III).

La laccase, 6tudi~e par GABRIEL BEt~TRA2N'D et DIDIER, BERTR=aND en France, par KETLI~T & MAhTN en Angleterre, est trgs r@andue ehez les v6g5taux: Pomme de terre, Betterave, Pomme, Chou et eham- pignons. Elle eatalyse l 'oxydation de substrats d'intgrgt biologique : para- et ortho-diph4nols, ~cide aseorbique (1), cyst6ine (2), cytochro- me (3). Elle pourrait jouer, chez les v~g6taux, ]e r61e de la cytoehro- me-oxydase chez les animaux et les levures. Elle coexiste frgquem- ment, en partieulier ehez les ehampignons sup~rieurs, avee la ty- rosinase.

Le travail qui fair l 'objet de Ia pr6sente communication met en 6videnee l'existence, ehez les ehampignons, d'enzymes anMogues la lacease, ayant les mgmes substrats, mais de pH optimum diff6- rent et montre que la presence d'une laccase acide ehez le champi- gnon de eouche d@end de la composition du milieu de culture.

Les tests utilis@s pour mesurer l'aetivit@ de la laeease sent: a) l 'oxydation de l 'hydroquinone, la quantit~ d'oxyg@ne absorb~

~tant mesnr~e par la m~thode manom6trique de Warbttrg. b) l 'oxydation du ga~aeol qui donne un produit eolor@ en rouge, la

t6tragaiacoquinone, dent la concentration peut 8tre d@termin~e photoeolorim@triquement (4). Cette m@thode, beaueonp plus sen- sible que la m6thode manom@trique, est nn moyen rapide de d6teeter la laecase.

PRESENCE D~UNE LACCASE ACIDE DANS LES CAt~POP~IOI%ES DES

CtIAMPIGNONS I~ECOLT:~S DANS LA NATURE

Environ cent espSces de ehampignons ont 6t5 examinges au cours de cette 6tude. La plupart des ehampignons riches en laeease sent du genre Lactarius. Le fair remarquable est que le pH opti-

521

m u m d ' ae t iv i t 6 de ee t t e laecase eat tr~s va r i ab le et s ' 6 tage en t re 3,5 e~ 7,2 s u i v a n t l 'esp6ce consid6r6e ( tab leau I) , le p H o p t i m u m de la lacease de l ' a rb r e g l aque & a n t 6,7 avee le gMaeol e o m m e s u b s t r a t (5)

TABLEAU ~.

Activi t~ et p H op t i m um de la lacease extraite du carpophore de diverses esp&es de champignons supdrieurs.* )

Act ivi t~ v i s -&vis Esp&e. p H op t i m um du gagacol (**)

Lactar ius plumbeu8 3,5 2100 ,, chrysorheus 3,7 950 ,, decipiens 3,7 210

Rus s u l a xerampel ina 4,2 1270 Lactarius pyrogalus 4,2 800

,, b lennius 4,2 700 ,, sub-duleis 4,2 450 ,, ser i f luus 4,2 88 ,, hepatieus 4,2 84, ,, camphoratus 5,2 1700

Rus s u l a sardonia 5,2 1100 Lactar ius vellereu~ 5,8 2000

,, quietus 6,0 2200 A garicus campestris 7,0 i500 Lctctctrius fu l ig inosus 7,2 1200

,, zonarius 7,2 1000

*) 5 g de ehampignon frais sent broyds avee du sable dana 50era a d'eaubidis- till6e. Apr~s eent, rifugation le Iiquide sumageant eat utilis4 eomme prdpa- ration enzymatique.

**) L'aetivitd de laeease eat exprim4e par le hombre de mierogrammes de ga/aeoquinone formge par heure et par 100 mg de poids frais (4).

Lea rgsu l ta t s du t a b l e a u I se r a p p o r t e n t g des p r6pa ra t i ons b r u t e s de t i ssu de e h a m p i g n o n homog6n4is6 dana de l ' e au bidisti l l4e (4), ma i s iI a 4t6 v6rifi6 sur p lus ieurs espgees que la pur i f ica t ion*) des

*) Lea prdparations brutes sent pr6cipit6es par le sulfate d 'ammonium ~ sa- tttcation; le prgcipit6 eat reeueilli et mis en suspension da.ns de l 'eau bidis- till6e; il se dissout partiellement. La suspension eat dialysde pendant 48 h centre de l 'ean bidistill6e. Apr~s filtration, on oJotien~ une liqueur parfaite- ment limpide ayant une forte activit6 de laccase.

522

Imm" O~ too l . . 0~ / hhS[. ~075,st.

~°diarnine

gaiacol

~ule "1J2 moL_O.,,,/ ~. " ~S'l. ,sulgst.

0 "I5 30 45 60 mn

Fig. t

Fig. 1. Oxydabion de divers substrats g pH 3,5 par une pr6paration purifi6e de L. Plumbeus.

C h a q u e fiole de W a r b u r g conbien~:

2 e m a de t a m p o n Mc I lwuine 0,5 crn 8 de p r @ a r a t i o n e n z y m ~ t i q u e 0,2 c m a de so lu t ion de subs t ra~ M/20 0,2 crn a de soude 10~o dans la cupule cent rMe.

523

preparations enzymatiqnes ne modifie pas la valeur du pH optimum

de ]a laccase.

L'enz:y~ne de Lactarius plumbeus a @t@ purifi~ et obtenu en quanti- t@ suffisante pour permettre de rechercher quelques-unes de ses propri@t@s : il oxyde, ~ p H 3,5, ia plupart des snbstrats de la ]accase: pyrocat@chol, hydroquinone, gaiacol, pyrogallol, p.ph@nyl@nedia- mine, acide ascorbique (fig. 1).

L'activit4 enzymatique baisse rapidement quand on 61~ve le p i t du milieu r@actionnel; elle devient pratiquement nulle ~ p i t 6,5.

On peut constater qne les laccases des carpophores des champi- gnons sup@rieurs out un pH optimum vari6. I1 en est de m~me pour les laccases du myc6Iium. D'apr~s les t ravaux de LI~DEBEnG, F~RAEUS & HOLM, le myc61ium de plusieurs espbces de champi~ gnons, notamment Polyporus zonatus, P. versicolor (6, 7) et ~laras- mius peronatus (8)cont ien ou s6cr~te une laccase dont le pH optimum va de 3,5 £ 5,5 suivant l'esp@ce.

La pr6sence d'une laecase acide chez les champignons semble donc 4tre fr6quente.

I ~ F L U E ~ C E DU M I L I E U DE CULTURE SUR LE p H OI)TI1V~UM DE LA

LACCASE CHEZ A. campestris.

Chez Agaricus campestris la Iaccase du carpophore est tocalis4e '& la base du stipe (9). I1 n 'y en a que des traces dans le chapeau. Son pH optimum est 6fi--7,0.

Le myc~lium cultiv@ dans l'industrie (myc~lium "industriel") en vue de l 'obtention du blanc de champignon est tr@s riche en laeease de p H optimum 6,5--7,0.

Nous avons recherch~ le pH optimum de la laccase produite par le myc@lium cuttiv4 sur milieu solide synth~tique et par le myc@lium a~rien ou submerg4 qui se d~veloppe en milieu liquide.

rR]~PARATIO:N DES CULTTJRES La composition de la solution nutritive utilis@e est la suivante :

glucose .............. 20 g

asparagine ............ 2 g S04Mg ......... 2.10 -3 M

S041Na2 ........ 2.103 M

PO4H2K . . . . . . . . 4.10 -3 IV[ 804C~ . . . . . . . . . . 0,5.10 -~ M

pour un litre de solution.

Fe ................. i mg Mn ................ 0,2 mg Zn . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 mg Cu . . . . . . . . . . . . . . . 0,050 mg Mo .............. 0,010 mg V ................ 0,010 mg

B .................. 0,1 mg

vitamine B I ......... 0,2 mg

Le pHest ajust4 g 6,5 avec de la soude.

524

Les m i 1 i e u x s o 1 i d e s ,,asparagine-glueose" sont eonsti- tu6s par 20 g de g61ose dissous dans un litre de la solution nutritive.

Les milieux solides £ la ,,Malt6a" sont constitugs par 20 g de g61ose + 40 g de MaltSa Moser du commerce dissous dans un litre d'eau bidistill6e.

Le milieu de culture est rgparti dans des flacons ~ large ouverture et st6rilis6. Aprgs refroidissement ehaque flacon est ensemene6 avee un petit fragment de mycglium ,,industriel".

Pour pr6parer les cultures sur m i l i e u x l i q u i d e s , la solution nutritive (25 cm 3) est introduite d~ns un Erlenmeyer de 100 cm a, st6rilis6e et ensemenc6e avee quelques fragments de mycg- lium submerg6. Le mye6lium submerg5 a 5t5 obtenu en dgposant un fragment de myc61ium, ,industriel" sur un disque de papier filtre plae6 /~ l'int6rieur d'un tube £ essai eontenant la solution nutritive de telle fa~on que le papier soit eonstamment humectg par eette solution, selon la m6thode de HELLE~ (10). Au bout de quelques jours on volt a, ppa,raitre au fond du tube et sur les patois des formations de myc61ium submerg6 provenant vraisemblablement de la germination des spores secondaires du myefilium agrien qui se d6veloppe sur le papier (11).

Ces cultures sont faites ~ l'6tuve 5~ 25°C et sont agitges p6riedi- quement pour favoriser l 'a6ration du milieu. Dgs que le mye61ium submerg6 atteint la surface, il prend la forme de mycglium a6rien.

I1 ~ 6t6 eonstat6 que, dans ees conditions, la laeease passe dans le milieu de culture. Une simple dialyse de ce milieu contre de l'eau bidistillge fournit une pr6paration enzymatique assez pure ne con- tena.nt pas de tyrosinase. L'activit6 de Ia lacease est d6terminSe sur uue partie aliquote de la solution dialys6e. La laeease a 6% re- eherch6e 6galement dans le myc61ium submerg6 et dans le my- e6lium a6rien.

Les elfltures jeunes sont souvent ineolores et le myc61ium a6rien qui commence 5~ se former est blanc. Les cultures gg6es sont sou- vent color6es en jaune et Ie mye61ium agrien pr6sente alors une teinte beJge-ros6.

~ESULTATS

La fig. 2 montre les eourbes de variation d'activitg de la laccase en fonction du pI-I pour diff6rentes pr@arations enzymatiques. Les cultures faites sur milieu liquide produisent une laeease dont le pH optimum est voisin de 5,6. Ce pH optimum est 6galement 5,6 pour les cultures sur milieux soIides ~ l'asparagine-glucose, mais it atteint la valeur 7,0 sur milieu solide ~ la 1Kalt6a.

Le d@!acement vers l'aeidit6 du p!-I optimum d'aetivit6 de la

525

"100

50

acfiv/td

/ / F / / ~ / / ~ \

2

5 6 7 PH

Fig. 2. Var i a t ion , en fone t ion du p i t , de l ' a e t iv i td de la lacease s@cr6t6e p a r d ivers m y c e l i u m s d' A. Campestris.

Le n o m b r e 100, sur l ' axe des ordonn@es, r ep r6sen te l ' a e t iv i t6 de la pr@para- t i on enz3~matique a u pI-I o p t i m u m .

C h a q u e fiole de V~arburg e o n t i e n t : 2 e m 3 de t a m p o n Me I lwa ine 1 em ~ de p r 6 p a r a t i o n e n z y m a t i q u e * * )

0,2 cm ~ d ' h y d r o q u i n o n e iVl/20 o o eourbes se r a p p o r t a n t a u x myc@liums d~velopp6s sur

mi l i eux l iquides . o. o eourbes se r a p p o r t a n t a u x mye@liums d@velopp@s sur mi l i eux solides. 0 o u r b e 1. Niyc@lium submerg6 cul t iv6 sur mi l i eu l iqu ide aspar . ~- gluc. C o u r b e 2. Niyc61ium a@rien eultiv@ sur mi l i eu l iquide aspar . @ glue. C o u r b e 3. Mil ieu de cu l tu re aspar . @ glue. off s ' e s t dgvelopp6 le myc@lium C o u r b e 4. Myc61ium cul t iv5 sur mi l i eu solide aspar . + gluc. C o u r b e 5. Myc@lium eultiv@ sur mi l i eu solide Mal t6a . C o u r b e 6. Mye61ium a@rien indus t r i e i eu l t iv6 su~ mi l i eu sol ide a u ]us de

fumier .

**) U n ce r t a i n poids de myc61ium frais es t holnog6n6is6 avec 10 fois son poids d ' e a u bidist i l l6e. Aprgs e e n t r i f u g a t i o n le l iqu ide s u r n a g e a n t es t u t i l i s6 e o m m e p r 6 p a r a t i o n enzs~qaatique.

526

laccase ne semble pas pouvoir 6tre attribu6/~ des conditions d'a6ra- tion diff6rentes des milieux de culture puisque le mgme pH op- t imum de 5,6 est observ6 avec le myc61ium submerg6 et le myc6- Iium a6rien des milieux liquides, ainsi qu'avec le myc61ium r6eolt6 sur un milieu solide.

I1 ne semble pas non plus que le p H du milieu de culture air une influence sur le pH optimum de la laccase s~cr~t6e. Des essais ont 6t6 fairs au eours desquels le pH initial du milieu de culture liquide avait 6t6 fix6 ~ des vMeurs vari6es comprises entre 7,2 et 4,0. Les cul- tures d6veloppges en milieu acide (pH inf. ~ 5,2) sont plus pauvI'es en lacease, mais le pH optimum de l 'enzyme sgcr~t6 reste voisin de 5,6 quel que soit le p H du milieu de culture. Au dessous d 'un pH initial de 4,0 environ, le mycglium ne so d4veloppe pas.

Nous remercions M. SA~AZIS¢, champignonniste, qui nous a fourni la souehe intiale de myeglium ,,industriel".

n ~ s s ~

I1 a gt6 montr6 clue los champignons sup6rieurs produisent une oxydase qui catalyse l 'oxydation des polyph6nols, de l a p . phdny- lgnediamine et de l'acide ascorbique en milieu acide. D'aprgs la nature des subtrats oxyd6s eet enzyme s'apparonte £ la laccase. Les diffSrentes valeurs du pH optimum des enzymes provenant d'esp~- ces diverses et qui s'gtagent entre 3,5 et 7,2 pourraient s'interpr6ter par la production, dans ohaque espgce ~tudige, d 'un m61ange en proportions vari6es de deux enzymes trgs voisins : une laccase ,,nor- male" et une laccase ,,aeide" qui ne se s@areraient pas au eours du traitement do purification mis en oeuvre. Le p i t opt imum de la lac- case produite par le myc61ium d'A. campestris cultiv6 dans les con- ditions habituelles est 7,0, mais, lorsque le myc61ium est eultiv6 sur terrains milieux synthdtiques, le p H optimum de la laecase synth6ti- s6e ost 5,6.

Ainsi, la production do lacease acide n'apparait pas comme une propri6t6 spgeifique, elle est en rapport avec la composition du milieu de culture.

S U M M ~ ' Y

I t is shown, that in higher fungi an oxydase is produced which catalyses the oxydation of polyphenols, of p-phenylene-diamine and ascorbic acid in an acid medium.

From the nature of substrates this enzyme is closely related to laccase. Different species of fungi show different values of the pH-opti- mum, between 3, 5 and 7,2 ; this could be interpreted by assuming that

527

every species contains a mixture of two related enzymes : a normal laccase and an acid laeease which could not be separated during the purification.

The pI-I optimum of the laeease of Agaricus campestris, cultivated in the usual medium, is 7,0; after cultivation in certain synthetic medium the pH optimum of the formed lactose is 5,6. Therefore the formation of an acid laeease is not a specific property but appears to be related with the composition of the culture medium.

ZUSA~CI:MENFASSUNG

Es wurde gezeigt, dass hShere Prize Oxydase erzeugen, die die Oxydation der Polyphenole, des p-Phenylendiamins und der Ascorbins~iure in sourer LSsung katalysieren. Die Natur der Sub- strate zeigt an, dass das Enzym mit der Laceasse verwandt ist.

]3as pH-Optimum des Enzyms ist je naeh der Pilzart versehieden, und liegt zwisehen den Werten yon pH 3,5 und 7,3 ; es wiire m.Sglieh die Versehiedenheit dieser Werte dahin zu deuten, d a s s e s sich je naeh der Pilzart um ein Gemiseh yon zwei sieh sehr nahe stehenden Enzymen handelt: einer "normalen" und einer "sauren" Laecase, die dutch I~einigung nieht trennbar sind.

Die Lacease, die - dureh dos Fiyzel vonAgaricus campestris geztich- tet - auf den fiblichen Ni~hrlSsungen gebildet wird, besitzt eine opti- male Aktiviti;t bei pH 7 ; diese optimale Aktivit~t liegt bei pH 5,6 wenn dos Myzel auf synthetischen Ni~hrlSsungen w~chst.

Die Bildung der "sauren" Laccase ist also in diesem FM1 keine spezifische Eigenschaft der Pilzart, sondern ist durch die Zusammen- setzung der N~hrlSsung bestimmt.

BIBLIOGRAP]:~IE

1. BERTRAND, D. 1945. Bull. Soc. Chim. biol., 27~ 396. 2. BERTICAND, D. 1947. C.R., 224~ 605. 3. BEI~T~AND. D., H. BELVAL ~5 G. LEGRAND, 1947. Bull. Soc. Chim. biol.,

29~ 607. 4. LEGRA~D, G., 1956. C.R. 243, 2167. 5. BE~TI~AND, D., 1944. Bull. Soc. Chim. biol., 26~ 40. 6. LINDEBE~G, G., & G. FA~AE~'S, 1952. Physiol. Plant., ~ 277. 7. FAm~E~TS, G., 1952. Physiol. Plant. 5~ 284. 8. LINDEB~nG, G., & G. HoL~, 1952. Physiol. Plant., 5~ 100. 9. LEGRAND, G., 1954. C.R., 288~ 375.

10. HELLE~, R., 1954. Ann. biol., 89~ 261. 11. I ( I ~ A s r , A. M., 1942. Amer. J . Bot., 2% 304.

528