La recherche et l'appui scientifique et techniquegoob.free.fr/iup/AFSSA/impression/laboratoire_complet.pdfLa recherche et l'appui scientifique et technique Site de Boulogne-sur-mer

La recherche et l'appuiscientifique et technique

Site de Boulogne-sur-merLaboratoire d’études et de recherches sur les produits de la pêcheDirecteur : Pierre Malle

Les partenariats développés les années précédentes ont été poursuivis, il s’agitnotamment des travaux réalisés avec l’Ecole nationale de la santé publique etl’Institut Pasteur de Paris dans le domaine de la détection des vibrions, et avec le Cnrsde Marseille pour l’évaluation de l’altération du poisson par des marqueurschimiques. Un nouveau partenariat a été engagé avec l’Institut Pasteur de Lille relatifà l’évaluation du risque Listeria monocytogenes dans la filière pêche. Les activitésen microbiologie sont sous assurance qualité. Un audit de surveillance favorabled’accréditation Cofrac a eu lieu en mars 2003 dans le cadre du programme sur lesanalyses microbiologiques des produits agro-alimentaires.

Les grands axes de recherche

- évaluation de l’altération du poisson par des marqueurs chimiques- optimisation des méthodes de détection des vibrions- méthodes moléculaires de détermination de la pathogénicité des Vibrio parahaemolyticus- évaluation des risques Listeria monocytogenes

L’appui technique et l’expertise

- composition des produits de la pêche- identification de contaminants physico-chimiques et biologiques- accréditation Cofrac au titre du programme sur les analyses microbiologiques des produits agroalimentaires- pôle de recherche de la filière halieutique pour la prévention du risque Listeria monocytogenes

13 personnes

La recherche et l'appui scientifique et technique – Afssa 2003/2004 1

La recherche

Evaluation du risque Listeria monocytogenes

· Le programme "Prévention du risque Listeria monocytogenes dans la filière pêche" du pôlede recherche du Boulogne-sur-mer a été mis en œuvre pour la filière halieutique. Lapremière phase du programme comprenait la récolte et la caractérisation d’isolats de Listeriamonocytogenes provenant du poisson fumé, puis l’étude de la variabilité génotypique. Laseconde phase a débuté en juillet 2003.

· Des travaux ont été engagés sur le potentiel de virulence de Listeria monocytogenes. La miseen œuvre d’un test in vitro sur cultures cellulaires (initialement mis au point à l’Inra deNouzilly) nous permet de caractériser la virulence des souches. Il s’agit d’un test enmicroplaques qui utilise la lignée cellulaire humaine de type entérocyte HT 29. L’infectiond’un tapis cellulaire confluent permet après une incubation de 18 à 24 heures de dénombrerles plages de lyse apparaissant dans les puits.

La distorsion apparente entre la prévalence élevée de Listeria monocytogenes dans lespoissons fumés et l’absence de cas avérés de listériose humaine liés à ces produits conduit às’interroger. Une première hypothèse reposait sur l’éventualité que les souches des poissonsfumés puissent être différentes de celles des autres filières. Cette hypothèse est désormaisécartée, puisque les groupes génétiques trouvés dans ces produits sont présents dans lesautres filières agroalimentaires.

Un autre axe de recherche a donc été développé, dans lequel est envisagée la possibilitéd’un effet de la matrice "poissons fumés" sur l’expression de la virulence. Les résultats vontfaire l’objet d’une publication.

Evaluation de l’altération du poisson

Analyses des composés volatils

Le but est de reproduire en laboratoire ce qui est fait par le consommateur lorsqu’il évaluela fraîcheur, mais de manière moins subjective : l’identification et la quantification decomposés volatils dont l’évolution est significative du niveau d’altération devrait permettreune prise en compte objective des odeurs, celles-ci constituant l’expression la plus explicitede la dégradation. Il convient donc de disposer d’une méthode performante de dosage descomposés volatils du poisson.


Différentes méthodes ont été développées pour extraire les composés volatils et semivolatils du poisson par extraction liquide et headspace.

La SPME (solid phase micro extraction) est parfaitement adaptée : cette techniqueperformante, qui consiste à concentrer à basse température des composés volatils sur unefibre, permet d’extraire ces composés en moins de deux heures sans utilisation de solvant,pour un coût faible. La SPME et l’équipement récent du laboratoire en GC/MS ont permisd’identifier 86 composés volatils sur le merlan, le cabillaud et le maquereau. Ce programmeest actuellement poursuivi.

Méthode PCR (TMAO réductase)

Un programme Ofimer a été mis en œuvre en décembre 2002 visant à déterminer la qualitéfraîcheur des poissons marins par une technique rapide basée sur la PCR.

Un des étapes clés de l’altération des chairs de poissons correspond à la réduction par desbactéries spécifiques du triméthylamine N-oxyde (TMAO) en triméthylamine grâce à uneenzyme bactérienne. Les études préliminaires ont permis grâce à la génétique moléculaire,de détecter in situ ces bactéries d’altération dans la matrice poisson. Une nouvelle techniquepour caractériser la qualité fraîcheur des chairs de poissons a ainsi été élaborée. Desrésultats satisfaisants ont été obtenus sur des cultures bactériennes et sur des poissonsaltérés. Désormais le laboratoire procède à une optimisation d’utilisation de ce test.


Le laboratoire a mené des analyses sur les produits de la pêche portant sur la compositiondes produits et sur l’identification des contaminants physico-chimiques et biologiques et aparticipé au plan de surveillance "histamine".


Site de BrestLaboratoire d’études et de recherches en pathologie des poissonsDirectrice : Martine Vigneulle

Le laboratoire de Brest est membre du conseil scientifique de la Structureexpérimentale mixte Inra-Ifremer SEMII), et du comité scientifique du Comitéinterprofessionnel des produits d’aquaculture. Il fait aussi partie du Réseau Bleu(association des organismes et laboratoires de recherches sur la mer de l’Ouest de laFrance) et du technopôle Brest Iroise. Dans le cadre de conventions de recherche, ilcollabore avec d’autres organismes de recherches (Inra, Ifremer, Env Nantes,Université de Belfast (Irlande), Ecole vétérinaire d’Oslo (Norvège), les administrations(DGAl, Anvar, Conseil supérieur de la pêche) et diverses organisationsprofessionnelles.

Les grands axes de recherche

- l'étude des maladies infectieuses et parasitaires des poissons d'élevage d'eau douce et marins avec :. la recherche finalisée : caractérisation et épidémiosurveillance des maladies, mise au point de moyens de lutte et de prévention, . le diagnostic spécialisé en virologie, bactériologie, biologie moléculaire, immunologie, histologie et hématologie.

- la stimulation du potentiel immunitaire des poissons - des risques sanitaires dans les filières de production- l’expertise de médicaments susceptibles de faire l'objet d'une demande d’autorisation de mise sur le marché


- les diagnostics spécialisés- la production d’animaux indemnes de virus- la fourniture de réactifs de référence

- Laboratoire national de référence pour les rhabdoviroses- Accréditation Cofrac pour les programmes « immunosérologie virale » et « virologie »- Représentant français de l’European Association of Fish Pathologists (EAFP)Objectifs etdomaines d’activités

17 personnes


Le laboratoire est constitué de deux unités: l'unité pathologie infectieuse et parasitaire despoissons et l'unité immunologie et thérapeutique des poissons. Les installations techniquescomprennent des salles pour expérimentation sur poissons (320m²) alimentées, en circuitouvert, en eau douce et en eau de mer, avec thermorégulation et une centrale d'acquisitionde mesures (température), ainsi qu'une animalerie lapins.

Confortée par l’arrivée en 2003 d’un ingénieur de recherches chargé de mettre en place unenouvelle thématique d’épidémiologie, l’équipe du laboratoire accueille également desétudiants de l’Université de Bretagne Occidentale, de l’Université de la Rochelle.

Recherche

» Rhabdoviroses : Nécrose hématopoiétique infectieuse (NHI)

Analyse phylogénétique des souches isolées en France fondée sur la séquence du gène NV :confirmation des résultats antérieurs obtenus à l’aide du gène de la glycoprotéine.

Pouvoir pathogène de souches présentant une mutation au niveau de la glycoprotéineconfirmé.

» Alphaviroses ( Maladies pancréatiques ) : Maladie du Sommeil (MS) de la truite arc enciel : Projet européen « Diagnosis pathogenesis and epidemiology of salmonid alphavirusdiseases »

- Pathogénie : L’étude histologique des lésions apparaissant au cours de la maladie(pancréas, cœur et muscles) ainsi que le suivi de la concentration virale dans les organes, etde la production d’anticorps ont été réalisés.

- Diagnostic : Différentes techniques ont été mises au point : HIC, séroneutralisation,hybridation in situ.

» Nodavirose ou encéphalopathie et rétinopathie virale

Epidémiologie : mise en évidence pour la première fois chez le bar en France d’unesouche pathogène à basse température (15°C), et chez la sole en Espagne d’une souche degénotype « SJNNV », génotype jusqu’alors décrit au Japon.


Base de données moléculaires de différents pathogènes (projet EUROPA) :(www.fishpathogens.net/). Pathogènicité : 3 sous-types d’ARN polymérase dans les isolatspathogènes à différentes températures

Vaccination : efficacité chez le bar d’une préparation de protéines recombinantes, dosedépendante.

» Virus herpès de la carpe koï : le génome du virus herpès a été détecté par PCR, pourla première fois en France chez la carpe koï.

» Suivi épidémiologique de Listeria monocytogenes dans la filière de productionde truite :recherche sur 5 sites d’élevage et d’abattage : prévalence variable selon lessites (16 à 75 %), avec présence sur le matériel, l’eau des bassins et de la rivière, la surfacedes poissons.

» Epidémiosurveillance de l’antibiorésistance des bactéries pathogènes despoissons d’élevage : Analyse de 100 souches : résistance à l’ampicilline, la lincomycineet aux sulfamides

» Résistance de la truite aux infections par l’utilisation de probiotiques par voiealimentaire (projet OFIMER- CIPA)

Effet positif des probiotiques sur la résistance à Y. ruckeri à la suite d’une infectionexpérimentale : augmentation du nombre des survivants, diminution des porteurs sains,étroite corrélation entre le portage et la concentration en lysozyme plasmatique.

En élevage aucun effet des probiotiques n’est observé pour l’instant sur les paramètresimmunitaires suivis mensuellement : IgM totales, lysozyme et complément (voie alterne).

» Épidémiologie

Mise en place d’un réseau d’épidémiosurveillance des maladies des poissons en France, quirassemble les vétérinaires aquacoles, les laboratoires d’analyses, les coordonnateursaquacoles des services vétérinaires et les chercheurs.

Initiation d’une enquête nationale sur l’activité de diagnostic et de recherche pathologie despoissons.

Appui technique et expertise

-Diagnostics spécialisés : analyse de 500 lots de prélèvements provenant de France et del’étranger.


-En tant que laboratoire national de référence pour la SHV et la NHI participation aucontrôle sanitaire officiel des salmonidés et aux essais interlaboratoires (EIL) européens,organisation des EIL français.

-Production d’animaux indemnes (50 000 truitelles pour l’expérimentation) et fourniture deréactifs de référence aux Laboratoires Vétérinaires Départementaux (souches, antisérums,lignées cellulaires).

-Développement de la technique ELISA pour la recherche d’anticorps antiviraux : étude del’évolution du seuil de positivité en fonction du poids des poissons et mise au point de laméthode par compétition applicable à tous les poissons (essai réalisé sur le maigre(Argyrosomus regius)).

L’Afssa Brest a participé au système de transfert d’informations de la recherche vers la profession, appelé « Aquaculture Recherche » en collaboration avec l’Inra, l’Ifremer, le Cipa.


Site de DozuléLaboratoire d’études et de recherches en pathologie équineDirectrice : Claire Laugier

Les activités du laboratoire sont centrées sur l’épidémiosurveillance des affectionséquines majeures, le diagnostic et la prévention des maladies infectieuses etparasitaires. En tant que coordinateur du réseau national d’épidémiosurveillance etobservatoire des maladies équines, grâce notamment aux autopsies, le site de Dozulépeut suivre l’évolution et la diffusion des maladies connues ainsi que l’apparition demaladies émergentes.

Les grands axes de recherche- l ’épidémiologie- la microbiologie-immunologie- la parasitologie- l ’anatomie pathologiqueLexpertise

L’appui technique et l’expertise- l ’autopsie- les examens complémentaires courants

18 personnes

Le laboratoire bénéficie d’un soutien financier important de la part du conseil régional deBasse-Normandie et du conseil général du Calvados. De nombreux partenariats ont étédéveloppés avec l'Université de Caen, le Centre hospitalier universitaire de Caen, l’UFR depharmacie, et la chambre d’agriculture du Calvados. Par ailleurs, l’étroite collaborationengagée depuis plusieurs années avec le laboratoire départemental se poursuit au travers deprogrammes de recherche et d’actions de formation des professionnels.

Recherche

Épidémiologie

Bilan du dépistage de la métrite contagieuse équine dans la population équine reproductricefrançaise – Taux d’infection et diffusion de la maladie dans le cheptel reproducteur.


Cette étude a été menée en 2003 en collaboration avec la Direction des ServicesVétérinaires de l’Orne (CESAME) et les Haras Nationaux. Elle a permis de dresser un bilandu dépistage au cours de la saison de monte 2001, de déterminer la prévalence apparente dela maladie en 2001 et son évolution au cours des 10 dernières années, d’analyser la gestiondes foyers et la diffusion de la maladie à partir d’un animal infecté.

Parasitologie

Au cours de l’année 2002, le service de parasitologie a mené des travaux sur les mesures deprophylaxie sanitaire applicables aux pâtures et les résultats ont été analysés en 2003. Ilsmontrent que l’efficacité de l’épandage de chaux vive et de cyanamide calcique sur ladestruction des formes libres de nématodes parasites du tube digestif du cheval, testée dansdes conditions de terrain, est d’environ 80% sur les œufs et les adultes de Strongyloïdeswesteri et de 60% sur les larves infestantes. Des études in vitro seront mises en place pourmettre en évidence l’activité de ces produits d’épandage sur les larves L3 des petits et desgrands strongles ; en effet, ces dernières sont difficiles à mettre en évidence dans l’herbe despâtures en l’absence des chevaux.Par ailleurs, les études menées en 2003 sur l’influence du climat sur le développement desformes infestantes des petits et grands strongles confirment que les températures observéesen Basse-Normandie tout au long de l’année ne tuent pas les différents stades du cycleexterne des grands et petits strongles.

Microbiologie

Les travaux de recherche 2003 se sont concentrés sur l’étude des mécanismes de virulencede Rhodococcus equi, en particulier ceux qui permettent la survie de la bactérie dans lesmacrophages.


En terme d’analysesAfin d’établir un diagnostic, 756 prélèvements ont fait l’objet d’analyses bactériologiques avecisolement et identification de 630 souches bactériennes. 1170 prélèvements ont étéeffectués sur des fœtus pour recherche d’agents infectieux dont le rôle abortif est méconnuet éventuellement mésestimé.

En terme de formations- Un service d’anatomie pathologique agréé pour l’accueil de docteurs vétérinaires stagiairespréparant le diplôme de l’European College of Veterinary Surgery


- Formations destinées à des publics professionnels ou étudiants sur le parasitisme digestifdes équidés, la biologie moléculaire, l’anatomie pathologique des équidés

Un observatoire nécropsique régional des maladies équines298 autopsiesIdentification de 630 souches bactériennes170 antibiogrammes1170 prélèvements

La réalisation de nombreuses autopsies, permet au laboratoire de jouer un rôle importantd’observatoire des maladies équines notamment celles affectant les chevaux d’élevage. Cetteactivité rend ainsi un service immédiat aux professionnels en particulier lors de maladiescontagieuses impliquant la mise en oeuvre urgente demesures de prophylaxie sanitaire ou médicale. 16 cas de rhodococcose ont été identifiésdont 5 de forme atypique et un cas rare chez un poney adulte ainsi que 16 cas declostridiose intestinale, 3 foyers de cyathostomose larvaire aiguë et 2 foyers de salmonellose.

Assurer la logistique du réseau national d'épidémiosurveillance(RESPE)

Surveillance épidémiologique de la grippe et de la rhinopneumonie forme respiratoire(réseau SRA) Ce sous-réseau a pour objectif la surveillance des affections respiratoires aiguës d’originevirale (principalement grippe et rhinopneumonie). 152 cas de suspicion grippale, provenantde 94 foyers, ont été enregistrés au cours de l’année 2003. 13 foyers de grippe (test ELISAréalisé sur des écouvillons naso-pharyngés) et 7 foyers de rhinopneumonie (HEV1) ont étéconfirmés.

Surveillance des Affections Neurologiques d’Origine Infectieuse (réseau ANI)Ce sous-réseau spécialisé a été mis en place en 2003. Il a pour objectif le recensement dunombre annuel de cas de troubles neurologiques correspondant aux maladies suivantes :rhinopneumonie forme nerveuse, West Nile, maladie de Borna, ehrlichiose, maladie deLyme, encéphalomyélite équine à protozoaire, listériose. 24 déclarations ont été réaliséespar les vétérinaires sentinelles. 7 chevaux ont fait l’objet d’un diagnostic sérologique derhinopneumonie forme nerveuse (HEV1). L’implication d’autres agents infectieux dans lessymptômes cliniques observés sur les autres chevaux n’a pu être prouvée.


Site de FougèresLaboratoire d’études et de recherches sur les médicamentsvétérinaires et les désinfectantsDirecteur : Pascal Sanders

Les activités du laboratoire de Fougères portent sur les résidus de médicamentsvétérinaires, l’efficacité antimicrobienne des antibiotiques et des désinfectants et ledéveloppement de la résistance à ces produits. Il étudie aussi la génotoxicité desrésidus et des contaminants. Le laboratoire intervient également sur le contrôle del’application des règlements nationaux ou européens dans le domaine du médicamentet des désinfectants. En 2003, le laboratoire a été évalué collectivement.

Les grands axes de recherche, l’appui technique et l’expertise- les contaminants médicamenteux- la pharmacologie des médicaments vétérinaires notamment les antibiotiques- la toxicologie alimentaire- les produits d’hygiène anti microbiens

- Laboratoire national de référence pour les résidus de médicaments vétérinaires- Laboratoire communautaire de référence pour les résidus d’antibiotiques- rapporteur auprès du ministère de l’Agriculture pour les homologations et

agréments des désinfectants- membre du Comité européen de normalisation

60 personnes

Recherche

Contaminants médicamenteuxLes travaux de recherche concernent le développement de méthodes de détection et deconfirmation des résidus de médicaments vétérinaires dans les tissus animaux et denréesd’origine animale.Dans le domaine des techniques biologiques, les travaux ont porté sur l’adaptation desméthodes bactériologiques existantes suite à l’arrêt de fourniture d’un des milieux utilisés.Une nouvelle méthode de confirmation de l’effet antibiotique dans le lait a été développéepour les laboratoires interprofessionnels laitiers. Les performances de différents kits ELISApour la détermination des résidus d’aminoglycosides dans le lait ont été vérifiées. Lesperformances de kits pour la recherche des résidus de chloramphénicol et de nitrofurannes


ont été déterminées pour diverses matrices (chair de crevettes, muscle). Des méthodes dedétection des résidus d’aminoglycosides et de nicarbazine basées sur le système Biacore sonten cours de développement.Dans le domaine des techniques physico-chimiques, les travaux de développement ontconcerné la validation des méthodes de quantification par chromatographie liquide pour lesrésidus de tétracyclines (muscle et œuf), de quinolones dans diverses matrices, de sulfamidesdans l’œuf et la chair de poisson, des anti-inflammatoires non stéroïdiens dans le muscle, deplusieurs benzimidazoles dans le foie, de 4 avermectines dans le muscle et la peau depoisson. Plusieurs méthodes de confirmation par chromatographie liquide couplée à laspectrométrie de masse ont été développées ou étendues à diverses matrices et validées aucours de l’année :

résidus d’antibiotiques (Lait, Muscle) résidus de nitrofurannes (œufs et ovoproduits, lactosérum, miel) résidus d’anti-inflrammatoires non stéroïdiens (muscle) résidus de carbadox et d’olaquindox (muscle, foie).

L’étude des performances des techniques électro-chromatographiques à l’analyse des résidusd’antibiotiques menés avec le Laboratoire des Sciences et Stratégies Analytiques del’Université Claude Bernard Lyon I, a été conclue par la soutenance de thèse de JC Valette.

Pharmacologie des médicamentsLe projet de recherche (AQS – F2590) intitulé « influence d’une fluoroquinolone sur la floreintestinale du porcelet » a été poursuivi. Des études in vitro, complémentaire des études invivo réalisées en 2002, ont permis de caractériser les bactéries résistantes émergentes. En find’année la réunion du bilan du comité de pilotage de ce projet a montré que toutes leséquipes participante avait réalisée leurs expérimentations et qu’un document consolidé surles résultats obtenus serait publié dans l’année 2004.La mise au point d’un modelé expérimental de biopsie œsophagienne chez le porc a étédéveloppé. Ce modèle permet de réaliser, sous anesthésie générale de courte durée desprélèvement de muqueuse afin d’évaluer la réparation de l’ADN cellulaire. Ce modèle a étéutilisée en collaboration avec le Centre François Baclesse de Caen pour étudier l’impact del’ingestion chronique d’alcool chez le porc.Un travail de recherche en méthodologie statistique sur les validations des méthodesanalytiques a été également mené dans le cadre d’une commission de la Société Françaisedes Sciences Pharmaceutiques. Ce travail porte sur l’utilisation du profil d’exactitude et duconcept de l’erreur totale (biais et écart-type) pour simplifier la phase de validation tout encontrôlant le risque associé à l’utilisation d’une méthode analytique.


Toxicologie alimentaireEn 2003, les activités de recherche en toxicologie alimentaire ont été menées dans lesdomaines de la toxicité cellulaire, la génotoxicité, les effets des antibiotiques sur les bactériesde la flore intestinale.

Les propriétés génotoxiques de l’acide okadaïque, une toxine marine, ont été recherchées invivo dans les tests du micronucleus sur moelle osseuse et sur colon chez la souris et in vitrodans le test UDS sur hépatocytes de rats. Les résultats confortent l’hypothèse que l’acideokadaïque est une substance aneugène, n’agissant pas directement sur l’ADN. Le mécanismed'action de l'acide okadaïque a également été étudié sur cellules CHO-K1. Ce produitprovoque un blocage des cellules en mitose au stade prométaphase avec absence de figuremétaphasique et présence d'un fuseau mitotique multipolaire.

Les dommages à l ‘ADN induits par l’acrylamide, un contaminant néo-formé par chauffage decertains aliments, ont été mesurés dans plusieurs organes de rat par le test du comète. Auxdoses de 50-75 mg/kg par voie orale chez le rat, des dommages à l’ADN sont observés dansles lymphocytes circulants, dans le cerveau et les testicules. Les travaux, réalisés dans lecadre d’une thèse se poursuivent par la recherche des adduits à l’ADN dans ces organes.Enfin, une doctorante de l’unité a travaillé sur l’exposition in utero à un contaminantalimentaire le 3-monochloro-propane-1,2-diol (-chlorohydrine, 3-MCPD) surl’organogenèse testiculaire du rat. A des doses induisant une toxicité générale chez lafemelle gestante (perte de poids corporel), le 3-MCPD est sans incidence sur la mise bas desfemelles ou sur le déroulement et les performances de la gestation. L’histologie destesticules issus de fœtus exposés in utero au 3-MCPD est normale. La reprise mitotique descellules germinales n'est pas non plus modifiée par le 3-MCPD et les activités de proliférationet d’apoptose sont normales. Le degré d’expression des marqueurs de la cellule de Sertoli,des cellules germinales, des cellules péritubulaires, ou des cellules de Leydig n’est pas nonplus affecté par le traitement. Enfin, le 3-MCPD n’affecte pas les niveaux de testostéroneintra-testiculaire, basale ou stimulée par l’hCG.

Le programme d’étude des effets de la ciprofloxacine sur la flore intestinale des rats HFAs’est terminé. Les résultats obtenus (déplacements des CMI) ont confirmé la sélection debactéries résistantes (B. fragilis et Enterococci) par le traitement antibiotique (forte dose) dansla flore intestinale des animaux traités

Produits d’hygiène antimicrobiens

Le développement d’une technique d’études de l’effet des désinfectants sur les biofilms s’estpoursuivi avec l’utilisation de la microscopie à épifluorescence et l’étude des conditionsd’ultrasonification.


La résistance du Circovirus de type 2 a été étudiée vis-à-vis de 10 désinfectants. Unerésistance de ce virus a été mis en évidence par comparaison avec la souche de référencechoisie pour l’homologation virucide des désinfectants d’élevage.En collaboration avec l’Afssa Boulogne, l’adaptation de 250 souches de Listeria monocytogenesissues de l’environnement d’ateliers de transformation de poissons fumés vis-à-vis desammoniums quaternaires (chlorure de benzalkonium et chlorure de didécylméthyl-ammonium) a été étudiée et des seuils de résistance pour des concentrations de 4 et 7,5ppm ont été déterminés.En collaboration avec l’Afssa Ploufragan, un programme d’étude de la résistance auxdésinfectants pour des souches de campylobacters issues de l’environnement d’ateliers detransformation de viandes de volaille et d’élevage a débuté dans le cadre d’une FormationComplémentaire par la Recherche d’une vétérinaire inspecteur.


Contaminants médicamenteuxCinq essais d’aptitude inter laboratoires ont été organisés dans le cadre des activités deLaboratoire communautaire de référence et de Laboratoire national de référence et quatrechaînes d’analyse ont été mise en place pour les laboratoires interprofessionnels laitiers.L’unité a également participé à des essais d’aptitude organisé par le RIKILT (Nitrofurannes)et un essai collaboratif organisé par le JRC de Geel (fluoroquinolones). Cinq plansexpérimentaux (anticoccidiens, anti-inflammatoires non stéroïdiens,Nitroimidazoles, nitrofuranes) représentant 488 analyses ont été réalisés ainsi que 702analyses de confirmation pour différents types de résidus dans le cadre national et 55 dans lecadre communautaire.Une rencontre avec les directeurs des laboratoires nationaux de référence des payscandidats a été organisée.Plusieurs sessions de formation ont été réalisées à destination des personnels deslaboratoires départementaux :

Méthode de dosage des AINS dans le muscle par CLHP , 2 sessions 4 et 5 participants(06 au 10/10).Méthodes de dépistage des anticoccidiens dans le muscle par CCM et du flubendazoledans le muscle de volailles et les œufs ", 2 sessions 4 et 5 participants (06 au 10/10).Dépistage des antibiotiques par la méthode des 4 boîtes : 4 sessions de 3 jours, 6participants/stage (février, mars, avril, juin)Méthode de confirmation des résidus de nitrofurannes, chloramphénicol et nitro-imidazoles par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem(Février 2004).


En décembre 2003, une session de formation à l’intention des laboratoires nationaux deréférence sur la méthode de détermination des résidus de carbadox et olaquindox a étéorganisé en partenariat avec le DARDNI de Belfast et la DGCCRF de Rennes.

Pharmacologie des médicamentsDans le cadre d’un plan de surveillance de la résistance aux antibiotiques de populationsbactériennes d’origine animale, mis en place par la Direction générale de l’alimentation, ladistribution des CMI vis-à-vis de souches indicatrices de l’évolution de la résistance au seinde flores bactériennes des porcs, volailles et bovins des filière de production française a étéétudiée respectivement pour 11 et 9 antibiotiques représentatifs des familles d’intérêtclinique en médecine humaine. Les CMI de 407 souches d’Escherichia coli et de 171 souchesd’Enterococcus faecium isolées en 2002 de poulets, porcs et bovins et 100 souches d’E. coliisolées de poulets et porcs en 2003 ont été déterminées pour les différents antibiotiquessélectionnés selon des méthodes standardisées appliqués dans le cadre des Bonnes Pratiquesde Laboratoire. Ces études ont fait l’objet d’un rapport pour l’ensemble des souches 2002testées. La détection des -lactamases à spectre étendu (ESBL) pour 319 souchesd’Escherichia coli trouvées résistantes à l’ampicilline a également été réalisée. Enfin, nousavons participé à l’essai circulaire EQAS 2003 dans le cadre de ARBAO-II pour Salmonella etE. coli.

Le développement et la validation d’une méthode analytique permettant le dosage de 3antibiotiques (marbofloxacine, ceftiofur, flofénicol et florfénicol amine) dans le sperme detaureau a été réalisé. Cette méthode est utilisée pour évaluer l’impact des antibiotiques surles performances de reproduction de taureau dans le cadre d’une étude collaborativecoordonnée par l’Ecole Vétérinaire de toulouse.

Un soutien expérimental et technique a été apportée pour la préparation de musclenaturellement chargée en chloramphénicol utilisés pour les essais d’aptitude communautaireet national.

Produits d’hygiène antimicrobiensEn tant que rapporteur auprès du ministère de l'Agriculture, le laboratoire gère des dossiersde demandes d'homologation (ou autorisation de mise sur le marché - AMM) et d'agrémentdes désinfectants. Cette activité est importante. Soixante quatorze produits ont fait l’objetde 120 analyses de l'activité bactéricide, fongicide et virucide par application d'une série denormes françaises ou européennes.

En matière d’action normative nationale et européenne, le laboratoire participe aux travauxdu Comité européen de normalisation en examinant les dernières méthodes éditées. L’étudea porté cette année sur les normes phagicide, mycobactéricide et virucide.


Evaluation de l’efficacité des désinfectantsA court et moyen termes, après une série d'échanges avec le MEDD, une convention seraprochainement établie avec l'Afssa pour l'expertise des volets efficacité et risquesalimentaires des substances actives et des produits biocides. L'Unite « produits d’hygiène antimicrobien » étendra son champ de compétence aux produits d'hygiène utilises sur la peau del'animal et de l'homme dans les domaines vétérinaire et agroalimentaire sur le voletefficacité. De plus, elle sera partie prenante dans l'évaluation des résidus et de la résistancedes bactéries aux antimicrobiens (non antibiotique).

ExpertisePlusieurs scientifiques du laboratoire sont membres de Comité d’experts et participent auxgroupes de travail.Pascal Sanders est membre du comité des « additifs à l’alimentation animale » de l’AutoritéEuropéenne de Sécurité Sanitaire des Aliments. Il a participé aux travaux de la consultationtripartite OIE/FAO/OMS sur l’évaluation du risque associé à l’usage non humain desantibiotiques et aux travaux d’évaluation sur ce sujet initié par un groupe transversal del’Afssa.Pierre Maris est rapporteur auprès du ministère de l’Agriculture pour les demandesd’autorisations de mise sur le marché (AMM) et d’agrément des désinfectants. Il a contribuéaux travaux concernant la transposition de la Directive 98/8/CE sur les biocides, menés parle ministère de l’Ecologie et du Développement durable et l’Agence française de sécuritésanitaire de l’environnement. Au niveau international, il participe aux travaux de l’OCDEdans ce domaine. Il est également membre du Comité d’experts spécialisés (CES) « Produitschimiques » de l’Afssa.

Michel Laurentie est membre de comité d’experts spécialisé « Additifs, Arômes etAuxiliaires Technologiques » de l’Afssa. Sa contribution se situe dans l’évaluation desméthodes analytiques et des données de toxicocinétique en vue de l’autorisation d’additifsou d’auxiliaire technologique. Il a également contribué à la rédaction des lignes directricespour la constitution d’un dossier relatif à l’emploi d’un auxiliaire technologique enalimentation humaine. Il a participé à un groupe de travail sur les « Seuils de préoccupationtoxicologiques » où il a eu la charge de rédiger les parties statistiques et métaboliques.Il est également membre du groupe de travail « Evaluation des risques pour l’homme » de lacommission d’étude de la toxicité des produits anitparasitaires à usage agricole et desproduits assimilés.

Jean Michel Poul est expert toxicologue pour la Commission d’études de la toxicité desproduits antiparasitaires à usage agricole et le CES « Arômes, Additifs alimentaires,auxiliaires technologiques ». Il a participé en outre à plusieurs groupes de travail de l’Afssa(« eaux de chaudières », « Iode dans les aliments », « Acrylamide »). Valérie Fessard a participé comme expert toxicologue au groupe de travail « Cyanos » del’Afssa.


Site de LyonLaboratoire d’études et de recherches en pathologie bovine ethygiène des viandesDirecteur : Didier Calavas

Le laboratoire de Lyon mène des activités de recherche et d’appui scientifique ettechnique dans le domaine de la pathologie des bovins et de la sécurité sanitaire desviandes. En matière d’ESST (encéphalopathies spongiformes subaiguëstransmissibles), et de mycoplasmologie cette activité s’étend à tous les ruminants, encollaboration avec les autres sites de l’Afssa.

Les grands axes de recherche, l’appui scientifique et technique

- les agents transmissibles non conventionnels : surveillance épidémiologique et diagnostic des ESST (ESB et tremblante), caractérisation des agents des ESST- l’antibiorésistance des bactéries pathogènes chez les bovins- les risques biologiques liés aux viandes des ruminanants- la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB) : caractérisation des mycoplasmes et épidémiovigilance vis-à-vis de la PPCB en France- l’animation du réseau d’épidémiosurveillance des salmonelloses- la leucose bovine enzoonotique et la rhinotrachéite infectieuse bovine

- Laboratoire national de référence pour les ESST des ruminants, la leucose bovine enzootique, la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB)- Laboratoire de référence de l’OIE pour la PPCB et la rhinotrachéite infectieuse bovine- Le laboratoire assure le stockage d’antigènes concentrés destinés à la fabrication de vaccins antiaphteux pour la Communauté européenne

84 personnes

Le laboratoire a tissé des liens avec de nombreuses équipes européennes, aussi bien auniveau des recherches de laboratoire que de l’épidémiologie. Mais, il a également développéde nombreux partenariats tant sur le plan national (Inra, Enva, Envt, Inserm, Cea, InstitutPasteur) que local (Cnrs, Envl, Ibcp, Ens Lyon sciences, Inserm, Afssaps, Université ClaudeBernard Lyon I, bioMérieux). Le laboratoire de Lyon participe au comité scientifique du GISInfections à prions et est partenaire du réseau d’excellence européen NeuroPrion dans le

cadre du 6e PCRD.

Le site de Lyon comporte une ferme expérimentale qui permet de mener desexpérimentations ne mettant pas en jeu des agents infectieux nécessitant des mesures deconfinement élevées.


Recherche

ESST

L’identification d’isolats d’ESST atypiques chez les bovins et chez le mouton

Les travaux de caractérisation des isolats d’ESST identifiés à partir des programmes desurveillance active ont révélé de façon très inattendue des isolats aux caractéristiques trèsinhabituelles aussi bien chez les petits ruminants que chez les bovins.

Chez le mouton, un proportion importante des isolats dépistés positifs par les programmesde surveillance active se caractérisent par le fait qu’ils ne peuvent être identifiés qu’avec unseul des deux tests de dépistage utilisés sur le terrain. Ces isolats montrent des propriétéstrès particulières de la protéine prion, dont l’identification constitue de façon générale leprincipe de ces tests. Outre les conséquences très importantes dans l’estimation de laprévalence de cette infection, il apparaît qu’environ la moitié de ces cas sont rencontréschez des animaux jusqu’ici considérés comme très résistants au développement de latremblante du fait de leurs caractéristiques génétiques. Ces cas posent d’importantesquestions à l’ensemble des laboratoires de références européens, y compris quant au statutet à la réalité du risque représenté par ces animaux.

Par ailleurs, les travaux sur les tests différentiels entre l’ESB et la tremblante chez les petitsruminants, fondés sur la caractérisation de la protéine prion, et les travaux de transmissionde la maladie à des souris transgéniques « ovinisées », ont été poursuivis. Ils ont notammentpermis la caractérisation approfondie d’isolats de terrain présentant des propriétéssusceptibles d’évoquer une infection par l’agent impliqué dans l’encéphalopathie bovine.

Sur le plan de l’épidémiologie, l’analyse des données les plus récentes confirment la trèsforte décroissance de l'épizootie d’ESB pour les cohortes nées après 1994-1995, ainsi quel'hétérogénéité spatiale du risque ESB à la fois pour les cas dénommés NAIF ((nés entrejanvier 1991 et juin 1996) et Super NAIF (nés entre juin 1996 et décembre 2000).

Bactériologie bovine et sécurité des viandesDans le cadre du programme Aliment-Qualité-Sécurité, un projet consacré à l’étude de larésistance aux antibiotiques de la famille des phénicolés débuté en 2002 a été poursuivi.L’évolution de la résistance à deux antibiotiques de cette famille (chloramphénicol etflorfénicol) a été analysée chez 2878 souches d’Escherichia coli provenant d’élevages bovinfrançais avant et après l’introduction du florfénicol en médecine vétérinaire en 1995. Lesrésultats indiquent la diffusion de différents variants du gène floR, probablement sur desstructures génétiques mobiles.


Mycoplasmoses des ruminantsLes travaux sur l'hyper variabilité antigénique de surface de M. mycoides subsp. mycoidesbiotype SC, l'agent de la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB) sont achevés. Ilsdémontrent que ce mycoplasme comme d'autres mycoplasmes pathogènes possèdent lescapacités de moduler l'expression de certaines protéines exprimées à sa surface, facilitantainsi la colonisation et la persistance chez l'hôte infecté.

Un projet réalisé en collaboration avec l'Afssa-Niort et portant sur la prévalence desinfections dues à des mycoplasmes du groupe "M. mycoides" chez les caprins a débuté.Parallèlement différentes techniques de sous-typage des souches sont évaluées pour définirla diversité génétique des différents mycoplasmes de ce groupe et pour développer, sipossible, des marqueurs moléculaires de virulence et de filiation entre les foyers.

L’appui scientifique et technique

Surveillance, épidémiologie et diagnostic des ESST

· Mise en œuvre des techniques de référence pour les confirmations des diagnostics de première intention réalisés de manière décentralisée pour les différents canaux de surveillance de l’ESB (réseau clinique, test en équarrissage et en abattoir).· Participation en tant que LNR au premier programme de surveillance par sondage chez les petits ruminants, à l’abattoir et en équarrissage, ainsi qu’au programme de dépistage systématique chez les petits ruminants dans les foyers identifiés de tremblante.· Organisation d’un essai inter laboratoires pour l’ESB et la tremblante (65 laboratoires).· Gestion et analyse des données de surveillance épidémiologique de l’ESB et de la tremblante à partir des données produites par le laboratoire et des données fournies parla DGAl, et édition d’un tableau de bord mensuel pour l’épidémiosurveillance de ces deuxmaladies.

Leucose bovine et rhinotrachéite infectieuse bovine

Leucose bovineUn essai inter laboratoires a concerné 108 laboratoires pour les techniques sérologiquesd’immunodiffusion en gélose (19) et ELISA sur sérum (86) et lait (30). Le laboratoire aeffectué des expertises sérologiques (423 sérums correspondant à 1 918 analyses de sérumset de 31 de lait) et contrôles de réactifs (13 lots de réactifs pour analyses sur sérum ainsique 2 contrôles de conservation et de 4 lots pour les analyses sur lait de mélange).

Rhinotrachéite infectieuse bovineUn essai inter laboratoires a concerné 103 laboratoires pour les techniques sérologiques de


séroneutralisation (8) et d'ELISA sur sérum (83) et lait (29). Les expertises sérologiques ontconcerné 425 sérums. Les contrôles de réactifs ont porté sur 18 lots de réactif ELISA ainsique 4 contrôles de conservation pour les analyses sur sérum individuel et sérum de mélangeet de 4 lots pour les analyses sur lait.

Le laboratoire a, par ailleurs, fourni des sérums de référence pour la leucose bovineenzootique (309 pour l’ELISA et 18 pour l’IDG) et pour la rhinotrachéite bovine infectieuse(730 pour analyses de sérum individuel et 187 pour les analyses sur sérum de mélange).

Mycoplasmologie des ruminantsL'enquête sérologique annuelle PPCB, menée selon le schéma actuellement en vigueur dansles troupeaux en zone frontalière pyrénéenne, a porté sur 22 930 prélèvements. Unesuspicion a été infirmée par expertise en immunoblotting. Un nouveau schéma desurveillance de la PPCB au niveau national a été proposé à la DGAl et devrait aboutir à unemise en place en 2004. Le schéma actuel n'est en effet plus adapté aux conditionsépidémiologiques actuelles et ne tient pas compte des particularités de la forme de PPCBeuropéenne récemment mises en évidence.

La spécificité et l'intérêt éventuel d'un nouveau test de dépistage de la PPCB chez les bovins,ont été évalués dans les conditions épidémiologiques nationales pour une éventuelleutilisation chez les bovins et les petits ruminants. L'enquête a porté sur 1800 sérums (1 100bovins, 500 caprins et 300 ovins).

Dans le cadre du réseau national d'identification des mycoplasmes des ruminants, 863demandes d'identification émanant de 29 laboratoires départementaux ont été traitées, dont534 concernant des ovins ou caprins, 313 des bovins. Au total 1110 souches appartenant à13 espèces mycoplasmiques différentes ont été identifiées dont 234 souches de M. bovis.L'agent de la PPCB qui fait l'objet d'une recherche systématique n'a pas été mis en évidence.

Bactériologie bovine et sécurité des viandes

Animation de réseaux d’épidémiosurveillance

Le laboratoire anime pour la filière bovine le réseau RESAPATH – réseaud’épidémiosurveillance de la résistance des bactéries pathogènes dans les filières bovine,porcine et aviaire, et le réseau RESSAB – réseau d’épidémiosurveillance des salmonellosescliniques chez les bovins adultes. Pour le réseau RESAPATH filière bovine, près de 2500résultats d’antibiogrammes sont enregistrés à Lyon chaque année.


En 2004, une analyse approfondie des résultats produits par le RESSAB a été réalisée :l’incidence des salmonelloses cliniques chez les bovins adultes en 2003 a été de 1,4 cheptelspour 1000 surveillés (IC à 95% [0.9 – 2.1]). Cette incidence, en baisse constante depuis lacréation du réseau en 1997, est stabilisée depuis 3 ans. Le sérovar majoritairement isolédans le RESSAB est Salmonella Typhimurium, salmonelle d'intérêt en santé publique. Dans lecadre de l'animation de ce réseau, des indicateurs de performance du réseau et un nouveauquestionnaire sont en cours d'élaboration, afin de mieux répondre aux atteintes du réseau,qui permettront d’évaluer la qualité globale du fonctionnement du réseau et d'en piloter lefonctionnement de manière raisonnée et efficace.

Collection de souchesLa collection de souches bactériennes bovines gérée par le site de Lyon est répertoriée dansle catalogue des collections microbiennes françaises. Alimentée principalement par lesréseaux d'épidémiosurveillance animés par le laboratoire, elle comportait près de 13 700souches lyophilisées en fin d’année 2003. 545 souches sélectionnées sur la base de leur profilde résistance aux antibiotiques ont été mises en collection en 2003.

Plans de surveillance de l’antibiorésistanceLe site de Lyon a réalisé pour la deuxième année consécutive les examens bactériologiquesprévus dans le cadre du plan national annuel de surveillance de l’antibiorésistance des floresintestinales normales des bovins (bactéries sentinelles et zoonotiques). Les analyseseffectuées sur 600 prélèvements en abattoir ont permis d'isoler 560 Escherichia coli, 9Salmonella, 138 entérocoques (Enterococcus faecium et E. faecalis) et 130 Campylobacter.L’évolution de la résistance aux agents antibactériens a ainsi pu être analysée.

Participation au réseau européen ARBAO L’unité participe au réseau européen ARBAO (Antibiotic Resistance of Bacteria of AnimalOrigin), action concertée financée par la Commission européenne. En 2003 dans le cadre duProgramme ARBAO-II, l’Unité a été chargée de l’organisation d’un essai inter laboratoire(EIL) pour les Pasteurella. Quatre souches de Pasteurella ont été sélectionnées et envoyéesà 24 laboratoires français et européens.


Site de Maisons-AlfortLaboratoire d’études et de recherches sur la qualité des aliments etsur les procédés agro-alimentairesDirecteur : Laurent Rosso

Un nouveau laboratoire au sein de l'Afssa

Laboratoire d'études et de recherches pour la qualité des aliments et surles procédés agroalimentaires

Afin d'offrir une meilleure lisibilité et favoriser les synergies, le Laboratoire d'études etde recherches pour la qualité des aliments et sur les procédés agro-alimentaires(Lerqap), créé le 1er septembre 2003, résulte de la fusion des laboratoires tournésprincipalement vers l'hygiène des aliments : le Laboratoire d'études et de recherchessur la qualité des aliments (Lerqha) et le Laboratoire d'études et de recherches surl'alimentation collective (Lerac). Ainsi le Lerqap constitue l'entité la plus importante del'Afssa dans le domaine de l'hygiène et de la qualité des aliments.

Le laboratoire a pour ambition d’apporter à la décision publique, une expertisescientifique à la fois généraliste sur la qualité et la sécurité des produits alimentaires,mais aussi plus spécifique sur le lait et produits laitiers et la restauration hors foyer.

Les activités du laboratoire portent sur l’élaboration et l’utilisation de méthodesvisant à identifier les dangers alimentaires et à estimer les risques qui leurs sontassociés. Ses travaux portent sur les dangers microbiologiques liés aux conditions deproduction et de préparation des denrées, mais également sur les dangers physico-chimiques présents dans l’environnement ou générés par les procédés agro-industrielset que l’on peut retrouver dans les denrées. Dans ce contexte, le laboratoires’intéresse à tous les aliments en général et au lait et aux produits laitiers enparticulier. Sur cette filière sont abordés les aspects sanitaires mais aussi ceux liés àla qualité générale et à la nutrition. Enfin, s’agissant des procédés agro-industriels, le laboratoire est laboratoire d’essaispour l’attribution de la marque NF Hygiène alimentaire, marque de qualitéconstituant une solution concrète aux problèmes microbiologiques soulevés enrestauration collective.


L’ensemble des activités du laboratoire est sous assurance qualité et certaines activités sontaccréditées Cofrac.Le laboratoire est Laboratoire national de référence pour les pesticides, les métaux lourds,les radionucléides, les phycotoxines, les mycotoxines et la microbiologie des aliments etLaboratoire de référence pour la composition des produits laitiers pour l’Onilait. Il animedes réseaux nationaux de laboratoires de terrain vers lesquels il transfert les méthodesd’analyse validées ou de référence au moyen de sessions de formation et d’essais d’aptitude. Laboratoire communautaire de référence pour l’hygiène du lait et des produits laitiers, ilanime un réseau de plusieurs dizaines de laboratoires répartis dans les 25 pays de l’Unioneuropéenne.Dans le cadre des activités de recherche, des collaborations étroites existent entre lelaboratoire, d’autres unités de l’Afssa et des équipes d’organismes de recherche commel’Inra, le Cnrs, le CEA, l’Institut Pasteur, l'Institut Pasteur de Lille, le Muséum nationald’histoire naturelle, les universités, les facultés de médecine, les centres hospitaliersuniversitaires et les écoles vétérinaires, d’agronomie et alimentaires pour mener des travauxde recherche finalisée ou d’application à court terme.

Les grands axes de recherche, l'appui technique et l'expertise organisésselon 3 pôles scientifiques - Pôle Contaminants biologiques– sécurité microbiologique en restauration hors foyer et dans les procédés industriels– microbiologie quantitative et estimation des risques– détection, caractérisation et épidémiologie microbienne– étude moléculaire des contaminants biologiques alimentaires– organismes génétiquement modifiés– virologie des aliments et de l'eau

– Pôle Contaminants physico-chimiques– toxines, polluants organiques et pesticides– contaminants inorganiques et minéraux de l'environnement

– Pôle Lait et produits laitiers– Qualité, valeur nutritionnelle et composition– Hygiène et microbiologie– Toxines bactériennes

140 personnes


Contaminants biologiques

Détection, caractérisation et épidémiologie microbienne

Missions d'appui scientifique et technique

Réseau SalmonellaLe laboratoire anime un réseau de 150 laboratoires vétérinaires et agro-alimentaires quiparticipent à la constitution de la base de données dont l’objectif est de suivre l’évolutionspatio-temporelle des sérotypes en fonction de leur origine (en 2003 : 14126 donnéescollectées dont 5189 souches analysées au centre de sérotypage du laboratoire). Un essaiinter-laboratoire de sérotypage des salmonelles a été organisé avec la participation de 50laboratoires.

Validation AFNOR de méthodesLe laboratoire est impliqué dans la validation de méthodes alternatives pour la detection dessalmonelles dans les aliments. En tant que laboratoire expert, il a réalisé l’étude dereconduction du test Oxoid salmonella Rapid Test pour sa validation à l’AFNOR et aparticipé à des études collaboratives multicentriques dans le cadre de validation deméthodes alternatives.

Caractérisations bactériennes Ces activités d’expertise ont été marquées en 2003 par :

- la caractérisation des 485 souches de L.monocytogenes isolés en 2003 de produitsalimentaires et de l’environnement de transformation dont 264 souches analysées parpylsotypage avec 2 enzymes de restriction.

- la coordination de l’enquête sur des échantillons de fromage responsable demortalités et mobidités avec identification et dénombrement des staphylocoques àcoagulase positive (SCP). D’autre part identification de 5 souches et biotypage de 104souches de S.aureus, et production d’enterotoxines de culture de 29 souches de S.aureus et de 21 souches de B. cereus

Virologie des aliments et de l'eauLe laboratoire est impliqué dans la mise en place d'un réseau de compétences scientifiques ettechniques sur la contamination virale des denrées végétales. Ce groupe est composé descientifiques de l'Institut de veille sanitaire, du Centre national de référence des virusentériques, et de centres techniques agro-alimentaires et de l'Afssa. Ces organismes sont enmesure de confronter leurs résultats épidémiologiques et micro-biologiques afin d'identifierles virus responsables de gastro-entérites or d'hépatites d'origine alimentaire. Ils apportentégalement leurs compétences dans les domaines des technologies industrielles et de leurseffets sur les contaminants viraux.


Le laboratoire répond également aux besoins d'études sur la contamination virale, lors desanalyses microbiologiques des eaux de consommation impliquées dans des phénomènesépidémiques.

Activités de recherches associées

Caractérisation moléculaireLe laboratoire intervient dans le cadre du projet européen FOOD-PCR qui porte sur lesméthodes moléculaires de détection des principaux pathogènes bactériens des aliments enanimant des travaux sur les différentes techniques de détection. Il a également participé àplusieurs analyses circulaires utilisant des techniques d’amplification génique pour rechercherles bactéries pathogènes des aliments. A la suite de ce projet, préparation de la suite duprojet dans le cadre du réseau d’excellence MED-VET-NET.Le laboratoire poursuit des travaux de recherches sur :>> la caractérisation des E. coli entérohémorragiques (EHEC) et notamment sur lesérotypage moléculaire par amplification génétique (chimie TaqMan) >> différents axes de caractérisation des staphylocoques (en 2003 divers outils moléculairespermettant le typage toxinique des gènes sea à sej ainsi que l’existence d’une nouvelleentérotoxine putative ont été décrits).>> le projet Européen « Genus Clostridium » avec la publication sur la prévalence de C.botulinum dans les matières premières destinées à la fabrication des produits de IVe et Ve

gamme.

Le laboratoire est impliqué dans la caractérisation moléculaire des Salmonella et des Listeria,notamment par électrophorèse en champ pulsé (PFGE) lors d’investigationsépidémiologiques en collaboration avec l’institut Pasteur, la DGAl et l’InVS ou dans le cadrede projets de recherche sur la caractérisation moléculaire des principaux sérovars deSalmonella par typage moléculaire et la construction d’une base de données ou surl’exposition au danger L.monocytogenes isolées de saumon fumé et de munster.Enfin le laboratoire a participé aux essais inter-laboratoires européens pour le typage parPFGE de Salmonella et L.monocytogenes dans le cadre du projet Pulse-Net Europe qui seraintégré dans le réseau d’excellence MED-VET-NET

AntibiorésistanceLes travaux sur cette thématiques ont été marqués par :

>> L’étude de la résistance aux antibiotiques de souches de Salmonella collectéesdans le cadre du réseau : 3673 souches analysées en 2003 avec mise en évidence del’émergence de souches résistantes aux céphalosporines de 3ème génération (C3G). Lacaractérisation des gènes impliqués a été réalisé en collaboration avec le CNR dessalmonelles et l’INRA-Nouzilly.


>> La fin des travaux sur la prévalence des salmonelles multirésistantes dans la filièrebovine et les facteurs y contribuant (collaboration avec l’ENVA). >> La thèse en cours sur l’épidémiologie des salmonelles multirésistantes auxantibiotiques>> Le démarrage d’un projet "Aliment-Qualité-Sécurité" (AQS) concernant larésistance aux antibiotiques de la flore bactérienne des végétaux consommés crus>> La participation au programme européen de surveillance de la résistance desbactéries d’origine animale ARBAO II

Virologie des aliments et de l'eauLe laboratoire est en charge des travaux de développement méthodologique afin d'identifier,de caractériser et de quantifier à partir des aliments et de l'eau (de boisson, agronomique ouindustrielle), les principaux virus responsables d'hépatites ou de gastro-entérite d'originealimentaire. Dans le cadre d’un projet AQS, il coordonne la mise au point d'une méthode dedénombrement des virus entériques cultivables et des bactériophages, à partir des salades.Le laboratoire conduit également des travaux afin de suivre en temps réel, les réactionsd'amplification enzymatique en chaîne des génomes viraux (RT-PCR en temps réel). Cetteanalyse ouvre des perspectives de détection et de dénombrement des virus difficilementcultivables, tels que le virus de l'hépatite A.

Organismes génétiquement modifiésLe laboratoire vient d'achever un projet AQS qui étudie chez les bovins le devenir dutransgène au cours des différentes étapes de transformation chez l’animal. Ce projet apermis la mise au point et l’optimisation de tests moléculaires sensibles, à haut pouvoir dedétection, ciblant la construction génétique du maïs BT 176 consommé par les animaux et leproduit d’expression du gène d’intérêt. Suite aux travaux de collaborations avec la société Roquette et l’Inra, publication par lelaboratoire d'un test de PCR-ELISA pour rechercher la présence du promoteur 35S dans lesmaïs OGM Bt176, Bt11, Mon810 et le soja RRS.Participation au groupe de travail OGM du COFRAC et achèvement du programmed’accréditation destiné aux laboratoires effectuant la détection des OGM.Enfin, démarrage, en collaboration avec le Geves d’un nouveau programme de recherchedestiné à identifier les OGM qui ont été détectés à l’état de traces dans certains lots desemences de maïs de production française.

Appréciation des risques microbiologiques

Missions d'appui scientifique et techniqueLe laboratoire participe à la coordination et à l'exploitation des résultats d'un essai inter-laboratoires international ISO sur l'incertitude liée à l'hétérogénéité de répartition desmicro-organismes dans les matrices alimentaires.


Suite à l'identification d'un problème sanitaire relatif à la contamination par Listeriamonocytogenes de poissons crus marinés, il a été réalisé sur des produits de la mer crustransformés, un suivi de contamination naturelle en Listeria monocytogenes au cours d'uneconservation avec ou sans rupture de la chaîne du froid. Certains de ces produits ont aussiété l'objet de tests d’épreuve microbiologique.

Activités de recherches associéesDans le cadre d'un projet de recherche qu'il coordonne et dont l'objectif est d'élaborer uneméthodologie en vue de déterminer le niveau d'exposition à Listeria monocytogenes lors de laconsommation de produits réfrigérés, les travaux ont porté en 2003 sur les points suivants :acquisition de données expérimentales relatives à la croissance de L. monocytogenes dans desproduits naturellement contaminés, caractérisation de la variabilité de croissance entre lessouches de L. monocytogenes, modélisation des interactions entre L. monocytogenes et la floreannexe, méthodologie d'ajustement d'un modèle à des données issues de tests d’épreuve.D'autre part, un programme AQS relatif à la caractérisation des distributions de latencescellulaires des populations de Listeria monocytogenes a été engagée en collaboration avecl’Enva.

Ecophysiologie bactérienne et étude de l'environnement desprocédés

Missions d'appui scientifique et techniqueTravaux de pré-normalisation et de normalisation relatifs à l’aptitude au nettoyage desmatériels agroalimentaires. De plus le laboratoire collabore avec la CNAM à la définitiond’une liste de sols recommandés en agroalimentaires.

Activités de recherches associéesLes causes et les conséquences de la contamination microbienne des surfacesinertes. Les travaux réalisés sur cette thématique concernent un projet Afssa (inter-laboratoire)associant l’Inra et intitulé : "Écologie et physiologie de L. monocytogenes dans les sitesindustriels et devenir dans l’aliment" dont les résultats laissent supposer que ce seraitessentiellement la présence d’anfractuosités non détectées qui serait la cause de lapersistance de certains clones dans les ateliers. D’autre part, afin de mieux connaître lesmécanismes de résistance de L. monocytogenes aux désinfectants, le criblage d’une banque demutants construite au laboratoire a été réalisé. Enfin, des travaux visant à évaluer lesmodifications au cours du temps de la charge microbienne des surfaces inertes des ateliersont démarré en 2003 dans le cadre d’une thèse d’Université.


Interactions microbiennesLe laboratoire conduit des travaux destinés à caractériser, au niveau moléculaire, desactivités inhibitrices (bactériocines, phages) produites par Listeria spp. (collaboration avecAgriculture Canada), dans le but d’améliorer les méthodes d'enrichissement lors de ladétection de L. monocytogenes dans les aliments.

Impact du stress froid sur la cultivabilité des Salmonella et la sécurité duconsommateurAfin de limiter la sous-estimation tant de la prévalence que du nombre de Salmonellaprésentes dans les aliments, l’impact de deux stress froids fréquemment rencontrés au seindes laboratoires d’analyses (congélation et réfrigération) a été étudié.

Microbiologie générale et hygiène en restauration collective

Missions d'appui scientifique et techniqueLaboratoire central des services vétérinairesAnalyses de microbiologie des aliments dans le cadre de contrôles systématiques etinvestigations de toxi-infections alimentaires pour le compte des DSV 75, 92 et 93, et plansde surveillance pour le compte de la DGAl.

Normalisation analytique.Le laboratoire est impliqué dans la normalisation de méthodes horizontales (tous produits).Il participe aussi aux travaux concernant les caractérisations de méthodes, les validations, etl’incertitude de mesure en microbiologie.

Essais relatifs aux matériels de restauration collectiveL’activité de laboratoire d’essai pour l’attribution de la marque NF Hygiène alimentaire auxmatériels de restauration s’est poursuivie : les performances frigorifiques ou thermiques ainsique l’aptitude au nettoyage des appareils présentés à la marque sont mesurées.

Activités de recherches associéesInvestigations microbiologiques des toxi-infections alimentairesEvaluation de la dose – réponse : les travaux menés ont pour but de mettre en place uneméthodologie de recueil de données complémentaires de celle habituellement collectéeslors de l’investigation des Toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Ces donnéesservent à la modélisation de la dose - réponse.Application des méthodes microbiologiques dans le cadre des investigations en cas de toxi-infections alimentaires et maladies des aliments. Un travail d’adaptation des méthodesnormalisées aux cas particuliers rencontrés au laboratoire est effectué.


Hygiène des procédés en restauration collectiveDes travaux de recherche visant à évaluer les dangers microbiologiques en restauration sontmenés. Cette évaluation s’effectue par caractérisation des couples temps-températureutilisés au cours des opérations de fabrication, stockage et distribution.

Lait et produits laitiers

L’activité du laboratoire sur le lait et les produits laitiers, implique l’ensemble des équipes,néanmoins elle concerne des missions spécifiques d’expertise et de recherche centréesparticulièrement sur certaines équipes spécialisées constituant le Pôle « Lait et produitslaitiers » mais aussi d’autres équipes du laboratoires contribuant aux missions de référencesnationale et communautaire.

Missions d'appui scientifique et techniqueLaboratoire communautaire de référence "Lait et produits laitiers"Le LCR Lait a organisé en 2003 deux réunions des Laboratoires nationaux de référence Lait:la première, les 3 & 4 juillet, a permis de présenter les travaux réalisés pendant les deuxannées passées, et d’envisager le programme de travail pour les deux années à venir. Laseconde, les 13 & 14 octobre, organisée spécifiquement à l'intention des nouveaux Etatsmembres de l'Union européenne, avait pour objectifs de présenter le Laboratoirecommunautaire de référence (LCR) aux futurs Laboraotires nationaux de référence (LNR)de ces pays et de recenser leurs besoins.Le laboratoire a conduit en interne des travaux de développement analytique surl’applicabilité aux produits laitiers de la méthode de référence sur la recherche deCampylobacter (méthode normalisée, actuellement en révision par l'ISO). Il a organisé unessai interlaboratoires d’aptitude à l’intention des Laboratoires nationaux de référence sur larecherche de L. monocytogenes. Il a mené une étude approfondie de deux procédésd’extraction rapide (TCA) ou hautement spécifique (immunopurification) des entérotoxinesde staphylocoques à partir des produits laitiers comme procédés alternatifs à ceux décritsdans la méthode officielle. Une technique de détection immuno-ernzymatique de cesentérotoxines, alternative à la technique de référence officielle a été validée par lelaboratoire. Enfin, des essais sur l'activité phosphatasique dans les laits de chèvre et de brebisont été entrepris, tout en améliorant la nouvelle méthode de référence (fluorimétrique)pour les contrôles officiels.Le LCR Lait a apporté à la Commission européenne son expertise pour la poursuite de lapréparation d’un règlement européen sur les critères microbiologiques et d’un avisscientifique d’évaluation des risques liés aux entérotoxines de staphylocoques dans lesproduits laitiers.


Normalisation analytiqueLe laboratoire est fortement impliqué dans l’élaboration de normes analytiques, tant auniveau national en participant aux travaux de l’Afnor qu’au niveau européen (CEN) ouinternational (ISO/FIL/AOAC). Soulignons en tant que points marquants l’organisation d’unessai inter laboratoire international pour la validation statistique de l’humidité des caséines,la rédaction en étape finale du projet de norme internationale matière sèche des yaourts, etdes spécifications techniques pour la quantification de l’acide citrique dans les fromages etfromages fondus.En 2003 un agent du laboratoire à été élu à la présidence du groupe de travail conjointISO/FIL/AOAC « traitements thermiques ».D’autre cette année a été marqué par l’organisation, avec l’Afnor, de la réunion du groupede normalisation européenne CEN TC 302 (lait) à Paris au mois d’octobre.

Evaluation des risques et expertisePrès de 7000 analyses diverses et de confirmation ont été réalisées dans le cadre ducontrôle des produits laitiers soumis à l’intervention ainsi que pour les investigations en casde toxi-infections alimentaires collectives Par ailleurs, l’expertise du laboratoire estrégulièrement sollicitée par l’ONILAIT, en particulier pour 2003, sur l’application del’autocontrôle en alimentation animale, sur des niveaux des nitrates anormalement élevésdans des poudres de lait françaises, et sur l’évolution du marqueur vanilline dans le beurre etbeurre concentré en fonction des conditions de conservation.Le laboratoire représente la délégation française au groupe des experts chimistes « lait etproduits laitiers» (CE, DG Agri). En particulier des sujets tels que la révision du règlement213/2001 sur les méthodes d’analyse et d’évaluation de la qualité du lait et des produitslaitiers, ainsi que l’élaboration d’un règlement européen sur le yaourt nous ont fortementmobiliséUne réunion organisée par la DGAl et regroupant une quarantaine de laboratoiresvétérinaires pratiquant la recherche des entérotoxines de staphylocoques dans les matriceslaitières a eu lieu début décembre 2003 pour faire le point sur la réglementation en vigueuret les avancées analytiques ainsi que proposer la création d’un réseau regroupant leslaboratoires d’application.

Activités de recherches associéesComposition, valeur nutritionnelle et qualité du lait et des produits laitiersAcides gras conjugués (CLA): Afin de déterminer l'implication des CLAs sur les risques dedéveloppement d'athérosclérose, en collaboration avec l'Inra et l'Enva, le laboratoire a misen place une expérimentation animale visant à étudier l’influence de l’acide ruménique (CLA18:2 9cis, 11trans) à différent taux, au cours d’un régime hypercholestérolémiant. Certainsparamètres sanguins en relation avec les risques de développement d'athérosclérose, telsque dosages des lipoprotéines plasmatiques ont été étudiés ainsi que les dépôts lipidiques surla crosse aortique et le dosage des lipides hépatiques.


Marqueurs enzymatiques de traitements thermiques en sub-pasteurisation : Dans lebut de caractériser les laits thermisés, une étude sur le couple enzymatiquefucosidase/phosphatase a été réalisée. En collaboration avec l’ITPLC pour la fourniture deséchantillons, l’étude a été élargie aux laits de chèvre en étudiant l’influence de la race et de lapériode de lactation, des variations journalières et de celles observées au cours d’une mêmejournée sur la fucosidase et la phosphatase. Un travail analogue a été réalisé sur des laits debrebis.Choix d’un marqueur pertinent pour la mise en évidence de l’authenticité dubabeurre utilisé en alimentation animale : La teneur en lactates et le ratio des protéinessériques sur les protéines totales ont été étudiés comme paramètres chimiques pouvanttraduire l’ajout de lactosérum acide. Un projet expérimental avec fabrications pilotes a étémis au point, afin de vérifier le bien-fondé des hypothèses émises.

Hygiène et microbiologie du lait et des produits laitiersL’impact des micro-organismes du lait sur le comportement de Listeria monocytogenes entechnologie laitière, en fonction des traitements thermiques appliqués au lait, a été étudié encollaboration avec l’INRA de Jouy-en-Josas, à partir de la mise en œuvre de différentestechniques de biologie moléculaire qui permettent de caractériser rapidement la floremicrobienne présente dans les laits crus ou traités thermiquement : TTGE (TemporalTemperature Gradient Gel Electrophoresis), DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis) et CE-SSCP (Capillary Electrophoresis Single Strand ConformationPolymorphism)..Une méthode de dénombrement pour L.monocytogenes à des faibles niveaux decontamination a été développée. Cette méthode a permis d’évaluer l’effet de la taille de lacontamination initiale (et particulièrement pour des inocula faibles) de L. monocytogenes sursa croissance dans les aliments ou des milieux synthétiques.

Toxine bactérienne du lait et des produits laitiersLe projet AQS intitulé « Développement et validation de colonnes d’immunoaffinité en vued’optimiser la recherche des entérotoxines de staphylocoques dans les matricesalimentaires » regroupant le laboratoire, la société Diffchamb et un laboratoireinterprofessionnel (LIAL M.C.) s’est achevé en 2003 avec la mise au point d’un nouveauréactif d’immunopurification des entérotoxines à partir de produits laitiers.Les premières étapes d’un projet de recherche Afssa dont le but de synthétiser desanticorps recombinants anti-entérotoxines à partir d’une banque naïve de phages(collaboration Institut Pasteur de Paris) sont réalisées.


Toxines et contaminants physico-chimiques

Missions d'appui scientifique et technique

Laboratoire national de référenceLa démarche de coordination de la surveillance officielle nationale et des produits importésen matière de phycotoxines diarrhéiques et associées, paralysantes et amnésiantes a étéétablie.Plusieurs centaines d’analyses de confirmation ont été réalisées dans le cadre du contrôle etde la surveillance des polluants organiques (carbamates, acrylamide) et pesticidesorganochlorés et organophosphorés ainsi que des contaminants de l’environnement(polychlorobiphényls indicateurs ou PCBI).Près de 600 analyses diverses et de confirmation ont été réalisées dans le cadre du contrôleet de la surveillance des contaminants inorganiques en parallèle à l’animation d’un réseau deplus de 40 laboratoires départementaux et à l’organisation de 3 formations et 4 essaisinterlaboratoires d’aptitude (radionucléides et métaux lourds).

Evaluation des risques et expertiseParticipation aux travaux des Comités d’experts spécialisés de l’Afssa notamment sur lessaisines "acrylamide", "aluminium", « méthylmercure », « méthodes d’analyse descyanotoxines », « purification et expédition des coquillages », « agriculture biologique :partie mycotoxines » et coordination des recueils de données analytiques dans le cadre destâches SCOOP de coopération européenne "Toxines de Fusarium" « Métaux lourds » et"Organoétains".En tant qu’expert individuel, une mission « Contrôle des coquillages » pour le compte del’Office Alimentaire et Vétérinaire de l’UE a été effectuée au Canada. Dans le cadre d’unecoopération internationale de l’Afssa, une mission d’expertise en Algérie pour l’évaluation dela mise en place d’un laboratoire de contrôle officiel des contaminants physico-chimiques etphycotoxines a été réalisée. Diffusion d’informations sur les contaminants inorganiques (éléments traces) : En tant quemembre de l’action concertée européenne "EVISA-European Virtual Institute for SpeciationAnalysis", le laboratoire continue d’apporter sa contribution au nouveau site webwww.speciation.net qui a pour objectifs de rassembler les compétences des experts et lesdonnées disponibles sur les connaissances et la toxicité des éléments traces, leurs méthodesd’analyse permettant la spéciation des différentes formes présentes, la mise en place del’assurance qualité, sur les niveaux de contamination dans les denrées alimentaires et lesdifférents compartiments de l’environnement, sur les méthodes de prévention et dedécontamination, l’amélioration de la qualité des produits industriels

Normalisation analytiqueLe laboratoire est très impliqué dans l’élaboration de normes analytiques, tant au niveau


international en participant aux travaux de l’Afnor qu’au niveau européen (CEN) ouinternational (ISO). Il vient de reprendre l’animation du groupe miroir français du CEN« Pesticides dans les produits gras ». Une application de la nouvelle norme ISO 16140 apermis de démontrer qu’une méthode d’extraction faisant appel à l’acide trichloracétique nepouvait être utilisée pour la détection des entérotoxines de staphylocoques dans lesfromages au lait de chèvre.Dans ce cadre, le laboratoire animant également le groupe miroir français du CEN« Eléments traces (Métaux Lourds) ». il a collaboré à la parution de six normes européenne(CEN/TC 275/WG 10) concernant les critères de performances, l’échantillonnage et lapréparation des échantillons, les méthodes de digestion et de détermination des élémentstraces (Hg, Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Cr, Mo) dans les aliments.En collaboration avec plusieurs laboratoires européens, dans le cadre des activités denormalisation du CEN/TC 275/WG 10, participation à l’élaboration et la validation d’uneméthode de référence pour analyser les éléments traces dans les aliments par détection parICP-MS.

Activités de recherches associées

Une thèse en cours sur la caractérisation chimique des ciguatoxines de l’océan indien(isolement, purification, mise au point d’une méthode d’identification et de dosage parspectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide (LC/SM-SM) dans le cadre duprojet AQS relatif à la sécurité sanitaire des produits de la pêche tropicale de l’océan indienentrant sur le marché européen (collaboration MNHN, ESPCI, ARVAM). Une thèse sur la contribution à l’appréciation du risque pour l’homme lié à la présence de lagymnodimine, phycotoxine neurologique émergente, dans les coquillages s’est achevée. Ellecomprend également une réflexion approfondie sur la mise en place d’un système demanagement de la qualité en recherche.

Acrylamide : Les méthodologies dont celle basée sur la chromatographie liquide couplée à laspectrométrie de masse en tandem ont été mises au point et seront utilisées pour laproduction de données analytiques dans certaines matrices alimentaires, ce qui permettrad’alimenter les banques de donnée sur l’acrylamide

Chlordécone : Réflexion et examen du dossier analytique de la chlordécone dans les denréesd’origine animale en Martinique et Guadeloupe, suite à une saisine de la Direction généralede la santé.

En collaboration avec les Ecoles nationales vétérinaires de Toulouse et de Maisons-Alfort,sur la « Contribution à l’évaluation des risques liés à la présence de cadmium dans lesaliments. Etude des interactions entre le cadmium et les minéraux essentiels par dosagesimultané par ICP-MS », un mémoire de thèse a été rédigé et 5 publications ont étéacceptées ou sont en voie de l’être.


En collaboration avec l’Afssa-OCA et l’unité Mét@risk de l’Inra, l’évaluation de l’expositionde la population française par l’étude dite "Total Diet Study" après digestion micro-ondessous pression et détermination par ICP-MS de 20 éléments traces sur 1080 échantillons esten cours. En collaboration avec l’Afssa-Hydrologie de Nancy, lancement d’une nouvelle étude portantsur la détermination du tritium libre par détection par scintillation liquide sur des eauxminérales et de source..En collaboration avec le laboratoire Afssa de Niort, optimisation et quantification dusélénium, du cuivre et du zinc et d’autres oligo-éléments par détection par ICP-MSd’échantillons de foie de chèvres, dans le cadre d’une étude in vivo portant sur l’évolution desprofils plasmatiques selon la quantité et la nature des vitamines et oligo-éléments apportés.


Site de Maisons-AlfortLaboratoire d'Etudes et de Recherches en Pathologie animales etZoonosesDirecteur : Eric Plateau

Les activités du laboratoire portent sur les zoonoses et les maladies constituant desrisques sanitaires majeurs (maladies de la liste A de l'Office international desépizooties et maladies de la liste B réglementées). Les travaux effectués visent d'unepart à améliorer les outils de détection et de caractérisation des agents des maladiestransmissibles et d'autre part à harmoniser et évaluer les méthodes d'analyse utiliséesdans les laboratoires de terrain. Ils permettent enfin de surveiller la situationsanitaire, détecter toute menace, conseiller les tutelles sur les mesures préventives oucuratives à mettre en œuvre. Le laboratoire est aussi laboratoire national deréférence pour de nombreuses maladies et zoonoses. Ses unités sont par ailleursimpliquées dans plusieurs projets de recherche nationaux ou internationaux.

Le laboratoire a établi de nombreuses collaborations avec d'autres laboratoiresinternationaux de référence, avec d'autres organismes de recherche nationaux,européens ou de pays tiers (Belgique, Espagne, Italie, Royaume-Uni, Mexique, Chine,Corée, Iran, Tunisie particulièrement).

Les grands axes de recherches :o La virologie : barrière d’espèces ; virus équins et virus émergents et

réémergentso Les zoonoses bactérienneso La parasitologieo L’épidémiologie

L’appui technique et l’expertiseo L’identification d’agents infectieuxo L’organisation d’essais inter-laboratoires d’aptitudeo Le contrôle de réactifs biologiques et de vaccinso Les expertises immunosérologiques


Laboratoire national et OIE de référence et Centre collaborateur de la FAO pour labrucellose, la tuberculose et la paratuberculose.

Centre national de référence (CNR) pour la brucellose et la tularémie humaine Laboratoire associé au CNR du Charbon (Institut Pasteur, Paris) Laboratoire national de référence pour le charbon bactéridien, la chlamydophilose

aviaire, la métrite contagieuse équine, la tularémie, la fièvre aphteuse, la maladievésiculeuse du porc, la peste équine, la morve, la dourine et la trichinellose.

Laboratoire national de référence pour l’anémie infectieuse des équidés avec L’Enva.

68 personnes 5 unités de recherches dont deux unités de virologie intégrées dans l’UMR virologie(Afssa-Enva- Inra) et une unité de parasitologie intégrée dans l’UMR BIPAR (Afssa-Enva-Inra).

Recherche

Virologie

Les activités de l’UMR Virologie 1161 Afssa/Enva/Inra sont centrées sur les viroses animalesà risque zoonotique et/ou d’émergence, l’étude de leur physiopathologie, le développementde nouvelles approches de diagnostic ou de prévention, ainsi que la participation à desréseaux de surveillance épidémiologique.

Pour de nombreuses familles virales, les risques de transmissibilité animal vers homme nesont que faiblement connus émergentes. L’UMR contribue à une recherche spécifiquedédiée aux risques potentiels liés aux virus animaux chez l’homme, par l’étude desinteractions virus/hôte favorisant ou limitant les transmissions interspécifiques, en particulierdans le sens animal /homme. Les recherches sont actuellement ciblées aux interactions avecdes tissus humains essentiellement i) à la porte d’entrée muqueuse ou ii) après localisationdans un des tissus cibles retenu : le tissu nerveux. L’objectif est de compléter lescompétences, outils et réseaux collaboratifs afin de devenir un pôle de référence dans cedomaine.


Les méthodes de prévention sont orientées vers des approches vaccinales, en privilégiant lavoie d’administration orale compte tenu des cibles prévisibles dans la faune sauvage. Lesefforts sont poursuivis afin de mieux comprendre les interactions d’adénovirus avec lesépithéliums muqueux, par ailleurs complémentaires au plan méthodologique du programmedécrit ci-dessus. Des approches originales reposant sur l’utilisation d’adénovirus modifiésdans leur cycle de réplication et/ou leur protéines de structure sont poursuivies de manièreà cibler les muqueuses et développer des outils génériques susceptibles d’être utilisés chezles mammifères par voie locale.

LNR pour plusieurs maladies virales de la liste A de l’OIE, l’unité assume également desmissions de recherche appliquée et d’appui technique qui entretiennent des fortes relationsavec le terrain, ainsi que des compétences particulières en méthodes analytiques appliquéesau diagnostic et à l’épidémiologie. L’UMR participe ainsi également aux activités desurveillance épidémiologique et de typage de souches de certaines maladies émergentes ouzoonotiques, virales ou à agent non conventionnel, sur lesquelles nous nous appuyons pourisoler les souches engagées dans les recherches ci-dessus.

L’UMR virologie comprend :

Génétique virale Le développement de vaccins adénoviraux

Les mécanismes d’induction des réponses immunes systémique et muqueuse aprèsadministration vaccinale ont été étudiés. Différentes modifications de la particule virale ontpermis d’étudier et de modifier les interactions avec les cellules et tissus impliqués dansl’établissement d’une réponse immune systémique et muqueuse.

Des adénovirus animaux porcin et canin ont été générés sous forme de vecteurs défectifs,réplicatifs ou pseudoréplicatifs pour application à la vaccination faune sauvage : sanglier etPeste porcine classique ; carnivores sur le modèle rage.

Des premiers essais ont été conduits en matière de développement de vaccins contre lesprions dans un modèle murin.

Les Prions : rôle de la PrP dans la mort neuronale et dans l’entrée par voie digestive Le rôle anti-apoptotique possible demontré pour la première fois pour la PrP-c in vivo, enfaveur de l’hypothèse selon laquelle une altération du rôle physiologique de la protéinepourrait être responsable de la mort des neurones observée dans le cas des maladies àprion. L’unité a par ailleurs développé l’étude de l’expression intestinale de la PrPc sur unmodèle de culture d’entérocytes et des modèles in vivo et in vitro de franchissement de labarrière digestive par les ATNC

Virologie Barrière d’espèces Les objectifs de cette unité sont l’étude des risques de contamination inter espèces enprenant pour modèles les virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) et de l’hépatite E (HEV).


Ce choix est dicté par les dangers potentiels de contamination virale du porc à l’homme parl’intermédiaire des réactifs médicamenteux et des xénogreffes. L’étude est effectuée à troisniveaux : épidémiologique, développement d’outils de diagnostic, étude moléculaire.

Epidémiologie : Pour le virus de l’EMC, une première enquête épidémiologique effectuée en collaboration lelaboratoire de l’Afssa- Ploufragan est terminée .Une autre enquête sur la prévalence sérologique de l’EMC et de l’HE au sein de lapopulation humaine, en accord avec l’Etablissement Français du Sang se met en place. Ilserait intéressant de constituer une banque de sérums au laboratoire notamment pour desenquêtes rétrospectives notamment en cas d’émergence de nouveaux virus animaux.

Des techniques de diagnostic sont mises au point dans les domaines suivants : Virus de l’EMC : le test ELISA mis au point est en cours de validation avec l’utilisationdes sérums de l’enquête.

Virus de l’HE : une protéine structurale a été exprimée à partir d’une partie de l’ORF2.Cette protéine est en cours d’étude pour son introduction dans un test ELISA.

Biologie moléculaireDes recherches sont réalisées vis à vis du virus de l’EMC avec, notamment, son interactionavec différents types de cellules afin de déterminer les facteurs impliqués dans latransmissibilité inter-espèce et la pathogénicité.Des essais d’adaptation aux cellules BRL ont donnés des résultats en cours d’exploitation.Concernant l’étude de la sensibilité de cellules primaires humaines, les premiers résultatsmontrent que celle-ci varie en fonction de la souche virale et du type cellulaire. Par ailleurs,le rôle de certaines mutations, identifiées au niveau du génome viral, en relation avec laspécificité cellulaire de l’EMCV sont en cours de vérification. Les facteurs impliqués dans sonpouvoir neurotrope et les interactions avec le tissu nerveux sont en cours d’étude.

Virologie des équidés et des virus émergents et ré-émergents La fièvre catarrhale du mouton (« bluetongue ») : les études relatives à la phylogéniedes orbivirus se sont poursuivies dans le cadre notamment du contrat européen QLK2 CT2000 00143. Ces données ont permis de préciser les relations phylogénétiquesqu’entretiennent les différents sérotypes présents dans le bassin méditerranéen (1, 2, 4, 9 et16) et d’identifier 3 segments (2, 9 et 10) dont la variabilité génétique indique que ceux-ciseraient impliqués dans les mécanismes de déterminisme de la virulence. Une base dedonnées accessible sur le web sur la phylogénie des orbivirus a été initiée en collaborationavec l’ « Institute for Animal Health » de Pirbright, GB

Par ailleurs ans le cadre du projet de développement de vaccins recombinants léporipox-bluetongue avec l’Envt et l’Inra de Toulouse, les gènes qui codent les protéines VP7, NS1 ,


NS2 et NS3 ont été clonés dans des vecteurs de transfert et d’expression. Les protéinesVP7, NS1, NS2 et NS3 ont été, ou sont en cours, d’expression Pour la protéine VP 7 quis’avère particulièrement intéressante pour le sérodiagnostic de groupe « bluetongue undépôt de brevet est en cours. Des tests ELISA utilisant ces antigènes sont en cours de miseau point.

– La maladie de Borna : la technique sérologique permettant la détection, chez leschevaux, d'anticorps dirigés contre le virus Borna (techniques ELISA et Western blot) aété validée. Dans le cadre du projet « trans-zoonose », financé par l’Inra, des enquêtesépidémiologiques ont été initiées concernant l’infection de la faune sauvage. Unecollaboration avec le CHU de Bordeaux a été développée pour ce qui concerne le volethumain.

- La fièvre aphteuse : dans le cadre d’une thèse de l’Université Paris 7 et d’unecoopération avec l’Institut des maladies exotiques d’Anyang (République de Corée) lecriblage d’une banque de peptides aléatoires a permis d’identifier deux épitopescorrespondants aux anticorps opsonisants mais non-neutralisants. Une étude sur l’activitéd’inhibiteurs de la mirystilation du virus aphteux a été entreprise et donne des résultatsprometteurs. Enfin, dans le cadre du programme « ACI microbiologie INSERM/INRA », lesprotéines recombinantes VP4 d’IBDV (virus de la maladie de Gumboro » - VP1 (protéine destructure du virus de la fièvre aphteuse » ont été exprimées et purifiées. Leur antigénicitéest en cours d’évaluation (collaboration avec l’Inra de Jouy-en –Josas).

Zoonoses Bactériennes L’unité a fourni depuis plusieurs années un très important effort de recentrage et deconcentration des moyens vers les affections zoologiques bactériennes ayant un impactmajeur en santé publique. Son implication dans des programmes européens d’envergureest le fruit des efforts consentis.Ainsi, elle participe au programme COST 845 « Brucellosis in man and animals » et à l’actionconcertée « Veterinary Network of laboratories Researching Improved Diagnosis andEpidemiology of Mycobacterial Diseases (VENoMYC » L’unité a débuté ses études sur la PCR en temps réel pour les principales infections dont ellea la charge.

Brucellose La mise en place d’outils moléculaires de différenciation des souches de Brucella a commencéet les premiers essais ont été conduits pour la différenciation entre souches sauvages etvaccinales. La surveillance de la brucellose chez le sanglier sauvage en France (collaborationDgal/Oncfs/Afssa) s’est poursuivie dans 22 départements sur plus de 1500 sérums et aconfirmé la très large endémie de brucellose dans cette espèce.


La 3e phase de l’étude comparative des tests sérologiques réalisés sur extraits pulmonaireset musculaires a confirmé la possibilité d’utiliser les extraits musculaires à la place du sérumpour les enquêtes de prévalence. L’existence d’un nouveau biovar de Brucella abortus (biovar7) identifié une première fois en 1999 en Mongolie a été confirmée en Turquie. Lescollaborations développées au plan international ont également permis la mise en évidencedu biovar 3 de B. suis chez le cheval et le sanglier en Croatie et celle du biovar 1 de B.abortus chez le buffle d’eau au Brésil.

Chlamydophilose aviaireL’unité a été associée sur cette thématique à l’enquête épidémiologique sur les pigeons deParis dans le cadre de l’installation expérimentale d’un pigeonnier (collaboration ENVA). Des investigations ont été menées sur plusieurs oiseaux d’une animalerie et certains de sesfournisseurs suite au décès d’un patient lié semble-t-il à l’ornithose-psittacose.La collection de souches a été développée et le typage moléculaire de ces souches a pudébuter. L’unité a poursuivi ses travaux de développement de tests de diagnosticimmunologique ou par PCR.

MycobactériosesLa mise au point d’un test PCR à partir de souches puis de prélèvements pathologiques pourla mise en évidence de Mycobacterium bovis (agent de la tuberculose animale) et lacaractérisation des isolats de la faune sauvage dans plusieurs régions françaises avecdifférents marqueurs moléculaires pour déterminer des liens épidémiologiques avec desfoyers de ruminants domestiques ont été poursuivies.De nouvelles méthodes de genotypage, « Variable Number Tandem Repeat (VNTR) » surdes isolats de la faune sauvage et de foyers bovins ont été mises en place.Une étude, en collaboration avec l’Inra, sur la biodiversité de M. avium subsp paratuberculosissur des souches d’origines géographique et animale diverses a été initiée de même qu’unsuivi sérologique de troupeaux mixtes suspects de paratuberculose (bovin, ovin, caprin) del’Inra.

Charbon bactéridienL’étude de génotypage réalisée précédemment par l’Institut Pasteur et l’université d’Arizonasur les souches françaises a été complétée par une étude des profils biochimiques desdifférents génotypes identifiés de Bacillus anthracis et de bactéries proches au planphylogénétique appartenant à la famille des Bacillus.L’étude de la distribution des terres charbonneuses en France et de la relation avec la naturedes sols se sont poursuivies.

TularémieL’évaluation de la PCR initiée en 2001 s’est poursuivie sur les prélèvements reçus.


Immunologie parasitaire et fongique L'Unité mixte de recherche Afssa/Inra/Enva intitulée “ Biologie moléculaire etimmunologie parasitaires et fongiques ”, « BIPAR » a pour objectifs l’étude des relationshôtes-pathogènes (biologie des agents, épidémiologie moléculaire, réactionsimmunitaires) et leurs conséquences sur la pathogénie, le diagnostic et les moyens delutte vis-à-vis des maladies parasitaires, fongiques ainsi que des maladies bactériennestransmises par les ectoparasites.Depuis sa création en 2000, elle a pu rapprocher les efforts de recherche présents surle site autour notamment des outils de la biologie moléculaire dans un souci decomplémentarité et de synergie. Deux thèmes fédérateurs ont été retenus :

- l'étude des zoonoses parasitaires, et au premier rang d’entre elles lesTrichinelloses

- les mycoses opportunistes et les infections émergentes qui ont aussi desimplications en pathologie comparée : Aspergillus, Pneumocystis (barrièred’espèce), Bartonella comme modèle de bactéries transmises par desectoparasites.

Trichinellose La cartographie des antigènes de Trichinella est en cours. Des épitopes critiques de Trichinellaont été mis en évidence avec des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre les stadesAdulte et L1NN du parasite. Les épitopes reconnus par ces anticorps sont en coursd’analyse en partenariat avec 4 laboratoires nationaux et européens :Les gènes spécifiques de stade ont été étudiés, notamment l’antigénicité des produitsd’expression des gènes spécifiques de stade. Un premier antigène majeur a été caractérisé(projet de brevet en cours). Deux antigènes codant pour des proteines fixant l’ADN ontégalement été analysés après séquençage complet.Par ailleurs l’analyse de la réponse immunitaire mucosale anti-trichine a porté sur l’invasionde Trichinella in vivo et la réponse humorale locale.

Mycoses opportunistes transmise par voie aérienne : aspergillose et pneumocystose L’équipe travaille sur le thème « Etude de la physio-pathologie et de l’épidémiologie desmycoses opportunistes. Relations entre mycoses animales et humaines. ». Ces recherchesont pour objectifs généraux une meilleure compréhension de l’épidémiologie des mycoses,l’optimisation des méthodes de diagnostic et la mise en place de méthodes de lutte adaptées.Deux projets ont été développés :

- interactions entre conidies d’Aspergillus fumigatus et cellules épithéliales desvoies aériennes supérieures chez l’homme et chez l’animal,

- épidémiologie des mycoses se transmettant par voie aérienne(pneumocystoses et aspergilloses).


Bactéries pathogènes vectorisées par les tiques Les travaux ont porté sur la définition des réservoirs de Bartonella dans les animaux derente, les mécanismes moléculaires de sa persistance et sa transmission ainsi que laconfection de tiques par des bactéries pathogènes. L’amplification d’un fragment d’ADN,codant pour les ARNr 16S et 23S, a permis un typage rapide des souches. En collaborationavec le département de microbiologie de l’université de Bale, une étude de mutants de B.birlesi ayant perdu le pouvoir de bactériémie chez la souris a été entamée. L’ADN deBartonella a été retrouvé dans différentes mouches hématophages des mammifères et laprésence conjointe de bactéries pathogènes a été recherchée.

EpidémiologieAu cours de l’année 2003, l’unité d’épidémiologie a poursuivi ses recherches dans ledomaine de la modélisation de diverses maladies transmissibles comme la fièvre aphteuse etl’encéphalite a virus West Nile.L’épidémie de SRAS a fortement implique l’unité qui participe aux études internationales surl’origine et la diffusion de cette maladie. Deux missions en Chine ont notamment étéeffectuées avec l’Union européenne, l’OIE, la FAO et l’OMS. Un programme européenimpliquant au niveau français l’Afssa et le muséum d’histoire naturelle a été élaboré etdevrait prochainement démarrer.

L’appui scientifique et technique et l’expertise

Virologie des équidés et des virus émergents et ré émergents ;Bluetongue : environ 380 prélèvements biologiques (Corse et île de la Réunion) ont étéreçus en 2003. En Corse, un virus de sérotype 4 a été isolé ; dans l’île de la Réunion, unvirus de sérotype 3 a été isolé.Fièvre aphteuse : Outre sa participation aux essais inter-laboratoire européen pour lediagnostic sérologique et virologique de la maladie vésiculeuse du porc l’unité a étendul’étude des réactions non spécifiques en seronoutralisation a diverses souches exotiques devirus de la FA : SAT 1, A Iran, Asia) .Par ailleurs, dans la perspective de sérologies enurgence et sur large échelle et corrélativement a la politique de décentralisation sélectivedes analyses vers des laboratoires d e terrain, il a été procédé à des études de spécificitédes 2 kits actuellement disponibles (Chekit test pour la détection des anticorps anti protéines nonstructurales et Ceditest pour la détection des anticorps spécifiques du type O)West Nile : L’unité a diagnostiqué plusieurs cas d’infection à virus West Nile chez le chevaldans le Var. Enfin, 906 sérums ont été traités dans le cadre d’une enquête sérologique miseen place par la DGAl et la DDSV du Var suite a la mise en évidence de cas cliniques chezl’homme et le cheval.


LNR pour les maladies virales réglementées du cheval ainsi que pour la morve et la dourinele Laboratoire d’études et de recherches en pathologie animale et zoonoses est sollicité enpermanence pour des suspicions cliniques ou des contrôles aux échanges internationaux ,10% environ des demandes émanant d’organismes étrangers (Services vétérinaires, organismesprofessionnels) car le nombre de laboratoires dans le monde capable de traiter l’ensemblede ces maladies et ayant une expérience suffisante en ces domaines est très peu élevé. Plusde 6000 échantillons biologiques (soit près de 20 000 analyses) constitués en majorité dessérums ont ainsi été traités dans le cadre de la surveillance et du contrôle des maladiessuivantes : anémie infectieuse, artérite virale, grippe, peste équine, morve, dourine, …

Zoonoses bactériennesDans le cadre des activités de référence, l’unité a effectué plus de 20 000 prestationsd’analyses, dont 2500 analyses de bactériologie, de PCR ou d’épidémiologie moléculaire. Plusde 40 lots de vaccins ou de réactifs de diagnostic ont été contrôlés pour la brucellose et latuberculose. Le laboratoire a également organisé des essais inter laboratoires et des formations auxtechniques de diagnostic à destination des laboratoires d’application (brucellose, charbon,métrite contagieuse équine, tuberculose, tularémie).

ParasitologieL’Unité parasitologie a conformément a ses missions auprès des tutelles, assuré la formationdes laboratoires de terrain, le contrôle des résultats et l’analyse des donnéesepidemiologiques nationales. Par ailleurs une enquête sérologie trichine (convention ONC)chez le sanglier visant à déterminer la séroprévalence apparente de Trichinella chez lesanglier a été menée en utilisant l’ELISA antigène excrétion/sécrétion (E/S), seul test deréférence actuellement disponible. Des échantillons de références et des préparationsantigéniques standards ont été réalisées pour mieux calibrer le test ELISA actuellement

utilisé. Dans le cadre des exportations de chevaux ou les suspicions de Babésiose clinique ont plusde 2500 prélèvements ont été traités au cours de l’année. Enfin l’unité assure un service en microscopie électronique. qui a pu traiter 23 dossiers,correspondant à 248 colorations négatives, 137 blocs et autant de coupes ultra finesanalysées.

Epidémiologie

L’unité d épidémiologie a assuré la permanence pour l’aide aux suspicions des maladiesvesiculo-aphteuse et a la formation des vétérinaires sanitaires en ce domaine. Elle a participéà la surveillance au diagnostic et au contrôle des foyers de Bluetongue en Corse et à laRéunion.


Site de NancyLaboratoire d’études et de recherches sur la rage et la pathologiedes animaux sauvagesDirectrice : Florence Cliquet

La rage vulpine a été la première mission du laboratoire et constitue encoreaujourd’hui une part importante de ses activités. Laboratoire communautaire deréférence en matière de rage animale, l’Afssa Nancy étudie les questions relatives auxmouvements internationaux des carnivores domestiques dans le cadre des mesuresalternatives à la quarantaine. Centre collaborateur de l’OMS pour la recherche etl’organisation de la lutte contre les zoonoses et laboratoire de référence de l’OIEpour la rage, le laboratoire de Nancy mène également des recherches sur la santé etla gestion de la faune sauvage.

Les grands axes de rechercheLa biologie des LyssavirusL’épidémiologie de la rageLa santé et la gestion de la faune sauvage et la mise au point de méthodes de régulationbiologique de certaines populations animales

L’appui scientifique et technique et l’expertise, notamment :L'organisation et la réalisation des campagnes de vaccination orale des renards contre la rageLe diagnostic de rage et les titrages sérologiquesLa surveillance sérologique des sangliers sauvagesLa validation des tests sérologiques et l'organisation de tests interlaboratoires d'aptitude

Centre collaborateur de l’OMS pour la recherche et l’organisation de la lutte contre les zoonosesLaboratoire de référence de l’OIE pour la rageLaboratoire de référence du Ministère de l’Agriculture et de la pêche pour le diagnostic derage (épidémiologie) pour le titrage des anticorps antirabiques séroneutralisants dans lecadre des mesures alternatives à la quarantaine ;Laboratoire de référence des ministères de l’agriculture britannique, suédoise etnorvégienne pour la mesure de la réponse immunitaire des animaux candidats aux mesuresalternatives à la quarantaine (validation des méthodes, tests inter-laboratoire)Désigné par le Conseil de l’Europe comme "Institut spécifique pour l’établissement descritères nécessaires à la standardisation des tests sérologiques de contrôle de l’efficacité desvaccins antirabiques".

3 unités42 personnes


La rage

Le laboratoire étudie plusieurs domaines de la rage animale incluant l'épidémiologie, lapathogénie, l'immunologie et les mécanismes moléculaires. Même si l'éradication de la ragevulpine en France métropolitaine est acquise, le dernier cas de rage terrestre datant de findécembre 1998, la persistance d’un foyer de rage en Allemagne et la démographie explosivedu renard imposent le maintien d’une épidémiosurveillance. A ceci s'ajoute la capacitéd'intervention en cas de retour de la maladie ainsi que la mise au point de moyenscomplémentaires, notamment la maîtrise de la reproduction des canidés. Enfin les donnéesépidémiologiques nouvelles confirment la nécessité d'une veille scientifique et la conduited'études spécifiques à la biologie des lyssavirus de chauves-souris, dont la pathogénicité a faitl’objet des premiers essais expérimentaux.La France étant un pays indemne de rage depuis plus de 4 ans, les préoccupations évoluent.L’un des objectifs du laboratoire est de promouvoir des méthodes nouvelles permettantd'éviter la quarantaine sans accroître le risque d'introduction de carnivores domestiques ouautres mammifères en incubation de rage. Des efforts importants sont mis en œuvre pour la poursuite de la reconnaissance dulaboratoire en tant que laboratoire communautaire de référence. De nombreux contactsont été établis afin de former des personnes de différents laboratoires à la sérologieantirabique en vue d’agréer les laboratoires nationaux des dix pays candidats qui viennentd’entrer dans l’Union Européenne.

Recherches sur la santé et la gestion de la faune sauvage

Le laboratoire assure une veille sanitaire et l’organisation du recueil des données de terrain,lui permettant de participer à la réflexion épidémiologique sur la faune sauvage. Il aégalement une approche spécifique relative à l’épidémiologie analytique ou opérationnelle dezoonoses ou de maladies partagées impliquant des Mammifères sauvages : rongeurs (fièvreshémorragiques à syndrome rénal), renards (échinococcose alvéolaire) ou sangliers (pesteporcine classique).Il comprend une station expérimentale située à Atton. Cette station constitue uneinstallation classée soumise à déclaration, unique par sa taille en Europe. Cet outil permetactuellement d'expérimenter jusqu'à 250 carnivores sauvages.

Recherche

Rage des chiroptères

Les objectifs du programme de recherche soutenu et financé par la DGAl, consiste à estimerles risques pour la santé publique liés à l'éventuel portage de lyssavirus par des chiroptères etd'approfondir les connaissances sur la potentialité des lyssavirus portés par les chauves-sourisautochtones à contaminer d'autres espèces animales. L'ensemble permettra de mieuxconnaître la pathogénie de la rage chez les chauves-souris européennes.


Le laboratoire a assuré, à la demande de la DGAl, l'animation du réseaud'épidémiosurveillance des lyssaviroses des chiroptères auquel participent les DSV, leschiroptérologues bénévoles (principalement de la SFEPM) ainsi que les vétérinairespraticiens. Il couvre désormais toute la France métropolitaine. Le nombre de chauves-sourisreçues pour diagnostic de rage est passé de 15 en 1999 à 202 en 2002 et 251 en 2003.

Il est à remarquer que parmi les quatre dernières chauves-souris positives analysées deseptembre 2002 à décembre 2003, trois ont été trouvées porteuses de la souche EBL1a,souche jamais isolée auparavant en France, les autres chauves-souris positives étant toutesmontrées porteuses du virus EBL1b. Le virus EBL1a a en effet été isolé pour la première foisen France en août 2002 à Guéret (23) (sérotine commune diagnostiquée positive à l'Afssa-Nancy), ensuite en janvier 2003 à Chemellier (49) par l'Institut Pasteur, puis à Carmaux (81 ;souche isolée par l'Afssa-Nancy). La comparaison des séquences nucléotidiques (les 40premières bases) du gène de la nucléoprotéine des deux souches (Carmaux et Guéret) apermis de montrer 99,2 % de similarité nucléotidique.

Ce nouvel isolement du virus EBL1a, largement distribué en Allemagne, Pays-Bas etDanemark suggère une certaine évolution épidémiologique des lyssavirus isolés sur chauves-souris en Europe.

Immunocontraception du renard

Dans le cadre du développement de nouvelles techniques de régulation biologique despopulations croissantes de renards, le programme de mise au point d’un vaccin contraceptifss’est poursuivi. Ce programme se justifie en tant que mesure d’accompagnement de la luttecontre la rage en cas de réémergence de la rage vulpine mais aussi dans le cadre du contrôlede l’échinococcose alvéolaire dans certaines zones.

Parmi les six protéines isolées a partir de spermatozoïdes de renard et fortementantigéniques, nos effort ce sont concentrés sur une d’entre elles, la protéine fSP13 de 97kDa . La spécificité d’organe a été confirmée par les techniques de Northern et Southernblot.Un premier vaccin ADN a été construit avec le gène de la protéine fSP13 sous le contrôled’un promoteur CMV. Les premiers essais d’expression du vaccin ADN sur cellules sont encours et la vaccination des renards en captivité est envisagée prochainement.L’étude de l'immunité du renard, en particulier la réponse immunitaire de type cellulaire, aété poursuivie. Un test Elispot spécifique du renard est maintenant au point, pour les celluleslymphoides et les splénocytes in vitro. La meilleure compréhension des mécanismes de laréponse immunitaire du renard roux permettra d'obtenir rapidement les informations surl’efficacité des formes vaccinales envisageables pour le vaccin contraceptif.Le contrôle et la maîtrise de la reproduction du renard en captivité sont maintenant acquis.La sélection des reproducteurs s'est poursuivie ce qui permis d’améliorer les résultats.


Portage d’Echinococcus multilocularis

L’étude de la présence du parasite chez le renard (un des hôtes définitifs) s’est poursuiviedans 36 départements français. Ce projet est réalisé en collaboration avec l’Université deFranche-Comté et l’Entente Interdépartementale de lutte contre la Rage et autresZoonoses.A ce jour, 5481 échantillons ont été récoltés grâce à l’aide des Fédérations de Chasse. Larecherche du parasite s’effectue sur les fèces collectées par l’intermédiaire de deux testslaboratoires : ELISA et PCR. La présence du parasite est aujourd’hui confirmée (ELISA etPCR) dans 5 départements avec des intensités différentes.Un programme de recherche sur les carnivores domestiques a été initié en 2003. Laquestion est de savoir si les animaux domestiques jouent un rôle dans la transmission duparasite à l’homme. Cette étude est réalisée en collaboration avec le Centre collaborateurde l’OMS pour la prévention et le traitement des échinococcoses humaines (Université deFranche-Comté/CHU de Besançon) et la MSA (Franche-Comté). La recherche du parasite,notamment par le développement d’un test de diagnostic individuel, a démarré.Un programme de recherche sur les renards en milieu péri-urbain (grande agglomérationNancéenne) a débuté cette année.

Epidémiologie de la fièvre hémorragique à syndrome rénal (FHSR)

Cette zoonose émergente fait l’objet d’un contrat Inserm dont l’intitulé du projet est : « Lesrisques d’émergence d’hantavirus dans de nouveaux territoires ? Evaluation et prévision de ladynamique épidémiologique ». Deux stratégies sont développées :- l’étude des virus circulants dans la faune sauvage. Ce point nécessite de développer desoutils de biologie moléculaire notamment pour développer des tests spécifiques. - comprendre la dynamique du virus Puumala dans des populations de rongeurs en vued’anticiper la survenue de zoonose.En 2003, 643 échantillons ont été analysés et la prévalence est de 39,05 % par la techniquede capture/marquage/recapture et de 5,66 % par la technique de capture seule.L’année 2003 a présenté un pic épidémique aussi bien dans les populations de rongeurstouchés que dans le nombre de cas humains.

Appui scientifique et technique et expertise

La dernière campagne de vaccination orale des renards contre la rage

La laboratoire a organisé la dernière campagne de vaccination en automne (pas de campagneau printemps) ainsi que le suivi des opérations de vaccination, en collaboration avec l’Officenational de la chasse et de la faune sauvage (Oncfs). Des prélèvements par tirs de nuit sur


renards (2001 : 402 prélèvements, 2002 : 420 prélèvements, en 2003 : 207 prélèvements) etdes recherches de tétracycline sur dents de renards ont été réalisés (en 2001 : 193, en2002 : 168, en 2003 : 200).

Activités de référence

896 diagnostics de rage ont été mis en oeuvre, donnant lieu à un diagnostic positif sur unechauve-souris du Tarn (octobre 2003) (sérotine commune). Une autre sérotine commune(Maine-et-Loire) a été diagnostiquée positive pour la rage par l’Institut Pasteur de Paris(janvier 2003).Enfin, en janvier 2003, un cas de rage a été identifié par l’Institut Pasteur de Paris sur unchien dans la ville de Cayenne (Guyane Française).L’année 2003 a été marquée par une stabilisation relative du nombre de sérums à analyser(5000 en 2001, 6000 en 2002, 6300 en 2003) dans le cadre des mesures alternatives à laquarantaine.

Programme national de surveillance sérologique des sangliers sauvages etprogramme de validation des tests sérologiques sur des extraits musculaire etpulmonaire chez le sanglier sauvage :

Cette étude est menée conjointement par l’Oncfs, l’Afssa (laboratoires de Malzéville etPloufragan) et l’Ecole nationale vétérinaire d’Alfort.Les risques sanitaires liés aux sangliers sauvages pour l’élevage porcin, n’ont pas diminué,tant vis-à-vis de la maladie d’Aujeszky (MA) que d’infections réémergentes telles que labrucellose. Par ailleurs la prévalence de la trichinellose, zoonose parasitaire majeure chez lesanglier reste très mal connue en France. De plus, depuis avril 2002 des cas de Peste porcineclassique ont été diagnostiqués le long de la frontière Luxembourgeoise.La peste porcine fait donc l’objet d’un programme spécifique de surveillance frontalière.Pour la saison 2003-2004, 35 départements parmi les 42 sollicités ont envoyé environ 1800sérums. Depuis le début du programme en 2000, 7500 sérums ont été collectés dans 73départements. La couverture géographique est donc satisfaisante. Une enquête a été menéeafin d’effectuer une épidémiosurveillance des trois maladies transmissibles entre suidéssauvages et domestiques. Un rapport de synthèse des résultats de l’étude a été effectué parl'AFSSA Nancy et a ensuite été distribué par la Direction générale de l'alimentation àl’ensemble des Directions des services vétérinaires.Ce programme a permis de confirmer la présence de la maladie d’Aujeszky dans certainsdépartements, la prévalence générale de la brucellose en France, d’estimer la fréquence del’infestation par la trichine chez le sanglier et d'établir une carte épidémiologique desmaladies. Il est prévu de ne pas renouveler la campagne de prélèvements pour la saison dechasse 2004-2005. Toutefois, une nouvelle campagne de prélèvements ciblée sur certainsdépartements dont la situation sanitaire et épidémiologique est intéressante, pourra êtremise en place en 2005-2006.


En ce qui concerne l’étude des maladies sur les extraits d’organes, la mise au point etl’adaptation des techniques de diagnostic se sont poursuivies. Les résultats préliminairesmontrent la difficulté d’obtenir un test sensible et spécifique sur les organes. Il en ressortnéanmoins que les prélèvements musculaires pourraient permettre une épidémiosurveillanceavec un nombre important d'échantillons. L'intérêt de ce programme est confirmé par le casclinique de brucellose du à B. suis 2 sur un chasseur du Gard en mars 2004.

Valorisation - Expertise

Validation d’un test ELISA de screening pour le titrage des anticorps antirabiques chez lechien et le chat. Le test, malgré ses imperfections (en particulier manque de sensibilitédiagnostique et de reproductibilité) a été présenté une seconde fois comme test descreening à la Commission des Normes de janvier 2003 et accepté définitivement lors desjournées de mai 2003 à l’OIE (il avait été refusé en 2002).

Conduite de deux jumelages avec l’Estonie et la Slovénie pour la mise en place deprogrammes de vaccination orale de la faune sauvage contre la rage.

Expertises sur les méthodes de vaccination orale applicables au renard (2 expertises enUkraine) et au chien (une expertise au Maroc).

Participations à plusieurs congrès internationaux et nombreuses présentations orales dulaboratoire dans les domaines de la rage et de la gestion de la faune sauvage. Plusieurspublications parues dans des revue à comité de lecture.


Site de NancyLaboratoire d’études et de recherches en hydrologieDirecteur : Jean-François Munoz

Le laboratoire d’études et de recherches en hydrologie intervient à la demande de laDirection générale de la santé dans l’instruction réglementaire des demandesd’autorisation d’exploitation pour les eaux minérales et d’agréments des matériauxde conditionnement des eaux.

Le laboratoire collabore avec les organismes publics dans le domaine de l’eau. Ses principauxpartenaires sont les ministères de la Santé et de l’Industrie, les services déconcentrés(Ddass, Drire) et les laboratoires régionaux agréés pour le contrôle des eaux minérales.

Les grands axes de recherchela chimie minérale- les micropolluants organiques- la microbiologie

L’appui technique et l’expertise- les procédures réglementaires d’autorisations- les agréments de matériaux de conditionnement des eaux- le fichier national des sources d’eaux minérales- la normalisation

13 personnes

Domaines d’intervention- Les procédures réglementaires d’autorisation

Pour les eaux minérales, et sur saisine de l’Afssa par la Direction générale de la santé, lelaboratoire effectue une visite des installations (émergence, traitement, utilisation etembouteillage) et détermine les caractéristiques physico-chimiques et bactériologiquesd’échantillons d’eaux. Il émet un rapport technique et sanitaire sur les installations existanteset la qualité du produit, qui représente une contribution majeure de l’avis donné par l’Afssa.

- Les agréments de matériaux de conditionnement des eaux Pour l’homologation des matériaux de conditionnement des eaux, le laboratoire effectue desanalyses physico-chimiques et bactériologiques complétées par des tests organoleptiques etla recherche de monomères résiduels, afin de garantir l’inertie des matériaux sur la qualitéde l’eau embouteillée.

- Le fichier national des sources d’eaux minéralesLe laboratoire reçoit et archive l’ensemble des résultats d’analyses physico-chimiques etbactériologique du contrôle sanitaire effectuées par les laboratoires agréés sur les eaux


minérales naturelles autorisées en France. L’informatisation de ces données des années 1992à nos jours est en cours.

- La normalisationLe laboratoire participe à la commission T91M Eaux micropolluants organiques.

- L’expertiseLe laboratoire participe à des groupes de travail d’expertise de la Direction de l’évaluationdes risques nutritionnels et sanitaires de l’Afssa : « Eaux minérales naturelles », « Matériauxau contact des eaux », « Comité de suivi de l’expérimentation multi-sites du procédéd’ionisation cuivre-argent en vue de lutter contre le développement des légionnelles dans lesréseaux d’eaux chaude sanitaire ».

Données chiffréesEn matière d’hydrologie où les dossiers peuvent se traiter sur plusieurs années, l’activité semesure en nombre de rapports réalisés. Pour un dossier d’autorisation d’eaux minérales, unrapport se compose d’un descriptif du dossier, de commentaires détaillés et critiques desinstallations suite aux deux prélèvements espacés de 6 mois, puis d’une exploitation del’ensemble des résultats d’analyses obtenus (environ 120 paramètres). Pour un dossier d’agrément de matériaux de conditionnement des eaux, le rapport reposesur l’analyse des pièces du dossier, et l’exploitation des résultats d’analyses obtenus (physico-chimiques, bactériologiques et organoleptiques) au nombre de 12 paramètres.

MISSIONS ACTIVITES 19992000 2001 2002 2003

Autorisations d'eauxminérales

Prélèvements pour analysescomplètes

85 91 114 96 73

Rapports pour le CES « Eaux » del’Afssa

7 17 18

Agréments dematériaux plastiquespour leconditionnement deseaux

Rapports pour la DGS 57 50 50 58 69

Fichier des eauxminérales

Nombre de bulletins de contrôlesclassés

70707537 10510 9998 8848

Faits marquants

Dans le cadre des homologations de matériaux de conditionnement des eaux, le laboratoirea testé et validé un nouveau concept de poche à usage unique pour équiper les bonbonnesdes fontaines à eau.


Dans le cadre des autorisations d’exploitation d’eaux minérales naturelles, il a été détectédes traces de benzène dans une ressource exploitée pour du thermalisme. Les hypothèsesde pollution ayant été écartées, l’origine géologique de ce composé pourrait expliquer saprésence dans un gisement situé à 1800 mètres de profondeur. Un suivi sanitaire dupersonnel de l’établissement sera assuré.

Rapports d’expertises

2002-SA-0292 : Demande d'autorisation d’exploiter en tant qu’eau minérale naturelle, àl’émergence l’eau du captage "Carnot" et après transport a distance, l’eau des captages"Louise", "Aubignat" et "Carnot" et leur mélange sous le nom de "Châtel", situés sur lacommune de Châtel-Guyon (Puy de Dôme).

2002-SA-0319 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle, aprèstransport à distance, l’eau des captages "Saint Jean 1er" (ex "Saint Jean"), "Béatrix" et "SaintJean Impératrice" et après traitement leur mélange sous le nom de "Saint Jean", situés à Vals-Les-Bains (Ardèche).

2002-SA-0318 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu'eau minérale naturelle : - à l’émergence, l’eau des captages "Agnès", "Denise", "Eliane" et "Viviane" situés à Hauterive(Allier),- après transport à distance, l’eau des captages "Agnès", "Denise", "Eliane", "Viviane"situés àHauterive (Allier), "Professeur Louise Blanquet", "Ingénieur Louis Armand", "NicolasLarbaud", "Pierre Fraissignes", "Marcel Soulier", "François Fabvier", "Jean Féry" situés à Saint-Yorre (Allier), "Anémone", "Bleuet", "Coquelicot" situés à Saint-Sylvestre-Pragoulin (Puy-De-Dôme) et "Etoile d’Or" situé à Saint-Priest-Bramefant (Puy-De-Dôme),- après mélange des 15 sources précitées et traitement de ce mélange (déferrisation etregazéification) sous le nom de "Source Royale",

2002-SA-0197 : Demande d'autorisation d'exploiter, en tant qu'eau minérale naturelle, àl'émergence, après transport à distance et après traitement, l'eau du captage "FontaineDidier" situé à Fort-de-France (Martinique)

2002-SA-0327 : Demande d''autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle, àl'émergence, après transport à distance, après traitement et après mélange sous le nom de"Manon" l’eau des captages "Amélie " et "Des Colonies" situés à Vals-les-Bains (Ardèche).

2003-SA-0022 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle, aprèstransport à distance, l’eau du captage "Les Capucins" situé sur la commune de Saint Jeand’Angély (Charente-Maritime).


2003-SA-0079 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle, àl’émergence, l’eau des captages "Saint Jean 1er " (ex "Saint Jean"), "Béatrix" et "Saint JeanImpératrice " situés sur la commune de Vals-Les-Bains (Ardèche).

2003-SA-0051: Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle, àl'émergence et après transport à distance l'eau du captage "Yvroux" situé à Rennes les Bains(Aude).Demande d'autorisation d’exploiter en tant qu’eau minérale naturelle à l’émergence, aprèstransport à distance et après mélange sous le nom "d’Aligre", l’eau des captages "Le Lymbe","Piatot", "Reine" et "Marquise" situés sur la commune de Bourbon-Lancy (Saône-et-Loire).

2003-SA-0102: Demande de révision de l'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minéralenaturelle à l'émergence, l’eau du captage "Bayard" situé sur la commune de Larivière-Arnoncourt (Haute-Marne).

2001-SA-0303 : Demande d'autorisation d'exploiter, en tant qu'eau minérale naturelle, aprèstransport à distance, l'eau du captage "Catherine de Bourbon" situé sur la commune deSalies-de-Béarn (Pyrénées-Atlantiques).

2003-SA-0061: Demande d'autorisation d’exploiter en tant qu’eau minérale naturelle:- à l’émergence, l’eau du captage "Diva 2" situé à Quézac (Lozère),- après mélange (sous le nom de "Source Diva"), après traitement et transport à distance,l’eau des captages "Diva 1" et "Diva 2" situés à Quézac (Lozère).

2001-SA-0209 & 2003-SA-0107 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu'eau minéralenaturelle, à l'émergence et après transport à distance l'eau du captage "César" (FC2) situé àCauterets (Hautes-Pyrénées).

2001-SA-0274 : Demande d’autorisation d'exploiter, en tant qu'eau minérale naturelle, àl'émergence et après transport à distance, l'eau de la source "de la Liese" (forage CELTIC96.2) située sur la commune de Niederbronn-les-Bains (Bas-Rhin).

2003-SA-0108 : Demande d'autorisation d’exploiter en tant qu’eau minérale naturelle, àl’émergence et après transport à distance, l’eau du captage "Evua" situé sur la commune deNeuvecelle (Haute-Savoie) et de la mélanger avec les sources "Cachat".

2003-SA-0105 : Demande d'autorisation d’exploiter, en tant qu’eau minérale naturelle àl'émergence et après transport à distance l'eau du captage "Borro", situé à Saint-Lary-Soulan(Hautes-Pyrénées).

2003-SA-0147 : Demande d'autorisation d’exploiter en tant qu’eau minérale naturelle, àl’émergence et après transport à distance, l’eau des captages "Honorine" et "Occident Nord"


et après mélange sous le nom "d’Occident", l’eau de ces deux captages situés sur lacommune de Cambo-Les-Bains (Pyrénées Atlantiques).

2002-SA-0114 : Demande de révision de l'autorisation d'exploiter, en tant qu'eau minéralenaturelle, à l'émergence, l'eau du forage "Saint-Eloi" situé sur la commune d'Amnéville(Moselle).

2002-SA-0217 : Demande d'autorisation d'exploiter, en tant qu'eau minérale naturelle, aprèstransport à distance, l'eau du captage "Saint-Claude" situé sur la commune de Casteljaloux(Lot et Garonne).


Site de Niort Laboratoire d’études et de recherches caprinesDirecteur : Christophe Chartier

Appuyés sur une forte implantation au sein des structures d'élevage et detransformation de la filière caprine, les travaux du laboratoire portent sur lesmaladies des chèvres et l'hygiène et la qualité des produits laitiers caprins. Un serviced'autopsie permet au laboratoire d’assurer une activité d'épidémiosurveillance et desuivre les évolutions des différentes pathologies présentes ou émergentes. L’Afssa-Niort est Laboratoire National de Référence pour l’arthrite encéphalite caprinevirale. Il est, de plus, agréé pour le diagnostic de la tremblante caprine et de latuberculose (histologie).

Les axes de recherche, l’appui scientifique et l’expertise- la virologie moléculaire- l’épidémiologie parasitaire- l’hygiène et la qualité du lait- la tremblante- l’autopsie et le diagnostic- la tuberculose caprine- le diagnostic sérologique et virologique de la CAEV

- Laboratoire national de référence pour l’arthrite encéphalite caprine virale- à l’initiative d’un réseau de collaborations sur la tremblante caprine- participation au groupe de travail d’évaluation des risques liés aux « protozoaires dans l’eau et les aliments »

20 personnes

Pour assurer l'ensemble de ces missions, le laboratoire a développé des collaborations avecdifférents organismes dans chacun de ses domaines de recherche. L’Inra pour laparasitologie, les mycoplasmes, la tremblante, et les antiparasitaires, l’Inserm (UniversitéBordeaux) et l’Institut vétérinaire de virologie de Berne pour les lentivirus. Il entretient aussides relations étroites avec les organisations professionnelles auprès desquelles il assure desfonctions de conseil scientifique et technique. Le laboratoire assure des formationssupérieures vétérinaires en matière de pathologie ovine et caprine ainsi que des formationsdestinées aux éleveurs sur différentes thématiques (mycoplasmes, cellules et infectionsmammaires, paratuberculose,) à la demande des laiteries ou des chambres d’agriculture. Lesite de Niort bénéficie d'un soutien financier important de la région Poitou-Charentes.


Recherche

Virologie moléculaire des lentivirus des petits ruminants :

- Barrière d’espèceLes fortes prévalences des infections à lentivirus chez les petits ruminants (CAEV de lachèvre et Visna-Maëdi du mouton) et la fréquence élevée des passages interespècesconstituent une passerelle pour l’émergence de virus recombinants CAEV/MVV susceptiblesd’affecter l’efficacité des mesures de lutte et des méthodes de dépistage.Les enquêtes épidémiologiques conduites au sein d’élevages mixtes caprin/ovin ont étérenforcées par l’optimisation d’un test PCR à la base du typage moléculaire des isolatsviraux. Ce test PCR amélioré a permis de doubler le nombre d’échantillons positifs. Letypage moléculaire des nouveaux isolats a démontré une fréquence élevée du passage devirus CAEV de la chèvre au mouton.

- Facteur de virulence du virus CAEVLes études menées sur une protéine virale d’intérêt ont été poursuivies dans le butd’élaborer une souche CAEV atténuée pour une approche vaccinale chez la chèvre. Uncontrôle négatif de cette protéine sur l’expression du virus à la surface cellulaire a étédémontré et les motifs impliqués dans cette régulation ont été identifiés à l’aide de mutantsde délétion.

Epidémiologie parasitaire :

- Les méthodes alternatives de lutte contre les nématodes gastro-intestinauxLa forte prévalence des nématodes résistants aux benzimidazoles en élevage caprin oblige àchercher des méthodes alternatives aux traitements chimiques et à évaluer leur efficacité.Une de ces méthodes, l’utilisation de spores de champignons prédateurs (Duddingtoniaflagrans) pour les larves de nématodes parasites, est actuellement testée au laboratoire. Lestravaux menés en 2003 ont suivi 3 axes principaux :

- détermination de la dose optimale en conditions d’administration contrôlée et enconditions d’élevage par mesure de la réduction du développement larvaire,

- efficacité en situation d’élevage par suivi de paramètres zootechniques etparasitologiques sur une saison de pâturage,

- impact environnemental sur les populations non cibles en vue d’une utilisation àgrande échelle.

Des discordances importantes apparaissent entre les résultats d’efficacité au laboratoire ousur le terrain. Elles peuvent tenir à l’administration des spores aux animaux ainsi qu’audéveloppement du champignon nématophage dans le milieu extérieur. Pour ce qui est del’impact environnemental, aucun effet défavorable n’a été relevé que ce soit sur la vitesse dedégradation des fèces, sur le développement de la faune coprophage ou sur les populationsde nématodes libres du sol.


- Epidémiologie et contrôle de la cryptosporidioseL’excrétion d’oocystes de Cryptosporidium parvum par les animaux adultes a été caractériséedans différentes classes d’âge puis autour de la mise bas en fonction de l’intensité d’excrétiondu parasite par les chevreaux. Une étude préliminaire de Giardia duodenalis a été entreprise.

Hygiène et qualité du lait :

Mycoplasmoses caprinesLes caprins ont la particularité d’héberger des mycoplasmes au niveau des oreilles. Lorsd’une enquête sur 15 élevages de statut différent (sain ou infecté), le portage auriculaire desmycoplasmes a été retrouvé dans pratiquement la totalité de ceux-ci, indépendamment deleur statut. L’identification des mycoplasmes auriculaires, en partenariat avec l’Afssa Lyon, apermis de :

- vérifier l’absence de mycoplasmes « exotiques » (les agents de la péripneumoniecontagieuse bovine et de la pleuropneumonie contagieuse caprine),

- d’établir la fréquence de portage auriculaire pour les souches impliquées dans lesépisodes pathologiques ( 38 % de M. mycoides mycoides LC, 3 % de M. capricolumcapricolum, 4 % de M. putrefaciens et 1 % de M. agalactiae),

- de mettre en évidence la présence de mycoplasmes spécifiques de ce biotope (M.yeatsii et M. cottewii) et des associations.

L’utilisation de techniques de biologie moléculaire devrait permettre de comparer lessouches de portage auriculaire et les souches responsables de foyers cliniques (projetEPIMYCO).

Santé de la mamelle : influence de la vitamine E et du sélénium L’influence d’un apport contrôlé en vitamine E et en sélénium, pendant la période sèche, surles infections mammaires a été étudiée : aucun effet de la supplémentation n’a pu être mis enévidence, ni sur les guérisons et les nouvelles infections. En revanche, la supplémentationpermet de limiter significativement l’augmentation des numérations entre 2 lactationssuccessives. Parallèlement, l’influence de la supplémentation des mères n’a pas augmenté laviabilité des chevreaux.

Activités d’appui scientifique et technique De par son implantation au cœur de la zone de production caprine, le laboratoire estsouvent sollicité pour des missions d’appui scientifique et technique (producteurs,vétérinaires, transformateurs)

- Laboratoire national de référence CAEV : 45 laboratoires départementaux ontparticipé aux essais d’aptitude en sérologie CAEV. 770 expertises sur sérums ont étéréalisées.


- Service d’autopsie (151 en 2003) et de diagnostic (524 dossiers d’analysereprésentant près de 5000 prélèvements traités) permettant le maintien d’un contact étroitavec le terrain (éleveurs, techniciens, vétérinaires) et constituant une activité de veilleépidémiologique probablement efficace.

- Tremblante : En 2003, 376 caprins ou ovins (159 élevages) l'ont été dans le cadredu Contrôle Sanitaire Officiel (histologie principalement).

- Prévalence relative au sein des troupeaux :Sept troupeaux soit 1968 animaux ont pu être étudiés au travers de prélèvements de tissuslymphoïdes et de SNC réalisés en équarrissage. La prévalence est comprise entre 0.3 % à 25% avec une sous estimation de celle-ci lorsque le diagnostic est limité aux tests rapides surtissus nerveux. Quatre troupeaux (903 animaux) ont fait l’objet de biopsies d’amygdales.

- Dissémination de la PrPsc dans l’organisme des animaux naturellement contaminés :L’autopsie fine de 20 animaux infectés (biopsie) d’un même troupeau, de classe d’âgesdifférentes, a permis d’établir les bases du schéma de dissémination de la PrPsc dansl’organisme chez les caprins naturellement infectés. Elle est complétée par l’étude d’unecohorte de 50 chevreaux inoculés par voie orale (en cours).

- Hygiène et qualité du lait : Les sujets traités concernent la sensibilité des Staphylocoques coagulase négative à la

novobiocine (facteur de pathogénicité), le suivi de différents foyers de mycoplasmoses pouraméliorer les outils de diagnostic (sérologie) et différents travaux concernant la qualité dulait de chèvre (relation urée et infections mammaires, composition et origine de la flore dulait, enquête sur l’origine des inhibiteurs).

- tuberculose : 107 prélèvements (ruminants et porcins) ont été analysés dans lecadre du diagnostic officiel (histologie).


Site de PloufraganLaboratoire d’études et de recherches avicoles et porcinesDirecteur : Gilles SALVAT

Le laboratoire de Ploufragan conduit des activités de recherche, d’appui scientifiqueet technique et d’expertise dans les domaines de la santé animale, du bien-être desanimaux et de l’hygiène des aliments appliqués aux productions avicoles, cunicoles etporcines.Il a fait l’objet en 2003 d’une évaluation collective de ses activités scientifiques ettechniques qui a été perçue comme très positive et est venu conforter les orientationsde la recherche au cours des 4 dernières années.

Laboratoire de national référence pour la maladie de Newcastle et l’Influenza aviaire et Salmonella dans la filière avicole pour la peste porcine classique et la peste porcine africaine associé au service de maladies contagieuses de l’Ecole nationale vétérinaire d’Alfort

pour la maladie d’Aujeszky de l’Office international des épizooties pour la maladie de Gumboro, Mycoplasma

gallisepticum et pour la maladie d’Aujeszky (associé dans ce dernier cas)

160 personnes

Le laboratoire contribue à l’amélioration de la santé, du bien-être dans les productionsavicoles, cunicoles et porcines et de la qualité hygiénique des produits qui en sont issus. Lestravaux menés portent sur l’origine et les mécanismes de virulence des agents responsablesdes maladies majeures et émergentes des productions mentionnées ci-dessus, leursméthodes de diagnostic et moyens de prévention. Ils contribuent à analyser les risquespotentiels liés à la consommation des produits d'origine avicole, cunicole et porcine et àprévenir les risques de contamination bactériologique de ces produits. Les travaux derecherche entrepris sur le bien-être des animaux intègrent les composantescomportementales et sanitaires des nouvelles méthodes d’élevage.

Les travaux conduits à l’Afssa-Ploufragan permettent une approche systémique et intégréedes problèmes des productions étudiées et utilisent la microbiologie, la parasitologie,l’épidémiologie, les biotechnologies dont la biologie moléculaire, la vaccinologie, lazootechnie et les analyses de système. Les activités des unités de recherches bénéficient del’appui de trois services expérimentaux qui sont une des composantes importantes du


laboratoire pour la production de poules, dindes, canards et porcs Exempts d’organismespathogènes spécifiés (EOPS), mais aussi pour des infections expérimentales en milieu confinéqui concernent les espèces avicoles, cunicoles et porcines ou l’évaluation des conséquencesdes différents systèmes d’élevages sur le bien-être des animaux et la sécurité sanitaire desproduits.

Les unités « Hygiène et qualité des produits avicoles et porcins » (HQPAP), « Virologie,immunologie, parasitologie aviaire et cunicole » (VIPAC), « Virologie, immunologieporcines » (VIP) et « Mycoplasmologie bactériologie » (MB) sont accrédités par le Cofrac.Par ailleurs, l’unité « Génétique virale et biosécurité » s’est engagée en 2003 sur la voie del’assurance qualité en recherche. L’année 2003 a été marquée par la fusion des systèmesqualités des différentes unités accréditées pour conduire avec succès début 2004 à un auditde l’ensemble de l’Afssa-Ploufragan.

Au cours de l’année 2003, le LERAP a été organisateur ou co-organisateur des 5e Journéesde la Recherche Avicole (Mars 2003) et des symposiums de l’ESVV (European Society forVeterinary Virology) (août 2003), du 16e symposium européen sur la qualité des viandes devolailles et du 10e symposium européen sur la qualité des œufs et des ovoproduits(septembre 2003).

Mycoplasmologie Bactériologie

Principaux résultats 2003/2004 :

La mise en évidence de la persistance du gène de résistance à la tétracycline tet Ochez Campylobacter jejuni inoculé à des souris à flore digestive humaine

L’extension aux mycoplasmes issus des filières bovine, ovine et caprine des travauxportant sur l’étude de la sensibilité/résistance aux antibiotiques

La détermination de la prévalence de Mycoplasma synoviae dans les troupeaux depoules pondeuses d’œufs de consommation des Côtes d’Armor, la recherched’hypothèses de facteurs de risque et l’évaluation des conséquences pathologiques,zootechniques et médicamenteuses de cette infection.

L’utilisation de cinq lignées cellulaires (épithéliales et fibroblastiques) afin depermettre d’étudier la capacité d’invasion intracellulaire de différentes espècesmycoplasmiques d’origine aviaire ou porcine.

Le choix du prélèvement le plus approprié pour détecter Streptococcus suis en élevagechez le porc vivant : l’écouvillonnage des amygdales.

La mise au point de la PCR-Ribotypage pour un suivi épidémiologique des souches deStreptococcus suis et son utilisation en élevage. L’application de cette technique autypage de 138 souches de S. suis a permis d'étudier les relations phylogénétiquesentre les souches isolées de cas pathologiques, chez l’Homme ou chez le porc, et lessouches isolées de porcs cliniquement sains.


L’étude de Mycoplasma synoviae, réisolé de poulets infectés expérimentalement puistraités à deux reprises à la dose thérapeutique d’enrofloxacine et présentant unediminution de la sensibilité. Le séquençage des différentes QRDR est en cours.

La détermination de la concentration minimale inhibitrice de différentes moléculesantibiotiques vis à vis de différentes espèces mycoplasmiques issues des filièresbovine, caprine et ovine (collaboration avec l’Afssa-Lyon et l’Afssa- Niort).

L’aboutissement des travaux réalisés dans le cadre du projet ACTIA visant àcomparer la sensibilité de souches de Campylobacter isolées, avant ou aprèsl’interdiction de l’utilisation des antibiotiques facteurs de croissance, soit de pouletsstandard ou label arrivant à l’abattoir, soit des produits finis issus des mêmes lots. Lesrésultats ont montré que les principaux facteurs influençant la sensibilité des souchessont l’espèce (C. jejuni plus sensible que C. coli), le type de production (souches issuesde poulets standard plus souvent résistantes que celles isolées de poulets label) et lapériode (souches isolées en 2001-2002 plus fréquemment résistantes que cellesisolées entre 1992 et 1995).

La poursuite des plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques des bactériessentinelles et zoonotiques de la flore digestive des porcs et des volailles (conventionDGAl).

La poursuite de la surveillance de la résistance aux antibiotiques chez les bactériespathogènes du porc et de la volaille (RESAPATH – Filières avicole et porcine ;convention DGAl).

La participation à trois séries d'essais inter-laboratoires européens (dont l’un a étéorganisé par les coordinateurs du RESAPATH) portant sur les techniquesd'antibiogrammes (E. coli, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pasteurella etActinobacillus).

Perspectives, outre la poursuite des travaux en cours

Le développement de travaux sur la pathologie respiratoire du porc, en collaborationavec l’Unité d’épidémiologie porcineL’étude de la persistance des mycoplasmes d’origine porcine chez des animauxexpérimentalement infectés, puis traités par une quinolone.L’étude de la capacité d’invasion intracellulaire de mycoplasmes d’origine aviaire et/ouporcine.L’étude du coût biologique de la résistance aux antibiotiques chez CampylobacterL’impact de la supplémentation en cuivre vis à vis de la résistance aux glycopeptides etaux streptogramines chez Enterococcus faecium.


Hygiène et qualité des produits avicoles et porcins

L'unité Hygiène et qualité des produits avicoles et porcins exerce des activités de rechercheet d'appui scientifique technique pour la maîtrise de la sécurité microbiologique des produitsissus des filières avicoles et porcines dans les champs d'activité suivants : épidémiologie/écologie de Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes dans les

filières de production de viandes et d'oeufs ; prévention et maîtrise des contaminations.

Filière porcine : La démarche intégrée qui prévaut en matière d’identification des dangers nous a

permis de décrire des sources de Listeria monocytogenes de sérovar 4b et depréciser les facteurs de risques de contamination spécifiques de certains types deconduite d’élevage. Plus en aval, la description de profils de flores associés à laprésence de Listeria monocytogenes sur les surfaces d’atelier de découpe et detransformation de viande de porc sera rendue possible grâce à une approchemoléculaire optimisée dans notre laboratoire. L’unité a participé au travailméthodologique visant à l’évaluation du devenir de faibles quantités initiales deListeria monocytogenes (suivis par miniNPP/ALOA, par centrifugation et filtration) dansdifférentes matrices alimentaires.

Parallèlement, les facteurs de risque d’excrétion de Salmonella par les porcs sont encours de validation expérimentale notamment par l’analyse quantitative de lacontamination d’effluents. Des études préliminaires de typage moléculaire, par PCR-SSCP (c’est considéré comme du typage ?), des flores digestives de porcs de mêmeorigine, devrait permettre d’établir les liens suspectés entre équilibre digestif etprotection vis à vis de l’excrétion de Salmonella.

Filière avicole :- Les résultats obtenus dans le cadre d’une étude sur l’écologie des flores pathogènes et

d’altération des ovoproduits montrent une influence du traitement appliqué à lamatrice œuf, un rôle de l’entreprise productrice et un effet destination du produit(exprimé par la DLC). Cette étude fournit un souchier qui sera exploité enmicrobiologie quantitative sur cette matrice. Le calcul de l’héritabilité de la résistanceaux salmonelles de souches de poules pondeuses est poursuivi.

- Par ailleurs, les expérimentations conduites sur les systèmes d’élevages alternatifs depoules pondeuses (volière) permettront après identification des bactéries récoltées destatuer sur les conséquences de ces systèmes sur la qualité bactériologique des œufsproduits.


- Les travaux concernant la maîtrise de Salmonella en filière de production de dindes’orientent désormais sur la prévention de l’excrétion au cours de la dernière semained’élevage. Expérimentalement 13 composés alternatifs à l’usage d’antibiotiques ont étécriblés pour leur effet sur la diminution du portage cæcal. Les 3 meilleurs candidatsseront retenus pour des essais sur le terrain. Pour des raisons pratiques, il convient devérifier que les lots de femelles (abattus 15 jours avant les mâles) peuvent constituer legroupe contrôle des mâles sur lesquels seraient appliqués les traitements.

- Enfin, un programme débuté en 2002 doit permettre de mieux cerner l’origine desSalmonella Typhimurium responsables de diarrhées chez l’homme (382 souches serontgénotypées et comparées). Une étude entreprise sur la bactériémie post-abattage chezles volailles souligne les difficultés méthodologiques pour l’obtention des résultats, il n’y apas d’effet attribuable au classement de la carcasse.

- Dans le domaine des Campylobacter, le travail sur les formes viables non-cultivables(VNC) devrait permettre de comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dansle passage des formes VNC aux formes cultivables. L’expression différentielle de gènessuite à choc aqueux froid (CAF) a été analysée par RT-PCR et utilisation d’une banquegénomique de C. jejuni précédemment mise au point. Les 10 gènes identifiés, sontimpliqués dans différentes voies métaboliques (protéines membranaires, de transport, deréparation de l'ADN). Une analyse protéomique a également été effectuée lors d'un CAFsur deux souches de C. jejuni. Elle permet de retrouver une traduction différentielle desgènes étudiés ci-dessus (i.e. mfd), de voir une forte implication de gènes de réponse austress oxydatif ainsi que de noter une différence importante dans le comportement des2 souches.

- Des expériences complémentaires ont été menées afin de conforter les résultatsconcernant l’adaptation physiologique de Campylobacter lors d'un CAF. Un supplémentsusceptible d’être additionné aux milieux de culture afin de favoriser le retour à lacapacité de culture des VNC est en cours de définition et de purification.

- Un essai de flore de barrière commerciale visant à limiter l’excrétion de Campylobacterdans un élevage de poulets de chair a montré des résultats encourageants, par contre lesanalyses des prélèvements obtenus à l’abattoir ne confirment pas l’effet observé. Si lesrésultats enregistrés quant à la quantité de Campylobacter parfois présents sur lesproduits justifient pleinement cette approche préventive en élevage, il semble qu’unemaîtrise des contaminations croisées dès les premières étapes de l’abattage s’impose.

- L’identification des circonstances associées à la contamination des poulets de chair élevésen plein air cible les phases avant / après "passage sur le parcours" et avant abattage. Lehaut niveau de contamination atteint dès la première phase suivie focalise ce travail surles facteurs de risque entourant la phase de claustration.

- Le typage moléculaire des souches des différents agents zoonotiques rencontrés dansprogrammes de recherche reste une activité importante de l’unité.


Activités d’appui scientifique et technique et d’expertise

- La participation aux essais inter-laboratoires organisés par le laboratoirecommunautaire de référence "Salmonella en filière avicole" (aptitude au sérotypage età l’antibiotypage et comparaison des méthodes ISO 6579 et U47-100).

- Le programme de surveillance de l’antibiorésistance des bactéries sentinelles etzoonotiques s’est poursuivi au cours de l’année 2003, l’identification des souches deE. coli et d’entérocoques est prise en charge par l’unité, ainsi que l’établissement desantibiogrammes des souches de Salmonella récoltées en 2003.

- La participation aux réunions du groupe V08-B (Microbiologie Alimentaire) del’AFNOR et à des réunions d’information auprès des structures professionnelles tantporcines qu’avicoles.

- La prise en charge des autocontrôles et des contrôles officiels des élevagesconventionnels et EOPS du laboratoire vis-à-vis des agents zoonotiques relevant desa compétence.

- La contribution aux travaux d’expertise de la Derns par la participation au CESMicrobiologie et au groupe de travail Campylobacter de l’Aesa.

VIROLOGIE IMMUNOLOGIE PORCINES

Activités de recherche

Peste Porcine Classique (PPC)

Influence de la virulence des souches virales de PPC sur l’immunopathogénicité du viruschez le porc et sur sa diffusion en zone de forte densité porcine, les études ont étéfocalisées sur les mécanismes d’interactions cellulaires susceptibles d’induire la déplétionlymphocytaire induite lors de l’infection par le virus de la PPC. Un modèle d’étudein vitro de l’apoptose a été mis au point. (3e année de thèse).

Caractérisation des souches virales isolées en Moselle (2002) et dans le Bas Rhin (2003).Les deux souches isolées en Moselle sur porc domestique et sur sanglier appartiennentau génogroupe 2.3, type Rostock, alors que la souche isolée à partir de sanglier dans leBas Rhin bien qu’appartenant au même génogroupe est de type Uelzen. Ces différencescorrespondent à deux introductions, l’une du Luxembourg et l’autre de RhénaniePalatinat. Des études de pathogénie sur porcs EOPS ont été réalisées avec les deuxsouches Mosellanes, mettant en évidence une virulence modérée et une faiblecontagiosité.

Détection des anticorps anti peste porcine classique à partir d’extraits musculaires oupulmonaires. Cette étude coordonnée par l’ONCSF et l’AFSSA Nancy, dans le cadre


d’une convention DGAl, a pris fin en 2003. Après trois campagnes de prélèvements, lesrésultats obtenus avec les exsudats musculaires ou pulmonaires ne conduisent pas àrecommander leur utilisation, la spécificité comme la sensibilité du test ELISA, étantfortement diminuées.

Peste Porcine Africaine (PPA), en collaboration avec le Cirad : Un essai sur porcs EOPS a permis de revivifier des souches virales à partir d’échantillons

prélevés à Madagascar Participation à une étude sur la détection génomique sur papiers buvards.

Immunologie - Vaccinologie Projet de vaccination orale des sangliers sauvages contre le virus de la PPC par

administration d’un antigène inerte en microsphères biodégradables (convention DGAlfinie en Novembre 2003). L’évaluation des réponses immunes suite à administrationmusculaire de la protéine recombinante E2 purifiée à partir de baculovirus recombinants(collaboration UVIP/UGVB) a permis de vérifier l’immunogénicité de la protéine, lesmécanismes mis en œuvre lors d’une administration nasale ou in situ sont en coursd’analyse. Dans le cadre d’un DEA (Octobre 2003- Juin 2004), en collaboration avec lelaboratoire de pharmacie galénique de l’université de Rennes 1, des travaux sur laformulation des microsphères sont en cours pour améliorer leurs captures par lescellules immunocompétentes.

Projet européen, 5e PCRD, (2001-2004) sur l’évaluation des réponses immunes induitespar de nouveaux vaccins marqueurs contre la PPC. Les ADNs plasmidiques permettentd’obtenir une protection partielle basée essentiellement sur des anticorps neutralisants.En revanche l’utilisation de protéine recombinante produite en système procaryote,capable in vitro d’activer des cellules dendritiques, n’est immunogène que pour laprotéine non structurale NS3, ce qui tend à démontrer que les épitopes impliqués sontde nature linéaire, contrairement aux glycoprotéines membranaires.

Etude de la migration des cellules dendritiques (DC) dans les organes lymphoïdes avecréalisation d’un essai expérimental sur porcs EOPS pour l’étude de la distribution desDC et autres cellules immunes au cours de la première semaine post infection par unesouche hypervirulente de PPC (2e année de thèse). L’étude de la localisation des diverstypes cellulaires est réalisé par immunohistochimie ainsi que par cytométrie en flux. Desessais de mise en culture des DC à partir des organes prélevés ont été réalisés pour enétudier le phénotype et la fonctionnalité.

Génération de DC porcines in vitro : amélioration de la purification des cytokinesrecombinantes GM-CSF et IL-4. Mise au point de l’isolement des monocytes sanguins paradhésion et premiers essais de différenciation en DC immatures.


Activités d’appui technique :

Laboratoire National de Référence des Pestes porcines classique et africaine- 140 analyses pour le diagnostic virologique différentiel PPC/PPA sur 108 prélèvementsreçus dans le cadre de suspicions,- 441 diagnostic sérologique différentiel PPC/pestivirus, 70 diagnostic sérologique PPA pourexportation- Organisation de l’essai annuel interlaboratoires d’aptitude à la sérologie PPC (une vingtainede laboratoires français et trois européens)- Participation à deux essais interlaboratoires européens : un d’aptitude pour la sérologie /virologie PPC et un d’intercomparaison des méthodes de détection par PCR du génomeviral de la PPC.- Contrôles initiaux et lot par lot des kits de diagnostic ELISA PPC. - Fourniture de réactifs au réseau de laboratoires agréés (souches virales et sérum deréférence)- Inspection OAV sur le plan d‘urgence peste porcine classique- Assurance qualité : Maintien de l’accréditation COFRAC sur le programme 109/02 pour lesanalyses : NFU47-025 (neutralisation virale PPC), IS350 (ELISA PPC), X01 (neutralisationvirale BD), et extension à l’isolement du virus de la PPC sur culture cellulaire, en novembre2002. Audit COFRAC en Juin 2003 et février 2004- Epidémiosurveillance des sangliers sauvages sur une zone de surveillance frontalièreincluant cinq départements du Nord-Est. Pour le compte de la DGAl, l’AFSSA Nancy etl’UVIP assurent en collaboration le suivi épidémiologique de la PPC sur la zone frontalière etles deux foyers de Moselle et du Bas Rhin. En 2003, 5342 prélèvements pour recherchesérologique et virologique ont été analysés à Ploufragan ; les résultats recueillis par l’AFSSANancy ont permis d’alimenter la base de données européennes et réaliser la cartographiedes foyers, outils d’aide à la décision sur les mesures de lutte à appliquer localement.

Maladie d’Aujeszky : Laboratoire de référence associé OIE : fourniture de sérums de référence à des

laboratoires vétérinaires départementaux et étrangers Programme d’enquête nationale de sérosurveillance sur sangliers sauvages (environ

1500 sérologies). Assurance qualité, maintien de l’accréditation Cofrac sur le programme

109/02/IS210, IS220 et IS221 (ELISA Aujeszky) et le programme 112/00/VA/220(Isolement du virus Aujeszky). Audit COFRAC en Juin 2003 et février 2004

Syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) : Fourniture d’antigène viral préparé sur macrophages pulmonaires de porcs EOPS, pour

la technique ELISA, à deux laboratoires d’analyse vétérinaire.


Activités d’expertise :

- Rapporteur de trois saisines de la DGAl auprès du CES santé animale de l’Afssa.- Participation au groupe national d’experts de la PPC chez les sangliers sauvages.- Participation au groupe de travail du CES Santé Animale de l’Afssa, sur l'éradicationde la maladie d’Aujeszky.- Normalisation (commission AFNOR U47A) :- Participation au groupe de travail sur la mise en œuvre des contrôles de réactifs.- Participation aux travaux du groupe pour la normalisation des analyses en virologieanimale, rédaction d’un guide de bonnes pratiques de culture cellulaire.- Participation à une évaluation européenne d’un nouveau kit ELISA pour ladifférenciation sérologique des animaux infectés ou vaccinés PPC.

Génétique Virale et Biosécurité

Le circovirus

Une PCR quantitative en temps réel a été mise au point et validée au laboratoire pourquantifier dans divers organes de porcelet, le génome du circovirus porcin de type 2 (PCV-2), agent étiologique de la maladie d’amaigrissement du porcelet (MAP). Cette méthode estbasée sur la technologie TaqMan qui utilise une sonde PCR fluorescente. D’autre part, lapossibilité d’utiliser un ADN de PCV-2 infectieux pour développer un modèle expérimentald’expression de la Maladie de l’amaigrissement du porcelet (MAP) a été examinée. Deuxcopies de génome du PCV-2 ont été clonées en tandem dans un plasmide. Cet ADN s’estrévélé infectieux in vitro et in vivo par injection intra-musculaire sur des porcelets EOPS de 5semaines d’âge mais n’a pas permis l’apparition de la maladie chez ces animaux. En parallèle,associé à l’injection d’ADN, l’effet d’un immuno-stimulant, le GM-CSF ("Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor"), sur l’expression de la MAP a été testé sansrésultat. Une autre voie d’immuno-stimulation a ensuite été envisagée sur des porcelets demême statut, en utilisant du milieu thioglycollate et de l’hémocyanine de mollusque enémulsion dans de l’adjuvant incomplet de Freund. Cette immuno-stimulation a eu un rôle surl’expression de la maladie car un porcelet transfecté a exprimé les symptômescaractéristiques de la maladie. Différentes voies d’inoculation de l’ADN infectieux vont êtreétudiées pour évaluer l’efficacité de transfection des muqueuses.


L’adénovirus

Cette équipe s’est essentiellement focalisée sur la construction d’adénovirus Celorecombinants et sur les lieux de multiplication in vivo du virus soit sauvage, soit recombinant.Plus d’une trentaine de recombinants ont été construits, vérifiés selon leur pattern derestriction in vitro, titrés sur la lignée cellulaire aviaire LMH, prouvés quant à leur possibilitéd’exprimer le transgène incorporé : IPMA, Western, etc. Des recombinants simples ont ainsiété créés : VP2 de Gumboro, gènes HN et F de Newcastle, VP1 de CAV, etc ainsi que desrecombinants doubles de type : antigène vaccinant – IRES – autre antigène vaccinant oucytokines aviaires (interféron, GM-CSF, IL18, etc). Un effet de position a pu être décrit etcorrélé avec un meilleur effet protecteur ; le transgène placé dans le sous fragment A deCelo s’exprime plutôt et en beaucoup plus forte quantité que lorsqu’il est placé dans le sousfragment D de Celo, le reste de la cassette étant identique, au moins in vitro (en cultureLMH) ; in vivo le transgène placé en A (cas de la VP2 de Gumboro) assure une protection à100% alors que placé en D, la protection tourne autour de 70-80 % ; la possibilité d’un"enhancer" plus ou moins cryptique est une hypothèse à l’étude. En ce qui concerne lestissus cibles du virus Celo (wt ou recombinant), il semble que primairement, ce soient descellules de type épithélial, présentes dans la trachée et les caeca; la présence du virus dans laBourse de Fabricius pose le problème de la cellule cible dans un tel organe ; après 15 jourspost infection il ne reste quasiment plus de traces du virus dans ces organes, que ce soitpour le virus sauvage ou le virus recombinant ; le passage dans le sang par des celluleslymphoïdes particulières est encore problématique et in vivo la mise en évidence d’un telprocess, malgré diverses techniques d’études sophistiquées, n’a pas pu être prouvée sansambiguïté. Les travaux futurs visent à améliorer la productivité des constructions existantespar des promoteurs plus sophistiqués, la présence d’introns et de séquences favorisant latranscription pour permettre une expression maximale du transgène in vivo, et donc de sonpouvoir vaccinant. Les premières études vont être entreprises pour la fabrication derecombinants "Gutless" porteurs simultanément de plusieurs antigènes vaccinants. Lesprocess de vaccination à l’échelle industrielle se tournent vers la vaccination in ovo à17 jours, lors du passage des œufs de l’incubateur à l’éclosoir.

Vaccination ADN contre la maladie d’Aujeszky

Depuis plusieurs années le modèle de vaccination ADN du porc contre la maladied’Aujeszky est utilisé et amélioré au laboratoire. Le vaccin de base est composé parl’association de trois plasmides codant pour des glycoprotéines du virus de la Pseudorageporcine (PrV). L’ajout au vaccin basique d’une séquence d’ADN, appelée CpG, reconnue parle système immunitaire inné permet d’améliorer légèrement l’efficacité vaccinale. Par contrela combinaison du vaccin ADN à un rappel protéique, obtenu par l’injection d’un virusdérivé du parapox exprimant certaines glycoprotéines du PrV, aboutit à un vaccin d’uneefficacité remarquable. Classiquement les protections contre le virus sont étudiées vingt et


un jours après l’injection du vaccin ADN. Une protection partielle peut néanmoins êtreobtenue en injectant le vaccin seulement cinq jours avant l’infection. Ceci montre que cetype de vaccination peut induire une protection "immédiate" permettant d’atténuerrapidement les conséquences d’une épidémie virale.

L’approche génomique

La caractérisation des interactions entre un virus et une cellule hôte par une approchemicroarray a été entreprise avec le virus de la pseudorage (responsable de la maladied'Aujesky), un modèle expérimental bien connu dans le laboratoire de Génétique Virale etBiosécurité. Cette approche microarray fait largement appel à l'utilisation de ressourcesinformatiques indispensables à l'analyse des résultats. Il apparaît, à l'issue de l'analyse desrésultats, que les modifications dans l'expression des gènes (sur-expression ou sous-expression) peuvent êtres regroupés en un nombre restreints de processus biologiquesdistincts qui pourraient constituer une signature de l'infection virale. Le modèleexpérimental utilisé est relativement bien référencé dans la littérature ce qui nous a permis,pour l'essentiel, de conforter nos résultats. De plus, des informations originales surl'expression de gènes impliqués dans des processus biologiques peu caractérisés en relationavec l'infection par le virus de la pseudorage ont aussi été mises en évidence. Desinvestigations complémentaires seraient nécessaires pour valider ces informations. Lacomparaison des signatures obtenues avec différentes lignées cellulaires, permissives ou nonà l'infection virale, devrait nous permettre de mieux caractériser le contexte cellulaireindispensable au bon déroulement du cycle viral du virus de la pseudorage. Par cetteapproche nous avons mis en évidence, à grande échelle, l'impact d'une infection virale sur laphysiologie cellulaire.

Virologie Immunologie Parasitologie Aviaire et Cunicole

Activité de référence et expertise Influenza aviaire (AI) et maladie deNewcastle (ND)

La 1ère étude de surveillance AI chez les canards prêts à gaver a posé des difficultésnouvelles en terme de méthodologie et a occupé une place importante dans l'activitédu laboratoire. Elle a généré une étude sur les facteurs de risque propres à cetteproduction (voir "Epidémiologie et qualité aviaires et cunicoles").

Le laboratoire a organisé un essai interlaboratoire (EIL) à l'intention d'une douzainede laboratoires impliqué dans le diagnostic sérologique AI et ND, et a participé avecsuccès à un EIL européen portant sur l'identification et le typage AI/ND.


Au plan national, le laboratoire a vu son accréditation au titre du programme 112 duCOFRAC renouvelée, et celle au titre du programme 109 étendue à de nouvellesanalyses d’identification des virus AI.

Avec 13 autres laboratoires européens, le LNR a participé à une étude organisée parla Pharmacopée européenne visant à déterminer la reproductibilité d'un test in vitropermettant de mesurer la concentration en principe actif de vaccins à virus inactivésde la maladie de Newcastle. Neuf préparations vaccinales codées ont été soumises àchaque laboratoire. Les résultats obtenus par le LNR français se situent parfaitementdans la moyenne.

Le laboratoire s'est doté de nouveaux outils : RT-PCR en temps réel pour ladétection des virus AI (ou leur quantification), réactifs pour le typage antigénique etgénétique de leurs neuraminidases, ainsi que constitution de banques de séquences etd'analyses phylogénétiques relatives à des isolats français provenant de volailles et del'avifaune sauvage. Les performances du test de détection sérologique AI ELISAcanard ont été présentées aux représentants des laboratoires de référenceeuropéens.

L'épizootie d'AI aux Pays-Bas/Belgique/Allemagne a généré un climat de fortepression avec augmentation des déclarations de suspicions, multiplication dessollicitations de nos tutelles notamment pour des avis sur l'analyse des risques tanten santé animale que publique, et pour de la formation en France ou à l'étranger.

Activité de recherche Influenza aviaire

Bien que freinés en raison du surcroît d'activité de référence, les travaux portant sur lavaccination ont été poursuivis dans le cadre notamment d'un projet de recherche européenassociant 6 laboratoires partenaires. Ceci s'est traduit par l'obtention de pseudo particulesvirales vides « dépourvues de matériel génétique, formées seulement de la protéine dematrice M1 et de l'hémagglutinine H7 virales », capables d'induire la production d'anticorpsH7 spécifiques chez le poulet après administration par voie sous-cutanée. L’activité derecherche a aussi consisté en i) la mise en évidence par vaccination ADN d'un possible rôlepotentialisateur - à confirmer - de la neuraminidase et de la protéine de matrice M2 dans lecontrôle des infections virales à sous-type H7, ii) des essais – partiellement satisfaisants – demise au point de tests permettant d'évaluer les réponses vis-à-vis des différentes protéinesvirales utilisées à des fins vaccinales (tests ELISA, d'immunoprécipitation, etc… ciblantnotamment les protéines M1 et M2).De plus, en vue du contrôle des infections virales à sous-type H5, des essais de vaccinationdu canard mulard avec un vaccin commercial à virus inactivé ont été entrepris en conditionsexpérimentales.


Calicivirus des lagomorphes

Des études menées avec l'ONCFS ont révélé la présence de souches non pathogènes devirus de la Maladie hémorragique virale du lapin (RHD ou VHD) induisant des anticorps quise sont révélés non protecteurs vis-à-vis des souches virulentes de RHDV.Les relations phylogéniques des virus du Syndrome du lièvre brun européen en France entre1989 et 2003 ont été établies. Deux types de souches cohabitent en France : l'un regroupantdes souches proches des premières souches apparues en 1989 et réparties sur tout leterritoire, l'autre regroupant des souches différentes, apparues depuis 1999 et répartiesplutôt au sud de la Loire.

Bursite infectieuse aviaire

Les travaux de recherche du programme "variabilité moléculaire du segment B de l’IBDV etbases moléculaires de la virulence chez ce virus" ont été poursuivis. Des réassortantsspontanés potentiels ont été identifiés entre vvIBDV et souches classiques. Par ailleurs, lesplasmides nécessaires à la production des clônes infectieux dérivés de deux souches d’IBDVont été construits et ont été validés pour 2 d’entre eux (production in vitro d’IBDVrecombinant), et un plasmide témoin de transcription in vitro / transfection a été construit.

Les travaux d’appui scientifique et technique du laboratoire OIE de référence ont étépoursuivis (16 souches virales caractérisées issues de 5 Pays Membres, 10 souchespropagées, participation à un essai d’intercomparaison européen, réponse à 14 demandestechniques ou administratives)

Pneumoviroses aviaires

Dans le cadre du programme européen HAMMoCS, les travaux de séquençage du gène Gchez les pneumovirus aviaires de sous groupe C ont été poursuivis par l’étude des virusisolés chez le canard et leur comparaison au virus Colorado séquencé l’année précédente.Le clonage dans des plasmides d’expression eucaryotes des gènes GD et GC a été réalisé,l’expression de la protéine GD en cellules Vero (utilisées habituellement pour la propagationvirale) a pu être démontrée par immunofluorescence. L’étude des protéines G des autressous groupes et de leur réactivité croisée est en cours. Par ailleurs, la sensibilité du caneton de barbarie EOPS aux pneumovirus aviaires desdifférents sous-groupes a été étudiée : seuls les virus de sous-groupe C semblent capablesd’infecter le canard et d’induire une séroconversion éventuellement accompagnée de signescliniques.


Anémie infectieuse du poulet

L’étude de l’impact de l’infection subclinique par ce virus a été suspendue dans l’attente del’obtention d’une nouvelle lignée cellulaire brevetée aux Etats Unis (négociation en cours)pour la multiplication et le titrage du virus.

Syndrome nanisme-bec court du canard mulard

Ce syndrome, dont l’agent étiologique supposé est le virus de la maladie de Derszy, est ànouveau un problème conséquent depuis fin 2002 malgré l’utilisation de vaccins Derszy. Apartir de rates prélevées chez des canards mulards affectés de 5 élevages du sud-ouest, uneséquence génomique virale correspondant au parvovirus du canard (un parvovirus différentde celui de la maladie de Derszy) a été systématiquement mise en évidence. Cetteobservation nécessite d’être confirmée à partir de prélèvements attendus d’autres sources.

Recherche et appui scientifique et technique enparasitologie

Des poulets ont été immunisés avec les extraits d’E. brunetti isolée et remultipliée en2002, en vue d’identifier des antigènes marqueurs de cette espèce coccidienne.

Des isolats de coccidies (E. acervulina, E. tenella et E. maxima) ont été collectés duterrain et leur pouvoir pathogène évalué. Ces isolats ont été fournis à un partenaireprivé dans le cadre d’une convention.

Des essais d’efficacité et / ou d’innocuité de différentes substances anticoccidiennesont été conduits chez la pintade et le poulet (avec notamment chez cette espèceétude expérimentale d’extraits végétaux) (prestation).

Deux essais ont été conduits en partenariat avec l’INRA de Jouy-en-Josas sur larésistance génétique des volailles aux coccidies (E. tenella) , sur des lignées parentalesde poulets fournies par un partenaire privé.

Une enquête préliminaire a été réalisée sur la possibilité de contamination desbâtiments d’élevages en coccidies par l’eau de forage alimentant ces élevages. Uneétudiante a été accueillie pour une thèse vétérinaire sur le sujet.

De nouvelles espèces de coccidies ont été obtenues au laboratoire : E.. praecox,coccidie du poulet, et E. mitis (identifiée comme contaminant d’un isolat d’E.. necatrix,information résultant d’échanges avec l’Inra de Nouzilly). Les deux isolats sont encours de clonage et/ou de remultiplication.


Epidémiologie et Qualité en Aviculture etCuniculture

Gestion et animation du RNOEA

Le Réseau National d’Observations Epidémiologiques en Aviculture (RNOEA) assureune veille épidémiologique des maladies des volailles en France à partir des observationstransmises par 58 correspondants du terrain. Pour l’année 2003, au total 19200observations ont été collectées. Le taux de participation a été de 96.5 % pour leslaboratoires et de 82.3 % pour les cabinets vétérinaires. L’année 2003 a étéparticulièrement marquée par une recrudescence des signalements de protozooses àflagellés, dont l’histomonose, dans les productions dindes et pintades.

Résultats d'enquêtes épidémiologiques

Depuis quelques années, Ornithobacterium rhinotracheale est une bactérie associée à destroubles respiratoires et locomoteurs préoccupants dans les élevages de dindes. Encollaboration avec le CIDEF, une enquête épidémiologique a été menée dans 70 élevagesde dindes de chair en Bretagne au cours de l’année 2003, afin d’estimer la prévalence dela maladie, d’identifier des hypothèses de facteurs de risque et d’évaluer le statutsérologique des élevages. Les résultats préliminaires concernant 30 élevages ont étéprésentés dans le cadre d’un DEA Biologie et Production animale en septembre 2003.Les résultats complets seront disponibles au cours de l’année 2004.

Suite à l’enquête nationale de surveillance de l’Influenza aviaire 2002-2003, une étude surles facteurs de risque de contamination des élevages de canards prêts à gaver parl’Influenza a été menée à la demande de la DGAl dans 102 élevages du Grand-Ouestentre juillet et octobre 2003, avec la participation du Comité interprofessionnel despalmipèdes à foie gras (CIFPG). Les résultats de cette étude constituent une baseconcrète pour la sensibilisation des éleveurs à la biosécurité et à l’hygiène en élevage.

Dans le cadre de l’étude sur la décontamination des élevages de poules pondeuses ausol, dix élevages ont été enquêtés en Bretagne entre janvier 2003 et février 2004. Lespremiers résultats montrent que si la décontamination du bâtiment est généralementefficace, celle du parcours demeure problématique. Le suivi des prochains élevages seradonc renforcé pour l’évaluation de l’efficacité des méthodes de décontamination desparcours.

Soixante-neuf élevages de poulets de chair plein-air ont été enquêtés depuis février 2003pour l’étude sur les facteurs de risque de contamination de ce type de production parCampylobacter spp, menée conjointement avec l’HQPAP. Les données recueillies serontanalysées à partir d’avril 2004 pour rendre les résultats du volet épidémiologique del’étude au second semestre 2004.


Mise en place de protocoles d’enquêtes épidémiologiques

Face à la recrudescence des cas d’histomonose liée à l’interdiction en mars 2003 detous les anti-histomoniques dans les filières avicoles, un projet d’enquête préliminairedans 10 élevages de dindes de chair, destiné à mieux appréhender les modalitésd’apparition de la maladie, a été élaboré avec le CIDEF. Ce suivi longitudinalcomprend également une étude des profils de contamination en salmonelles et enCampylobacter des élevages de dindes. Cette première étude sera poursuivie dans unsecond temps par une enquête rétrospective cas - témoin concernant 100 élevages,afin d’identifier des hypothèses de facteurs de risque associés aux cas d’histomonose.

Epidémiologie porcine et assurance-qualité

Maladie de l’amaigrissement du porcelet

Les travaux sur l’épidémiologie de la Maladie de l’amaigrissement de porcelet (MAP)se sont poursuivis en 2003. Il s’agissait de cerner de près les circonstances qui enélevage, à l’échelle de l’animal, président à l’expression de la maladie. Des travauxantérieurs avaient clairement montré l’implication du circovirus de type 2 dans leprocess mais que cette présence était loin d’être suffisante. Par ailleurs une influencede la génétique mâle (race Piétrain) était suspectée d’intervenir. Une étude decohorte est donc conduite dans 4 élevages naisseurs engraisseurs encore concernéspar la MAP. L’étude débute par l’insémination artificielle des truies affectées auhasard aux 2 traitements expérimentaux. (semence issue de verrats piétrain ou de larace habituelle utilisée dans l’élevage). 500 porcs ont été individuellement suivis. Lesrésultats n’ont pas permis d’observer un effet "race du verrat" dans l’expression de laMAP. En revanche nous avons pu approfondir les éléments du milieu qui yconcourent. Parmi ceux-ci on trouve les co-infections virales attestées par exemplepar la séroconversion parvovirus de la truie en cours de gestation. Des éléments duprocess morbide interviendraient ainsi précocement dans la vie du porcelet. Par lasuite d’autres facteurs interviennent et sont liés pour l’essentiel à la qualité del’hygiène et du management des animaux. Les études de cohortes vont se poursuivreen 2004.

Salmonelles

Des travaux d’épidémiologie concernant l’excrétion des salmonelles ubiquistes parles porcs ont été réalisés en 2004. Il s’agissait de tester l’influence de quelquesfacteurs révélés antérieurement par enquête. L’effort majeur est orienté vers lesaspects hygiéniques et singulièrement vers l’efficacité des opérations de nettoyage et


de désinfection des locaux. Les travaux réalisés viennent en ce moment alimenter laréflexion des professionnels qui sont amenés à élaborer et à proposer desprogrammes de contrôle de l’infection Salmonelle dans leurs élevages.

Utilisation des antibiotiques en élevage

L’utilisation des antibiotiques en élevage est l’objet d’investigations tant chez lesvolailles que chez les porcs. Après une première phase d’enquêtes à visée descriptiveayant permis de déterminer quels sont les antibiotiques utilisés, à quel âge, pourquels motifs, une recherche des facteurs susceptibles d’influencer la consommationantibiotique des élevages a été entreprise. Elle a montré l’intérêt des bonnespratiques d’élevage et d’une application raisonnée des traitements antibiotiques surl’exposition des animaux, quantifiée en application des travaux méthodologiquesprécédemment conduits sur les unités de mesure. Afin de pouvoir suivre l’évolutiondes utilisations, selon la saison ou après mise en œuvre d’interventions (définiesd’après les facteurs identifiés influençant la consommation ou réglementaires tellesque l’arrêt en 2006 des facteurs de croissance), des systèmes pérennes etreprésentatifs de recueil des consommations antibiotiques en élevage sont mis enœuvre. Parallèlement, des études analytiques sont conduites, relatives à l’impact del’utilisation des antibiotiques et des pratiques d’élevage sur le portage par les animauxde bactéries résistantes. Elles permettent d’identifier et de quantifier les facteurs derisque du portage de bactéries résistantes aux antibiotiques.

Méthodologie en statistiques

Des projets de recherche en statistique sont menés afin d’améliorer le traitementdes données d’épidémiologie animale. L’objectif du traitement statistique desdonnées d’enquête est de déterminer, parmi les nombreuses variables explicatives,les facteurs de risque de la maladie ou d’occurrence du problème de santé. Ledomaine travaillé actuellement répond au problème de la sensibilité des méthodesactuelles aux variables corrélées. Plusieurs voies sont explorées : études deméthodes publiées s’adaptant aux données épidémiologiques (régression surcomposantes, PLS logistique) et développement de nouvelles méthodes plusprometteuses (collaboration avec l’INRA de Nantes).

De plus, une activité d’appui statistique est proposée à tous les chercheurs de l’AFSSAPloufragan sous plusieurs formes : conseil, formation et traitements statistiques à lademande.


Pathologies respiratoires

Les syndromes grippaux ont été étudiés dans le cadre d’un projet soutenu parl’Union Européenne. Les travaux conduits dans les élevages de porcs ont montré lavariété des agents infectieux impliqués. Les virus grippaux restent néanmoinslargement majoritaires (virus A/H1N2 et A/H1N1). Par ailleurs on a pu observerl’intervention d’autres virus pneumotropes : SDRP (Syndrome Dysgénésique etRespiratoire Porcin) et CVRP (Coronavirus Respiratoire Porcin). La caractérisationdes virus grippaux est réalisée à l’Institut Pasteur de Paris.

Appui technique

Au cours de l’année 2003 comme du cours des années précédentes de nombreusesinterventions ont été réalisées au bénéfice de nos partenaires de la filière porcine.Elles ont pris la forme d’audits en élevage sur des situations sanitaires délicates ouencore de réunions techniques à l’animation desquelles nous étions conviés. Denombreuses missions ont également été réalisées à l’étranger.

Pôle alimentation animale

Comme en 2002, le Pôle alimentation animale a participé en 2003, en tant qu’invité, auxréunions du Comité d’Expert Scientifique en Alimentation Animale de l’Afssa et a fait partidu groupe de travail sur les "produits et substances "nouveaux" ou à effet nouveaurevendiqué". Il a également représenté l’Afssa auprès de professionnels de l’alimentationanimale et des activités d’appuis scientifiques et techniques ont été assurées.

Protection animale

L’Unité de protection animale a travaillé sur plusieurs projets de recherche en 2003concernant le bien-être des volailles, des lapins et des porcs. Des activités d’appuiscientifique et technique ont également été assurées auprès des professionnels (ITAVI,CNPO, UGPVB) ainsi qu’une activité d’expertise auprès de la DGAl (euthanasie des volaillessur le site d’élevage, mission au Danemark) et de la World Poultry Science Association(expert français dans le groupe Bien-être). Plusieurs enseignements ont également étédispensés sur le thème du bien-être animal auprès de différentes écoles d’ingénieurs.

Les volailles :

L’année 2003 a vu se poursuivre l’expérimentation concernant la comparaison du bien-êtreet des performances zootechniques de poules pondeuses logées en cages conventionnelles


ou en volières. Les résultats obtenus montrent une amélioration des performanceszootechniques en volières depuis le début des essais, en revanche les problèmes de qualitéde l’ambiance persistent avec de forts taux de poussières en volières. Une étude de l’impactde la qualité de l’air sur la santé des animaux montre que la présente de poussières en fortesconcentrations dans l’air induit des lésions de bronchites chroniques chez les poulespondeuses. Il s’agit des seuls résultats disponibles en Europe actuellement sur ce sujet. Ilsserviront à l’élaboration du rapport intermédiaire de la directive pondeuses 1999/74/CE. Lesrésultats concernant le bien-être des animaux confirment ceux obtenus lors des deuxpremiers essais conduits en 2001-2002 : bonne répartition des poules dans les volières,activités plus variées qu’en cages, résistance osseuse accrue. De nouveaux outilscomportementaux et physiologiques d’évaluation du bien-être des poules pondeuses ont étéutilisés, les résultats sont en cours d’analyse.

Les porcs :

La partie terrain de l’enquête sur les facteurs de risque d’apparition des problèmeslocomoteurs chez les truies a été réalisée en 2003 (70 élevages), l’analyse des résultats esten cours.

Les lapins :

L’étude de l’élevage du lapin de chair en parc a été poursuivie. L’Unité de protection animalea mené une troisième expérimentation sur l’impact de la taille du groupe et del’enrichissement du milieu (plate forme surélevée, matériaux à ronger non alimentaires) surle bien-être et les performances du lapin de chair. En parcs de 60 animaux, la vitesse decroissance des lapins est plus faible, en revanche les activités de bonds sont davantagepratiquée.Une nouvelle série d’expérimentations a été démarrée visant à étudier l’influence de la miseà disposition de blocs alimentaires à ronger sur le bien-être et les performanceszootechniques de lapins élevés en parcs de 60 individus.

Services expérimentaux

Service de productions de porcs assainis et d’expérimentation (SPPAE):

Le service SPPAE a conduit une trentaine d’essais pour le compte des différentes unités derecherche de l’AFSSA site de Ploufragan au cours de l’année 2003. La totalité des 626 porcsutilisés en expérimentation est de statut EOPS et a pour origine la porcherie protégée. Leplan de charge des animaleries protégées a été très soutenu puisque le taux de remplissagedes animaleries a été de 86 %. sur l’ensemble de l’année. Outre les études conduites par le SPPAE pour le compte des unités de recherche, certainesle sont à son initiative propre. En 2003, ces travaux ont permis par exemple de développerl’étude d’un modèle d’excrétion du virus PCV2 in vivo, d’expertiser une éventuelle présence


de contaminants humains détectables en sérologie sur les truies du troupeau EOPS, defournir des organes issus d’animaux EOPS en vue de futures xénotransplantations, ou demesurer l’efficacité de la filtration de l’air au regard de la protection sanitaire des élevages.

Service d’expérimentation avicole et cunicole (SEAC): En 2003, le SEAC a contribué notamment à l’évaluation de l’effet des systèmes alternatifd’élevage de poules pondeuse sur le bien être et la qualité des œufs, en particulier pour lesaspects zootechniques de ces productions. Le service est de plus le fournisseur d’alimentpour l’ensemble des services expérimentaux de l’Afssa-Ploufragan.

Service d’élevage et d’expérimentation en pathologie aviaire (SEEPA):

Le SEEPA participe aux essais expérimentaux mis en œuvre par les unités et contribue à lamise au point de modèles comme à titre d’exemple le modèle d’épreuve avec un virusInfluenza aviaire H7N1 faiblement pathogène.


Site de Sophia-AntipolisLaboratoire d’études et de recherches sur les petits ruminants et lesabeillesDirecteur : Michel Aubert

Le laboratoire étudie les principales maladies des petits ruminants (moutons etchèvres) et des abeilles avec une démarche en trois étapes : une meilleureconnaissance de la maladie par sa reproduction expérimentale chez l’animal cible, lamise au point et le développement d’outils diagnostiques pour mieux identifier lamaladie sur le terrain et une participation à l’élaboration de moyens de préventionou d’éradication de la maladie. Par ailleurs, le laboratoire participe à plusieursprojets de recherche soutenus par la Communauté européenne dans le cadre duProgramme apicole européen et du Programme communautaire de recherche etdéveloppement (maladies ovines).

Les grands axes de recherche et l’appui technique Les axes de rechercheet l’appui technique

Petits ruminants>> Bactériologie : maladies abortives et fièvre Q, mammites à Staphyloccocus aureus,>> Virologie : lentivirus (Maedi-visna) et pestivirus (Border disease), ecthyma contagieux et fièvrecatarrhale ovine (Blue Tongue)>>Laboratoire de référence de l'OIE pour l'ensemble des lentivirus des petits ruminants>> Laboratoire national de référence pour le Maedi-visna

Abeilles>> les principales maladies (varroatose, maladies d'origine virale)>> les intoxications aiguës ou chroniques par les pesticides>> le miel et les produits de la ruche (recherche de résidus)>> Laboratoire national de référence et laboratoire de référence de l'OIE pour les maladies del'abeille>> Laboratoire national de référence pour les résidus dans le miel

36 personnes


CollaborationsLe laboratoire a engagé diverses collaborations : avec l'Université de Nice-Sophia- Antipolissur les sujets concernant la qualité des miels, avec l'Université de Marseille, l'Inserm, l’hôpitalde Nice, le Cnrs et l’Inra sur la fièvre Q, les lentivirus et les staphylocoques, avec l'Inra dansplusieurs domaines concernant les maladies des abeilles et des ruminants. Il est en relationétroite avec des organisations d’éleveurs ovins et caprins au niveau national, régional (Frgds)et départemental. Membre des associations Persan et Corpaca regroupant les organismes derecherche de la technopole de Sophia-Antipolis et de la région Provence-Alpes-Côte-d’Azur,le laboratoire est aussi très impliqué dans la vie scientifique régionale.Le laboratoire est installé sur le centre vétérinaire de Sophia-Antipolis qui regroupe lelaboratoire vétérinaire départemental des Alpes-Maritimes et la direction des servicesvétérinaires. Il dispose d’une station expérimentale, à Sclos-de-Contes dans l’arrière-paysniçois, pouvant héberger une centaine de moutons et chèvres, et d’un rucher expérimentalcomposé de plus de 160 ruches, réparties sur plusieurs sites en Provence.

D’autre part, le soutien financier de la région Provence-Alpes-Côte-d'Azur et du conseilgénéral des Alpes-Maritimes devrait permettre d’achever la construction, en 2004, d’unlaboratoire P3 destiné à conduire des recherches sur l’agent de la fièvre Q et les virosesexotiques des ruminants.Enfin, le laboratoire participe à l’enseignement et à la formation pratique post universitaireen biotechnologie, en génie cellulaire et en gestion sanitaire apicole.

La recherche

Les abeillesDans la perspective d’étudier l’impact des virus d’abeille et leur rôle dans l’affaiblissementdes colonies, le laboratoire a mis au point ou acquis des méthodes de diagnostic d’infectionsvirales latentes ou cliniques de l’abeille : la paralysie chronique,la paralysie aiguë et la maladie du couvain sacciforme. La mise au point et la validation de cesdiagnostics pour les virus de la cellule noire de la reine, des ailes déformées et duCachemire sont les prochains objectifs..Une autre problématique majeure de l’unité est l’analyse des contaminants du miel et larecherche de leurs origines possibles : pratiques agricoles ou apicoles. Ainsi après avoirvalidé des méthodes d’identification des résidus d’antibiotiques dans le miel, le laboratoire aentrepris de titrer ceux-ci dans le miel récolté dans des ruchers traités à l’aided’antibiotiques selon des protocoles différents.

Recherche sur les pathologies des petits ruminantsL’année 2003 a été marquée par la mise en place d’un projet de thèse sur les staphylocoques(S. aureus) responsables de mammites subcliniques chez la brebis laitière. La caractérisation


des facteurs de virulence du pulsotype particulier mis en évidence dans les élevages dudépartement est abordée grâce à la technique des biopuces en collaboration avec uneéquipe du CNRS Valbonne Sophia-Antipolis.Pour la fièvre Q, dans l’attente du laboratoire P3, l’Unité a recentré son activité sur lesaspects épidémiologiques de la maladie, à l’occasion de plusieurs flambées de fièvre Qhumaine en vallée de Chamonix et dans le Beaufortin.Pour les pestivirus (Border disease= BDV), des travaux entamés dans le cadre d’une thèsede doctorat de l’Université de Tunis a permis de déterminer une nouvelle espèce de virusau sein du groupe BDV regroupant les isolats tunisiens. Côté lentivirus, ce sont surtout lesaspects de référence OIE et nationale qui ont prévalu en 2003 : tout d’abord par la mise enplace d’une étude sur plus de mille sérums qui a permis de valider la sérologie sur desmélanges de 5 sérums en Visna-Maedi (VM) ( en collaboration avec le LNCR1, l’ADILVA1 etles producteurs de kits). . La campagne 2004 va officialiser cette nouvelle méthodepermettant de réduire les coûts du programme volontaire de qualification pour le VM enplein accord avec les éleveurs qui réclamaient cette adaptation depuis plusieurs années. Lesuivi du dossier ELISA s’est traduit début 2004 par son acceptation définitive comme« prescribed test » par l’OIE en lieu et place de l’IDG1. Cette acceptation estl’aboutissement d’une longue procédure initiée au cours de l’action COST 834 (1997-202)sur les lentivirus (SRLVs) et portée par notre Unité en tant que laboratoire de référence desSRLVs de l’OIE.

L’Unité s’est aussi fortement impliquée sur le contrôle des vaccins destinée à lutter contrel’épizootie de fièvre catarrhale en Corse ; ainsi des vaccins atténués ou des vaccins inactivésexpérimentaux ont été testés en station expérimentale.

La recherche et l’appui scientifique et technique>> Etude du virus de la paralysie chronique (CBPV)>> Titrage de résidus d’antibiotiques dans le miel>> Mise au point et validation des méthodes de diagnostic pour la fièvre Q>> Recherches de terrain sur la fièvre Q en vallée de Chamonix>> Contrôle des vaccins Blue Tongue


Les abeillesDe fortes mortalités de colonies d’abeilles dans le sud-ouest de la France au printemps 2002,ont conduit le laboratoire à participer aux enquêtes de terrain et à mettre en place desessais de toxicité au laboratoire afin d’en déterminer les causes.

1 LNCR : Laboratoire National de Contrôle des Reproducteurs ; ADILVA : Organisation regroupant lesLaboratoires Vétérinaires Départementaux (LVD) ; IDG : immunodiffusion en gélose


L’unité contribue aux travaux du Comité scientifique et technique de l’enquêtemultifactorielle des troubles de l’abeille mis en place par le ministère de l’Agriculture et de laPêche et participe au Groupe Abeille de la Commission des Toxiques. Elle a, en particulier,élaboré une fiche de déclaration de troubles constatés par les apiculteurs et présenté auComité une interprétation épidémiologique des réponses reçues en 2002 (réseau RESATA).L’enquête prospective des troubles de l’abeille, incluant 25 ruchers (5 dans 5 départements)a démarré. La problématique consistera à suivre sur ces ruchers les paramètres propres àceux-ci (management apicole, paramètres de développement, de production et sanitaires) etles pratiques culturales et phytosanitaires dans leur environnement proche.

Pathologie des petits ruminantsL’unité s’est dotée depuis 2003 d’une plate-forme « biologie moléculaire » avec une refontedes procédures et un ré-aménagement des locaux en coopération avec l’Unité Pathologie del’abeille. Cette ré-organisation a été accompagnée de l’acquisition de matériels performantstels qu’un ensemble d’électrophorèse en champ pulsé (utilisé pour la caractérisation desstaphylocoques et bientôt pour une caractérisation des sérotypes de Mannheima haemolytica[ex Pasteurella]) ou plus récemment d’un appareil de PCR en temps réel (SmartCycler®) quisera adapté aux thématiques virus de l’abeille, fièvre Q et lentivirus.En matière d'expertise, l’Unité compte (i) trois de ses membres impliqués dans les Comitésd'experts santé animale ou ESST de l'Afssa et (ii) un membre dans le panel Animal Healthand Animal Welfare (AHAW) de la nouvelle Autorité Européenne de Sécurité des Aliments(EFSA).


Documents

La recherche et l'appui scientifique et techniquegoob.free.fr/iup/AFSSA/impression/laboratoire_complet.pdfLa recherche et l'appui scientifique et technique Site de Boulogne-sur-mer