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La réplication d’acides nucléiques

La réplication d’acides nucléiques. 2 Parce que des fois ceci... 3

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La réplication d’acides nucléiques

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Parce que des fois ceci...

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...nous mène ici! (Yikes!)

http://www.scienceclarified.com/Ex-Ga/Fertilization.html4

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Pour grandir, le nombre de cellules doit augmenter Les cellules doivent

dupliquer leur contenu Chaque division

cellulaire donne lieu à deux cellules filles (bleue)

Tout l’ADN doit être copié

Les erreurs doivent être gardées au minimum (haute fidélité de réplication)

Le taux de mutations est de 1 nucléotide/109 nucléotides (6.4x109 bp dans une cellule diploïde humaine)

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La réplication dans le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est

le procédé ordonné de duplication cellulaireLa réplication de l’ADN

se produit seulement en phase S

M phase: mitoseG1 et G2: ‘gap’

périodes où la cellule se prépare pour l’étape suivante

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Distribution des brins d’ADN – les possibilités

Différentes possibilités de distribution: 1 parental: 1 fille semi-

conservateur (Watson-Crick)

Parental et fille (conservateur) (Bloch)

Briser l’ADN bicaténaire pour synthétiser les nouveaux brins (dispersive) (Delbrück)

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http://web.virginia.edu/Heidi/chapter30/chp30.htm

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L’expérience Meselson-Stahl – préparation 14N (léger) est la

forme la plus abondant d’N

15N (lourd) est fonctionnel et pas radioactif

Centrifuge l’ADN extrait de colonies de E. coli sur un gradient CsCl, puis on prend une photo de l’absorbance UV

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Meselson M, Stahl FW. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli. PNAS Vol 44: 671-682

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L’expérience Meselson-Stahl – les résultats Les générations sont

mesurées après l’addition de 14N

À génération 0: 1 bande À génération 1: 1 bande À génération 1.9: 2

bandes

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Pourquoi est-ce qu’il y a deux bandes à génération 1.9?

Pourquoi est-ce qu’il y a 3 bandes quand on mélange 0 et 1.9?

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Distribution des brins d’ADN

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Cette théorie est prouvée

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/DNAreplicationModes.png

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Base pour la réplication d’ADNPour pouvoir accomplir la réplication, le

strict minimum requis: Les 4 désoxyribonucléotides

triphosphates (dNTPs) dATP, dTTP, dCTP, dGTP

ADN matrice Amorce d’ADN/ARN pour commencer la

réaction ADN polymérase

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La réplication d’ADN La complémentarité

des bases selon les règle de Watson-Crick

L’hydrolyse donne lieu à un lien phosphodiester

Relâche une molécule pyrophosphate (qui est aussi hydrolysé en phosphate, produit de l’énergie)

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Formation du lien phosphodiester

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Nature. 1998. 391:231-232

Le nucléotide amène deux molécules de Mg2+ attaché au triphosphate

Mg2+ se lieu au Asp de la polymérase (conservé)

Le Mg2+ baisse l’affinité de l’oxygène pour l’hydrogène, et permet à la réaction de se produire

Le groupement OH attaque le triphosphate de la base azotée

3’ 5’5’ 3’

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Synthèse d’ADN - polymérase

Le nucléotide à ajouté doit être complémentaire à la matrice pour être reconnue par la polymérase

L’ADN polymérase catalyse la formation du lien phosphodiester

La processivité de l’ADN polymérase est le nombre de lien phosphodiester formé avant que la réaction ne cesse

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La réplication de l’ADN

18Figure 5-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Par microscopie, on peut observer la réplication d’un plasmide

Chaque fourche dans l’ADN est composé d’ADN parental et du brin répliqué

Le point de départ s’appelle l’origine de réplication

Les grosses molécules d’ADN peuvent avoir plus qu’une origine

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La fourche de réplication L’ADN est dénaturée La réplication se fait toujours 5’→3’ dans les organismes Une expérience avec 3H dans des bactéries a démontré

la présence de molécules d’ADN de 1000-2000nt: les fragments d’Okazaki

Fragments d’Okazaki dans eucaryotes: 100-200nt

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Amorces pour le brin tardif À chaque 100-200nt

(eucaryotes), une amorce est requise pour que la réplication se produise

Les amorces sont synthétisées par l’ADN primase

Les amorces sont à base d’ARN

Ont une taille de 10nt

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Réplication du brin tardif Les amorces d’ARN sont

étendues par l’ADN polymérase III

La polymérase III tombe du brin quand elle rencontre une structure bicaténaire

ADN polymérase I efface l’ARN et la remplace par ADN

ADN ligase forme les liens phosphodiester

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Types d’ADN polymérases

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Comment garder la polymérase sur l’ADN La polymérase ne reste

pas sur l’ADN bien longtemps avant qu’elle ne « tombe »

La pince coulissante (sliding clamp) garde la polymérase sur le brin d’ADN

La pince est chargée sur l’ADN par le facteur de chargement (clamp loader)

Le processus requiert l’ATP

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Dépend d’ATP!

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Polymerase – more than a protein...

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Pince coulissante

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Le complexe se forme

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Chaque forme est une protéine distincte. Ensemble, elles forment le complexe appelé polymérase.

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La correction d’erreurs ADN polymérase III a

une activité exonucléase 3’→5’

Si les nucléotides ne sont pas complémentaires, il y a un transfert à la sous-unité d’édition

Le mauvais nucléotide est enlevé (3’→5’) et la synthèse continue

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La correction d’erreur...

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ADN ligase

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Il manque un lien phosphodiester sur le brin d’ADN

Dans les bactéries: ligase dépend de NAD+ comme énergieDans eucaryotes: la ligase dépend d’ATP

ADN ligase

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Délier l’ADN Pour être répliquée, la

structure bicaténaire doit être ouverte

Double hélix est très stable

L’hélicase utilise l’ATP pour se propulser le long du brin

Peut délier l’ADN à jusqu’à 1000bp/s

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Garder l’ADN droit Des régions de

complémentarité existent sur le brin délié

Ces régions déstabilisent la polymérase

Single-strand DNA-binding protein (SSB) stabilise le brin simple

SSB ne recouvre pas les nucléotides, permettant la réplication

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L’origine

In E. coli: DnaA se lie à

l’origineCette région est

près d’une région riche en AT

L’hélicase est DnaB

La primase est DnaG

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La fourche de réplication active

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Putting it all together

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Séquençage d’ADN par Méthode de Sanger

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Chaque ddNTP est “coloré” à l’aide d’un fluorochrome de couleur différente

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PCR Technique commune

dans tous les labo de biochimie

Après 25 cycles, la séquence génique est amplifiée 106 (2n =n est le nombre de cycles)

Utilisé pour identifier des pathogènes lors d’infections, types de cancer, maladies génétiques, parmi bien d’autres...

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https://sites.google.com/a/luther.edu/genetics/students/tyler-best/pcr-amplification