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La réplication d’acides nucléiques
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Parce que des fois ceci...
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...nous mène ici! (Yikes!)
http://www.scienceclarified.com/Ex-Ga/Fertilization.html4
Pour grandir, le nombre de cellules doit augmenter Les cellules doivent
dupliquer leur contenu Chaque division
cellulaire donne lieu à deux cellules filles (bleue)
Tout l’ADN doit être copié
Les erreurs doivent être gardées au minimum (haute fidélité de réplication)
Le taux de mutations est de 1 nucléotide/109 nucléotides (6.4x109 bp dans une cellule diploïde humaine)
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La réplication dans le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est
le procédé ordonné de duplication cellulaireLa réplication de l’ADN
se produit seulement en phase S
M phase: mitoseG1 et G2: ‘gap’
périodes où la cellule se prépare pour l’étape suivante
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Distribution des brins d’ADN – les possibilités
Différentes possibilités de distribution: 1 parental: 1 fille semi-
conservateur (Watson-Crick)
Parental et fille (conservateur) (Bloch)
Briser l’ADN bicaténaire pour synthétiser les nouveaux brins (dispersive) (Delbrück)
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http://web.virginia.edu/Heidi/chapter30/chp30.htm
L’expérience Meselson-Stahl – préparation 14N (léger) est la
forme la plus abondant d’N
15N (lourd) est fonctionnel et pas radioactif
Centrifuge l’ADN extrait de colonies de E. coli sur un gradient CsCl, puis on prend une photo de l’absorbance UV
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Meselson M, Stahl FW. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli. PNAS Vol 44: 671-682
L’expérience Meselson-Stahl – les résultats Les générations sont
mesurées après l’addition de 14N
À génération 0: 1 bande À génération 1: 1 bande À génération 1.9: 2
bandes
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Pourquoi est-ce qu’il y a deux bandes à génération 1.9?
Pourquoi est-ce qu’il y a 3 bandes quand on mélange 0 et 1.9?
Distribution des brins d’ADN
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Cette théorie est prouvée
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/DNAreplicationModes.png
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Base pour la réplication d’ADNPour pouvoir accomplir la réplication, le
strict minimum requis: Les 4 désoxyribonucléotides
triphosphates (dNTPs) dATP, dTTP, dCTP, dGTP
ADN matrice Amorce d’ADN/ARN pour commencer la
réaction ADN polymérase
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La réplication d’ADN La complémentarité
des bases selon les règle de Watson-Crick
L’hydrolyse donne lieu à un lien phosphodiester
Relâche une molécule pyrophosphate (qui est aussi hydrolysé en phosphate, produit de l’énergie)
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Formation du lien phosphodiester
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Nature. 1998. 391:231-232
Le nucléotide amène deux molécules de Mg2+ attaché au triphosphate
Mg2+ se lieu au Asp de la polymérase (conservé)
Le Mg2+ baisse l’affinité de l’oxygène pour l’hydrogène, et permet à la réaction de se produire
Le groupement OH attaque le triphosphate de la base azotée
3’ 5’5’ 3’
Synthèse d’ADN - polymérase
Le nucléotide à ajouté doit être complémentaire à la matrice pour être reconnue par la polymérase
L’ADN polymérase catalyse la formation du lien phosphodiester
La processivité de l’ADN polymérase est le nombre de lien phosphodiester formé avant que la réaction ne cesse
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La réplication de l’ADN
18Figure 5-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Par microscopie, on peut observer la réplication d’un plasmide
Chaque fourche dans l’ADN est composé d’ADN parental et du brin répliqué
Le point de départ s’appelle l’origine de réplication
Les grosses molécules d’ADN peuvent avoir plus qu’une origine
La fourche de réplication L’ADN est dénaturée La réplication se fait toujours 5’→3’ dans les organismes Une expérience avec 3H dans des bactéries a démontré
la présence de molécules d’ADN de 1000-2000nt: les fragments d’Okazaki
Fragments d’Okazaki dans eucaryotes: 100-200nt
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Amorces pour le brin tardif À chaque 100-200nt
(eucaryotes), une amorce est requise pour que la réplication se produise
Les amorces sont synthétisées par l’ADN primase
Les amorces sont à base d’ARN
Ont une taille de 10nt
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Réplication du brin tardif Les amorces d’ARN sont
étendues par l’ADN polymérase III
La polymérase III tombe du brin quand elle rencontre une structure bicaténaire
ADN polymérase I efface l’ARN et la remplace par ADN
ADN ligase forme les liens phosphodiester
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Types d’ADN polymérases
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Comment garder la polymérase sur l’ADN La polymérase ne reste
pas sur l’ADN bien longtemps avant qu’elle ne « tombe »
La pince coulissante (sliding clamp) garde la polymérase sur le brin d’ADN
La pince est chargée sur l’ADN par le facteur de chargement (clamp loader)
Le processus requiert l’ATP
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Dépend d’ATP!
Polymerase – more than a protein...
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Pince coulissante
Le complexe se forme
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Chaque forme est une protéine distincte. Ensemble, elles forment le complexe appelé polymérase.
La correction d’erreurs ADN polymérase III a
une activité exonucléase 3’→5’
Si les nucléotides ne sont pas complémentaires, il y a un transfert à la sous-unité d’édition
Le mauvais nucléotide est enlevé (3’→5’) et la synthèse continue
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La correction d’erreur...
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ADN ligase
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Il manque un lien phosphodiester sur le brin d’ADN
Dans les bactéries: ligase dépend de NAD+ comme énergieDans eucaryotes: la ligase dépend d’ATP
ADN ligase
Délier l’ADN Pour être répliquée, la
structure bicaténaire doit être ouverte
Double hélix est très stable
L’hélicase utilise l’ATP pour se propulser le long du brin
Peut délier l’ADN à jusqu’à 1000bp/s
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Garder l’ADN droit Des régions de
complémentarité existent sur le brin délié
Ces régions déstabilisent la polymérase
Single-strand DNA-binding protein (SSB) stabilise le brin simple
SSB ne recouvre pas les nucléotides, permettant la réplication
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L’origine
In E. coli: DnaA se lie à
l’origineCette région est
près d’une région riche en AT
L’hélicase est DnaB
La primase est DnaG
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La fourche de réplication active
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Putting it all together
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Séquençage d’ADN par Méthode de Sanger
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Chaque ddNTP est “coloré” à l’aide d’un fluorochrome de couleur différente
PCR Technique commune
dans tous les labo de biochimie
Après 25 cycles, la séquence génique est amplifiée 106 (2n =n est le nombre de cycles)
Utilisé pour identifier des pathogènes lors d’infections, types de cancer, maladies génétiques, parmi bien d’autres...
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https://sites.google.com/a/luther.edu/genetics/students/tyler-best/pcr-amplification