Biologie générale II Cahier de laboratoire 37

L’ACTIVITE ENZYMATIQUE

Buts

• Étudier l’influence de facteurs tels que, la température et le pH, sur l'activité enzymatique.

Matériel • Cuvette à dissection • Gros bécher • Thermomètre • Chronomètre • Crayon gras • Papier filtre • Auto-pipette • Pinces • Burette de 100 ml • Bouchon avec tube • Bouteille à réaction • Tube flexible • Ciseaux • Solution hépatique de catalase • Peroxyde d'hydrogène à 3% • Glace concassée • Trois solutions tamponnées (pH: 5, 7, 9)

À lire : Starr, C. et Taggart, R. Biologie générale, pages À voir : http://svt.ac-rouen.fr/biologie/enzymo/enzymea.htm http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_biochemistry-enzymosubstrat.htm

Théorie La catalase est une enzyme présente dans presque tous les types de cellules, au

niveau des peroxysomes. Elle se trouve particulièrement abondante dans les cellules du foie. Elle participe, comme la peroxydase, à la défense contre les dérivés toxiques de l’oxygène, mais elle agit pour des concentrations plus élevées en peroxyde que la peroxydase. Les peroxydases catalysent la formation d’eau oxygéné ou peroxyde d’hydrogène.

R-H2 + O2 ⇒ R + H2O2

Ce peroxyde d’hydrogène est utilisé par la catalase pour oxyder certaines substances toxiques.

H2O2 +R’H2 R’ + 2H2O Le R peut être un groupement phénol, de l’acide formique, du formaldéhyde ou un

alcool. Par exemple, l’alcool éthylique ou éthanol est transformé dans le foie en acétaldéhyde qui est détruit par la catalase.

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En présence d'une concentration suffisamment grande de substrat, l’augmentation de la concentration de l’enzyme produit une augmentation proportionnelle de l’activité enzymatique, et ce jusqu’à une certaine limite. Par contre, pour une même quantité de molécules enzymatiques, l’influence de la température et du pH nous montre qu’il existe une température optimale et un pH optimal où l’enzyme montre une activité maximale. Une température plus basse ou plus élevée que cette température optimale, diminue l’activité enzymatique. De même, un pH plus bas ou plus élevé que le pH optimal amène une activité enzymatique moindre.

La catalase hépatique agit sur le peroxyde d’hydrogène (H202) pour le transformer

en eau (H20) et en oxygène (02) selon l’équation suivante: 2 H202 ⇒ 2 H20 + 02

Liquide ⇒ liquide + gaz

L’activité enzymatique peut se mesurer en calculant la quantité de substrat qui disparaît par unité de temps ou encore par la quantité de produit de réaction qui apparaît par unité de temps.

Dans l’expérience sur l’action de la catalase sur la décomposition de H202, il est très

facile de mesurer indirectement le nombre de molécules d'oxygène dégagées en mesurant le volume d’oxygène qui apparaît lors de la réaction. Comme l’oxygène est un gaz et que ce gaz s’échappe du milieu réactionnel nous ne serons pas ennuyés par l’influence des produits de réaction.

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Expérience et manipulations 1-Effet du pH

1- Avec le gros bécher, prélever du robinet de l’eau à une température d’environ 24°C, remplir la cuvette à dissection au 3/4 avec cette eau. Noter la température réelle

2- Découper un morceau de papier-filtre de 2,5cm x 2,0cm et le placer dans une

bouteille à réaction propre et sèche sur l'une des faces internes, près du goulot. 3- Mélanger la solution enzymatique 4- Ajuster la pipette automatique à 80µl, pipeter et essuyer l’extérieur de l’embout. 5- Déposer lentement la solution enzymatique sur le papier-filtre déposé dans la

bouteille, jusqu’à ce que toute de la solution soit absorbée. 6- Faire coller le papier sur la surface interne près du goulot en appuyant avec la

pointe de l'embout de la pipette automatique. N.B. Il n'est pas nécessaire de changer l'embout car vous pipetez toujours la même solution.

7- Placer ensuite la bouteille debout, le papier-filtre doit rester coller près du goulot

sans que l'enzyme donne des coulisses. Si le papier tombe, c’est qu’il est trop grand ou que vous n’avez pas assez appuyé avec l’embout. S’il y a des coulisses c’est que le papier est trop petit.

8- Verser dans le fond de la bouteille, 10ml d’une des solutions de peroxyde

d’hydrogène (pH 5) en évitant tout contact avec le papier-filtre et mettre le bouchon en place.

9- Placer la bouteille à réaction, dans la cuvette à dissection, en prenant soin de la

mettre sur le côté de manière à ce que le papier-filtre soit en haut afin d’équilibrer la température des 2 systèmes.

10- Remplir la burette de 100ml en position inversée en aspirant l’air à l’aide du tube

flexible. 11- Ajuster le niveau «air – eau» à 100ml. Prendre en note cette lecture en regardant

bien les graduations de votre burette.

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12- Coucher délicatement la bouteille à réaction, le papier-filtre étant toujours en haut, sur le coté.

13- Placer le tube de verre, de la bouteille à réaction, sous l’ouverture de la burette

graduée le tout étant dans l’eau. 14- Partir le chronomètre, retourner la bouteille à réaction d’un demi-tour, ce qui

permet le contact de l’enzyme (papier-filtre) avec le substrat et déclenche la réaction enzymatique.

15- Prendre en note, toutes les 30 secondes, le volume d’oxygène dégagé pendant 6

minutes (360 secondes). Faire la lecture des graduations sur la burette. N.B. Pour trouver le volume d'oxygène dégagé vous faites des soustractions car les lectures que vous notez sont décroissantes. Par exemple :

Temps Lecture sur la burette graduée Volume d’oxygène dégagé 0 (au

départ) 99,0ml

30 secondes 92,0ml 99,0 ml – 92,0 ml = 7,0 ml d'02

60 secondes 87,5ml 99,0 ml – 87,5 ml = 12,5ml d'02

… … …

ON DOIT TOUJOURS, UTILISER LA LECTURE AU TEMPS ZERO (AU DEPART) CAR IL NOUS FAUT LE VOLUME D'OXYGENE CUMULATIF.

16- Après 6 minutes, prendre en note la température de l'eau de la cuvette à dissection.

17- Laver la bouteille à réaction, l'essuyer et l'assécher complètement. 18- Refaire l’expérience avec les solutions de peroxyde d’hydrogène de pH 7 et 9.

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Feuille de données de l’effet de la variation de pH en fonction du temps

pH Temps (sec.) 5 7 9 30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

360

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2- Effet de la température

1- Découper un morceau de papier-filtre de 2,5cm x 2,0cm et le placer dans une bouteille à réaction propre et sèche sur l'une des faces internes, près du goulot.

2- Mélanger la solution enzymatique 3- Ajuster la pipette automatique à 80µl, pipeter et essuyer l’extérieur de l’embout. 4- Déposer lentement la solution enzymatique sur le papier-filtre déposé dans la

bouteille, jusqu’à ce que toute de la solution soit absorbée. 5- Faire coller le papier sur la surface interne près du goulot en appuyant avec la

pointe de l'embout de la pipette automatique. N.B. Il n'est pas nécessaire de changer l'embout car vous pipetez toujours la même solution.

6- Placer ensuite la bouteille debout, le papier-filtre doit rester coller près du goulot

sans que l'enzyme donne des coulisses. Si le papier tombe, c’est qu’il est trop grand ou que vous n’avez pas assez appuyé avec l’embout. S’il y a des coulisses c’est que le papier est trop petit.

7- Verser dans le fond de la bouteille, 10ml de la solution de peroxyde d’hydrogène en

évitant tout contact avec le papier-filtre et mettre le bouchon en place. 8- Avec le bécher, prélever du robinet de l’eau et ajouter de la glace pour obtenir une

température d’environ 10°C, remplir la cuvette à dissection au 3/4 avec cette eau. Il est important de s’assurer que la température soit stable durant l’expérience.

9- Placer la bouteille à réaction, dans la cuvette à dissection. Il est important

d’attendre que la bouteille à réaction et son contenu soient à la même température que l’eau de la cuvette à dissection avant de poursuivre.

10- Remplir la burette de 100ml en position inversée en aspirant l’air à l’aide du tube

flexible. 11- Ajuster le niveau «air – eau» à 100ml. Prendre en note cette lecture en regardant

bien les graduations de votre burette. 12- Coucher délicatement la bouteille à réaction, le papier-filtre étant toujours en haut,

sur le coté.

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13- Placer le tube de verre, de la bouteille à réaction, sous l’ouverture de la burette graduée le tout étant dans l’eau.

14- Partir le chronomètre, retourner la bouteille à réaction d’un demi-tour, ce qui

permet le contact de l’enzyme (papier-filtre) avec le substrat et déclenche la réaction enzymatique.

15- Prendre en note, toutes les 30 secondes, le volume d’oxygène dégagé pendant 6

minutes (360 secondes). Faire la lecture des graduations sur la burette. N.B. Pour trouver le volume d'oxygène dégagé vous faites des soustractions car les lectures que vous notez sont décroissantes. Par exemple :

Temps Lecture sur la burette graduée Volume d'oxygène dégagé 0 (au

départ) 99,0ml

30 secondes 92,0ml 99,0 ml – 92,0 ml = 7,0 ml d'02

60 secondes 87,5ml 99,0 ml – 87,5 ml = 12,5ml d'02

… … …

ON DOIT TOUJOURS, UTILISER LA LECTURE AU TEMPS ZERO (AU DEPART) CAR IL NOUS FAUT LE VOLUME D'OXYGENE CUMULATIF.

16- Après 6 minutes, prendre en note la température de l'eau de la cuvette à

dissection. 17- Laver la bouteille à réaction, l'essuyer et l'assécher complètement. 18- Refaire l’expérience en plaçant dans la cuve à dissection de l’eau à 24°C, 37°C et

50°C. Il est important d’attendre que la bouteille à réaction et son contenu soient à la même température que l’eau de la cuvette à dissection avant de placer le tube de verre sous l’eau, position couchée de la bouteille à réaction, sinon vous verrez l’eau s’introduire dans le tube de verre et partant, dans la bouteille à réaction. À 37°C et 50°C, on peut immerger la bouteille à réaction et son tube sous l’eau de la cuvette à dissection sans attendre l’équilibre thermique, mais pas sous la burette graduée, car la chaleur de l’eau provoquera une expansion de l’air dans la bouteille à réaction et vous noterez alors la sortie de gaz, comme si la réaction était commencée et ce n'est pas le cas. Attendez que l’air de la bouteille soit à la même température que l’eau de la cuvette à dissection et, le dégagement d’air cessera. Alors vous pouvez placer le tube de verre sous l’ouverture de la burette graduée et commencer l’expérience, mais pas avant.

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Feuille de données de l’effet de la variation de la température en fonction du temps

Température °C Temps (sec.) 10°C 24°C 37°C 50°C 30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

360

Évaluation Un travail est à compléter et à remettre pour la prochaine séance de laboratoire