Le «chromosome mitochondrial des cellules animales: originalité structurale et fonctionnelle

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Le ( (chromosome) ) mitochondrial des cellules animales : originali t6 structurale et fonct ionnel le

Toutes les cellules eucaryotes sont pourvues d'un systdme g~n~tique extra nucl~aire indispensable au bon fonction- rtement d'organites complexes tels que les mitechondries ou les chloreplastes. Depuis I'isolemen.t et la caractdrisation des mutants <( petite colonie, )) de levure, incapables d'uti l iser de fa.con adrobie les substrats ndcessaires ~ leur croissance, il est clair que I'int~grit~ du chromosome mitochondrial est n~cessaire au maintien des fonctions respiratoires des cellules eucaryotes. La nature de r information g~n~tique contenue clans le DNA mitochondrial (mt DNA) a 6t~ pr~cis~e au cours de la dernidre d~cennie par I" emploi de mdthodes gdn~tiques largement exploi- t~es chez la levure et d'dtudes biochi- miques r~alis~es sur une gran.de vari~t~ d" organismes recouvrant un. spectr.e allant des ascomyc~tes (levure - - N'eu'.ros.po,ra

- - P~s,pergiii'lus) aux cellules httmaines en culture. La fonction g~n~tique du mt-DNA de levure r~v~l~e par I'~tude des mutants (( petite colonie )) constitue pour I'instant le module de rdf~rence pour I'ensemble des cellules eucaryotes. II apparMt que le chromosome mitochondrial rertferme et e~cprime un petit hombre de g~nes dont les produits hydrophobes (6-8 polypeptides) sont des composants de complexes multi- enzymatiques de la membrane interne mitochondriale, un composant polypepti- dique de la petite so us-unitd des mitori- bosomes, les RNA constitutifs de chaque sous-unitd ribosomale et les tRNA indis- pensables & la traduction prot~ique intra-

mitochondriale [ I -3 ] . La synth~se de I'ensemble des autres constituants mitochondriaux est d~termin~e par le g~nome nucl~aire et .effectu6e dans le cytoplasme ; les produits de synth~se sont transpor- t6s dans les mitochondries par des m~ca- nism'es semblables ~ ceux g~ndralement utilisds pour ,la s~crdtion des prot~ines I'ext6rieur des cellules [4, 5]. Bien que sous la d~pendance r~gulatrice c[u g~nome nucl~aire, le syst~me gdndtique intramito- chondrial s'exprime par I'interm~diaire d'appareils de transcription et traduction dtstincts, ce derni~r 6rant caractdris6 par sa sensibilitd au chloramph6nico.l. A ucun transfert de RNA messager ou de tRNA du cytoplasme vers les mitochondries n'a pu ~tre observe. Le fonctionnement des mitochondries est donc sous la d~pendance de deux syst~mes gdndtiques individuali- s6s mais compl~mentaires. L'origine du syst~me g~n~tique mitochorrdrtal pourrait, selon les partisans de la thdorie endosym- biotique, remonter ~ t" assGciation primitive de bact~ries avec des structures cel- lutaires protocaryotiques. R~cemment, I'~tude comparative de la s~quence nucl~otidique du RNA constituti f de la petite sous-unit~ ribosomale de divers organismes a conduit ~ distinguer deux voies ~volutives distinctes. Le premier ras- semblant les organismes v~gdtaux et uni- cellulaires aurait dvolu~ ~ partir d'une association avec un type bact~rien diffd- rent de celui ayant conduit aux mitochom dries des cellules animales [6]. La double origine possible des mitochondries des cellules eucaryotes recouvre des dfffd- fences importantes de structure du mate- riel g~n~tique. Le chromosome mitochondrial des cellules de levure, de N,em'os- pora et des cellules v~g~tales a une taille

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3 ~ 5 fois supdrieure ~ celui des cellules animales. Pour des fonctions gdn~tiques semblables ceci suppose une organisation gdndtique et des mdcanismes simplifica- teurs, au cours de I'~volution, tr6s d i f f , - rents. II est clair ~ujourd'hui que le gdnome mitochondrial de levure comme le g~nome nucl~aire poss~de des g~nes en mosa~que [1-8] alors que le mtDNA des cellules animales para]t totalement d~pourvu de ce type d'organisation g~n~- tique. L" objet de cet article sera de d~crire les particularitds uniques de la structure et de I'organisation gdn~tique du chromosome mitochondrial des ceilules animales, et d'en ddgager I'image d" une mote- cute remplissant des fonctions complexes avec une dconornie de moyens et une simplif ication extremes. L'ensemb/e des don- ndes exposdes est le rdsultat du ddvelop- pement r~cent des techniques biochi- miques d'dtude des acides nucldiques : ~tablissement de cartes physiques au moyen d'endonucldases de restriction, hybridations mol~culaires, ddtermination de s~quences nucldotidiques. Ces dtudes fournissent un excellent exemple des in- formations que I'~tude des structures peut apporter dans la connaissance des fonctions d'une molecule [9]. Ca ract6ri~stiques s~ru,cturales.

Le (( chromosome )) mitochor~drial des cellules des animaux m#tazoaires est une molecule bicatdnaire, circulaire fermde, de petite taille (environ 5 ~, en microscopie #lectronique). Present ~ un petit hombre d'exemptaires dans chaque organite, i l reprdsente un faibte pourcentage de la masse totale du DNA cellulaire (1 ~ 2 % environ). Seules certaines cellules germi- nales de grande taifle telles que les oocytes de Xeno,pu,s laevils tr~s riches en mitochondries en poss#dent une quantit# sup#rieure ~ celle du DNA nucl#aire (3 ng contre 40 pg) [ I 0].

L'essentiel des connaissances sur cette molecule est le r#sultat d'#tudes r#alis#es sur des cellules de mammif~res dont I'#tablissement de lign#es en culture a facilit# le marquage radioactif du mtDNA : cellules humaines, de souris, de hamster. Les donn~es parcellaires obte- nues avec du matdriel d'autres origines (foie de rat, embryon de poulet, oocytes de Xenopus ~laevis, drosophile) sugg~rent que les caract~ristiques du module mamma.lien peuvent ~tre ~tendues ~ queiques d~tails pros (qui seront d~velopp~s aux endroits appropri~s) ~ t'ensemble des cel-

lules animales. La taille du chromosome mitochondrial est relativement uniforme dans le r~gne animal et caract6ristique de l'espbce (16 569 paires de nucl~otides pour le mtDNA humain [ I I ] 16 265 pour celui de souris [12], environ 17 400 pour Xenopu~s lae~i,s [13] et 15 700 ~ 19500 selon les esp~ces de'drosophile [ 14]. Des formes plus complexes correspondant la fusion t~te ~ queue de deux molecules (dim~re unicirculaire) et ~ I'interp~n~tra- tion en maillons de cha]ne de 2 ou plusieurs molecules (formes concatdn~es) sont fr~quemment observ~es dans les cellules de mammif~res [15]. Ces formes normalement accessoires de la conforma- tion des molecules du mtDNA doivent ~tre consid~r~es comme la manifestation de m~canismes enzymatiques de r6plica- tion de ces molecules relativement impr6- cis. La structure nucl6oprot6ique d u chromosome mitochondrial apparait tr~s sim- plifi~e par rapport ~ celle de ses homo- Iogues nucldaires. Les observations en microscopie 61ectronique ou par la tech- nique de pontage avec les d6riv~s du pso- ral~ne excluent I'existence d'une structure chromatinienne typique [ 16] (dans les conditions classiques du maintien de la stabilit~ des nucldosomes). Une quanti- t~ et un nombre tr~s limit6s de mol6cules de prot~ines peuvent ~tre isol~s du chromosome mitochondrial dans des conditions d'extraction douce. Dans des cellules de nature aussi vari~e que les cellules HeLa [17], de foie de rat [18], de Xenopu,s ~laevi,s [ 19] ou de drosophile [16] ces prot6ines semblent se fixer prd- f~rentiellement dans une rdgion contenant I'origine de r~plication. Cette r6gion pourrait ~tre impliqu~e dans I'association du chromosome avec la membrane interne mitochondriale [11-18]. L" observation dans le foie de rat de rosettes constitudes par des boucles de DNA organis~es autour d'un noyau prot~ique central montre que ces prot~ines jouent un r61e dans la con- densation du chromosome, peut ~tre, par I'interm~diaire d'une liaison ~ la membrane interne des organites [:tO]. Une de ces prot~ines (16 kilodaltons) pourrait ~tre impliqu~e dans la stabilisation des formes interm6diaires de rdplication (formes D. Loop).

Formes D. Loop.

L'observation en microscopie 61ectro- nique de populations de mol~cules de mtDNA convenablement fix~es r~v~le

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/'existence sur certaines moldcu/es de boucles Iocalisdes ayant /a forme de bouc/es de ddnatura, tion. Ces boucles de ddplacement (D-loop) reprdsentent une structure ~ 3 brins darts 'laquelle le brin parental (brin /dger ou L) forme un seg- ment bicat~naire avec sa copie. Le brin parental (brin Iourd ou H) non copi~ est d~placd sur une distance dquiva/ente et reste sous form.e monocat~naire [21 ] . Cette structure est restreinte ~ une r~gion unique de la molecule comme le prouve sa position par rapport aux sites d'endo- nucl~ases de restriction [13]. La taille de la D. loop est variable d'une esp6ce rautre et dans les cellu/es de mammi- f~res elle correspond approximativement

5 % de la taille totale du g~nome soil environ 500, 700, 900 nuc/~otides res- pectivement dans les cel/ules de Hams- ter [22], humaines [11] et de souris [ 12 ] . Dans les O0'CytreS de Xenopu~s laevis la taille de cette rdgion est 2 lois plus importante (1400 ~ 1500 nucl~otides) [23]. La frdquence de ces formes est ~galement tr6s variable. Elle est fonction de I'esp6ce animale d'origine et de la situation physiologique, de la cellule.

Ainsi, le mtDNA des cellules L d,e souris comporte environ 80 % de formes D- loop, celui des cellules humaines environ 30 % alors que celui des cellutes de drosophile en para~t ddpourvu. La frdquence des formes D-loop ~volue au cours des stades de maturation des oocytes de Xer~opu!s laevi.s, variant entre 70 % dans les phases d,e vitellogendse active et 30 % dans les oocytes matures [24]. Le pro- bl6me fondamental que pose rexistence de ce~te structure exceptionnelle est la comprehension de son r61e. Pendant long- temps, les formes D-loop ont ~t~ consid~- r~es comme des interm~diaires bloqu~s de r~plication repr~sentant un ~tat d'~qui- libre topologique de la molecule. Sous forme D-loop, apr~s activation de ror igine de r~plication, le ddroulement partiel de la double h~lice compenserait tr6s exac- tement les supertours n~gatifs initiale- ment presents dans la molecule circulaire totalement apparide [21 ] . Les experiences de marquage radioactif et de chasse r~ali- s~es avec le DNA mitochondrial de sou- ches particuli6res de cellules de souris (d~pourvues de thymidine kinase cyto- plasmique fonctionnelle et permettant un marquage efficace du mtDNA avec la thymidine) con,firment le r61e possible d'in-

term~diaire de cette moldcule dans la r~- plication [21 ]. L'~.tude de la copie in. vi~tro de formes D-loop par une DNA polymdrase purifi6e [25] sugg6re que la poursuite de la r~plication intervient par un ddblocage enzymatique des contraintes accumul6es [26] dans la. molecule. Cette conception a 6t6 dlargie sinon r~vis6e par I'accumu/ation de donn6es rdcentes con- cernant la sdquence nucl~o,tidique de cette r6gion. Aprds isolement et enrichissement en gradient de den,sit6 des formes D-loop le brin H (copie partielle du brin parental L) peut ~tre isol6 par d6naturation ther- mique et marqu6 en position 5" phosphate ou en position 3" par Ja cordycepine. La s&quence nu'cl6otidique de ces deux extr~- mit~s pettt ~tre d~termin~e et dans le cas ob la s&rquence de la molecule parentale est disponible (mtDNA humain et de souris [I I, 12]) la comparaison des s~quences permet de Iocaliser avec precision la position du brin H de la D-loop.

Ces &tudes ont permis d'enregistrer les r&sultats suivants i) Les extr~mit6s 5" d'u brin H n6ocopi6 de la forme D-loop et du brin H de formes r~plicatives plus ~vo- lu6es sont identiques [21]. Ceci montre que la forme D-loop peut effectivement Otre un pr6curseur de la forme r6plicative. La position de I'extr6mit~ 5"P dolt mar- quer celle de I'origine de r~plication.

i i) L'origine de r~plication du brin H est situ~e entre le g6ne du tRNA Phe et l'extr~mit6 5" du brin H de la D-loop. Cette r~gion (240 ~ 400 nucl6otides selon I'origine du mtDNA) [28] ne contient pas de s6quence susceptible de conduire ~ la formation d'une structure cru- ciforme ou boucle en 6pingle ~ cheveux tr6s stable et caract6ristique des origines de r6plication de nombreux a utres chromosomes [29]. Bien .clue des blocs de sdquence pr~sentent une certaine homo/o- gie dans les ,cellules de rat, souris et horn- me [ I I, 28], i l n " est pas possible d" obser- ver une structure, conserv~e au cours de i'~volution' et capable de jouer le r61e. d" un signal ~vident de r~plication.

i i i) L'analyse de la s~quence nucl~oti- d~ique de la r6gion 5" du brin H a r~v~16 I'existence de ribonucl6otides dans une fraction des molecules. Le caract~re at6a- toire de la presence des ribonucl~otides svgg6re que leur persistance re f l6 te/ 'excision d6fectueuse d'une mol6c~/le de RNA amorce [311]. On sait que I'amor-

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cage de la synth6se du DNA par ie RNA est rendu n~cessaire par 'l'incapacitd qu'ont les DNA polymdrases d'autoamor- cer la synth6se du DNA. La raise en ~vi- dence de ribonucldotides clans la r~gion origine de r~plication rer~d compte d'une vieille observation montrant que le DNA mitochondria~ est tr6s sensible aux trai- tements alcalins [31]. Elle explique ~galement en pa.rt~ie t'hdtdrog~n~itd de taille des brins H de la D-loop dans un orga- nisme donn~ (3 positions 5"P pour te mtDNA humain, 2 positions diff~rentes pour le mtDNA de souris) I'excision RNA amorce dtant plus ou moins complete selon les classes de molecules.

iv) L'analyse de la s~quence nucl~o- tidique des extr~mit~s 3" a montrd I'existence de 4 rdgions de terminaison du brin H dans la D-loop pour les cellules de souris et d'une r~gion unique pour les cellules humaines [32]. Cha- cune de cos classes d'extr~mit~s est pr&c~d~e ~ faibte distance en amont par une sdquence de 12 nucldotides 3" (TAA Py Py AAATTACA) 5". Cette corre- lation ne pout representer un phdnom~ne atdatoire (probabilitd irrf~rieure ~ 10 "1~) et ces S~lUences consensus fourniraient un signal de ddcrochage ou de pause pour los enzymes qui rdalisent ,la syn- th6se du brin H [33]. La poursuite d'dtudes de ddtermination de s~quence avec des chromosomes d'origine non mamma- /ienne est n~cessaire avant de conclure

la gdndralitd de cette interprdtation. L'ensemble de cos r~sultats joint au fait que le brin H ndocopid de la D-loop est soumis ~ un remaniement continuel de synth6se et de ddgradation [34] jette un doute sur la fonction purement r~plicative de cette structure. L'analyse et la cartographie des produits de transcription du g~nome mitochondrial de ce/lules de mammif6res [35] et ,de Xenopus laevis [36] rnontre que la rdgion de la D.Ioop renferme un promoteur unique de transcription pour I'ensemble du brin H. Dans ces conditions, la D-loop repr~senterait une structure favorable pour la copie simuItan&e du g~nome par deux syst6mes enzymatiques cliff,rents et dans deux directions oppos~es (transcription du brin H et rdplication du brin L). Le facteur d~terminant de sa formation serait le d&marrage de la transcription. La r~plication partielle du brin H n~cessaire au maintien de la s~paration des brins paren-

taux L e t H serait la consc~quence de ce ph~nom6ne. Dans ces conditions, la syn- th6se et la ddgradation cyclique sans efficacit~ apparente du brin H se poursuivrait jusqu'~ ce que, sous /'effet d'un stimulus de rdp#cation, /'effet des sdquences consensus d'arr~t soit occult~ et I'~longation du brin H puisse se poursuivre darts sa totalitd. L'hypoth6se d'une fonction prin- cipale de la D-loop darts la transcription peut ~tre confortde par des arguments d'ordre physiologique. Dans les oocytes de Xen<>pus plaevi~ la frdquence de la D-loop est tr~s ~lev6e (70 %) dans les premiers stades de maturation: Ces stades correspondent ~ une activit~ de vitello- gen6se intense et un m~tabo/isme a~robie producteur d'~nergie important. L'activit~ des mitochondries dolt ~tre fortement sol- licit~e pendant cos stades. La fr~quence des formes D-loop baisse progressivement pour atteindre un seuil de 30 % dans los oocytes matures. Cette diminution (d'un facteur deux) au cours de /a maturation des oocytes repr~sente vraisemblablement /a diminution d'efficacitd transcription- nelle de ,la moldcule, son efficacit~ r~p/i- cative diminuant d'un facteur 10 pendant l e m~me temps [37]. L'absence apparente de forme D-loop dans le chromosome mitochondrial de cellules de drosophile peut ~tre rdconcili~e avec les interpreta- tions pr6c~dentes. Contrairement aux chromosomes mammaliens ou amphi- biens la rdgion du ddmarrage de la r~plication se caract~rise chez la drosophile par sa grande richesse en addnine et thy- mine, ce qui lui conf~re des propridt~s de grande ddnaturabilit~. Dans ces conditions, I" ouverture de la double hMice dans cette r#gion ne constituerait plus un facteur l imitant du d~marrage, de la transcription du brin H ni de/a r6p/ication du brin L.

O'ri'~i,nes de ,r~pli.catio,n. L'gtude ddtaillde de ia structure et de

la s~quen'ce nucldotidique de la forme D-loop indique que cette r~gion contient I'unique origine fonctionnelle de rdplication pour la synth6se du brin H. Cette origine (0~) ne peut ~tre Iocalis6e de fa.con tr6s precise en raison de I'absence d'une structure symgtrique typique et de I'h~t~rogdn~it~ des extr~mitds 5" des brins H. La persistance de ribonucl~otides

I'extr~mitd 5" du brin H de la D-loop (qui se retrouvent ~galement darts la molecule totalement r~pliqu~e) montre

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qu'une molecule de RNA cod~e par le brin L intervient clans I'amorcage de la synthbse du DNA. Une molecule de RNA d'environ 200 nucl~otides isolde de mitochondries de cellu~les H eLa et de Xenopus laevis s'hybride sp$cifiquement avec le brin L ,du mt DNA ~ proximit~ immediate de la rdgion ant~rieure de la D-loop [36, 38]. Cette molecule constitue un bon can- didat pour I'amorgage de la r$plication du brin H. En effet, elle repr$sente un des rares produits de transcription du brin L et le seul transcrit ~ prox, imit~ immediate de I'extr$mitd 5" du brin H ~ qui elle pourrait fournir une extr$mit$ 3"OH amorce. De plus aucun autre r61e ne peut lui ~tre attribu$ pour I'instant. II reste r$atiser une cartographie tr6s precise de ce RNA dans la r~gion limit~e par le g6ne du tRNA Phe et I'extr$mit$ 5" du brin H de la D-loop pour d$finitivement lui attri- buer un r61e dans ramorcage de la r~plication (aucune molecule de ce type n'a encore ~t~ identifide dans les cellules de souris). Le schema qui se d$gage des $tudes sur rorigine de r$plication du brin H est celui d'une r$gion sans caract$- ristique de reconnaissance particuli~re. A I'exception de quelques courtes s$quences assez conserv$es et l imitant I'extr$- mit$ 5" des brir~s H, cette r$gion a une s$quence variable d'une esp6ce animale I'autre. Son activation en origine de r$plication pourrait davantage ~tre la consd- quence de ph$nom6nes sp$cifiques de transcription (d$naturation de cette r$gion li$e au d#marrage de la transcription du brin H et transcription localis$e du brin L fournissant une possibilit# d'amorgage de la r~plication) que la mise en place d'un signal exclusif de rdplication: R$cemment i l a ~t~ montr~ que la r~gion D,Ioop du chromosome mitochondrial d'oocytes de Xeno,pus laevi~s est tr6s efficace pour assurer la r~plication d'un plasmide recombinant de levure. Aucune autre origine de r$plication $tudi$e n'a r$v$l$ la m~me capacitY. Ceci d$montre ,les faibles exigences requises pour I'activation de cette r#gion et sa tr6s faible sp$cificit$ [a~].

Dans le mod61e de r~ptication du DNA mitochondrial ~tabli au d~but des ann~es 1970 [21] I'extension de la forme D-loop repr$sente I'$tape qui va conduire ~ la r$plication compl6te de la molecule. Par un m~canisme ignore, le d~passement des s$quences consensus d'arr~t (r$gion

3" de la D-loop) conduit ~ I'extension du brin H. La copie semi conservative de ce brin se poursuit de facon continue et en I'absence complbte de copie du brin H compl$mentaire qui se trouve ainsi d#- plac$ [21]. La validit6 de ce mod61e $tabli ~ partir de I'$tude de marquages radioactifs du DNA 'in, Vivo et d'observations en microscopie $lectronique est largement confirm~e par les 6tudes structu- rales et de d6termination de s$quence nucl~otidique d6velopp$es ces derni6res ann$es. Un 6v~nement important du processus d'extension de la forme D-loop est le d$roulement de la double h$lice dans une r$gion situ$e aux 2 / 3 de la mol6cule

partir de OE. D6s que la fourche de r~plication est pass~e ,darts cette r~gion, on note le d$marrage de la synth6se anti- parallble ,du brin L ills. Cette r~gion contient donc rorigine de r~plication du brin L, ( OL). D'~l~gantes 6tudes de cartographie (au moyen de la nucl~ase Sl) de I'origine de la synth6se de ce brin a permis de Iocaliser OL au nucl$otide pr~s. Dans les cellules KB humaines et L de souris O~ est situ$e dans une r~gion pr~- sentant une structure secondaire stable constitute de deux s~quences pouvant conduire & la formation d'$pingles ~ cheveux [27]. Cette r$gion est ~galement caract6ris$e par I" abondance de g6nes des tRNA (4 d'entre eux $tant cod$s par le brin L e t 1, le tRNA Trp par te brin H). L'amor.cage de la synth6se du brin L fait ~galement intervenir un RNA initiateur puisque comme 05 cette r~gion est une zone de forte fr$quence de ribosubstitu- tion [31]. Aucune mol6cule de RNA can- didate ~ ramor.cage de la synth6se r~plicative du brin L n'a $t$ identifi$e. Toute- lois, ~ environ 170 n~cl~otides de OH mat$rialis~ par la s~quence CGG, se trouve dans le brin H le g6ne de structure du tRNA Trp. Le tRNA Trp pourrait fournir rextr~mit~ 3" OH n#cessaire au d$marrage de la synth6se du brin L. !1 faudrait dans ces conditions admettre que le repliement du brin H d$plac~ dans cette r$gion tr6s riche en g6nes de tRNA permet de mettre en continuit$ le 3"OH du tRNA Trp (produit de transcription du brin H) avec 0i,. Cette hypothbse attrayante aurait pour avantage d" uniformiser certains concepts sur I'amor.cage de la r$plication dans les cellules eucaryotes. En effet, r intervention du tRNA Trp dans I'amorgage de la r$plica.tion en DNA du RNA 35S du virus du Sarcome de Rous est d$montr~e depuis

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Iongtemps. Plus r~cemment la prdsence de la tryptophanyl tRNA synth~tase asso- ci te ~ la DNA polymdrase o~ de cellules HeLa (enzyme assurant la r~plication du DNA nucl~aire) a ~t~ dgalement obser- v~e [40],

L'existence de deux origines de r~plication distinctes pour chacun des deux brins du mt DNA contribue ~ simplifier les m~canismes enzymatiques mis en ]eu au cours de la r~plication de ces molecules. En effet la non copie simultan~e des deux brins parentaux au niveau de ia fourche de r~plication permet une ~longation continue du DNA. Ce mdcanisme ~vite I'intervention de syst~mes d'amorcage des fragments d'Okazaki, d'dl imi- nation de nombreuses moldcules de RNA et enfin limite la fr~quence des phdno- manes de ligation. La mise en place spon- range de rorigine de r~plication 0i, au moment du passage de ,la fourche de rdplication pourrait donc representer un mdcanisme simplificateur ne n~cessitant pas I'intervention d'une prot~ine spdcifique. Dans I'~tat actuel des connaissances on peut imaginer que le contrdle de r~plication s'exerce seulement au niveau de la D-loop. La liaison de prot~ines spdcifiques et l'association possible de cette r~gion avec la membrane interne mitochondriale [11] pourrait supprimer I'Jnfluence des signaux d'arr~t de r~plication (sdquence consensus) et provoquer la r~plication de la molecule. L'amplification ~norme et simultan~e du nombre de mitochondries et des molecules de DNA mitochondrial pendant la phase de vitellogen~se des oocytes de Xen,opu~s laevi~s [10] r~fl~terait cette situation.

O rganisatio,n dre I"i,nformatio~n g~n6ti',que.

La taille modeste du g~nome mitochon- dri~tl des cetlutes animales a constitu~ un atout capital pour l'~tude de I'organisation de I' information g~n~tique du chromosome. La cartographie des produits de transcription et la ddtermination de la s~quence nucl~otidique complbte des mt DNA humains [ I I ] et de ceilules de souris [ IZ] a rdvdld un degr~ extraordinaire d" empaquetage de I' information g~n~- tique. Des revues rdcentes permettront au lecteur de se documenter de fa`con plus approfondie [12, 41]. Nous r~sumerons ici los caract~res essentiels de I'originali-

t~ de ces molecules. Dans les ce/iules de mammif~res aussi bien que de Xe~opus laevis, ~ I'exception de la r~gion de la D-loop, la totalitd du brin Hes t transcrite. Une partie importante du brin Les t ~ga~e- ment transcrite. Toutefois, seule une faible fraction des produits de tra,lscrip- tion primaire de ce brin correspond ~ un contenu informatff uti/isable. La cartographie precise au moyen de la nucl~ase Sl des extr~mit~s 5"P des produits de transcription intra mitochondriaux et leur superposition avec la s~quence nucl~otidique des mtDNA de cellutes humaines et de souris a permis de pr~ciser los limites des g~nes de ces diff~rents trans- crits [I I, 12, 38]. Les g~nes de structure d'un petit nombre de polypeptides cod~s par le g~nome mitochondrial ont pu ~tre Iocalis6s par la comparaison de la s6quence nucl~otidique de cadres de lecture ouverts avec la s~quence en acides amines de prot~ines analogues purifi~es

partir de levure (par exemple, la sous- unit~ II de la cytochrome oxydase). Ces diff~rentes ~tudes ont permis de Iocaliser les g~nes des RNA ribosomaux 12S et 16S, les 22 g~nes de tRNA ( 14 codds par le brin H, 8 par le brin L) et 12 ~ 13 sdquences susceptibles d'etre traduites en prot~ines dont lesproduits de 8 d'entre elles restent inconnus. Ces derni~res s~quences son t ddsigndes par I'abr~via- tion URF. L'analyse d~taill~e de la dispo- sition r~ciproque de ces g~nes a montrd que seLtls des chevauch,ements trbs rdduits entre g~nes pouvaient exister. D" autre part I ' information gdn6tique expri- m~e par le brin H nese superpose clue trbs faiblement avec celle contenue dans le brin L (m#me si la transcription de chacun des brins est largement chevauchante). Cette ~tude a montrd une al.ternance r~guli~re entre les g~nes de prot~ines (URF) correspondant ~ des RNA messagers polyA + ou les g~nes des 17NA ribosomaux d'une part et los gdnes des tRNA d'autre part. Seules deux exceptions qui s'ex- pliquent par la copie simultan~e en un produit de transcription primaire unique de deux gdnes ad]acents a ~td notre. L'analyse de la s~quence des zones de jonction entre cadres de lecture ouverts et g~nes de tRNA a montr~ que le dernier codon de lecture en position 3" des URF precede d'un ou deux nucldotides le premier nucl~otide du g~ne de tRNA. Le ou les nucl~otides entre los 2 gbnes sont in- variablement A et A T ce qui signffie que

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les RNA messagers correspondants se ter- minent par U ou UA. Ce type d'organisation a conduit ~ envisager I'existence d'un m~canisme de transcription et de terminaison de la traduction tout ~ fait parti- culiers. La transcription polycistronique du brin H ~ partir du promoteur unique de la D-loop conduirait ~ la formation d'un long produit de transcription primaire. Des signaux de coupure endonucldoly- tique seraient constituds par la structure en feuille de t r i f le des molecules de tRNA r~guli~rement alternds avec les RNA messagers. Aprbs d~cottpage, les molecules de RNA messagers se terminant par U ou UA seraient polyad~nyl~es. Ce processus conduirait & la mise en place des co dons d'arr~t UAA.

L'~conom.ie exceptionnelle des mdcanismes mis en jeu pour I'expression g~ndtique de I' information du mtDNA se manifeste ~galement dans le petit nombre de moldcules de tRNA utilis~es pour le d~codage g~n~tique. Se~lement, 22 esp~ces de tRNA au lieu de 32 apparais- sent n~cessaires pour le ddcodage de toutes les families de codon. Le nucl~o- tide U en position 5" de I'anticodon pourrait contrairement aux tRNA cytoplas- miques reconna?tre n'importe quelle base du codon du RNA messager. Des modif i- cations de nature inconnue pourraient dans un petit nombre de cas restreindre ces possibilit~s et accroHre la fid~lit6 de lecture de certains codons.

L'util isation du co don UGA pour la lecture du tryptophane plut6t que son utilisa- tion comme codon d'arr~t (la polyad~ny- lation remplissant ce r&le) pourrait ~galement favoriser un mdcanisme d'accumula- tion maximale de I' information r g~n~tique dans cette petite molecule. La r~duction du nombre et de la taille des tRNA, de la taille des s~quences leaders et du polyA dans les RNA messagers, I'absence de syst~me de coiffe dans ces mdmes mRNAs, I'existence d'un tr~s petit nombre de promo~eurs (vraisemblab,lement deux) pour la transcription de plusieurs dizaines de g~nes sont autant d'exemples de la simplification des mdcanismes mis en jeu pour l'expression g~n6tique ,de ces chromosomes. On pent supposer que ,la transcription simultande des gdnes (rR~NA, tRNA et polypeptides du brin H), vraisemblablement coupl~,e ~ ce'lle des tRNAS cod~s par le brin Les t un m~canisme trbs in~ressant pour le fonctionnement des mitochondries. En effet, le couplage de la

transcription des tRNAs, avec les autres g~nes de structure du brin H permet non seulement le d6coupage precis des produits de transcription mais permet ~galement I'approvisionnement coordonn6 des mitochondries en composants de I'appa- reil de traduction (rRNA, tRNA) n6ces- saires ~ la synth~se de polypeptides parti- cipant ~ une mdme cha~ne m~tabolique (cha?ne respiratoire). La modulation de la production relative de ces diff~rents produits (le RNA ribosomal est produit en grande quantitY) pourrait s" expliquer par un m~canisme classique d'att~nua- lion [42] .

La remarquable densit~ de I'organisa- lion g~n~tique du chromosome mitochondrial des ce/lules animales et la grande simplicit6 apparente de son fonctionnement (transcription - - r6plication) peuvent Otre la manifestation d'une stra- t~gie de s6lection des solutions d'6cono- mie maxim~le au cours de I'~volution. I! est vraisemblable que 1"6tude des m~canismes enzymatiques assurant le fonctionnement de ce syst~me g6n#tique tra- duira le mOme caractOre. L'6tude des pro- pri6t~s des DNA et RNA polym~rases [3] isoldes de mitochon:dries de diverses origines suggbre effectivement une simplif i- cation par rapport ~ ,la situation observ~e avec le systbme nucl~aire. Ce domaine constitue une des perspectives les plus attirantes de la poursuite de I'~tude d'un g6nome qui n'a pas fini 1de livrer tous ses secrets. En effet, le r61e du mtDNA ne se limite pas ~ t'approvisionnement des organites en composants de la cha?ne respiratoire et de la membrane mitochondriale interne. L'identif ication des produits de chacune ,des URF (8 pour les cellules animales et davantage dans les cellules v~g~- tales) [43] , peut contribuer ~ expliquer divers m~canismes lids ~ la fonction g~n~- tique du chromosome mitochondrial : la transformation des cellules animales par le mtDNA [44] , la fixation prdf6rentielle des carcinog~nes chimiques par les mitochondries [45] des remaniements g~n~- tiques (g~n6rateurs de la stdrilit~ des fleurs m~les) du mtDNA des cellules v6g~tales [46] .

G. B ru,n et A. Cor do,n~n,i~r IJnsti'tut Curie,

Section de Bi~log'i:e, 26 ,rue d'Urm,

75231 Pa,rirs Cedex 05.

1982, 64, n ° 5.

X

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(Socidt~ Chimique de France et Soci~td de Chimie Bio logique) se t iendront Paris, les 5-6-7 Jui f let 1982, dans le cadre du centenaire des b~t iments de la Facultd de Pharmacie, 4, Avenue de I 'Observa- toire.

Date l imi te de proposit ion de commu- nicat ions (orales ou par af f iches) : 15 M a i 1982,

Renseignements : Professeur F. Perche- ron, 4, A venue de I 'Observatoire, 75006 Paris.

1982, 64, n ° 5.

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Le «chromosome mitochondrial des cellules animales: originalité structurale et fonctionnelle