1

LES BIOFILMS …

Lydie PLOUX

Institut de Chimie des Surfaces et Interfaces

UPR CNRS 9069

15 rue J.Starcky BP248868057 Mulhouse cedex

– Le Mans – 20/03/2007 -

Interactions Système bactérien - Surface des (bio)matériaux

formation des biofilms

Facteurs d’influence :- caractéristiques de la surface

- conditions de culture- molécules bioactives

(inhibitrices)

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PLAN

Conclusions

Les biofilms bactériens : définitions et enjeux

Devenir d’un (bio)matériau

• Le film de conditionnement : exemple de l’adsorption de protéines

• Approche physico-chimique de l’adsorption de virus et des adhésions cellulaires primaires

• Interactions bactérie – surface et biofilm - surface

• Interactions ostéoblastes – surface

• Influence du film de conditionnement …

– Le Mans – 20/03/2007 -

3

LE BIOFILMBACTERIEN

dans la nature …

Canalisation d’eaux usées

Biofilm d’un écosystème aquatiquealpin

Biofilm dans une flaque d’eau

© Gordon McFeters, author

Photo by John Lennox

Biofilm mixte (cocci et batônnets)sur la surface d’une plante

– Le Mans – 20/03/2007 -

4

- Structure hétérogène

- Nombreux paramètres environnementaux

- Système dynamique (temps, espace)

Matériau

Matrice de polymère

extracellulaireSubstances et débris divers+

Bactéries

VIDE

PHASE LIQUIDE

COLONIES CELLULAIRES

CANAUX

«BANDEROLES»

Zones plutôt denses Parties en cours de détachement

Des pores et des canaux– Le Mans – 12/09/2006 -

5

• protection contre les antibiotiques et les nettoyants chimiques

• réservoir de bactéries viables (possibilité de re-contamination bactérienne)

• protection contre les actions de nettoyage mécaniques

• protection contre des conditions de vie défavorables (hautes températures, lumières, séchage, …)

Avantages pour les bactéries …

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Les problèmes posés

Milieu / Environnement

- Contamination bactérienne

- Contamination chimique (toxine par exemple)

Support

- Corrosion (métaux)

- Colmatage (filtres)

- Dégradations diverses (coating)

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Biofilm sur uncathéter

Biofilm sur uneprothèse

Plaque dentaire

Biofilm sur la peau dans le domaine biomédical …

Biofilm dans l‘intestin

+

+

--

-

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Homme, 56 ans, endocardite associée à un pacemakerUn exemple …

Fièvre (39,2°), vomissementsDouleurs cardiaquesS. aureus dans prélèv. sanguins

Cloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 4 semaines

Perte des symptômes7 jours

Fièvre, vomissementsTranspiration abondanteS. aureus dans prélèv. sanguins

Cloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 6 semainesRifampicine : 600 mg / jour, oral, 6 semaines

Perte des symptômes9 jours

Fièvre, vomissementsTranspirationS. aureus dans prélèv. sanguins

Retrait du pacemaker, recouvert de S. aureusCloxacilline : 12 g / jour, intraveineux, 4 semaines

Guérison– Le Mans – 20/03/2007 -P.Lejeune

9

macromolécules

virusbactéries cellules

eucaryotes

Propriétés du matériau Chimie, Topographie, Récepteurs spécifiques, …

Devenir d’un (bio)matériau …

– Le Mans – 20/03/2007 -

10

Bactérie (2 µm)

Virus (50 à 100 nm)

Protéine ~ 3 nm

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais »

A différentes échelles …

– Le Mans – 20/03/2007 -

… et avec différents atouts …

11

– Le Mans – 20/03/2007 -

Matériau

Compétition entre les différents objets

macromolécule

cellulevirus

bactérie

MatériauFilm de

conditionnement

12

Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux

minérauxFe, Mg, …

– Le Mans – 20/03/2007 -

13

Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux

minéraux

protéines

Albumine

Fibronectine

Fibrinogène

Sérum complet

… autres protéines du sang ou des tissus

– Le Mans – 20/03/2007 -

14

Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux

minéraux

protéines

lipides

Biosurfactants(glycolipides ou lipopeptides)

rhamnolipid (Pseudomonas)surfactin (Bacillus)

serrawettin ( Serratia)

– Le Mans – 20/03/2007 -

Produits métaboliques bactériens

15

Film de conditionnement

Molécules présentes dans le milieu

métaux

minéraux

protéines

lipides

– Le Mans – 20/03/2007 -

sucresExopolysaccharides

bactériens

Produits métaboliques bactériens

16

Film de conditionnement : les facteurs d’influence

– Le Mans – 20/03/2007 -

- nature de la molécule (masse, composition élémentaire, fonctions chimiques, conformation) et du matériau (charge, hydrophobicité)

- présence de plusieurs molécules

compétition pour l’adsorption

déplacement de molécules adsorbées

Interactions électrostatiques, Interactions van der Waals, Interactions hydrophobes

quantité adsorbée

réversibilité

conformation (dénaturation)

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Self-assembled monolayers (SAMs)

1) homogènes :

Film de conditionnement : exemple

– Le Mans – 20/03/2007 -

Conditions expérimentales:- Fn = 2µg/mL- Alb = 20µg/mL- Durée de l’adsorption = 2h- Séchage = flux de N2

Observation par AFM:Structure arborescente sur surfaces hydrophobes Structure globulairesur surfaces hydrophiles

Alb

Fn

Hydrophilic NH2Hydrophobic CH3

Contraste de phase(5x5)µmS.Fleith, thèse (2005)

Fibronectine (Fn) et Albumine (Alb) : conformation différente selon la nature de la surface.

18

2) Hétérogènes :

S.Fleith, thèse (2005)– Le Mans – 20/03/2007 -

Conformation arborescente sur CH3

Mélange de conformations globulaire et arborescente sur NH2

+ Fibrinogène (Fn)

AFM topographic image (5x5)µm

CH3 1’ NH2 CH3 1’ NH2 gas + Fn

19

Matériau

Adsorption et première phase de l’adhésion

– Le Mans – 20/03/2007 -

20

Matériau

Adsorption et première phase de l’adhésion

– Le Mans – 20/03/2007 -

21

Matériau

Adsorption et première phase de l’adhésion

– Le Mans – 20/03/2007 -

Théories DLVO

(Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek)

DLVO : interactions électrostatiques + interactions Van der Waals

DLVO étendue : + interactions hydrophobes

DLVO étendue + effets stériques

22

Application de DLVO à l’adhésion bactérienne

DLVO étendue + effets stériques Ong Langmuir (1999) Lipopolysaccharide

(LPS)

– Le Mans – 20/03/2007 -Membrane d’une bactérie Gram négative

23

Ong, Langmuir (1999)

Étude par AFM des

interactions bactéries-

surface

Accord qualitatif

Accord quantitatif

– Le Mans – 20/03/2007 -

24

… dégager des tendances

Adhésion-agrégation

Sharp 1975– Le Mans – 20/03/2007 -

VIRUS

Floyd 1977 Images MEB

25

L’adhésion-agrégation virale dépend

De la surface

- la charge de surface

- l’hydrophobicité

Gerba 1984, Voorhuizen 2001, Gassiloud 2005

Gerba 1984

Gerba 1984, Lytle 1995, Dowd 1998Du sérotype viral

- la charge de surface (point isoélectrique)

- la présence d’un coating de surface (polypeptides)

– Le Mans – 20/03/2007 -

26

Du milieu

- pH

- la force ionique

- la nature des ions présents

Gerba 1984, Lukasik 2000, Zhuang 2003

Gerba 1984– Le Mans – 20/03/2007 -

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L’adhésion-agrégation virale est

Réversible

Médiée par les protéines adsorbées

Favorable à la survie virale

Facteur d’inactivation virale

Lytle 1995, Loveland 1996

Floyd 1977, Gerba 1984,

Gassiloud 2005

Lipson 1984

Gassiloud 2005

surtout étudiée pour les applications dans le domaine de la contamination des eaux rétention/inactivation

utilisée pour caractériser les propriétés « barrière » des matériaux

L’adhésion-agrégation virale est

– Le Mans – 20/03/2007 -

28

BACTERIES

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais »

– Le Mans – 20/03/2007 -

P.Lejeune

29

Les étapes de la formation du biofilm

SURFACEColonisation

primaireColonisation secondaire

Maturation et détachement

1 2

– Le Mans – 20/03/2007 -

30

la composition de la membrane bactérienne (présence de LPS)

Variations inter-bactéries dues à …

• permettent les mouvements « contrôlés » des bactéries (transport vers la surface)

• permettent de « dépasser » les forces répulsives (adhésion primaire)

• jouent peut-être un rôle d’adhésine (interactions spécifiques)

– Le Mans – 20/03/2007 -

la présence de flagelle(s)

31

Curli

P.Lejeune

Flagelles, fimbriae, pili favorisent la

formation du biofilm, en particulier dans la

phase initialePrigent-

Combaret(2000)

- Plus courts, plus fins et plus nombreux que les flagelles

- protéine polymérisée

– Le Mans – 20/03/2007 -

la présence d’organelles d’adhésion

Interactions à faible distance : liaisons

hydrogènes et liaisons covalentes

?

32

Attachement irréversible, consolidation

– Le Mans – 20/03/2007 -

33

Les étapes de la formation du biofilm

– Le Mans – 20/03/2007 -

SURFACEColonisation

primaireColonisation secondaire

Maturation et détachement

1 2

34Lejeune, Bioadh’05

Création de colonies bactériennes …

– Le Mans – 20/03/2007 -

Curli

ProliférationRegroupement des bactéries en colonies (twitching)

et migration des colonies (swarming)

P.Lejeune

35

P.Lejeune

EPS

Synthèse des EPS(acide colanique pour Escherichia coli)

– Le Mans – 20/03/2007 -

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- Présence d’organelles (flagelles, pili)- Charge et hydrophobicité de la membrane externe

Bactéries

- Chimie de surface- Charge, énergie et hydrophobicité de la surface- Topographie de la surface

Surface du matériau

- pH, température, tension ionique- présence de surfactant- composition chimique

Conditions environnementales

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Charges de surface

- point isoélectrique des bactéries : pH 2

charge négative à pH 7

mais : très variable selon les bactéries

et les conditions environnementales

⇒

++ ++ + ++ ++ +

---- -

----------

-- -- - -- -- -

---- -

----------

attraction répulsion

Adhésion initialeHogt 1986

Harkes 1991

Van der Mei 1992

Kiremitci-Gumustederelioglu 1996

Gottenbos 2001

Li 2004

Dankert 1986

Li 1999

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Gottenbos J Antimicr Chemoth 2001

1 heure

Chargée +

Chargée -

7 heures

Chargée +

Chargée -

Chargée +

P.aeruginosa E.coli

Chargée -

Temps d’incubation Roberts 2004

Milieu de cultureModèle bactérien

+

+++

Li Int J Food Microb 1999

Tension ionique Adhésion initiale

++ ++ + ++ ++ +

---- -

----------

+ + +++

++++ + +

- - -- -- -

Li 2004

– Le Mans – 20/03/2007 -

39

Hydrophobicité et énergie de surface

• Surfaces hydrophobes : favorables à l’adhésion bactérienne

Tegoulia 2002

Katsikogianni 2004

règle Bactéries hydrophiles sur surfaces hydrophiles

Bactéries hydrophobes sur surfaces hydrophobes

An 1998

Bakker 2004

Tsibouklis 1999

Li 2004

• Energie de surface faible surface antibactérienne

– Le Mans – 20/03/2007 -

40

Topographie de la surface (rugosité)

- paramètre critique : taille des bactéries

1-3 µm

0,5-1,0 µm

Sites protégés

E.coli sur silice :lisse

E.coli sur silice :poreux (1 à 2µm)

Taylor 1998

Boyd 2002

– Le Mans – 20/03/2007 -

Structures inférieures à la taille d’une bactérie ?

41

Bactérie

Charge de surface

Energie de surface

Hydrophobicité

Rugosité

[2] Bos 1999

[4] Bakker 2004

[5] Roberts 2004

[1] Gjaltema 1997

[3] Li 1999

[1] [2] [3] [4] [5] [6]

[6] Terada 2005

+ effet majeur

- effet mineur

0 pas d’effet

+ -+

+

0

+

-

Autres facteurs

déterminants si charge <0

+

Composition chimique Rugosité

+

Milieu de culture

-

Composition chimique

(protéines)

-

-

– Le Mans – 20/03/2007 -

42

Film de conditionnement

Colonisation primaire

Colonisation secondaire

MATERIAU 1 2

Adhésion bactérienne Maturation et détachement

?

– Le Mans – 20/03/2007 -

Etude cinétique d’un biofilm formé sur des SAMshydrophobes et hydrophiles

Mouillabilité à l’eau (θe après stérilisation)

CH3 NH2

98,5° ± 3,5 54,0° ± 2,5

Ploux (2007)

43

NH2CH3

PDMSin milieu aqueux

Biofilm

en milieu confiné NH2CH3

1 mm

Haidara (2000)

évolution cyclique =

maturation puisdétachement0,0E+00

2,0E+074,0E+076,0E+078,0E+071,0E+081,2E+08

0 100 200 300 400

Culture duration (hours)

cells

/cm

2

NH2

CH3

– Le Mans – 20/03/2007 -Ploux (2007)

44

Modèle du processus de détachement : deux voies, physique et biologique …

MATERIAU

Signal biologique

Détachement

Signal physique

Modification de la morphologie du

(bio)film

=

Modification de la cohésion du

(bio)filmCaractéristiques de la surface

Modification de la morphologie du

(bio)film

=

Modification des conditions de vie

physiologique

Signal physique

– Le Mans – 20/03/2007 -Ploux (2007)

45

CELLULES

EUCARYOTES

K.Anselme

G.Bourbonnais « http://ici.cegep-ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais »

– Le Mans – 20/03/2007 -

Image MEB

46

Cinétique de l’adhésion cellulaire

Secondes

Phases

Forces de Van der WaalsForces ioniques

Liaisons Intégrine-ligand

Augmentation de la zone de contact, regroupement des récepteurs en cluster et

interactions avec le cytosquelette

Synthèse de la matriceextracellulaireJours

Minutes

Heures

– Le Mans – 20/03/2007 -K.Anselme

47

cellules en

division

cellule en cours

d’adhésion

cellule adhérente

– Le Mans – 20/03/2007 -

K.Anselme

48

Matrice extracellulaire

MATERIAU

NoyauExpression des gènes

Ca2+

Na+

K+

JonctionsInter-

Cellulaires

Actine

IntégrinesPoint focal

Signalisation

Cytosquelette

L’adhésion cellulaire

– Le Mans – 20/03/2007 -K.Anselme

49

Protéines membranaires Interactions cellule-matériau ou cellule-matrice

Sites d’attachement des filaments d’actine

Figure 16-75Molecular biology of the cell, 3rd Edition, B. Alberts et al.

– Le Mans – 20/03/2007 -

50

Les points focaux

de Molecular biology of the cell, 3rd

Edition, B. Alberts et al.Figure 19-10

Double marquage fluorescent : en orange, les points focaux

Figure 17-42

– Le Mans – 20/03/2007 -

51

Influence des caractéristiques physico-chimiques de surface

Topographie de la surface

- amplitude de la rugosité (nano- and micro-

topographie)

- organisation de la rugosité (isotrope/anisotrope)

- porosité (micro- and macro-porosité)

– Le Mans – 20/03/2007 -

Chimie de surface

- composition de la surface

- énergie de surface, hydrophilicité/hydrophobicité

52

Amélioration de l‘adhérence (modification de la porosité, de la texture, …)

Cellules osseuses sur des matériaux poreux ou à topologie structurée

Images MEB

– Le Mans – 20/03/2007 -K.AnselmeK.Anselme

53

– Le Mans – 20/03/2007 -

Influence de la chimie de surface CH3 NH2 3’ CH3 1’ NH2

H (°) 15 +/- 4 17 +/- 2 22 +/- 4 22 +/- 10

S.Fleith, thèse (2005)

54Hiérarchie des couches adsorbées: Eirich, Bolger et Michaels (1968)

Rédu

ctio

nde

l’en

ergi

ede

sur

face

Influence du film de conditionnement : quelle surface ?

– Le Mans – 20/03/2007 -

55

Influence du film de conditionnementprotéines Albumine

FibrinogèneEffet inhibiteur pour l’adhésion bactérienne

Effet promoteur pour l’adhésion bactérienne

– Le Mans – 20/03/2007 -

Adsorption préférentielle des cellules sur les zones avec protéines

Fibronectine et Pluronic F68 (copolymère amphiphile) Dewez (1998)

Polystyrène (PS)

PS-OX

Image ToF SIMSHépatocytes de rat

56

Influence du film de conditionnement

– Le Mans – 20/03/2007 -

biosurfactant

Souche mutante de Serratia liquefaciens défectueuse en biosurfactant

Plaques contenant de la serrawettin

serrawettin

Gouttes d’eau contenant de la serrawettin

0 0,5 0,8 1,0 2,0 40

Favorise la formation des colonies bactériennes

Daniels (2004)

57

Conclusions

Aspects physico-chimiques

Aspects biologiques

Surfaces (réelles ou modèles) Modèles biologiques (macromolécules, cellules)

Conditions environnementales(milieu de culture, film de conditionnement)

– Le Mans – 20/03/2007 -

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Remerciements

Fabienne Poncin-Epaillard

Karine Anselme

Arnaud Ponche

Conclusions

– Le Mans – 20/03/2007 -

identifier les caractéristiques des cellules (bactéries et cellules eucaryotes) et de l’environnement

tenir compte du facteur TEMPS (adhésion primaire, adhésion long-terme)

gérer la compétition entre « objets biologiques » (protéines, cellules eucaryotes, bactéries)

… optimiser les biomatériaux