LES CELLULES SANGUINES

Elabor par : YASMERO & TASSA

Promotion 2O14

Plan de travail

Introduction

Les constituants du sang : Les cellules sanguines

Le frottis sanguin

Numration des cellules sanguines

Numration des rticulocytes

Valeurs normales des cellules sanguines

Conclusion

I. Introduction: 1, 2

Le sang est un tissu de type conjonctif qui remplit trois fonctions primordiales : le transport, la

rgulation et la protection. Le sang est responsable du transport doxygne, des nutriments, des

hormones et des dchets dans lorganisme. Le sang joue un rle dans la rgulation des liquides, des

lectrolytes et de lquilibre acidobasique. Le sang possde aussi un rle de protection par sa capacit

coaguler et combattre les infections. Il comprend deux lments principaux : le plasma et les

cellules sanguines. La morphologie de ces dernires peut tre tudie sur un frottis color au May

Grnwald Giemsa (MGG). Et leur numration se fait sur une lame spciale appele cellule Malassez.

II. Les constituants du sang : Les cellules sanguines 1, 2

Environ 45% du sang est compos dlments figurs, ou cellules sanguines ce qui correspond

lhmatocrite (Fig.2). Le rle principal des rythrocytes est le transport de loxygne, alors que les

leucocytes interviennent dans la dfense de lorganisme contre les infections. Les plaquettes quant

elles, favorisent la coagulation du sang.

a. Les Globules Rouges ou Erythrocytes :

Parmi les lments figurs du sang, les rythrocytes ou globules rouges sont les plus nombreux. Ils

occupent environ 48% du volume sanguin chez lhomme et 42% chez la femme. Ils ont comme rles

principaux le transport des gaz (oxygne et dioxyde de carbone) et la conservation de lquilibre

acidobasique.

La composition et les caractristiques dun rythrocyte facilitent son rle de transport. Lrythrocyte

de diamtre 7 m est une cellule anucle souple possdant une forme biconcave particulire, sa

flexibilit lui permet de changer de forme afin de traverser les minuscules vaisseaux capillaires, sa

membrane cellulaire est trs mince, ce qui facilite la diffusion des gaz.

Les rythrocytes sont composs principalement dune grosse molcule appele Hmoglobine (Hb),

cette dernire est une hmoprotine complexe compose dhme (un compos de fer) et de

globine (une protine simple), se combine loxygne et au gaz carbonique. Pendant que les GR

circulent dans les capillaires qui irriguent les alvoles pulmonaires, loxygne se lie au fer de

1 Sharon Mantik Lewis,Margaret M.. Heitkemper,Shannon Ruff Dirksen, soins infermiers, Mdecines chirurgie

Tome 2, de boeck, 2011 2 MacCance, 2006

lhmoglobine. Lhmoglobine oxygne, appele oxyhmoglobine, est lorigine de la couleur rouge

vif du sang artriel.

b. Les Globules Blancs ou Leucocytes :

Tout comme les GR, les leucocytes proviennent des mmes cellules souches hmatopotiques (Fig.1)

Ils sont de taille variant entre 6 20 m

Il existe cinq diffrents types de leucocytes, rpartis historiquement en deux groupes en fonction de

leur noyau et de leurs granules cytoplasmiques.

Les leucocytes dont le cytoplasme contient des granules sont appels GRANULOCYTES ou LEUCOCYTES

POLYNUCLEAIRES, ils ont un noyau unique plurilob, on distingue trois types de granulocytes en

fonction des colorants fixs par leurs granules spcifiques :

- Les neutrophiles : taille de 12 15 m, leur noyau est pluri-segment dont les lobes 3 5 sont

reli par de fins filaments chromatiniens, la chromatine est dense, mott, de couleur violet

fonc, leur cytoplasme est abondant, parsem de fines granulations primaires

Les granulations spcifiques sont trs peu visibles.

- Les basophiles : taille de 10 14 m, prsentant un noyau volumineux, marqu en partie par

de grosses granulations de couleur violet fonc, disperses dans le cytoplasme.

- Les osinophiles : taille de 12 14 m, avec un noyau bilob, un cytoplasme abondant

contenant de nombreuses granulations sphriques de couleur orang.

De la mme faon, le terme AGRANULOCYTE a t utilis pour distinguer les lymphocytes et les

monocytes des granulocytes, car leurs granules cytoplasmiques ntaient pas mis en vidence par les

techniques microscopiques de lpoque.

Dune manire gnrale, tous les leucocytes exercent leurs fonctions dans les tissus et nutilisent le

sang que comme voie de transport entre les sites de formation, de stockage et dactivits. Tableau II.

Tous les leucocytes peuvent traverser les vaisseaux sanguins et les tissus grce des mouvements

amibodes.

- Les Lymphocytes : la variabilit morphologique des lymphocytes nest pas bien corrle leur

diversit fonctionnelle (BT ou NK)

*Lymphocytes de petites tailles (7 9 m) :

- Noyau arrondi (ou ovalaire, parfois encoch) excentr, chromatine dense et motte de

couleur violet fonc.

- Cytoplasme peu tendu, clair ou lgrement basophile.

*Lymphocytes de taille plus grande (9 15 m) :

-Cytoplasme tendu, contient parfois des granulations violaces (3 5) ces cellules

correspondent des lymphocytes T cytotoxiques ou des cellules NK.

- Les Monocytes : ces cellules posent souvent des problmes didentification en raison de leur

variabilit, de forme nuclaire et de leur aptitude se dformer.

-Grandes cellules de taille 20 40 m

-Noyau de forme variable (arrondi, rniforme ou irrgulier)

-Chromatine peu dense, de structure rgulire

-Cytoplasme tendu, de couleur gris bleut, contient de fines granulations roses.

TYPE ROLES

Granulocytes

Neutrophile Phagocytose, surtout durant la phase prcoce de linflammation

Eosinophile Phagocytose (moins efficace que le neutrophile) ; raction allergique, protection contre les maladies parasitaires

Basophile Ractions inflammatoire et allergique ; libration de bradykinine, dhparine, dhistamine, de srotonine ; phagocytose limite

Agranulocytes

Lymphocyte Raction immunitaire mdiation cellulaire et humorale

Monocyte Phagocytose ; raction immunitaire cellulaire

Tableau I Type de leucocytes et leurs rles

c. Les Plaquettes : 3

Les plaquettes appartiennent au tissu mylode, elles proviennent de la fragmentation du cytoplasme.

Les plaquettes circulent dans le sang pendant une dure de dix jours environ, leur destruction se fait

ensuite essentiellement dans la rate et le foie.

Nommes aussi thrombocytes ont pour rle principal damorcer le mcanisme de la coagulation en

formant un clou plaquettaire durant la phase initiale de lhmostase primaire.

3 Sy Hung Nguyen, Anne-Claude Allin-Pfister, Redha Bourouina , Manuel d'anatomie et de physiologie, 2008

Cellule souche

hmatopotique Cellule souche

multipotente

Progniteur

mylode

Fig.1 - LHmatopose

TH

ERESE W

INSLO

W

Fig.2 - Lhmatocrite

JER

OM

E HA

RLE

III. Le frottis sanguin en hmostase et son interprtation : 4 , 5

Principe :

Diverses techniques de laboratoire permettent danalyser le sang. Le frottis sanguin fait partie de ces

technique, cest lexamen au microscope dune goutte de sang, qui permet dtudier les

caractristiques morphologiques (forme, taille, aspect) des cellules sanguines afin de dceler la

prsence dune ventuelle anomalie, utile au diagnostic cytologique de nombreuses maladies

hmatologiques et parasitaires.

Matriel :

- Lancettes ou aiguilles strilises

- Lames microscope et couvre-objets propres

- Alcool thylique ou mthylique 95 %

- Rcipients peu ou botes de Ptri

- Microscope avec une capacit grossissante d'au moins 200 fois

- Papier absorbant

- Marqueur ou crayon

- Eau distille

*Echantillon : Sang total capillaire ou sang veineux prlev sur EDTA

*Ractifs :

Solutions tampon de Srensen pH = 7

- Solution A: KH2 PO4 9,1 g/1

- Solution B : Na2 HPO4 9,5 g/1

On mlange ces deux solutions dans les proportions suivantes:

- Solution A 38,9 ml - Solution B 61,1 ml

Solution de May Grnwald

Solution de Giemsa dilue 10% dans de l'eau tamponne pH= 7.

4 Franois Jobin, lhmostase, 1995

5 QA International Collectif, Encyclopdie familiale de la sant: comprendre, prvenir, soigner, 2010

Les solutions de May Grunwald et de Giemsa sont prtes l'emploi et se conservent bien dans des flacons bruns bien bouchs l'abri de la lumire pendant plusieurs mois.

La solution tampon se conserve 1 mois +4C.

A savoir :

- Renseignements cliniques

- Rsultats de lhmogramme

a. Prparation de la lame :

Le frottis est ralis avec du sang capillaire ou du sang veineux EDTA et doit tre effectu de

prfrence dans les 3 heures suivant son prlvement.

*Technique de ltalement : (Fig. 3)

- Immdiatement aprs le prlvement sanguin, dposer une goutte de sang de la taille dune

tte dpingle sur lextrmit dune lame parfaitement propre et exempte de poussire

- Placer devant la goutte une deuxime lame et former un angle de 30 45 avec la premire

lame

- Reculer cette deuxime lame incline, jusqu'au contact de la goutte de sang pour la faire

s'tendre, par capillarit, sur toute la largeur de la lame incline.

- Faire glisser la deuxime lame sans trop de pression et dun mouvement rgulier le long de la

lame infrieure

- En procdant rapidement avec un angle plus ferm, le frottis sera plus fin quen tirant plus

lentement et avec un angle plus ouvert.

*Le frottis obtenu :

Ne doit tre ni trop pais, ni trop mince

Ne doit atteindre ni les bords, ni les extrmits de la lame.

Ne doit pas prsenter de trous, ni de stries

Doit tre aussi rgulier que possible

* Traitement ultrieur des lames :

Par prcaution, il vaut t mieux raliser pour chaque patient au moins un frottis

supplmentaire, voire davantage, si des examens de cytochimie sont prvus

Immdiatement aprs ltalement, les lames sont identifies au crayon papier avec

le nom du patient, un numro didentification et/ou la date.

Le frottis doit scher au moins pendant 3O minutes avant sa coloration

1. Placer une deuxime lame incline

entre 30 et 45

2. Laisser la lame du dessus venir en

contact avec la goutte de sang, qui va

remonter sur la lame par capillarit

3. Tirer la lame dans le sens de la flche

pour taler le frottis sanguin

Point de ponction

Garrot

Fig. 3 Frottis sanguin - Technique de ltalement

b. Coloration du frottis :

Principe

Le colorant de May-Grnwald est une solution neutre d'osine et de bleu de mthylne dans

de l'alcool mthylique, ce qui permet la fixation des lments. Lorsqu'on utilise ce colorant

isolment, les noyaux sont colors en bleu ple, les cytoplasmes en bleu trs clair ou sont

incolores, les granulations secondaires des granulocytes en rouge clair pour la ligne

neutrophile, en bleu fonc pour la ligne basophile et en rouge-orang pour la ligne

osinophile. Les hmaties sont colores en beige ros.

Le colorant de Giemsa est une combinaison d'osine et de drivs du bleu de mthylne dont

l'azur. Il colore les noyaux en violet, les cytoplasmes en bleu plus ou moins intense ou en rose

selon les cellules et les granulations primaires des granulocytes en rouge-pourpre intense

(granulations dites alors azurophiles).

Etape 1 : fixation et coloration par le May Grnwald On trempe le frottis dans un bac contenant le May Grnwald pur, pralablement filtr, pendant 3 5 minutes. Etape 2 : rinage l'eau tamponne pH = 7 On sort le frottis et on le trempe dans un bac contenant l'eau tamponne pH = 7 pendant 2 3 minutes. Etape 3 : coloration par le Giemsa dilu On sort le frottis et on le trempe dans un bac contenant la solution de Giemsa, pralablement filtre et dilue au 1/10 dans l'eau tamponne/ pendant 20 30 minutes. Etape 4 : rinage l'eau tamponne pH = 7 On trempe le frottis dans un bac plein d'eau tamponne pendant 2 3 minutes. Etape 5 : schage l'air libre Les lames colores sont gouttes et sches l'air libre. Il faut attendre au moins 5 minutes avant de les lire. Au terme de ces tapes, le frottis sanguin est prt tre tudi au microscope optique.

c. La fixation :

Si vous colorez le frottis avant de l'avoir fix, les cellules exploseront en raison du soi-disant choc osmotique ou hypotonique. Cela se produit parce que la concentration saline dans les cellules est beaucoup plus leve que celle du colorant, qui est dilu dans l'eau distille.

Il faut donc fixer le frottis avant la coloration. Cette opration entrave le gonflement des cellules, qui demeurent intactes une fois colores. Une technique de fixation simple et efficace est de tremper le frottis pendant de trois cinq minutes dans un rcipient contenant de l'alcool thylique ou mthylique 95 %. Pour verser de l'alcool sur le frottis, vous pouvez galement utiliser un compte-gouttes ou une bouteille distributrice.

d. Contrle du frottis :

- Pour dterminer la rpartition des cellules, la qualit de l'talement et de la coloration, il faut tout d'abord contrler le frottis au grossissement (obj xl00). Si la rpartition est juge Satisfaisante, on dpose une petite goutte d'huile immersion sur la queue de l'talement, puis on met en place l'objectif x100.

- La rpartition des cellules n'est pas parfaitement gale. Les leucocytes doivent tre intacts et leur rpartition relativement homogne. Tout de mme/ on ne peut viter une certaine sgrgation.

- Les lments les plus petits tels que les lymphocytes se regroupent au centre du frottis, les plus volumineux (polynuclaires et monocytes) sont entrans dans les franges et la queue. Les hmaties observes dans la zone d'paisseur idale, doivent tre tales en couche monocellulaire; leurs contours doivent tre rguliers et leur coloration ros.

- Quant aux plaquettes on les retrouve gnralement regroups en amas.

e. Etude et interprtation du frottis :

- Montage du couvre-objet : Le frottis est maintenant prt pour l'observation, mais si on veut

le conserver longtemps, on doit rendre la prparation permanente. Pour cela, aprs avoir fait

scher la lame, posez sur le frottis une goutte dun liquide de montage ou dun baume spcial

et montez le couvre-objets. Si le liquide du montage est trop visqueux, vous pouvez faire

chauffer un peu la lame ( une temprature ne dpassant pas 40 pour faciliter le flux du

liquide de montage ou du baume entre la lame et le couvre-objet.

- Observation : Un grossissement de 200 fois suffit pour nous permettre d'observer et identifier les diffrents types de cellules. Si vous utilisez un grossissement plus puissant on verrait mieux les dtails des cellules. On peut aussi les examiner avec un objectif sec ou en appliquant la technique de l'immersion l'huile. Dans ce dernier cas, si on a appos un couvre-objet, on devrait attendre une journe que le baume durcisse, sinon, quand on dplacerait la lame, l'huile fera glisser le couvre-objet.

- Sous le microscope on observe : (Fig. 4)

Neutrophile

Eosinophile

Basophile

Monocyte

Lymphocyte

Granulocytes

Agranulocytes

Leucocytes

Erythrocytes

Fig. 4 Frottis sanguin les cellules sanguines aprs coloration au MGG

IV. La numration sanguine des cellules sanguines: 6

La numration formule sanguine (NFS) ou hmogramme permet de mesurer le nombre dlments de

chacune des trois catgories de cellules sanguines savoir ; les globules rouges (rythrocytes),

globules blanc (leucocytes) et les plaquettes.

La numration globulaire consiste compter le nombre de globules de chaque catgorie, et la formule

leucocytaire rpartir les globules blancs en diffrentes classes en fonction de leurs caractristiques.

Et l'valuation :

- De l'hmatocrite qui est le rapport du volume total des globules rouges circulant par rapport

au volume total du sang

- L'hmoglobine qui est le constituant des globules rouges

- Du volume globulaire moyen (V .G .M .)

- De la concentration corpusculaire moyenne en hmoglobine (C .C .M .H.)

a. Indication de la numration sanguine:

Elles sont multiples, si bien que le laboratoire doit tre prvenu si une recherche particulire entraine

une modification de ses techniques. Parmi les plus importantes on note les syndromes anmiques, la

surveillance des hmorragies aigus, syndromes infectieux, etc.

b. Technique de numration sanguine sur cellule Malassez :

La cellule Malassez : hmatimtre dune capacit de 1 mm3 dont le quadrillage est

compos de 10 bandes, 5 longitudinales et 5 transversales, dlimitant de grands

rectangles et de petits carrs, chaque bande mesure 0,1 mm3 de diamtre.

Enonc de la technique :

- Le prlvement se fait au niveau de la veine ou plus simplement la pulpe du doigt.

- Une goutte de sang est prleve la pipette de Potain (Fig.5)

- La goute est tale sur une lame sche et colore au MGG

- Elle est tudie lhmatimtre ou cellule Malassez (Fig.6)

Certains laboratoires pratiquent la numration des globules rouges laide de compteurs

lectroniques.

6 Pierre Delforges,Alain Harlay,Daniel Berdeu Surveillance infirmire: mdecine, chirurgie, 2003

Numration des globules blancs :

- On effectue une dilution au 1/20 me dans le liquide de LAZARUS

- On compte au microscope objectif 40 les GB dans 5 bandes horizontales (=N), 1

bande horizontale = 1/1O mm3

- On compte 5 bandes = 1/2 mm3, il y a donc N x 2leucocytes /mm3 de sang dilu au

1/2O me

- Le rsultat final est donc : N x 2 x 20 = N x 40 leucocytes / mm3

Numration des globules rouges :

- On effectue une dilution au 1/200 me dans le liquide de MARCANO et HARZEN

- On utilise la pipette Potain

- On remplit la pipette jusqu graduation 2

- On termine le remplissage avec le liquide de MARCANO et HARZEN jusqu

graduation 101

- On compte au microscope objectif 40 les globules rouges.

Numration des plaquettes :

- A laide dune pipette Potain de rouge faire une dilution au 1/200 me avec le liquide

chloridrate de procane ou novocane

- Agiter 20 30 mn avec un agitateur

- Laisser reposer 30 mn plat voir mme 1 heure en agitant quelques secondes de

temps autre pour complter lhmolyse

- Agiter une dernire fois pendant 1 mn

Fig. 5 les pipettes Potain

Potain pour les GB

Potain pour les GR

Fig. 6 La cellule Malassez

- Remplir la cellule malassez

- Laisser reposer 5 10 mn

- Rgler lclairage du microscope de faon maintenir le champ gris, grossissement

40

- Les plaquettes apparaissent comme des capsules brillantes de taille ingale de 1,5

3

- Faire la numration, compter 2 bandes au moins dans les cas normaux

- En cas de thrombopnie lire toute la cellule

- Quelques reticulocytes en cas de thrombocytose

- Le nombre N des plaquettes = nbre de 2 bandes x linverse de la dilution 2 bandes =

1,5 mm3

- N = nbre x 200 x 5

- VN = 150 000 ---- 400 000/ mm3

c. Technique de numration des rticulocytes :

Etapes pr-analytiques

Prlvement de sang capillaire ou de sang veineux sur tube EDTA (mme tube que lhmogramme).

Mthode danalyse

Principe et intrt

Permet de classer les anmies en rgnratives et argnratives. Le taux dhmaties par mm3 ou par litre doit tre connu pour les calculs des valeurs rapportes au volume de sang

Les rticulocytes sont des hmaties jeunes contenant encore quelques granules ou filaments dARN. La coloration au bleu de crsyl fait apparatre ces lments colors en bleu fonc.

Les rticulocytes ne se colorent que "vivants" ; il faut donc procder la coloration avant la confection du frottis ; les rticulocytes sont dnombrs sur frottis paralllement aux hmaties.

Matriel et ractif

Tubes hmolyse. Bain-marie ou tuve. Lames et pipettes. Bleu de crsyl brillant.

Mode opratoire

Introduire dans un petit tube 6 - 8 gouttes de sang et 6 - 8 gouttes de ractif (cf. infra) ; mlanger en roulant le tube entre les deux mains et boucher le tube avec du coton.

Mettre une temprature proche de 37 pendant 10 20 minutes, sans surchauffer. Prparer des frottis trs minces, laisser scher. Ne pas contre colorer.

Numration et rsultats

Choisir, lobjectif x 10, une zone dans laquelle les hmaties sont bien tals, ne se chevauchent pas et ou leur densit est homogne (cette zone est en gnral situe vers la queue du frottis).

Effectuer la numration lobjectif x 100.

Les hmaties sont uniformment colores en bleu-vert ple. Les rticulocytes apparaissent comme des hmaties avec des grains ou filaments bleu violac. ATTENTION de ne pas confondre ces grains ou filaments dARN avec des taches de colorants.

1 Comptage et rsultats en pourcentage de rticulocytes par rapport aux hmaties.

compter le nombre de rticulocytes dans 9 champs conscutifs : soit R le nombre de rticulocytes dans ces 9 champs.

compter le nombre total dhmaties (rticulocytes compris) dans 3 des champs, non conscutifs, o on a compt les rticulocytes (par exemple les champs : 1 puis 4 puis 9) : soit H le nombre dhmaties dans ces 3 champs. Donc, pour 9 champs : 3 x H.

Le % de rticulocytes est : % Ret = (R / 3H) x 100.

Effectuer le mme comptage dans deux autres zones de la lame et retenir comme rsultat final la moyenne de ces trois pourcentages.

2 Expression du rsultat en nombre absolu de rticulocytes exprim en mm3 ou en litre de sang.

On obtient ce rsultat en multipliant le pourcentage obtenu, exprim de faon dcimale (ex : 8% = 0,08 ; 15 % = 0,15) par le nombre total dhmaties par mm3 ou par litre.

Ralisation partir de sang capillaire

On met , la pipette 3 ou 4 gouttes de bleu de crsyl brillant dans un tube hmolyse puis on fait tomber 3 ou 4 gouttes de sang capillaire dans le tube Comme le colorant contient du citrate de Na, le sang ne coagule pas

On homognise de la mme faon puis on procde de la mme faon que ci-dessus.

Valeurs normales

En valeurs relatives : 0,5 2 % des hmaties En valeur absolue : 25 000 75 000 / mm 3 ou 25 75 giga / litre

Une anmie est considre comme rgnrative si le taux de rticulocytes est suprieur 120 000 / mm3 ou 120 giga / l.

V. valeurs normales :

FEMME HOMME NOUVEAU- NE ENFANT

PN 45 70 % 45 70 % 80% 30%

PE 1 5% 1 5% 1 5% 1 5%

P BASOPHILES 0 - 0,5 % 0 - 0,5 % 0 - 0,5 % 0 - 0,5 %

MONOCYTES 2 10% 2 10% 2 10% 2 10%

LYMPHOCYTES 20 40% 20 40% 40% 60%

HEMATIES X 106 4 5,4 4,5 5,9 5,5 - 6 3,2 4

PLAQUETTES X 103 MM3

150 400 150 400 150 400 150 400

GLOBULES BLANCS 103 MM3

4 - 9 4 - 9 12 - 25 5 - 11

VI. La conclusion :

La pratique de l'tude de la morphologie cellulaire sanguine a beaucoup volu depuis quelques

annes grce aux automates modernes d'hmatologie qui identifient les cellules normales

circulantes par une technique de cytomtrie en flux. La microscopie optique demeure cependant

toujours indispensable la reconnaissance sur frottis sanguin des cellules pathologiques. Une bonne

connaissance de la morphologie des lments normaux du sang, globules rouges, plaquettes et

leucocytes, reste un pralable l'tude de la pathologie. La pdagogie traditionnelle a galement

bnfici des progrs de l'informatique, et de la tlmdecine, par l'introduction de supports

nouveaux de communication qui constituent des outils prcieux d'aide la formation.