Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE

Option : BIOTECHNOLOGIE- MICROBIOLOGIE

Présenté le

par

RANDRIANOFIDINA Mbolasitraka Andriampenomanana

Maître ès Sciences

Soutenu publiquement le 02 novembre 2012 devant la commission d’examen composée de :

Président : Professeur ANDRIANARISOA Blandine

Examinateurs : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette

Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina

Rapporteurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana

Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube digestif des termites et leurs

implications dans le phénomène d’agrégation du sol

Et quoi que vous fassiez, en parole ou en

œuvre, faites tout au nom du Seigneur

Jésus, en rendant par lui des actions de

grâce à Dieu le Père.

Je dédie ce mémoire à :

Mes parents, en témoignage de leur sacrifice, soutien et patience durant mes études

Mes frères et leur famille pour leur soutien et affection

Soafara, pour ta sympathie, tes encouragements et conseils

Qu’ils trouvent dans cet ouvrage le fruit de tant d’années de sacrifices et de

dévouements.

Aussi, un ENORME MERCI à vous tous pour votre soutien sans faille.

Remerciements

Le présent travail est le fruit d’une collaboration étroite entre le

Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE (Centre

National de Recherche sur l’Environnement) et le Laboratoire de

Biotechnologie-Microbiologie (Département de Biochimie Fondamentale et

Appliquée) de la Faculté des Sciences d’Antananarivo. Nous tenons à

exprimer nos vifs et sincères remerciements :

Au Docteur RAKOTO RANOROMALALA Danielle Aurore Doll, Chef

du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des

Sciences et au Professeur JEANNODA Victor, Responsable de la formation

en Troisième Cycle au sein du département, de nous avoir donné la

permission de soutenir ce mémoire.

Aux Professeurs RAVELONANDRO Pierre et REJO-FIENENA

Félicitée, Directeurs successifs du Centre National de Recherches sur

l’Environnement, qui nous ont accueillis dans leurs laboratoires pour la

réalisation de nos travaux.

Au Professeur ANDRIANARISOA Blandine, de l’Université

d’Antananarivo, qui, malgré ses multiples occupations et responsabilités a

bien voulu nous accorder son attention et sa précieuse assistance et nous

faire l'honneur de présider le jury de ce mémoire.

Au Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette et au Docteur

TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina qui ont aimablement répondu a notre

sollicitation de siéger en tant que membres de jury et nous ont consacré une

partie de leur précieux temps. Leurs observations et leurs remarques seront

reçues avec intérêt.

Au Docteur RAMAMONJISOA Daniel, Maître de Conférences à

l’université d’Antananarivo pour m’avoir dirigé, conseillé et soutenu lors de

la réalisation du stage et du présent manuscrit, malgré ses multiples

occupations.

Au Docteur Baohanta Rondro Harinisainana pour son amabilité et sa

disponibilité, qui a suivi ce travail pas à pas et qui m’a beaucoup aidé par l’intérêt

qu’elle a bien voulu porter à mes résultats malgré ses lourdes responsabilités.

Aux Docteurs RAMANANKIERANA Heriniaina,

RASOLOMAMPIANINA Rado, RAKOTOARIMANGA Nirina, chercheurs au

Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) pour l’accueil

chaleureux qu’ils nous ont toujours réservé et pour les conseils qu’ils nous

ont donnés au cours de notre stage.

A toutes les équipes de l’unité 1 et de l’unité 2 du Laboratoire de

Microbiologie de l’Environnement.

A tous mes amis stagiaires au Laboratoire de Microbiologie de

l’Environnement.

A tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de

ce travail.

Table des matières

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE ............................................................................................................................................... i

LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................................ ii

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... iii

LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................... iv

INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................................. 3

I.LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE ......................................... 3

I.1. Généralités sur les polysaccharides ...................................................................................... 3

I.2. Les polysaccharides d’origine microbienne ........................................................................ 3

I.2.1. Définitions des exopolysaccharides (EPSs) ....................................................................... 3

I.2.2. Importances des EPSs dans la vie de la cellule productrice ........................................... 3

I.2.3. Composition chimique des EPSs ....................................................................................... 4 a) Composition osidique ............................................................................................................. 4

b) Les substituants organiques .................................................................................................... 5

c) Les substituants inorganiques ................................................................................................. 5

I.2.4. Classification des EPSs ....................................................................................................... 6

a) Les homopolysaccharides ....................................................................................................... 6

b) Les hétéropolysaccharides ...................................................................................................... 7

I.3. Utilisation des exopolysaccharides ....................................................................................... 9

I.3.1.Dans le domaine médical ..................................................................................................... 9

I.3.2. Dans l’industrie alimentaire ............................................................................................ 11

I.3.3.Les applications en agronomie .......................................................................................... 12 a) Notion de rhizosphère ........................................................................................................... 12

b) Notion d’agrégat, de structuration et de stabilité du sol ....................................................... 12

c) Les microorganismes rhizosphériques et la production d’EPS ............................................ 13

Table des matières

I.4.La production des EPSs ....................................................................................................... 15

I.4.1. Conditions de culture ........................................................................................................ 15

I.4.2. Milieu de culture ............................................................................................................... 15

I.4.3. Conditions optimales de synthèse des EPSs ................................................................... 15

I.4.4. Extraction des EPSs .......................................................................................................... 16

I.5.Intérêts des EPSs ................................................................................................................... 16

II.LES TERMITES ............................................................................................................................. 18

II.1. Généralités .......................................................................................................................... 18

II.2. Organisation et classification ............................................................................................ 18

II.3. Les différentes castes .......................................................................................................... 19

II.4. La termitière ....................................................................................................................... 19

II.5. Répartition mondiale ......................................................................................................... 19

II.6. Les termites de Madagascar .............................................................................................. 20

II.7. Le tube digestif des termites .............................................................................................. 20

II.7.1. Morphologie générale du tube digestif des termites .................................................... 20

II.7.2. Diversité des microorganismes du tube digestif des termites ...................................... 20

II.8. Rôles et utilisations des termites ....................................................................................... 21

MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................ 23

I.ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES MICROORGANISMES PRODUCT EURS D’EPSS .................................................................................................................................................................. 23

I.1. Matériels biologique : le termite ouvrier ........................................................................... 23

I.1.1. Classification ..................................................................................................................... 23

I.1.2. Morphologie ...................................................................................................................... 23

I.2. Isolement des microorganismes producteurs d’EPSs ....................................................... 24

I.2.1. Dissection du tube digestif des termites .......................................................................... 24

I.2.2. Isolement et dénombrement des microorganismes ........................................................ 24

Table des matières

a) Préparation du milieu de culture ........................................................................................... 24

b) Ensemencement .................................................................................................................... 24

c) Comptage des colonies ......................................................................................................... 25

d) Purification et criblage des souches ..................................................................................... 25

I.2.3. Conservation des souches ................................................................................................. 26

I.3. Etude de la croissance des dix (10) souches sélectionnées : mesure du poids sec .......... 27

I.3.1. Mesure du poids sec .......................................................................................................... 27

I.3.2. Détermination de la vitesse spécifique de croissance maximale µmax ........................... 27

I.3.3. Détermination du temps de génération G ....................................................................... 28

II. CARACTERISATION DES SOUCHES BACTERIENNES .............................................. 28

II.1. Etude des caractères culturaux ......................................................................................... 28

II.2. Description des caractères morphologiques et structuraux ........................................... 28

II.2.1. Observation à l’état frais ................................................................................................ 28

II.2.2. Coloration de Gram ........................................................................................................ 29

a) La fixation ............................................................................................................................. 29

b) La coloration ......................................................................................................................... 29

II.3. Etude des caractères biochimiques ................................................................................... 29

II.3.1. Culture sur milieu mannitol mobilité ............................................................................ 29

II.3.2. Milieu citrate de SIMMONS .......................................................................................... 30

II.3.3. Milieu de Hajna-Kligler .................................................................................................. 30

II.3.4. Milieu lysine – fer ............................................................................................................ 32

III. LES SOUCHES BACTERIENNES, LA PRODUCTION D’EPSS ET LE PHENOMENE D’AGREGATION DU SOL ................................................................................ 33

III.1. Mise en évidence de la production d’EPS par les souches bactériennes ..................... 33

III.1.1. La fermentation ............................................................................................................. 33

a) Préparation du milieu de fermentation ................................................................................. 33

b) Inoculation microbienne ....................................................................................................... 33

c) Suivi de la croissance bactérienne ........................................................................................ 33

III.1.2. Extraction des polysaccharides .................................................................................... 34

Table des matières

III.1.3. Description des propriétés physiques des EPSs .......................................................... 34 a) Mesure de l’élasticité des exopolysaccharides ..................................................................... 34

b) Evaluation de la viscosité ..................................................................................................... 35

c) Calcul du débit-volume qv .................................................................................................... 35

III.2. Les souches bactériennes et le phénomène d’agrégation du sol ................................... 36

III.2.1. Préculture des souches .................................................................................................. 36

III.2.2. Fermentation .................................................................................................................. 36

III.2.3. Préparation du sol .......................................................................................................... 36

III.2.4. Inoculation des souches bactériennes ........................................................................... 36

III.2.5. Test de désagrégation .................................................................................................... 36

III.2.6. Mesure du diamètre des agrégats ................................................................................. 37

III.2.7. Test de la capacité des souches productrices d’EPSs à solubiliser le phosphate ..... 37

RESULTATS ........................................................................................................................................ 37

I. DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES PRODUCTEURS D’E PS ................ 38

II. ISOLEMENT ET SELECTION DES BACTERIES PRODUCTRIC ES D’EPSS ......... 38

II.1. Criblage selon la taille des colonies bactériennes ............................................................ 38

II.2. Criblage selon la viscosité du milieu de culture ............................................................... 39

II.3. Etude de la croissance des souches en milieu de culture liquide .................................... 40

II.3.1. Cinétique de croissance des dix souches sélectionnées ................................................. 40

II.3.2. Vitesse de croissance maximale et temps de génération .............................................. 43

III. CARACTERISATION ET IDENTIFICATION DES DIX SOUC HES MICROBIENNES ISOLEES ........................................................................................................... 44

III.1. Morphologie des colonies bactériennes sur milieu solide .............................................. 44

III.2. Caractères morphologiques des souches ........................................................................ 45

III.3. Caractères biochimiques des souches ............................................................................. 46

IV. PRODUCTION DE POLYSACCHARIDES PAR LES 10 SOUCHES .......................... 47

IV.1. Courbe de croissance des souches en cours de fermentation ....................................... 47

Table des matières

IV.2. Quantité d’EPS extraits pour chaque milieu de fermentation ..................................... 48

V. PROPRIETES PHYSIQUES DES EPS .................................................................................... 49

V.1. Elasticité des EPS ............................................................................................................... 49

V.2. Viscosité du milieu de culture ............................................................................................ 49

VI. POTENTIALITE DES SOUCHES MICROBIENNES ET LE PHE NOMENE D’AGREGATION DU SOL .............................................................................................................. 50

VI.1. Pourcentage en agrégats stables à l’eau .......................................................................... 50

VI.2. Solubilisation du phosphate par les souches bactériennes ............................................ 52

DISCUSSION ....................................................................................................................................... 52

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ........................................................................................... 57

REFERENCES BIBIOGRAPHIQUES .......................................................................................... 58

ANNEXES ...................................................................................................................................................

Glossaire

i

GLOSSAIRE

Agrégation : Fait de s’assembler pour constituer une masse plus ou moins compacte.

Chélation : (du grec khêlê : « pince ») Processus physico-chimique au cours duquel est formé un complexe, le chélate, entre un ligand, dit chélateur (ou chélatant), et un cation (ou atome) métallique, alors complexé, dit chélaté.

Dispersion : éparpillement en divers endroits (des éléments d'un groupe) en les séparant. Chez les termites, seuls les adultes reproducteurs sont responsables de cette dispersion.

Embolie : Largage de matériel (appelé embole) dans la circulation sanguine. Le risque est l'obstruction d'une artère périphérique ou pulmonaire provoquant une ischémie.

Flagellé : Organisme unicellulaire pourvu d’un appendice filiforme assurant son déplacement.

Foret sclérophylle : Type de végétation dépendant des conditions climatiques caractérisées par une saison sèche marquée et des minima de température assez accusés.

Géophagie : Pratique consistant à s'alimenter de substances minérales, comme par exemple l'argile.

Inoculation : Apport contrôlé d’un germe, bienfaisant dans une culture végétale.

Nisine : Peptide antibactérien polycyclique de 34 résidus d’acides aminés utilisé comme conservateur alimentaire. Elle est utilisée dans les industries de transformation des fromages, viandes, boissons, etc. pour prolonger leur durée de vie.

Nutraceutique : (mot-valise des mots « nutrition » et « pharmaceutique ») Se dit d’un produit alimentaire ou d’un aliment qui procure des avantages médicaux et de santé y compris la prévention et le traitement de la maladie.

Rhéologie : (du grec rheo, couler et logos, étude) Etude de la déformation et de l'écoulement de la matière sous l'effet d'une contrainte appliquée.

Rhizosphère : Interface ou région du sol sous l’influence directe de la racine.

Sarcome : Tumeur maligne qui se forme aux dépens du tissu conjonctif ou des tissus qui en dérivent comme le tissu musculaire, l'os.

Symbiose : Vie en commun d’individus appartenant à des espèces différentes dont les organismes demeurent proches l’un de l’autre, ceci avec avantages réciproques pour les deux partenaires.

Synérèse : Exudation de l’eau.

Thrombose : Caillot de sang qui se forme dans une veine (thrombose veineuse) ou dans une artère (thrombose artérielle).

Ubiquistes : Qui se trouvent au même moment en plusieurs lieux.

Liste des abréviations

ii

LISTE DES ABREVIATIONS

A: Acétate

ANOVA : Analyses of variance

CNRE : Centre National de Recherche sur l’Environnement

Da: Dalton

DV : Débit-volume

E.D : Eau distillée

EPS(s): Exopolysacharide(s)

Gal: Galactose

Glc: Glucose

LME : Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement

ln : Logarithme népérien

MOS: Matière Organique du Sol

P: Pyruvate

Rha: Rhamnose

RP: Rouge phénol

TCP : Phosphate de Calcium Tricalcique

tr/min : Tours par minute

UFC : Unité Formant Colonies

Liste des tableaux

iii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Origine des EPS en concordance avec leur substituant………………………….…6

Tableau 2 : Applications des polysaccharides bactériens (Sutherland, 1998)……………........10

Tableau 3 : Effet de l’inoculation avec NAS206 sur les propriétés physiques du sol rhizosphérique………………………………………………………………………...................14

Tableau 4: Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation des milieux d’identification………………………………………………………………………………….31

Tableau 5 : Nombre de colonies isolées sur le milieu YM………………………………............................................................................................... 37

Tableau 6 : Diamètre des colonies isolées sur milieu YM mesuré après 3 jours d’incubation……………………………………………………………………………………..37

Tableau 7 : Classement des souches selon la viscosité des milieux de culture………………. 39

Tableau 8 : Vitesse spécifique de croissance maximale et temps de génération des 10 souches……..................................................................................................................................42

Tableau 9 : Caractéristiques des 10 souches sélectionnées…………………………………….43

Tableau 10 : Aspect morphologique des colonies des dix souches bactériennes cultivées sur YM (observation macroscopique)………………………………………………………............43

Tableau 11 : Caractères morphologiques des souches étudiées………………………………..44

Tableau 12 : Caractères biochimiques des souches…………………………………………….45

Tableau 13 : Quantité d’EPS extraits du milieu de culture de chaque souche (pour un litre de milieu de fermentation)………………………………………………………………….............47

Tableau 14 : Elasticité des polysaccharides des 10 souches…………………………………...48

Tableau 15 : Temps d’écoulement et Débit-volume des EPSs………………………………...49

Tableau 16 : Poids et pourcentage en agrégats stables à l’eau après inoculation……………....50

Tableau 17 : Diamètre du halo+colonie des souches après 7 jours de culture sur le milieu TCP…………………………………………………………………………………………... 51

Liste des figures

iv

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Structure du dextrane, un homopolysaccharide……………………………………....7

Figure 2 : Structure de l'EPS de Lb. rhaminosus RW-9595M…………………………………..8

Figure 3 : Structure du xanthane………………………………………………………………. 8

Figure 4 : Structure du gellane………………………………………………………………......8

Figure 5 : Microagrégats bactériens du sol rhizosphérique extrait du sol de la Martinique…………………………………………………………………………………..…...13

Figure 6 : Production d’EPS dans un fermenteur de 2 litres…………………………………...16

Figure 7 : Schéma du tube digestif d'un termite humivore, Thoracotermes macrothorax….….21

Figure 8 : Termites ouvriers humivores dans leur habitat naturel…………………….….……22

Figure 9 : Mesure du diamètre des colonies selon un axe vertical (Dx) et un axe horizontal (Dy). Culture observée après 3 jours d’incubation………………………………….………………...25

Figure 10 : Mesure de l’élasticité (exemple des souches 40 et 44) après 3 jours d’incubation des souches à 30°C..............................................................................................................................34

Figure 11 :Répartition des souches selon leur diamètre après 8 jours de culture sur le milieu YM................................................................................................................................................38

Figure 12 : cinétique de croissance des 10 souches sélectionnées sur le milieu YM après 10 jours d’incubation.........................................................................................................................40

Figure 13 : Cinétique de croissance des 10 souches au cours des trois jours de la fermentation…………………………………………..…………………………………………47 Figure 14: Pourcentage en agrégats stables à l’eau du sol inoculé par les souches après 10 jours d’incubation………………………………………………………………………..……………51

INTRODUCTION

Introduction

1

INTRODUCTION Les polymères d'origine biologique ou biopolymères tels que les polysaccharides

présentent une diversité de structures qui offre un large spectre de propriétés fonctionnelles.

Outre leurs intérêts dans les exploitations pétrolières, dans l'agroalimentaire ou dans les

industries papetières, les activités biologiques de ces molécules ne sont pas négligeables

(Garrido et al., 2002). Par ailleurs, le marché qui a été essentiellement dominé par les gommes

d'origine végétale ou algale, s'ouvre désormais aux polysaccharides issus de bactéries

(exopolysaccharides EPSs) qui eux ne dépendent pas des aléas climatiques, écologiques et

politiques qui affectent la qualité, le coût et l'approvisionnement, contrairement à leurs

homologues extraits d'algues ou de plantes (Guezennec, 2004).

De plus, les points positifs des EPSs bactériens résident, d’une part sur les possibilités

d’agir sur les conditions de fermentation (sources de carbone, température, aération, pH, etc...)

en vue d’optimiser la production, d’assurer la traçabilité, mais aussi de modifier le polymère

produit, et d’autre part, sur la diversité de leur structure et des microorganismes producteurs qui

sont également issus de divers habitats (Vincent et al., 1994). Les microorganismes qui vivent à

l’intérieur du tube digestif des termites sont parmi les plus étudiés étant donné qu’ils sont

particulièrement nombreux et diversifiés (Ohkuma et al., 2001). En effet, grâce à l’association

symbiotique, ils profitent de l’environnement stable à l’intérieur de ces deniers et participent en

retour à la dégradation des aliments au bénéfice des termites par la production de substances

diverses dont les exopolysaccharides.

En matière d’exploitation, l’importance de ces EPSs dans l’amélioration et le maintien

de la fertilité des sols de culture, notamment celle des sols tropicaux, représente actuellement

l’un des nouveaux défis à relever pour les scientifiques. En effet, l’amélioration et le maintien de

cette fertilité des sols sont parmi les éléments-clés dans le contexte actuel de priorisation de

l’autosuffisance alimentaire des pays en voie de développement. Etant donné que la stabilité de

la structure du sol est fortement corrélée avec sa teneur en matière organique, les

polysaccharides bactériens, fractions importantes de cette dernière, y jouent alors un rôle

prépondérant (Kaci & Heulin, 2008), notamment, dans la formation des agrégats qui sont les

unités de base du sol (Santaella et al., 2008). En effet, les agrégats déterminent les propriétés

mécaniques et physiques du sol (mobilité de l'eau, aération, régulation de la température…) et

jouent un rôle important dans la germination et la croissance racinaire des plantes. L’importance

de ces EPS est ainsi cruciale du point de vue agronomique et environnemental.

Introduction

2

Or, il est actuellement bien connu que, d’une part, les sols tropicaux continuent à se

dégrader, et d’autre part, la résilience naturelle des écosystèmes est particulièrement lente, voire

même inexistante, dans certains cas. Le recours à des procédés biologiques pour la restauration

du sol est donc impératif et a déjà fait l’objet des nombreuses études (Alami et al., 2000 ;

Bomfeti et al., 2011). De ce fait, l’inoculation du sol rhizosphérique par les bactéries

productrices d’EPS est l’une des technologies biologiques de taille pour améliorer et maintenir

la fertilité du sol pour stimuler le développement des plantes (Kaci et al., 2005). De ce fait, pour

le cas des pays en voie de développement comme Madagascar, l’exploitation de cette

potentialité des microorganismes producteurs d’EPSs pour la restauration des écosystèmes

cultivés représente une alternative intéressante pour pallier les utilisations abusives des produits

chimiques.

Ce travail de recherche sur l’importance des polysaccharides d’origine microbienne

dans l’amélioration de la structure du sol en valorisant les ressources naturelles disponibles est

parmi les pionniers dans ce domaine. En considérant le fait que le tube digestif du termite

renfermerait diverses communautés de bactéries productrices d’EPS et que ces derniers

augmenteraient le processus d’agrégation du sol, cette étude a eu comme objectif principal de

décrire les impacts de l’inoculation du sol par les exopolysaccharides bactériens sur sa structure

et son fonctionnement. Les objectifs spécifiques seront i) d’isoler et de caractériser diverses

souches de bactéries productrices d’exopolysaccharides à partir du tube digestif des termites, ii)

de faire un criblage des souches productrices d’exopolysaccharides et iii) d’étudier l’importance

de ces souches sur le phénomène d’agrégation du sol et la dynamique du phosphore dans le sol.

Cette étude se divise en trois parties : la première partie résumera les données

bibliographiques sur les exopolysaccharides et sur les termites, la deuxième partie décrira les

matériels et les méthodes utilisés, la troisième partie exposera les résultats obtenus ainsi que leur

discussion respective. Ces trois parties seront terminées par les conclusions et les perspectives.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

3

I.LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE

I.1. Généralités sur les polysaccharides Les glucides sont des composés organiques constitués de carbone, d'hydrogène et

d'oxygène selon la formule empirique (CH2O) n. Ils incluent les sucres simples, les

polysaccharides et leurs dérivés (Mustapha & Babura, 2009). Ces composés sont les principales

substances nutritives de la plupart des organismes et sont absorbées généralement sous forme de

sucre simple (glucose). Ils fournissent l'énergie et les carbones nécessaires pour la biosynthèse

de protéines, d'acides nucléiques, de lipides et d'autres glucides (Pigman et Horton, 1972).

Les glucides se subdivisent en quatre (4) groupes, à savoir : les monosaccharides, les

disaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides.

Les polysaccharides sont des macromolécules constituées par un grand nombre de

résidus monosaccharidiques liés entre eux par des liaisons glycosidiques. Ils constituent une

importante famille de molécules souvent ramifiées et sans forme particulière (molécules

amorphes), insolubles dans l'eau, et ils n'ont pas de pouvoir sucrant (Flitsch et Ulijn, 2003).

Les polysaccharides ont comme formule générale [Cx (H2O)y)] n où y est généralement

x – 1 et où x est généralement un nombre compris entre 200 et 2500.

En considérant que les motifs récurrents dans le squelette de la molécule polymère sont

souvent constitués de monosaccharides à six carbones, la formule générale peut aussi être

définie par (C6H10O5) n où 40 ≤ n ≤ 3000.

I.2. Les polysaccharides d’origine microbienne

I.2.1. Définitions des exopolysaccharides (EPSs) Les exopolysaccharides (EPSs) sont des polymères biosynthétisés [substances

polymériques extracellulaires (SPE) ou Extracellular polymeric substances (EPS)] (Geesey,

1982). La majorité d’entre eux sont des polymères de surface excrétés par les cellules

procaryotes ou eucaryotes (bactéries et champignons) sous forme de capsules enrobant la cellule

ou de matières visqueuses excrétées dans le milieu extérieur (Sutherland, 1972 ; Cerning, 1994 ;

Mata et al., 2006).

I.2.2. Importances des EPSs dans la vie de la cellule productrice Etant donné que les bactéries productrices d'EPS occupent une large gamme de niches

écologiques, les propriétés des EPSs changent d’un environnement à un autre. En effet, la

capacité de production d'EPS a été décrite comme étant une réponse directe et logique aux


4

pressions sélectives de l'environnement (Dudman, 1997). Ces polymères, qui sont

essentiellement constitués de carbohydrates, sont principalement impliqués dans la formation

d’agrégats ou "biofilm" microbiens (Sutherland, 1990). Les EPS peuvent également jouer de

nombreux rôles qui sont dans la majorité des cas aux bénéfices des cellules productrices :

certains agents pathogènes produisent des EPS(s) pour exprimer leur virulence, certains groupes

de microorganismes les produisent pour interagir avec leur environnement (plante, sol, autres

microorganismes, dessiccation, composés toxiques présents dans le milieu) (De Vuyst, 1999 ;

Leigh et Coplin, 1992 ; Lopez-Lara et al., 1993).

In vitro, l’importance des EPS pour la cellule n’est pas très remarquable, pourtant en

milieux naturels leur production procure aux bactéries un avantage compétitif et protecteur qui

leur permet de se maintenir en vie plus longtemps que les autres groupes non producteurs d’EPS

(Cerning, 1994).

- La couche d'EPS autour de la cellule influence significativement la diffusion de

différentes molécules aussi bien vers l'extérieur que vers l'intérieur de la cellule ce qui rend

difficile l’action des agents antimicrobiens (Whitfield, 1998). A titre d’exemple, la production

d'EPS a conféré à une souche de Lactococcus lactis une tolérance significative envers le cuivre,

la nisine et le lysozyme (Looijesteijn et al. , 2001).

- Les EPS permettent aux bactéries d’agréger des particules en suspension en

utilisant leur caractère anionique et leur capacité à chélater les métaux et les ions. Ces propriétés

les font ressembler à une résine échangeuse d’ions et favorisent l’apport en nutriments

nécessaires à la croissance bactérienne (Costerton et al., 1981).

- Les EPSs sont en grande partie impliqués dans la formation des biofilm

bactériens qui permettent aux communautés bactériennes de s’adhérer à des surfaces en milieux

naturels ou qui les protègent contre les surfactants et même les antibiotiques (O’Toole et al.,

2000).

I.2.3. Composition chimique des EPSs

a) Composition osidique Les EPSs sont composés de résidus glycosidiques, qui peuvent être liés de façon

covalente à des substituants organiques ou inorganiques. Les sucres que l’on peut trouver dans

les EPS sont extrêmement divers. Le D-glucose, le D-galactose et le D-mannose sous forme

pyranose, sont présents dans de nombreux EPSs. La plupart de ces résidus sont également

présents chez les animaux et les végétaux. Toutefois, les EPSs des cellules eucaryotes se

distinguent par la présence, dans certains cas, de pentoses comme le D-ribose ou le D-xylose,


5

qui sont beaucoup moins fréquents dans les polysaccharides dérivés des procaryotes

(Sutherland, 1990).

b) Les substituants organiques Les EPSs microbiens peuvent contenir différents types de substituants organiques liés

par des liaisons éther, ester, amide ou acétalique au squelette glycosidique qui sont fréquents

dans les unités répétitives des EPSs bactériens mais rares dans les polysaccharides d’eucaryotes

et sont en grande partie responsables des propriétés physico-chimiques des polymères qui les

portent.

c) Les substituants inorganiques Les groupements sulfates ont longtemps été limités aux polysaccharides eucaryotes et

aux protéoglycanes mais il s’avère que les polysaccharides sulfatés sont également présents chez

les procaryotes. La majorité des EPSs sulfatés décrits sont produits par des cyanobactéries (De

Phillips et Vincenzini, 1998). D’autres bactéries sont capables de produire des EPS possédant un

groupement sulfate dans l’unité répétitive (Parolis et al., 1996, Raguénès et al., 1997). Les taux

de sulfates de ces EPSs sont bas (< 10 % du poids de la molécule) contrairement aux

polysaccharides d’algues comme les fucoïdanes (Percival et McDowel, 1967, Chevelot et al.,

2001) ou certains glycosaminoglycanes (GAG) comme l’héparine qui peuvent contenir jusqu’à

40 % de sulfates.

Les phosphates sont beaucoup plus répandus et représentent un constituant

fréquemment rencontré dans les EPS bactériens. Beaucoup des EPS phosphorylés ressemblent à

l’acide téichoïque présent dans la paroi des bactéries à Gram positif. En réalité, beaucoup de

souches produisent à la fois des polymères phosphorylés constitutifs des membranes et des EPS

phosphorylés. Les groupements phosphates peuvent se présenter sous deux formes : (i) sous

forme de mono-esters, ils contribuent alors à accentuer le caractère anionique des

polysaccharides qui les portent. C’est le cas des phosphomananes (Parolis et al., 1996) ; (ii) sous

forme de phosphodiesters. L’atome de phosphore est alors engagé dans deux liaisons avec les

hydroxyles de deux résidus différents (Van Casteren et al., 1998).

Les EPS peuvent être soit neutres, soit polyanioniques. Pour ces derniers, la charge

négative est due aux acides uroniques, aux substituants inorganiques (sulfate ou phosphate), aux

groupements pyruvate ou succinate. Le tableau 1 recense les différents substituants les plus

fréquents dans les structures des EPSs selon leur origine (Dumitriu, 2005).


6

Tableau 1 : Origine des EPSs en concordance avec leur substituant (Dumitriu, 2005)

Type de substituant Origine des EPS

Acétate

Glycérate

Phosphate

Pyruvate

Succinate

Sulfate

Bactéries

Bactéries

Bactéries gram positives

Bactéries et algues

Bactéries

Archaea et cyanobactéries

I.2.4. Classification des EPSs

Selon leur composition chimique, les EPSs peuvent être subdivisés en deux groupes:

les homopolysaccharides et les hétéropolysaccharides (Sutherland, 1972).

a) Les homopolysaccharides

Une chaîne d’homopolysaccharide est composée d’un seul type de monomère

saccharidique dont la variation de la structure permet de différencier les homopolysaccharides.

A titre d’exemple, le curdlane, la cellulose et le dextrane qui sont tous composés par le D-

glucose montrent des comportements très différents concernant leurs capacités épaississantes.

Les homopolysaccharides sont de poids moléculaire élevé et peuvent être classés en

quatre (4) groupes: α-D-glucanes, β-D-glucanes, les fructanes et les polygalactanes. Ainsi, la

masse moléculaire du dextrane produit par Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F varie

entre 6,2 et 7,1x106 Da, et celles des levanes et fructanes, produits par Streptococcus mutans

vont jusqu'à 21,6x106 Da et 12,4x106 Da, respectivement (Cerning et al., 1990). La figure 1

montre la structure du dextrane (Homopolymère).


7

Figure 1 : Structure du dextrane, un homopolysaccharide (Lapasin, 1999)

Les homopolysaccharides suivants sont parmi ceux qui sont les plus étudiés:

- les curdlanes sécrétés par Agrobacterium radiobacter (Phillips et al, 1983) sont des

polyglucanes β(1,3) formant un gel en solution.

- les dextranes produits par Leuconostoc mesenteroides (Sutherland, 1972) sont des

polyglucanes β(1,4) formant un gel en solution.

- la cellulose synthétisée par Acetobacter xylinum (Lin et al, 1985) est également un

polyglucaneβ(1,4) mais celui-ci est insoluble en solution.

b) Les hétéropolysaccharides

La majorité des polysaccharides bactériens sont des hétéropolysaccharides formés par

des polymères dont l’unité répétitive est constituée d’au moins deux résidus saccharidiques

différents. Les principaux représentants de cette classe sont : la pectine, l'acide alginique, l'agar,

les carraghénanes (Rougeaux et al., 1999).

Le nombre de types de monosaccharides des hétéropolysaccharides est finalement

assez limité. Parmi eux, les hexoses tels que le D-glucose, le D-galactose et le D-mannose, mais

aussi des méthylpentoses (généralement le L-fucose ou le L-rhamnose) et les acides uroniques,

les acides D-glucuronique et D-galacturonique sont les plus communs (Vandamme et al., 2002).

De plus, il y a aussi des résidus qui ne sont pas des sucres, comme le phosphate, l'acétyle et le

glycérol. Les différentes structures des hétéropolysaccharides ont été résumées par De Vuyst et

Degeest(1999), Riccardi et Clementi (2000), De Vuyst et al. (2001) et Ruas-Madiedo et al.

(2002).

La figure 2 présente la structure de l'unité répétitive de l'EPS synthétisé par

Lactobacillus rhaminosus RW-9595M. Il s'agit d'un heptasaccharide contenant du glucose,

galactose et rhamnose avec un groupement pyruvate.


8

Figure 2 : Structure de l'EPS de Lb. rhaminosus RW-9595M (Van Calsteren et

al. 2002).

- Le xanthane (Figure 3) sécrété par Xanthomonas campestris est un des

hétéropolysaccharides les plus étudiés (Rehm, 2009). Il s'agit d'un polymère dont la chaîne

principale est constituée de D-glucoses avec des liaisons en β(1-4) et dont un maillon glucose

sur deux est substitué en position 3 par une chaîne latérale tri-saccharidique comportant un

résidu acide glucuronique, et deux résidus mannose, l'un sous forme d'acétate, l'autre sous forme

pyruvate. Cette structure de molécule anionique est primordiale pour comprendre le

comportement, l’affinité et les interactions du xanthane.

Figure 3 : Structure du xanthane (Rehm, 2009)

A part le xanthane, les hétéropolysaccharides les plus utilisés sont:

- le gellane (Figure 4) , qui est produit par Pseudomonas elodea (O’Neill et al.,

1983) , peut concurrencer la gélatine dans certains domaines;

→3)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-L-Rhap-(1→

Figure 4 : Structure du gellane (O’Neill et al., 1983)


9

- les alginates traditionnellement extraits des algues brunes qui peuvent également

être produits par des bactéries comme Azotobacter vinelandii et Pseudomonas aeruginosa.

(Michael et al., 1998);

- des précurseurs de glycosaminoglycanes (acide hyaluronique, héparine et

chondroïtine) qui peuvent être produits par les souches Escherichia coli K5 et K4. Ces

polysaccharides contrairement aux glycosaminoglycanes animaux ne sont pas sulfatés (Manzoni

et al, 1993 ; Rodriguez et al ., 1988).

I.3. Utilisation des exopolysaccharides

Les EPS comme le xanthane, le scléroglucane, le curdlane, l’alginate bactérien, le

dextrane, le pullulane, la cellulose bactérienne, etc. ont été utilisés avec succès dans l’industrie

alimentaire, en médecine, en pharmacie, en cosmétique, en chimie (Sandford et al., 1986;

Sutherland, 2002). Dans la rhizosphère, les EPS bactériens contribuent à l’agrégation du sol en

assemblant les particules entre elles (Chenu, 1995).

Le tableau 2, page 10 (Sutherland, 1998) présente les applications établies des

polysaccharides bactériens les plus connus.

I.3.1.Dans le domaine médical

L’utilisation des EPSs dans le domaine médical peut être liée à leurs propriétés

physico-chimiques, en particulier leurs propriétés rhéologiques et la capacité de certains

exopolymères à retenir l’eau. Ces caractéristiques, qui en font d’excellents agents texturants

pour l’industrie agroalimentaire, ont également conduit à leur utilisation en médecine en tant

que substituts de plasma (Carlin et al., 1976), de peau (Sutherland, 1998) ou pour le transport de

principes actifs (Meseguer et al., 1996 ; Carlfors et al., 1998).

Le dextrane, le plus couramment produit par la bactérie Leuconostoc mesenteroides

(souche B 512F) , est largement utilisé comme extenseur du plasma sanguin, grâce à sa faible

antigénicité et sa faible viscosité en solution saline (de plus, il est moins coûteux que

l’albumine) . Il est également utilisé dans la prévention des chocs postopératoires, dans le

traitement des brûlures, et dans la réduction des risques de thrombose ou d’embolies

(Vandamme et al., 2002).

Différentes études ont été menées sur l’activité anti-tumorale des exopolysaccharides.

L'action du levane, produit par la souche Zymomonas mobilis a été étudiée sur le sarcome 180

(Calazans et al., 2000). Les (1→3)-β-D-Glucanes, provenant de telles bactéries ou de

champignons ont été également décrits par plusieurs auteurs comme agents anti-tumoraux. Le


10

Tableau 2 : Applications des polysaccharides bactériens (Sutherland, 1998)

Utilisation Polymère

Propriétés biologiques Agents antitumoraux

Chirurgie des yeux et des

articulations

Analogues d’héparine

Pansements

β-D-Glucanes

Acide hyaluronique

(Streptococcus EPS)

Escherichia coli K5 EPS

Cellulose bactérienne

Propriétés physiques

Stabilisation d’émulsions

Solidité de la fibre

Formation de film

Floculant

Stabilisation de mousse

Agents gélifiants

Agent hydratant

Inhibiteur de la formation de

cristaux

Contrôle de la viscosité et de

la force de cisaillement

Agent de suspension

Contrôle de la viscosité

Agent de relargage

Alimentation, peintures

thixotropiques

Membranes acoustiques

Enrobage en alimentation

Clarification de l’eau,

extraction de minerai de

cuivre

Bière, extincteurs

Technologies des cellules et

des enzymes

Alimentation

Récupération du pétrole

Cosmétiques,pharmaceutiques

Nourriture congelée, pastilles

et sirops

Forage pétrolier

Alimentation

Enrobage en papeterie

Pesticides dans l’agrochimie

et Vaporisateurs

Imprimantes

Médicaments, herbicides

Xanthane

Cellulose bactérienne

Pullulane

Variés

Xanthane

Gellane

Curdlane et gellane

Curdlane et Xanthane

Acide hyaluronique

Xanthane

Xanthane

Xanthane

Variés

Xanthane

Xanthane

Gellane


11

mécanisme d’inhibition du développement tumoral n’a pas été entièrement élucidé jusqu’à ce

jour. Cependant, cette activité semble être liée principalement à la conformation en triple hélice

adoptée par ces glucanes, leur masse moléculaire, le nombre et la position des chaînes latérales

(Misaki et al., 1993).

La bactérie Streptococcus zooepidemicus produit un polymère d’acide hyaluronique

dont l’unité répétitive est identique à celle de l’acide hyaluronique produite par les mammifères.

Cet acide hyaluronique bactérien est actuellement très pris en chirurgie ophtalmique et en

cosmétique. En effet, sa compatibilité avec le système immunitaire humain prouve la similitude

entre le produit bactérien et celui issu des cellules eucaryotes (Vandamme, 1994 ; Sutherland,

1998).

L’EPS secrété par Bacillus polymyxa réduit le taux de cholestérol chez les animaux

hypercholestérolémiques de laboratoire. Le polymère responsable de cette activité contient des

sucres neutres (D-glucose, D-galactose et D-mannose) et des oses acides (acide D-glucuronique

et D-mannuronique). Les mêmes propriétés ont été décrites sur les polysaccharides d’origine

végétale comme la pectine et les gommes à base d’agar et des exopolysaccharides de

champignons (Cheung, 1996; Kim et al., 2001).

L’EPS produit par la souche Vibrio diabolicus présente des caractéristiques totalement

différentes des autres EPS identifiés puisque possédant des teneurs élevées en osamines et

présentant une forte analogie structurale avec l’acide hyaluronique (Deming, 1998) . Cet EPS a

été utilisé comme implant de comblement osseux dans un modèle expérimental (Zanchetta et al.,

2003).

I.3.2. Dans l’industrie alimentaire

Dans le domaine agroalimentaire, l’utilisation des polysaccharides est très courante.

Leurs propriétés rhéologiques les rendent capables d’épaissir, de gélifier, de stabiliser et

d’émulsifier. Généralement, ils sont utilisés pour diminuer l’activité de l’eau des aliments et

contribuent ainsi à leur conservation. Du fait de leur appartenance à la classe des fibres

alimentaires, ils servent à remplacer le gras, à améliorer les comportements organoleptiques, et

peuvent produire des aliments possédant des propriétés nutraceutiques (immunomodulatrices,

antivirales, anti-tumorales, amélioration du transit digestif).

Les polysaccharides sont ajoutés dans les produits alimentaires afin de modifier leurs

propriétés rhéologiques. La plupart des polysaccharides microbiens sont utilisés pour leur


12

capacité à épaissir ou à former un gel, à prévenir ou à réduire la formation de cristaux de glace

dans les nourritures congelées. Ils peuvent également influencer l’aspect, la couleur ainsi que

l’odeur des produits alimentaires traités (Sutherland, 1990). Ces dernières années, une attention

particulière a été portée sur les EPS produits par les bactéries lactiques en raison de leur

contribution à la rhéologie et à la texture des produits alimentaires tels que les yogourts et les

fromages (Cerning and Marshall, 1999) et pour leur capacité à diminuer le risque de synérèse

(Broadbent et al., 2001). En effet, dans le cas de l’industrie laitière, la capacité des bactéries

lactiques à produire des EPS influence directement la texture des produits laitiers fermentés (de

Vuyst et Degeest, 1999).

I.3.3.Les applications en agronomie

a) Notion de rhizosphère

Le terme rhizosphère a été introduit en 1904 par Lorenz Hiltner, bactériologiste des

sols et professeur d’agronomie. “Rhizo” vient du grec “rhiza,” signifiant “racine” et “sphère” est

le champ d'action ou d'influence. La rhizosphère est la partie du sol qui est directement soumise

à l’influence de la racine. Cette zone est considérée comme l’habitat des microorganismes liés

aux activités de la racine ou de la plante et est le lieu des échanges d’éléments nutritifs ainsi que

les diverses interactions positives ou négatives (Lynch, 1990). La rhizosphère peut contenir une

quantité importante de microorganismes pouvant aller jusqu’à 1000 fois plus importante que

ceux trouvés dans le sol ambiant non influencé par les racines (Fuschs, 1999).

b) Notion d’agrégat, de structuration et de stabilité du sol

Les agrégats sont les unités de base du sol résultants des interactions intimes établies

entre les composés organiques et les minéraux et classés en deux types selon leur taille : les

macroagrégats et les microagrégats (Chenu et al., 1994). Leur stabilité est en général fortement

associée à la teneur en matière organique qui assure la continuité et la cohésion des particules

minérales. Les agrégats déterminent les propriétés mécaniques et physiques du sol (mobilité de

l'eau, aération, régulation de la température, etc.), deux facteurs déterminants pour la

germination des graines et la croissance racinaire.

Le rôle agrégeant des différents composants organiques du sol rhizosphérique a été

décrit par des nombreux auteurs. En effet, il a été établi que les racines et les filaments

mycéliens participent aux macroagrégats, et que les résidus organiques, les bactéries, les

polysaccharides participent aux microagrégats (Rinaudo, 2008 ; Elsass et al., 2008). De plus, la

stabilité des agrégats est fortement corrélée à la nature et à la teneur en matières organiques du


13

sol (MOS) (Oades, 1984 ; Tisdall et Oades, 1982) qui participent à la stabilisation des agrégats

par l’augmentation de leur cohésion en liant les particules minérales entre elles et par la

réduction de la mouillabilité des agrégats (Chenu et al., 2000) . Les racines des plantes apportent

de la MOS, soit directement par le matériel racinaire, soit indirectement par la stimulation de

l’activité microbienne dans la rhizosphère.

c) Les microorganismes rhizosphériques et la production d’EPS

Les microorganismes rhizosphériques (bactéries, algues, champignons) participent au

maintien de la structure du sol. Les interactions entre les microorganismes et les particules du

sol sont multiples et synergiques. Les particules minérales influencent l’activité biologique et la

survie des microorganismes par le contrôle des conditions physicochimiques locales

(particulièrement la disponibilité de l’eau et de l’oxygène). Les microorganismes, à leur tour,

modifient l’agencement des particules du sol (structure) ainsi que leur stabilité (agrégation)

(Chenu et Stotzky, 2002). Les microagrégats bactériens issus du sol rhizosphérique observés

sous microscopie électronique sont présentés dans la figure 5 (Amellal et al., 1999 ; Blanchart et

al., 2000).

Figure 5 : Microscopie électronique de microagrégats bactériens rhizosphériques extraits de sol de la Martinique (Amellal et al., 1999 ;

Blanchart et al., 2000)

La principale contribution des microorganismes rhizosphériques au phénomène

d’agrégation est associée aux secrétions extracellulaires (Chenu et Stotzky, 2002 ; Tisdall, 1994)

qui sont un mélange complexe de biopolymères tels que les polysaccharides, les protéines, les


14

acides nucléiques et les lipides (Wingeder et al., 1999). En effet, l’inoculation avec des souches

productrices d’EPS induit une modification significative des propriétés physiques du sol telle

que l’augmentation de la masse du sol adhérant aux racines par rapport à la masse du tissu

racinaire (RAS/RT), de la taille et de la stabilité des agrégats, accompagnée d’une modification

de la porosité du sol. Ces modifications favorisent la croissance des plantes via l’amélioration de

l’absorption des nutriments et de l’eau (Ashraf et al., 2004 ; Ashraf et al., 2006).

Ci-après quelques exemples d’inoculations des sols rhizosphériques avec diverses

souches bactériennes déjà effectuées:

- l’inoculation des racines de tournesol par une souche de Rhizobium

sp. (productrice de YAS34) dans un sol français (Alami et al., 1999; Alami et al., 2000) ;

- l’inoculation du sol algérien par une souche de Paenibacillus

polymyxa (productrice de levane) et une souche de Rhizobium sp. (productrice de KYGT207)

(Kaci et al., 2005);

- l’inoculation des racines de blé par la souche Pantoea

agglomerans (productrice de NAS206) dans un vertisol marocain (Amellal et al., 1998 ;

Amellal et al., 1999).

Le tableau 3 reporte l’effet de l’inoculation des racines de blé par la souche Pantoea

agglomerans (NAS206) (Amellal et al., 1999). La stabilité structurale est déterminée par un test

de désagrégation en plaçant les racines avec leur sol adhérant dans un tamis (0,2mm) suspendu

et immergé dans 200ml d’eau. L’ensemble est ensuite soumis à un mouvement rotatif pendant

une heure (1h) puis le pourcentage d’agrégats stables à l’eau (taille > 0,2mm) est estimé.

Tableau 3 : Effet de l’inoculation avec NAS206 sur les propriétés physiques du sol rhizosphérique

Sol rhizosphérique RAS/RT (g/g) Agrégats stables à l’eau (%)

MWD (mm) Macroporosité (Hg mm3/g)

Contrôle 105 ± 8 35,2 ± 4,2 1,3 ± 0,2 63 ± 1

Inoculé NAS206 155 ± 9 44,4 ± 2,5 1,6 ± 0,3 87 ± 1

Légende : masse du sol adhérant aux racines par rapport au tissu racinaire (RAS/RT),

proportion d’agrégats stables à l’eau, diamètre moyen des agrégats (MWD) et macroporosité

(déterminée par porosimétrie au mercure, 6µm < r < 40µm). Les valeurs sont données avec la

déviation standard.

La présence de l’EPS augmente la teneur en fraction d’agrégats stables à l’eau (de taille

supérieure à 200µm) (Chenu et Guerif, 1991). Le renforcement des propriétés mécaniques est


15

expliqué par un mécanisme de pontage. En effet, les EPS jouent un rôle agrégeant en

s’adsorbant et en reliant entre elles les particules minérales qui forment ainsi un réseau organo-

minéral (Chenu et Guerif, 1991 ; Chenu et al., 1994).

L'utilisation des populations bactériennes capables de produire activement des EPS est

une approche complémentaire de celle qui consiste à utiliser des bactéries capables de

promouvoir la croissance de la plante par la stimulation de la croissance racinaire ou par la lutte

biologique contre des champignons pathogènes (Bally et al., 1999).

I.4.La production des EPSs

I.4.1. Conditions de culture

La majorité des bactéries productrices d’EPS sont aérobies ou anaérobies facultatives.

La production est généralement maximale quand l’oxygène n’est pas un facteur limitant. Des

cultures pures sont utilisées et des conditions aseptiques sont nécessaires pour prévenir la

croissance de contaminants dans le milieu (Sandford, 1972).

I.4.2. Milieu de culture

La composition en oses des EPS est indépendante de la source de carbone utilisée dans

le milieu de culture (Sandford et Conrad, 1966). Toutefois, les composants suivants sont

indispensables pour la croissance et l’activité des souches productrices : (1) une source de

carbone dont les plus couramment utilisées sont le D-glucose ou le saccharose ; (2) une source

d’azote sous forme de sels inorganiques (ions NH4+ ou NO3

-) ou sous forme de produits naturels

tels que l’extrait de levure ou l’hydrolysat de caséine, (3) des cations comme le fer, le

magnésium, le potassium, le manganèse et le sodium. Le phosphore est aussi exigé et il est

généralement additionné sous forme de phosphate de potassium ou de sodium. L’utilisation d’un

milieu défini permet de déterminer l’effet d’un ingrédient spécifique sur la production de

polysaccharide. Cependant, un milieu complexe peut contenir un facteur de croissance inconnu

qui pourrait stimuler la formation du polysaccharide (Moraine et Rogovin, 1971).

I.4.3. Conditions optimales de synthèse des EPSs

Les conditions optimales pour la production d’EPS à l’instar de celles pour la

croissance sont affectées par le pH, la température, la quantité en oxygène, la présence ou

l’absence d’agitation et la quantité de l’inoculum bactérien. De ce fait, des études préalables

sont nécessaires afin de déterminer les conditions optimales des souches à utiliser

(Sandford, 1972).


16

Les souches bactériennes peuvent être cultivées en milieu liquide dans des fermenteurs

de différentes capacités de 1 à 100 litres (Figure 6). La quantité d’exopolysaccharides produits

peut varier, entre 0,5 et 5 grammes d’EPS par litre de culture, selon la souche bactérienne et les

conditions de culture. Le meilleur rendement de production est obtenu lorsqu’il y a un élément

limitant dans le milieu de culture notamment la carence en nutriments comme l’azote, le soufre,

le magnésium, le potassium ou le phosphore (Sutherland, 1982). La production d’EPS se traduit

par une forte augmentation de viscosité après 48 à 60 heures de fermentation.

Jour 0 : Debut de la fermentation Jour 2 ou 3

Figure 6 : Production d’EPS dans un fermenteur de 2 litres

I.4.4. Extraction des EPSs

La méthode utilisée pour l’extraction de l’EPS dépend du type de microorganisme qui

le produit, du type de polysaccharide et du degré de pureté voulu. Afin d’obtenir des solutions

limpides et pures, il convient de clarifier le moût de culture avant la récupération du

polysaccharide. Des traitements ultérieurs utilisant soit des alcools froids (méthanol, éthanol ou

alcool isopropyl) ou de l'acétone, soit des ultracentrifugations et dialyses successives soit une

centrifugation à haute vitesse (20 000 g) permettent d'isoler les cellules bactériennes et d'obtenir

dans la majorité des cas un ou parfois deux exopolymère(s) à très faible taux de contaminants

(Vincent et al., 1994 ; Guezenenec et al., 1994).

I.5.Intérêts des EPSs

En termes d'exploitation biotechnologique, les exopolysaccharides bactériens sont plus

intéressants par rapport à ceux issus de plantes ou d’algues. Ces polymères présentent une


17

structure chimique régulière qui, dans de nombreux cas, conduit à la formation d’une

conformation hélicoïdale qui rigidifie la chaîne. Ils peuvent être extraits et purifiés sans

utilisation de conditions drastiques.

Les EPSs possèdent une diversité de structure chimique qui peut conduire à des

propriétés intéressantes pour des applications spécifiques en milieux aqueux.


18

II.LES TERMITES

II.1. Généralités

Les termites sont des insectes ubiquistes qui occupent plus des deux tiers de la surface

terrestre et sont particulièrement nombreux en milieu tropical. Ils sont classés parmi les premiers

assimilateurs des composés lignocellulosiques (Lee et Wood, 1971 ; Butler et Bucherfield,

1979). Cette potentialité de dégradation est liée à la présence, dans leur tractus digestif, d'une

microflore symbiotique nombreuse et de leurs comportements alimentaires très diversifiés

(Breznak, 1975).

Les termites sont des insectes sociaux, qui vivent au sein de colonies hiérarchisées et

organisées en castes. Ils se rencontrent surtout dans les pays chauds, où certaines espèces

construisent de grands nids en terre mâchée, les termitières, caractéristiques des plateaux

tropicaux. Ils existent au moins depuis le Jurassique et se caractérisent par des pièces buccales

broyeuses, par un abdomen relié au thorax. Ils sont biologiquement proches des blattes.

II.2. Organisation et classification

Les termites, parfois surnommés fourmis blanches, sont les seuls représentants de

l'ordre des isoptères qui compte environ 281 genres et 2600 espèces (Kambhampati et Eggleton,

2000).

Ils sont répartis en castes fonctionnelles bien définies (ouvriers, soldats et

reproducteurs). Les ouvriers fourragent, construisent et entretiennent les nids mais assurent aussi

l’alimentation des autres individus. Les soldats (absents chez certaines familles comme les

Apicotermitinae) défendent les colonies tandis que les ailés reproducteurs (rois et reines) sont

responsables de la dispersion et de la reproduction (Eggleton, 2006).

Les termites sont classés en sept (7) familles incluant les termites inférieurs

(Mastotermitidae, Hodotermitidae, Termopsidae, Kalotermitidae, Rhinotermitidae,

Serritermitidae) et des termites supérieurs qui sont les Termitidae et qui représentent un peu plus

de 75% de toutes les espèces de termites connues (Kumari et al., 2006). Contrairement aux

autres termites, ces derniers ne possèdent pas de flagellés dans leur tube digestif. Cette

caractéristique est corrélée à une plus grande diversification des habitudes alimentaires ainsi

qu’à quelques changements majeurs au niveau des associations symbiotiques (Eggleton et

Tayasu, 2001 ; Eggleton, 2006).

Selon les différents régimes alimentaires, quatre groupes peuvent être distingués :

(Grassé, 1984)


19

- les xylophages qui vivent plus ou moins uniquement dans le bois ;

- les champignonnistes qui consomment du bois, des feuilles et des herbes

et vivent en symbiose avec des champignons dans des chambres appelées meules à

champignons ;

- les fourrageurs qui consomment de l’herbe et de la litière ;

- les humivores qui se nourrissent d’humus et qui sont parfois géophages.

II.3. Les différentes castes

Les sociétés de termites renferment des mâles et des femelles en nombre à peu près

égal. Cependant, la plupart de ces sexués restent stériles, même adultes, et n’acquièrent jamais

d’ailes (seules les sexués adultes possèdent des ailes) pour se différencier par la suite en soldats

ou ouvriers. Les ouvriers de type broyeur simple forment la caste la plus nombreuse. Les soldats

apparaissent plus pigmentés avec une tête de grande taille munie d’ordinaire de puissantes

mandibules en cisailles. La période d’accouplement se déroule principalement juste après le

début de la saison de pluie formant ainsi la nouvelle colonie.

II.4. La termitière

Les termitières sont de structures et de formes extrêmement variées. Cependant, cinq

catégories peuvent être distinguées (Grassé, 1984) :

- les nids intégrés dans les bois ;

- les nids arboricoles (sur les troncs ou branches) ;

Ces deux premiers nids sont constitués d’excréments et du contenu de la panse rectale.

- les nids hypogés (souterrains) ;

- les nids épigés sont très variés, ils peuvent atteindre 13 mètres de haut et

avec une base pouvant atteindre 30 mètres de diamètre. Les nids peuvent être compacts et

présentent généralement des structures très complexes réalisées à partir de matériaux

sélectionnés mêlés à la salive ;

- les nids inquilins situés à l’intérieur des nids d’autres espèces.

II.5. Répartition mondiale

Il existe dans le monde près de 3000 espèces de termites connues (Eggleton 2001). La

diversité est plus élevée autour de l’équateur et s’annule vers les 45° de latitude nord et sud

(Eggleton 2000). Les termites supportent mal le froid, limités certainement par l’inefficacité de

leurs associations symbiotiques à basse température (Lavelle & Spain 2001). Cependant, les

frontières de répartition des espèces et les flux migratoires des termites ont tendance à s’étendre


20

avec l’activité anthropique (Leniaud et al. 2008 ; Lefebvre et al. 2008). Ainsi, des infestations

par des termites dans des villes inattendues comme Hambourg (Allemagne) ou Devon

(Angleterre) ont été observées (Clément et al. 2001). La diversité spécifique dans des zones

naturellement colonisées par des termites, et où leur présence est bénéfique (forêts tropicales

humides, savane), peut être fortement affectée par les activités humaines (Eggleton et al. 1996).

II.6. Les termites de Madagascar

La biologie des termites malgaches n’est connue, jusqu’à présent, que par les

observations faites sur le terrain. Aucun essai en laboratoire ne semblait avoir été tenté dans

l’île. Les nids des termites autres que les Neoiemes et les Mesotermitidae, c’est-à-dire les

Termitidae, varient d’une espèce à une autre. A Madagascar, une grande variété de nids ont été

observés allant de bois de construction pourri (Coarclotermes clepsydra et des Microtermes

sakalava), sous les pierres (Eutermes milloti, Coarclotermes pauliaini et C. beharensis), dans

des nids, construits au sol ou souterrains (Microtermes kauderni, M. sikorae, M. longiceps et M.

unideniatns, Capritornes capricornis, Coarclotermes clepsydra) ou dans les bois

(Microcerotermes subtilis, Eutermes comorensis, E. nigrita, E. canaliculatus) (Cachan, 1949).

II.7. Le tube digestif des termites

II.7.1. Morphologie générale du tube digestif des termites

Bien plus élaboré qu’une panse de ruminants miniaturisée, l’intestin des termites est

d’une remarquable complexité. Sa structure diverse témoigne, plus que tout autre élément

anatomique, de la formidable évolution des termites. Leur examen morphologique est d’ailleurs

un puissant moyen pour la détermination taxonomique des termites (Donovan et Bignell, 2001).

Respectant la structure de base des insectes, le tractus digestif est organisé en trois

compartiments majeurs : l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur (Grassé,

1982).

II.7.2. Diversité des microorganismes du tube digestif des termites

Le tube digestif des termites abrite une grande variété de microorganismes associés :

protozoaires flagellés, champignons, levures, archéobactéries et bactéries filamenteuses,

spiralées, coccoïdales ou en bâtonnets. Cependant, seule une faible minorité de la microflore

intestinale peut être cultivée. L’avancée de la biologie moléculaire a permis de mieux connaitre

la diversité des microorganismes associés aux termites (Ohkuma et al. 2007) et la plupart des

connaissances acquises se basent sur les banques de clones réalisées à partir du séquençage de

l’ADN 16S.


21

Figure 7 : Schéma du tube digestif d'un termite humivore, Thoracotermes macrothorax (http://www.inra.fr/dpenv/illustr/c23f1ro.htm)

1 : proctodéum (intestin antérieur) ; 2 : mésentéron (intestin moyen) ; 3 : zone

intermédiaire, début du proctodéum (intestin postérieur ou IP) ; 4 : tubes de Malpighi ; 5 :

premier segment de l'intestin postérieur (IP1) ; 6 : valvule entérique (IP2) ; 7 : panse (IP3) ; 8 :

côlon (IP4) ; 9 : rectum (IP5)

II.8. Rôles et utilisations des termites

Les termites sont utilisés pour nourrir les volailles dans le Sud de Madagascar et

comme matériaux de construction dans certains pays (le mélange de salive des termites et

d'argile très fine de la termitière donne un matériau très dur, qui ne se rétracte pas au séchage et

résiste à la pluie).

En outre, les termites contribuent à la micro-agrégation de sols tropicaux. De

nombreuses espèces de termites fabriquent des micro-agrégats minéraux, organiques ou organo-

minéraux, ovoïdes à sphériques, de taille comprise entre 50 et 100 m : les « boulettes

termitiques » (Eschenbrenner, 1986).

Les termites sont considérés comme des espèces-clé de voûte dans plusieurs

écosystèmes (déserts, savanes, forêts tropicales...) en raison du rôle qu'ils jouent dans la

minéralisation de la matière organique. Ils sont notamment responsables de l'émission de

grandes quantités de méthane et d'azote minéral. Le terme d' « île de fertilité » a été suggéré

pour les termitières en raison de l'accumulation de matières organiques et de minéraux

(notamment nitrate et azote) qui s'y produit. Cette richesse en minéraux, d’une part, favorise le

développement des plantes qui poussent à proximité ou sur les termitières, et, d’autre part, attire

certains animaux (éléphants...) qui viennent préférentiellement s'y nourrir.


22

Les termites jouent également d’importants rôles écologiques à cause de leur

implication dans la décomposition des matières végétales lignocellulosiques et le cycle du

carbone mondial (Ohkuma, 2003; Katsumata et al., 2007). En effet, grâce aux microorganismes

associés contenus dans leur tube digestif ou en produisant eux même leurs propres enzymes, ils

sont capables de dégrader des molécules récalcitrantes habituellement non dégradables par

d’autres organismes (Breznak & Brune, 1995; Zhou et al., 2007 ; Scharf & Tartar, 2008). Les

termites ouvriers sont, en grande partie, responsables de la digestion des aliments et de la

dégradation de la lignocellulose (Kouame et al., 2005).

Par ailleurs, il a été constaté que la termitière est composée spécialement par un

mélange de matières fécales et de sol extrêmement riche en matières organiques, renforcé par

leurs sécrétions salivaires (Contour-Ansel et al., 2000). Ces dernières sont composées

essentiellement d’enzymes, de polysaccharides, d’acides aminés, etc..., qui contribuent au

maintien et à la stabilité de la termitière (Garnier-Sillam, 1987 ; Garnier-Sillam et al., 1989 ;

Scharf et Tartar, 2008). De ce fait, ce groupe d’insectes joue des rôles importants dans le

processus d’humification et dans la fertilité du sol (Garnier-Sillam et al., 1989 ).

MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

23

I. ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES MICROORGANISMES PRODUC TEURS D’EPSs

I.1. Matériel biologique : le termite ouvrier Les microorganismes producteurs d’EPS sont isolés du tube digestif des termites

ouvriers, prélevés à l’intérieur d’une termitière localisée au sein de la forêt sclérophylle de

Tapia d’Arivonimamamo située à 50km à l’Ouest de la capitale de Madagascar. Ce sont des

termites humivores avec un nid de type épigé. Ils sont prélevés avec une petite portion de leur

nid et conservés dans une boite aérée jusqu’à l’arrivée au laboratoire.

I.1.1. Classification La classification du termite est donnée ci-dessous. Toutefois le genre et l’espèce

n’ont pas pu être déterminés aucours de l’étude.

• Règne: ANIMAL

• Embranchement: ARTHROPODES

• Super-classe: HEXAPODES

• Classe: INSECTES

• Sous-classe: PTERYGOTES

• Ordre: BLATTODES

I.1.2. Morphologie Les termites ouvriers sont caractérisés par des pièces buccales broyeuses avec un

abdomen relié au thorax. De couleur blanche, l’adulte mesure environ 5mm tandis que les

jeunes mesurent moins de 2mm. La figure 8 montre les termites dans leur habitat naturel.

Figure 8 : Termites ouvriers humivores dans leur habitat naturel

.

: 1mm


24

I.2. Isolement des microorganismes producteurs d’EPSs

I.2.1. Dissection du tube digestif des termites (Lefebvre, 2008)

Le travail est effectué en milieu stérile, c'est-à-dire sous une hotte à flux laminaire.

Après avoir été lavés dans de l’eau distillée stérile, les termites (cinquante individus adultes)

sont disséqués avec des pinces fines stériles sous loupe binoculaire afin d’accéder à leur tube

digestif. Pour ce faire, l’insecte est déposé dans une goutte d’eau salée à 0,6% de NaCl

préalablement versée sur une lame en verre stérile. La tête est coupée, puis chaque extrémité

du corps décapité est enserrée à l’aide des pinces. En tirant délicatement de chaque côté, le

tube digestif quasi-entier s’extirpe de l’abdomen par la partie postérieure. Après étalement en

longueur du tractus digestif sur la lame, la panse est isolée avec précaution du reste de

l’intestin (intestin moyen et parties de l’intestin postérieur IP1, IP4 et IP5) étant donné que

c’est à ce niveau que se situe la majorité de la microflore symbiotique.

I.2.2. Isolement et dénombrement des microorganismes Les panses de chaque termite sont respectivement placées dans des eppendorfs puis

broyées à l’aide d’un pilon. Chaque broyat mis en suspension dans 1ml d’eau distillée

stérilisée sert de solution mère pour l’isolement.

a) Préparation du milieu de culture

Le milieu gélosé YM (yeast molds) est utilisé comme milieu de sélection des

bactéries productrices de polysaccharides. C’est un milieu synthétique qui a prouvé ses

applications dans plusieurs travaux de recherche concernant les microorganismes producteurs

d’EPS. Le milieu est stérilisé à la chaleur humide (autoclave) à 121°C pendant 20 minutes,

pression 2 bars puis réparti dans des boîtes de Pétri stérilisées à raison de 12ml par boîte.

b) Ensemencement

La technique de dilution en cascade, suivie de l’étalement sur milieu de culture

solide dans des boites de Pétri est utilisée pour l’isolement des microorganismes. La dilution

est effectuée en mélangeant 100µl de la solution mère à l’aide d’une micropipette munie de

cônes stériles avec 900µl d’eau distillée stérilisée contenues dans des éppendorfs. Les

solutions, de dilutions à sont par la suite ensemencées sur le milieu de culture à

raison de 1ml de solution et deux répétitions par dilution, puis étalées sur toute la surface de la

gélose à l’aide d’un racloir. Les cultures ont été incubées à l’étuve à 30°C pendant 72 heures.


25

c) Comptage des colonies

Le nombre de colonies est compté par observation macroscopique après la période

d’incubation. Seules les boîtes de Pétri contenant entre 30 et 300 colonies sont considérées.

Le nombre de colonies par boîte est ramené en nombre de bactéries productrices

d’exopolysaccharides par tube digestif de termite utilisé pour la préparation de la solution

mère et est exprimé en Unité Formant Colonie (UFC) par tube digestif. Le nombre d’Unité

Formant Colonie noté N est déterminé selon la formule :

� : Nombre d'UFC ou par ml de produit initial

� : Somme des colonies des boîtes interprétables

� : volume de solution déposée (1ml) � : nombre de boîtes considéré à la première dilution retenue � : nombre de boite considéré à la seconde dilution retenue

� : facteur de la première dilution retenue

d) Purification et criblage des souches

A partir des colonies comptées, soixante (60) souches numérotées de 1 à 60 sont

repiquées, à l’aide de cures dents stérilisés, sur du milieu YM enrichi par du saccharose à

10g/l. L’opération est répétée jusqu’à l’obtention de souches pures exemptes de toute

contamination.

Le criblage, en deux temps, sur milieu solide puis dans un milieu liquide, est effectué

à partir de ces 60 souches.

- Criblage sur milieu solide

Les souches repiquées sur milieu YM enrichi et solidifié sont incubées à 30°C. Le

diamètre de chaque colonie est mesuré toutes les 24 heures suivant deux axes (vertical et

horizontal). Les valeurs sont notées en millimètre et les valeurs suivant l’axe vertical sont

notées Dy tandis que celles suivant l’axe horizontal sont notées Dx. L’aspect de la colonie

(muqueux ou pas) est noté. La mesure est effectuée jusqu’à ce que le diamètre des colonies

n’augmente plus. La figure 8 suivante montre la mesure du diamètre des colonies.


26

Figure 9 : Mesure du diamètre des colonies selon un axe vertical (Dx) et un axe horizontal (Dy). Culture observée après 3 jours d’incubation.

- Criblage sur milieu liquide

Le milieu liquide utilisé est le milieu YM sans ajout d’agar. Le milieu est réparti

dans soixante (60) tubes à essais (un tube pour chaque souche) et est stérilisé à 121°C pendant

20 minutes à l’autoclave. Une ansée de la colonie est prélevée et inoculée dans le milieu. La

culture est bien mélangée à l’aide du vortex puis incubée à 30°C pendant trois jours.

Après incubation, l’anse de platine bien stérilisée est plongée dans le milieu puis

remontée doucement pour le criblage. L’objectif est de suivre et d’observer à l’œil nu

l’écoulement du milieu le long de l’anse afin de pouvoir conclure s’il est visqueux ou pas.

Les milieux qui s’écoulent rapidement sans s’adhérer à l’anse sont considérés comme

non visqueux et sont notés (-), ceux qui s’écoulent lentement le long de l’anse sont considérés

comme visqueux (+) et ceux qui adhèrent à l’anse avec un écoulement très lent sont

considérés comme très visqueux (++).

Les souches, qui ont à la fois formé la plus grande colonie en termes de taille et qui

ont permis d’obtenir les milieux les plus visqueux, sont choisies pour la suite des expériences.

Ainsi, 10 souches numérotées sont sélectionnées et repiquées sur le milieu YM enrichi au

saccharose à 10g/l une fois tous les 14 jours afin de s’assurer de la pureté et du rajeunissement

des colonies et également pour conserver les caractères génétiques des souches.

I.2.3. Conservation des souches

La conservation des souches est faite à -80°C dans du glycérol 50%. Ainsi, 500 µl de

milieu liquide stérilisé sont mélangés avec 500 µl de glycérol stérilisé dans un cryotube stérile

pour chaque souche. Puis, une ansée de la colonie pure et jeune est inoculée dans le milieu de


27

conservation. L’ensemble est mélangé à l’aide d’un agitateur magnétique avant d’être placé

dans le congélateur -80°C.

I.3. Etude de la croissance des dix (10) souches sélectionnées : mesure du poids sec

Il existe différentes méthodes pour évaluer la croissance microbienne parmi

lesquelles la mesure du poids sec. L’objectif est de tracer la courbe de la cinétique de

croissance bactérienne X= f(t) où X est la concentration en biomasse exprimée en gramme de

matière bactérienne sèche par litre de milieu.

Le milieu liquide utilisé est le milieu YM enrichi sans ajout d’agar, stérilisé à 121°C

pendant 20 minutes, pression 2 bars. Une ansée de la culture pure et jeune est inoculée dans

20 ml de milieu contenu dans un tube à essais qui est par la suite bouché hermétiquement à

l’aide d’un coton cardé. Les tubes sont ensuite incubés à 30°C.

I.3.1. Mesure du poids sec

Toutes les 24 heures, 1ml d’échantillon est prélevé de chaque tube dans des

conditions stériles, puis versé dans un éppendorf puis centrifugé à 4000 tr/mn pendant 30

minutes. Ensuite le culot est séché dans l’étuve à 109°C pendant 3 heures. Il est par la suite

pesé sur une balance de précision après avoir été refroidi à la température ambiante.

La concentration en biomasse exprimée en gramme de cellules sèches par litre est notée X (g/l).

En même temps que la mesure du poids sec, 1 ml d’échantillon de chaque tube est

prélevé afin de mesurer la densité optique D.O à 520 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

La courbe X= f(t) a été par la suite tracée.

I.3.2. Détermination de la vitesse spécifique de croissance maximale µmax

La vitesse spécifique de croissance (µ) ou taux de croissance est le nombre de

divisions exprimé par unité de temps. Elle est égale à la vitesse de croissance en biomasse

rapportée à l’unité de biomasse.

X : Concentration en biomasse


28

Le taux de croissance maximal µmax est à déterminer pendant la phase de croissance exponentielle. C’est la période pendant laquelle µ est maximal et constant.

I.3.3. Détermination du temps de génération G

Le temps de génération G ou temps de dédoublement de la population est l’intervalle

de temps qui s’écoule entre deux divisions cellulaires. Il est exprimé en heure (h) et déterminé

selon la formule suivante :

G=

II. CARACTERISATION DES SOUCHES BACTERIENNES

Cette caractérisation est partielle car a été effectuée selon la disponibilité des milieux

de culture et réactifs au sein du laboratoire.

II.1. Etude des caractères culturaux

L’étude des caractères culturaux permet d’observer macroscopiquement l’aspect des

colonies cultivées sur milieu solide. Les souches pures sont ensemencées sur milieu YM, puis

incubées à 30 °C pendant 5 jours. La croissance est suivie toutes les 24h en notant la forme, la

taille, la couleur et l’aspect des colonies.

II.2. Description des caractères morphologiques et structuraux

II.2.1. Observation à l’état frais En l’absence de toute fixation ou de coloration, un montage entre lame et lamelle

permet d’observer les bactéries vivantes et de mettre en évidence leur morphologie, leur mode

de groupement et leur mobilité (Marchal, 1985).

Une colonie bactérienne pure a été prélevée à l’aide d’une anse de platine stérilisée,

puis étalée sur lame et recouverte d’huile d’immersion. L’observation a été faite sous

microscope optique (objectif X40) pour la description des caractères des bactéries (forme,

taille, etc.).

Après observation, les lames sont jetées immédiatement dans un bocal contenant de

l'eau de Javel pure (100%).


29

II.2.2. Coloration de Gram (Marchal, 1985 ; Singleton, 1999)

La coloration de GRAM est une méthode de coloration de base en bactériologie. Elle

consiste à colorer les cellules par le violet de gentiane, un colorant basique qui a la

particularité de se fixer sur les composants cytoplasmiques. Les bactéries dites à Gram négatif

sous l’action de l’alcool (ou le mélange alcool + acétone) se décolorent du fait de leur paroi,

riche en lipides, perméable à l'alcool. Par contre, les bactéries à Gram positif dont la paroi est

imperméable à l'alcool demeurent colorées en violet.

a) La fixation

Une colonie bactérienne pure est prélevée à l’aide d’une anse de platine stérilisée

puis étalée sur lame en un film mince par un mouvement régulier et circulaire. La fixation est

effectuée en versant quelques gouttes d’alcool 90°C sur le frottis puis en séchant le tout à la

flamme du bec Bunsen. Le frottis doit devenir terne mais ne doit ni brunir, ni brûler. Il s’agit

de tuer les bactéries, de rendre les membranes plus perméables, de fixer les structures sans les

altérer et de faire adhérer le frottis à la lame.

b) La coloration

La coloration est effectuée par le contact du frottis avec le colorant, Violet de

Gentiane, pendant une minute puis avec le lugol pendant une minute. L’ensemble est par la

suite rincé à l’eau du robinet, séché avec du papier Joseph et rincé de nouveau avec de

l’alcool (90°C) pour enlever les restes de colorant avant la recoloration avec la safranine

pendant une minute. Un dernier rinçage est effectué avant le séchage complet du frottis par un

court passage au-dessus de la flamme du bec Bunsen. L’observation est effectuée sous

microscope optique (objectif x 100).

II.3. Etude des caractères biochimiques

Cette étude permet de distinguer différents genres ou espèces de bactéries, basée sur

la différence de leur métabolisme en utilisant différents milieux de culture.

II.3.1. Culture sur milieu Mannitol Mobilité Nitrat e

Ce milieu de culture bactérienne permet de décrire à la fois la mobilité des bactéries

et l'utilisation du mannitol comme source de carbone et d’énergie. Il s’agit de noter le virage

de l’indicateur coloré, le rouge de phénol RP contenu dans le milieu en jaune, et les traces de

migration bactérienne sur le milieu.


30

Le milieu de culture est coulé dans des tubes à essai vissés stérilisés.

L’ensemencement par la culture bactérienne pure et jeune est effectué au fil droit par piqûre

centrale à l’aide d’une anse de platine stérile. L’incubation se fait à 30°C pendant 24h.

D’une part, les bactéries sont dites Mannitol (+) si la couleur du milieu vire en jaune

et Mannitol (-) si le milieu ne montre aucun changement de couleur (milieu rouge ou orange)

étant donné qu’il n’y a pas eu acidification du milieu suite à la dégradation du mannitol.

D’autre part, le milieu faiblement concentré en agar (milieu semi-solide) favorise la

mobilité des bactéries dans le milieu. Les bacilles mobiles diffusent à partir de la piqûre

d’ensemencement.

II.3.2. Milieu citrate de SIMMONS

Ce milieu permet de déterminer l’utilisation du citrate (C6H5O7 3-) qui constitue

l’unique source de carbone dans ce milieu de culture. L'utilisation de ce substrat, pour la

plupart des bactéries pouvant le cataboliser, est une utilisation aérobie, et se traduit par une

alcalinisation du milieu témoignée par le virage de l'indicateur de pH au bleu pour les

bactéries citrate de Simmons (+). Par contre, pour les bactéries citrate de Simmons (-) la

couleur de l'indicateur de pH ne change pas.

L'équation de l'oxydation par respiration aérobie du citrate est :

• 2 C6H5O7 3- + 9 O2 -------------> 12 CO2 + 2 H2O + 6 OH-

Le milieu est coulé dans un tube à essai vissé puis incliné pour avoir une gélose

pente. L’ensemencement est fait par strie longitudinale avec une ansée de la culture pure et

jeune. Le bouchon n’est pas vissé à fond afin de permettre les échanges gazeux (en particulier

élimination du dioxyde de carbone). L’incubation se fait à 30°C pendant 24h.

II.3.3. Milieu de Hajna-Kligler

Le milieu de Kligler-Hajna est un milieu de culture complexe, qui permet la

recherche de plusieurs caractères biochimiques dont :

• l'utilisation du lactose ; • la fermentation du glucose ; • la production d'H2S ; • la production de gaz.


31

Le milieu de Hajna-Kligler contient deux glucides, le glucose et le lactose, qui sont

utilisés par les bactéries selon la loi de la diauxie (utilisation de la source d’énergie la plus

facilement dégradable). Pour ce cas-ci, le glucose est utilisé jusqu'à l’épuisement avant que

les souches entament le deuxième glucide plus complexe (le lactose). Par ailleurs, une

bactérie glucose (-) est toujours lactose (-), le catabolisme du lactose passant par celui du

glucose (l’hydrolyse du lactose donne les deux oses simples glucose et galactose).

Le milieu est coulé dans un tube vissé puis incliné pour avoir une gélose pente. Le

culot et la pente sont ensemencés avec une ansée de la culture pure et jeune, respectivement

par piqûre centrale et par stries ascendantes. La lecture des résultats se fait comme suit :

a) Utilisation des glucides

L’aspect du milieu se présente généralement comme suit après incubation des

souches à 30°C pendant 24 heures :

- Bactérie de type fermentatif du glucose (+) et lactose (+) : culot jaune et pente jaune.

- Bactérie de type fermentatif du glucose (+) et lactose (-) : culot jaune et pente rouge.

- Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose (-) et lactose (-) : culot rouge et pente rouge.

b) Production d’H2S

La présence de thiosulfate de sodium et d’ion ferrique dans ce milieu permet

d'apprécier la capacité des bactéries à produire de l'H2S à partir du thiosulfate. Cette

production est matérialisée par la formation à la limite du culot et de la pente d'un précipité

noir de sulfure de fer.

La production de gaz lors de l'utilisation des glucides est mise en évidence par le

décollement de la gélose et/ou des bulles dans la gélose appelé aussi « fragmentation » de la

gélose. S'il n'y a pas ces témoins de dégagement gazeux, la bactérie est gaz (-).


32

II.3.4. Milieu lysine – fer

Ce milieu enrichi en lysine et en fer permet de mettre en évidence la production

d’hydrogène sulfuré et la présence des enzymes, lysine décarboxylase (LDC) et la lysine

désaminase (LDA), typiques des bactéries fermentant le glucose.

Le milieu de culture est coulé dans des tubes à essai vissés qui sont par la suite

inclinés pour avoir une gélose pente. Avec une ansée de la culture jeune, le culot est

ensemencé par piqûre centrale et la pente par stries ascendantes. Les cultures sont incubées à

30°C pendant 24 heures.

En aérobiose, la production de LDA se manifeste par le virage de la coloration du

milieu en rouge vineux à la surface de la pente tandis qu’en anaérobiose, le glucose fermenté

acidifie le milieu. Dans ce cas, la LDC est activée et il y a production de la cadavérine qui ré-

alcalinise le milieu. Il peut également y avoir production d’H2S révélé par la formation de

sulfure noir.

Le tableau suivant résume la modalité d’ensemencement, de lecture et

d’interprétation de ces milieux d’identification.

Tableau 4: modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation des milieux d’identification

Milieu Ensemencement Lecture après incubation de 24 h à 30 °C

Réaction + Réaction - Mannitol Mobilité

Piqûre centrale Virage au jaune

Diffusion de la culture Pas de virage

Pas de diffusion de culture

Hajna Kligler Pente en stries ascendantes et piqûre centrale

Culot jaune : glucose + Pente jaune : lactose +

Présence de bulles : gaz + Présence de précipité noir :

H2S +

Culot rouge : glucose - Pente rouge : lactose -

Absence de bulles : gaz - Absence de précipité noir : H2S -

Lysine-fer Pente en stries ascendantes et piqûre centrale

Culot jaune : LDC – Pente jaune : LDA +

Culot violet : LDC + Pente violette : LDA -

Citrate de Simmons

Pente en stries ascendantes

Virage au bleu Pas de virage


33

III. LES SOUCHES BACTERIENNES, LA PRODUCTION D’EPSs ET LE PHENOMENE D’AGREGATION DU SOL

III.1. Mise en évidence de la production d’EPS par les souches bactériennes

Il s’agit de mettre en évidence la production d’EPS par chaque souche bactérienne

dans un milieu de culture adéquat et dans des conditions bien définies. L’obtention des EPSs

s’effectue généralement en deux (2) étapes : la fermentation et l’extraction des EPSs.

III.1.1. La fermentation

Le mot fermentation désigne ici le procédé selon lequel les bactéries sont cultivées

sur un milieu de culture non renouvelé et dans des conditions bien définies.

a) Préparation du milieu de fermentation

Pour chaque souche, le milieu de fermentation est le milieu YM, enrichi avec du

saccharose à 30 g/l et stérilisé à l’autoclave pendant 20 minutes à 121°C, pression 2 bars.

b) Inoculation microbienne

Les 10 souches bactériennes sélectionnées après criblage, en pleine phase

exponentielle de croissance (préalablement mises en culture dans du milieu glucose-peptone

liquide pendant 48 heures à 30°C), sont respectivement inoculées dans un milieu de

fermentation à raison de 5ml d’inoculum dans 100ml de milieu.

Les conditions de la fermentation sont les suivantes :

• température : 28°C • ph du milieu égal à 7, ajusté avec du KOH 0.5N

• agitation à 200 tr/mn • milieu enrichi de 30 g par litre de saccharose • durée de la fermentation : 72 heures.

c) Suivi de la croissance bactérienne

Le suivi de la croissance est effectué pour chaque souche afin de vérifier si les

cellules bactériennes sont vivantes et qu’elles continuent à se multiplier.

La croissance bactérienne est suivie tout au long de la fermentation en prélevant sous

des conditions stériles, un aliquot du milieu de culture toutes les 24h et en mesurant la densité


34

optique à 520 nm. Avant chaque lecture, le spectrophotomètre est mis à zéro avec 1ml de

milieu de fermentation stérilisé et non inoculé comme témoin.

III.1.2. Extraction des polysaccharides

A la fin de la fermentation, pour chaque souche, le milieu est récupéré puis

centrifugé à 16000g à 4°C pendant 30 minutes. Le culot, constitué par les débris cellulaires,

est éliminé tandis que le surnageant est récupéré dans un récipient stérile. De l’éthanol absolu

(100%) y est ajouté (volume/volume). Les précipités qui s’y sont formés sont séparés du

mélange par centrifugation à 12000g pendant 20 minutes puis récupérés et lavés avec des

mélanges successifs eau-éthanol. Pour chaque souche bactérienne, les polysaccharides

obtenus sont lyophilisés puis pesés.

La concentration en EPS (CEPS) produits est déterminée en rapportant la masse pesée

après lyophilisation à la quantité du milieu de fermentation. Cette concentration est exprimée

en mg/l de milieu.

III.1.3. Description des propriétés rhéologiques des EPSs

L’étude des propriétés rhéologiques des EPS a été effectuée dans le but de

déterminer leurs éventuelles applications dans l’industrie alimentaire.

a) Mesure de l’élasticité des exopolysaccharides

Les 10 souches sont repiquées sur du milieu YM solidifié enrichi de saccharose à

30g/l. Après incubation à 30°C pendant 72 heures, l’élasticité des exopolysaccharides est

mesurée à l’aide des cures dents stérilisées en piquant le centre de la colonie avec la pointe de

la cure dents puis en tirant vers le haut. La longueur du polysaccharide est mesurée à l’aide

d’une règle graduée. Les valeurs sont exprimées en cm. Les mesures sont effectuées à raison

de 2 répétitions par souche.


35

Figure 10 : Mesure de l’élasticité (exemple des souches 40 et 44) après 3 jours d’incubation des souches à 30°C.

b) Evaluation de la viscosité

La viscosité peut être définie comme la résistance à l'écoulement uniforme et sans

turbulence se produisant dans la masse d'une matière. Lorsque la viscosité augmente, la

capacité du fluide à s'écouler diminue. Pour un liquide (au contraire d'un gaz), la viscosité

tend généralement à diminuer lorsque la température augmente.

La viscosité peut être mesurée soit par un viscosimètre rotatif soit par une mesure

approximative du temps d’écoulement entre les deux traits d’une pipette jaugée de 10 ml.

Cette dernière méthode est choisie pour cette étude.

Les souches sont d’abord cultivées dans le milieu de fermentation décrite

précédemment. Après 3 jours de culture, la viscosité est mesurée dans des conditions stériles à

l’aide d’une pipette jaugée de 10ml. Le temps d’écoulement du milieu entre les deux traits de

jauge est noté avec 3 répétitions par chaque souche. La viscosité de l’eau a servi de référence.

c) Calcul du débit-volume qv

Le débit est le quotient de la quantité de fluide qui traverse une section droite de la

conduite par la durée de cet écoulement.

Si V est le volume de fluide qui a traversé une section droite de la conduite pendant

le temps t, par définition le débit-volume est : (unité : ml·s-1).


36

III.2. Les souches bactériennes et le phénomène d’agrégation du sol

Cette partie traite de l’importance des souches bactériennes productrices d’EPS dans

le phénomène d’agrégation du sol.

III.2.1. Préculture des souches

Les dix (10) souches productrices d’EPSs sélectionnées précédemment sont

préalablement cultivées dans les mêmes conditions de fermentation décrites ci-dessus dans du

milieu glucose-peptone pendant 48 h pour avoir des bactéries en phase exponentielle de

croissance.

III.2.2. Fermentation

La fermentation est conduite dans des erlenmeyers de 250ml contenant chacun

100ml de milieu YM enrichi de saccharose à 30g/l, pH 7. Les milieux sont ensemencés

respectivement par 1ml de chaque pré-culture des 10 souches avant d’être incubés pendant

72h à 28°C sous agitation à 200 tr/min.

III.2.3. Préparation du sol

Le sol utilisé est un sol pauvre prélevé dans le champ de culture du Laboratoire de

Microbiologie de l’Environnement Fiadanana, Tsimbazaza . Le sol, non stérilisé, est tamisé à

l’aide d’un tamis de 4mm de maille, homogénéisé puis réparti dans des pots en plastiques de

50ml avec 4 répétitions pour chaque souche. Les pots sont percés pour permettre l’aération et

la sortie d’eau puis le sol est arrosé avec 25ml d’eau distillée stérilisée.

III.2.4. Inoculation des souches bactériennes

Après 72h d’incubation dans le milieu de fermentation, l’inoculation des sols par les

souches microbiennes est effectuée à raison de 25ml de milieu par pot et pour chaque souche.

Le témoin est constitué par du sol tamisé non stérilisé inoculé uniquement avec de l’eau

distillée stérilisée (25ml). Ensuite, les sols ainsi traités sont incubés pendant 10 jours à 28°C.

III.2.5. Test de désagrégation

Il s’agit de déterminer la teneur en agrégats stables à l’eau du sol après l’inoculation

des bactéries productrices d’EPS. En effet, la stabilité des agrégats est proportionnellement

liée à leur teneur en matière organique. La proportion en agrégats stables à l’eau est élevée


37

quand cette teneur en matière organique est élevée, et inversement, elle est basse si la quantité

de la matière organique dans ces agrégats est faible.

Le test de désagrégation est effectué sur un tamis de 200µm de diamètre. Tout

d’abord, les sols sont respectivement pesés (poids noté Pi), puis placés sur le tamis avant

d’être soumis à une agitation et arrosage permanente et régulière pendant 15 minutes pour le

test de stabilité.

Les agrégats supérieurs à 200 µm restés sur le tamis sont par la suite pesés et le

pourcentage d’agrégats stables (%AS) à l’eau est déterminé. Le calcul de ce pourcentage est

donné par la formule suivante :

%AS= X 100

III.2.6. Mesure du diamètre des agrégats

Le diamètre des agrégats est estimé pour chaque sol. Les valeurs sont exprimées en

mm et la moyenne est tenue en compte.

III.2.7. Test de la capacité des souches productrices d’EPSs à solubiliser le phosphate

L’aptitude des souches productrices d’EPSs à solubiliser le phosphate est également

testée sur le milieu TCP. Les souches sont repiquées sur ce milieu opaque qui ne contient

qu’une seule source de phosphate : le phosphate tricalcique (TCP). De ce fait, la capacité des

bactéries à solubiliser le phosphate se traduit par l’apparition de halos translucides autour des

souches après quelques jours d’incubation alors que le reste du milieu reste opaque. Le

diamètre de chaque halo est mesuré toutes les 24 heures suivant deux axes et ce pour chaque

souche jusqu’à ce que le diamètre atteigne une valeur constante.

Traitement statistique des données :

Les données ont été traitées statistiquement par des analyses de variance

(ANOVA/MANOVA). Afin de déterminer les différences entre les moyennes des valeurs

obtenues par traitement, les données ont été soumises au test de Newman-Keuls au seuil de

probabilité 5% et en utilisant le logiciel STATISTICA.

RESULTATS

Résultats

38

I. DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES PRODUCTEURS D’E PS

Seules les dilutions 10-4 et 10-5 ont permis de compter 30 à 300 colonies. De ce fait,

d’après le calcul, il y a environ 6,3636.104UFC/ tube digestif dénombré sur milieu YM

(tableau 5). Ce résultat indique que le tractus digestif des termites abrite un nombre assez

élevé de microorganismes dont les bactéries productrices d’exopolysaccharides qui ont fait

l’objet de cette étude et qui jouent des rôles essentiels dans l’alimentation des termites.

Tableau 5 : nombre de colonies isolées sur le milieu YM Dilution 10-4 10-5

Nombre de colonies (50 termites) 245 219 103 131

Moyenne 233 117

N = 6,3636.104 UFC / tube digestif de termite

II. ISOLEMENT ET SELECTION DES BACTERIES PRODUCTRIC ES D’EPSs

Le criblage des souches a permis d’obtenir les résultats suivants :

II.1. Criblage selon la taille des colonies bactériennes

La mesure du diamètre de chaque colonie pendant 8 jours montre que ce diamètre

varie de 4mm à 9 mm pour les 60 souches (Tableau 6).

Tableau 6 : Diamètre des colonies isolées sur milieu YM mesuré après 3 jours d’incubation

Diamètre des colonies en mm 4-6 6-8 8-10 Diamètre des colonies en mm 4-6 6-8 8-10 Numéro des souches 2 1 21 Numéro des souches - 20 -

27 3 23 - 22 - 28 4 33 - 24 - 32 5 34 - 25 - 37 6 40 - 26 - 38 7 44 - 29 - 39 8 46 - 30 - 41 9 48 - 31 - 43 10 51 - 35 - 45 11 54 - 36 - 47 12 55 - 42 - 52 13 59 - 49 - 57 14 - - 50 -

- 15 - - 53 - - 16 - - 56 - - 17 - - 58 - - 18 - - 60 - - 19 - - - -

Résultats

39

Le tableau 6 et la figure 11 montrent que 58% des souches bactériennes (numéro 1,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 29, 30, 31, 35, 36,

42, 49, 50, 53, 56, 58, 60) contenus dans le tube digestif des termites ont formé des colonies

dont la taille est comprise entre 6-8mm de diamètre, 22% (numéro

2,27,28,32,37,38,39,41,43,45,47,52,57) entre 4-6mm et 20% (numéro

21,23,33,34,40,44,46,48,51,54,55,59) entre 8-10mm.

Figure 11 : Répartition des souches selon leur diamètre après 8 jours de culture sur le milieu YM.

1 : Groupe des souches ayant un diamètre compris entre 4 mm et 6 mm 2 : Groupe des souches ayant un diamètre compris entre 6 mm et 8 mm

3 : Groupe des souches ayant un diamètre supérieur à 8 mm

Les souches sélectionnées selon la taille des colonies sont celles qui ont un diamètre

supérieur à 8 mm c'est-à-dire les souches n° 21, 23, 33, 34, 40, 44, 46, 48, 51, 54, 55, 59.

II.2. Criblage selon la viscosité du milieu de culture

Les souches sont classées selon les caractéristiques de leur milieu de culture qui a été

classé en milieu pas visqueux (-), milieu visqueux (+), milieu très visqueux et épais (++) après

72 h d’incubation (Tableau 7).

Ainsi d’après les observations faites à l’œil nu 40% des 60 souches ne rendent pas

leur milieu de culture visqueux, 33% le rendent visqueux et 27% des souches rendent leur

milieu de culture à la fois très visqueux et épais à savoir les souches numéro 12, 21, 23, 28,

29, 33, 34, 40, 44, 46, 48, 51, 52, 55, 57, 58.

Résultats

40

Tableau 7 : Classement des souches selon la viscosité des milieux de culture

Viscosité du milieu (-) (+) (++) Numéro des souches 1 3 12

2 4 21 5 8 23 6 9 28 7 13 29 10 14 33 11 15 34 16 22 40 17 27 44 18 31 46 19 35 48 20 36 51 24 39 52 25 41 55 26 45 57 30 53 58 32 54 - 37 56 - 38 59 - 42 60 - 43 - - 47 - - 49 - - 50 - -

(-) milieu pas visqueux ; (+) : milieu visqueux ; (++) milieu très visqueux et épais.

La viscosité des milieux de culture témoigne de la production de substances telles

que les polysaccharides par les microorganismes qui y ont été cultivés. De ce fait, d’après ces

deux critères, dix (10) souches (les numéros 21, 23, 33, 34, 40, 44, 46, 48, 51, 55) sont

retenues à cause de la taille de leurs colonies et leur capacité à induire la viscosité du milieu

de culture.

II.3. Etude de la croissance des souches en milieu de culture liquide

II.3.1. Cinétique de croissance des dix souches sélectionnées

La figure 12 montre les cinétiques de croissance des dix souches sélectionnées après

dix jours de culture sur le milieu YM liquide.

.

Résultats

41

Résultats

42

Figure 12 : Cinétique de croissance des 10 souches sélectionnées sur le milieu YM après

10 jours d’incubation

Avec X : Concentration en bactéries (g/l)

D’après les courbes, la phase de latence est très courte et inexistante même pour la

plupart des souches. Ce qui pourrait signifier que les souches microbiennes sont parfaitement

adaptées au milieu de culture et ont entamé directement la phase de multiplication. L’atteinte

de la phase exponentielle de croissance qui dure en moyenne 3 à 5 jours se fait globalement

après 1 jour de culture pour les souches 21, 23, 33, 34, 51 et 55 et après 2 jours de culture

pour les souches 40, 44, 46 et 48. La phase de déclin pour les souches n° 55, 51, 46 et 23 est

atteinte après en moyenne 5 jours de culture tandis que pour les souches n° 33, 34, 21, 40, 44

et 48 cette phase est atteinte après 9 jours de culture.

Résultats

43

Toutefois, l’observation de la forme des cinétiques de croissance montre que le

comportement de chaque souche bactérienne diffère les unes des autres par la durée de la

phase exponentielle, la durée de la phase stationnaire et l’atteinte de la phase de déclin.

II.3.2. Vitesse spécifique de croissance maximale et temps de génération

La vitesse spécifique de croissance maximale (µmax) et le temps de génération des

dix souches bactériennes sont donnés par le tableau 8 :

Tableau 8 : Vitesse spécifique de croissance maximale et temps de génération G des 10 souches

Souches µmax (h-1) G (h)

21 0,0594 (bc) 11,656 (c)

23 0,0453 (b) 15,290 (d)

33 0,0487 (b) 14,217 (cd)

34 0,0444 (b) 15,578 (d)

40 0,0759 (c) 9,125 (b)

44 0,1020 (c) 6,771 (a)

46 0,0497 (b) 13,933 (cd)

48 0,0565 (bc) 12,256 (c)

51 0,0301 (a) 22,967 (f)

55 0,0406 (b) 17,038 (e)

Les souches n° 40 et 44 ont la vitesse spécifique de croissance maximale (µmax)

significativement élevée avec 0,0759h-1pour la souche n° 40 et 0,1020 h-1 pour la souche n°

44. Le temps de génération (G) est également significativement court par rapport aux autres

souches avec 9,125h pour la souche 40 et 6,771 h pour la souche 44. Ce qui signifie que ces

deux souches se multiplient plus rapidement que les autres souches sur le milieu de culture

YM.

Le tableau 9 résume les caractéristiques à la base de la sélection de ces 10 souches

parmi les 60 souches isolées du tube digestif des termites.

Résultats

44

Tableau 9 : Caractéristiques des 10 souches sélectionnées

N° SOUCHES Diamètre (mm) µmax ( ) G (h) Viscosité

21 8.2 0,0594 11,656 ++

23 8.5 0,0453 15,29 ++

33 8.4 0,0487 14,217 ++

34 8.2 0,0444 15,578 ++

40 8.2 0,0759 9,125 ++

44 8.5 0,102 6,771 ++

46 8.2 0,0497 13,933 ++

48 8.5 0,0565 12,256 ++

51 8.2 0,0301 22,967 ++

55 8.2 0,0406 17,038 ++

III. CARACTERISATION ET IDENTIFICATION DES DIX SOUC HES MICROBIENNES ISOLEES

III.1. Morphologie des colonies bactériennes sur milieu solide

L’observation à l’œil nu permet de décrire les aspects morphologiques des colonies

microbiennes sur milieu YM solide.

Les dix souches sélectionnées possèdent beaucoup de caractères communs et très peu

de caractères distinctifs. Le tableau 10 montre les caractères culturaux des dix souches sur

milieu YM après 5 jours d’incubation à 30°C.

Résultats

45

Tableau 10 : Aspect morphologique des colonies des dix souches bactériennes cultivées sur YM (observation macroscopique)

Souches Croissance

à 30°C Couleur Forme Surface et

texture Opacité Contour

21 Rapide Blanche Arrondie, Bombée

Lisse et onctueux

opaque irrégulier

23 rapide Jaune Arrondie, Bombée

Lisse et onctueux

opaque régulier

33 rapide Jaune Arrondie Bombée

Lisse et onctueux

opaque régulier

34 rapide Jaune Arrondie , Bombée

Lisse et onctueux

opaque régulier


Lisse et onctueux

opaque régulier


Lisse et onctueux

opaque régulier


Lisse et onctueux

opaque régulier


Lisse et onctueux

opaque régulier


Lisse et onctueux

opaque régulier

55 rapide jaune Arrondie Bombée

Lisse et onctueux

opaque régulier

La majorité des souches ont une croissance rapide à 30 °C sur le milieu YM. Elles

sont toutes de couleur jaune, excepté la souche 21 qui est de couleur blanche.

III.2. Caractères morphologiques des souches

La forme, le mode de groupement, la mobilité et le groupe des bactéries sont mis en

évidence par observation microscopique d’une préparation examinée à l’état frais et d’une

préparation examinée après coloration de Gram. Les caractères morphologiques des dix

souches sont résumés dans le tableau 11.

Résultats

46

Tableau 11 : Caractères morphologiques des souches étudiées

Souches Mode de

groupement

Forme Mobilité Taille Groupe

21 En chaînette bacille Immobile grande Gram+


33 En chaînette bacille Immobile grande Gram-








Toutes les souches sont immobiles, en forme de bacille et se regroupent en chaînette.

Parmi elles, quatre souches (21, 23, 34, 55) sont à Gram positif et six souches (33, 40, 51, 46,

48, 44) sont à Gram négatif.

III.3. Caractères biochimiques des souches

Les résultats de l’étude des caractères biochimiques des souches sont représentés

dans le tableau 12. D’après les observations, toutes les souches sont immobiles mais sont

capables de dégrader le mannitol sur le milieu Mannitol Mobilité. Les souches 34, 46 et 51 ne

sont pas capables d’utiliser le citrate comme seule source de carbone et d’énergie sur le milieu

citrate de Simmons. Seule la souche 40 est glucose (-) c'est-à-dire qu’elle ne fermente pas le

glucose tandis que toutes les souches ne produisent pas de sulfure d’hydrogène (H2S) et les

souches 21, 33, 46 sont gaz négatif. Toutes les souches ne produisent ni de lysine

décarboxylase (LDC) ni de lysine désaminase (LDA) sur milieu lysine fer.

Résultats

47

Tableau 12 : Caractères biochimiques des souches

Souche21 Souche23 Souche

33 Souche 34 Souche

40 Milieu Mannitol

mobilité Mannitol Mobilité

+ immobile

+ immobile

+ immobile

+ immobile

+ immobile

Milieu Citrate de SIMMONS

Citrate perméase

+ + + - +

Milieu Hajna-Kligler

Glucose Lactose

H2S Gaz

+ + - -

+ - - +

+ - - -

+ - - +

- - - +

Milieu Lysine-Fer

Glucose H2S LDA LDC

+ - - -

+ - - -

+ - - -

+ - - -

- - - -

Souche 44 Souche 46 Souche 48 Souche 51 Souche 55 Milieu Mannitol

mobilité Mannitol Mobilité

+ immobile

+ immobile

+ immobile

+ immobile

+ immobile

Milieu Citrate de SIMMONS

Citrate perméase

+ - + - +

Milieu Hajna-Kligler

Glucose Lactose

H2S Gaz

+ + - +

+ - - -

+ - - +

+ - - +

+ - - +

Milieu Lysine-Fer

Glucose H2S LDA LDC

+ - - -

+ - - -

+ - - -

+ - - -

+ - - -

+ : réaction positive

- : réaction négative

IV. PRODUCTION DE POLYSACCHARIDES PAR LES 10 SOUCHES

La production de polysaccharides par les dix souches bactériennes est effectuée en

fermentation sur milieu YM liquide.

IV.1. Courbe de croissance des souches en cours de fermentation

La courbe de croissance des 10 souches sélectionnées au cours de la fermentation est

présentée dans la figure 13. Ces courbes montrent que toutes les souches excepté la souche n°

44 atteignent immédiatement la phase exponentielle de croissance dès le début de la

fermentation étant donné qu’elles ont été mises en pré-culture pendant 24heures avant la

fermentation.

Résultats

48

Figure 13 : Cinétique de croissance des 10 souches au cours des trois jours de la fermentation

Les souches 21 et 23 atteignent la phase stationnaire après seulement deux jours de

fermentation tandis que les autres souches restent en phase exponentielle de croissance

jusqu’à la fin de la fermentation.

IV.2. Quantité d’EPS extraits pour chaque milieu de fermentation

L’extraction des exopolysaccharides à partir de chaque milieu de culture a permis

d’obtenir les quantités suivantes (Tableau 13) selon la souche concernée.

Tableau 13 : Quantité d’EPS extraits du milieu de culture de chaque souche

(pour un litre de milieu de fermentation)

Souches Quantité d'EPS

(Poids sec en mg) 21 3,32 23 15,05 33 32,24 34 21,98 40 23,03 44 13,65 46 29,14 48 26,17 51 30,54 55 20,09

Résultats

49

La quantité d’EPS produits par les souches varie de 3,32mg à 32,24mg. Les souches

21 et 23 sont moins performantes par rapport aux autres souches en produisant seulement

respectivement 3,32mg et 15,05mg d’EPS. Ceci pourrait être dû au fait qu’elles ont atteint la

phase stationnaire bien avant la fin de la fermentation par rapport aux autres souches. Il en est

de même pour la souche 44 qui n’a produit que 13,65mg d’EPS qui pourrait être dû par une

phase de latence bien plus longue que les autres souches.

Les souches 33, 46 et 51 sont les plus performantes en matière de production d’EPS,

en produisant respectivement 32,24mg, 29,14mg et 30,54mg.

V. PROPRIETES RHEOLOGIQUES DES EPS

V.1. Elasticité des EPSs

La mesure de l’élasticité est donnée dans le tableau 14 avec des valeurs comprises

entre 2 cm et 8,25 cm. Les EPSs produits par les souches 55, 51 et 33 sont significativement

(p<0,05) plus élastiques par rapport à ceux produits par les autres souches avec

respectivement 8,3 cm, 7,1cm, et 7,5 cm contre 2cm pour la souche 21, 3,4 cm pour la souche

23, 4,3 cm pour la souche 34, 4,6 cm pour la souche 40, 2,9 cm pour la souche 44, 2,5 cm

pour la souche 46 et 3cm pour souche 48.

Tableau 14 : Elasticité des polysaccharides des 10souches

Souches Elasticité des EPSs (en cm)

21 2,0 (a)

23 3,4 (ab)

33 7,5 (c)

34 4,3 (b)

40 4,6 (b)

44 2,9 (a)

46 2,5 (a)

48 3,0 (ab)

51 7,1 (c)

55 8,3 (c)

V.2. Viscosité du milieu de culture

L’évaluation de la viscosité des milieux de culture des 10 souches microbiennes est

donnée dans le tableau 15. Le temps d’écoulement (Te) et le débit-volume (DV) de 10 ml de

Résultats

50

milieu de culture contenant les souches, après 5jours d’incubation, le long d’une pipette de 10

ml sont mesurés puis comparés à ceux de l’eau distillée.

Tableau 15 : Temps d’écoulement et Débit-volume des EPSs

Souches Te (en

seconde) DV (en ml/s)

Témoin (ED) 6,000(a) 1,667

souche 21 7,667(b) 1,304

souche 23 8,667(b) 1,154

souche 33 11,000(c) 0,909

souche 34 9,667(bc) 1,034

souche 40 8,333(b) 1,200

souche 44 9,000(bc) 1,111

souche 46 9,667(bc) 1,034

souche 48 9,700(bc) 1,034

souche 51 10,350(c) 0,967

souche 55 10,000(bc) 1,000

Te : temps d’écoulement et DV : débit-volume

Le temps d’écoulement Te de 10 ml d’eau distillée le long d’une pipette de 10 ml est

de 6 secondes ce qui fait un débit-volume DV de 1,666 ml par seconde. Pour les milieux de

culture, ce Te varie de 7,666 secondes (pour la souche 21) à 11 secondes (pour la souche 33).

Plus le milieu est visqueux et plus le temps d’écoulement est élevé. Ainsi, le milieu

de culture qui a le temps d’écoulement le plus élevé est significativement plus visqueux

(p<0,05) par rapport aux autres. Le milieu de culture de la souche 33 a montré à la fois un

temps d’écoulement relativement lent et un débit-volume plus faible de l’ordre de 0,909 ml/s.

VI. POTENTIALITE DES SOUCHES MICROBIENNES ET LE PHE NOMENE D’AGREGATION DU SOL

VI.1. Pourcentage en agrégats stables à l’eau

Les résultats de l’inoculation du sol par les milieux de fermentation des souches

microbiennes sont donnés dans le tableau 16.

Résultats

51

Tableau 16 : Poids et pourcentage en agrégats stables à l’eau après inoculation

Poids sol(g) Poids

agrégats(g) % Agrégat Diamètres des agrégats

(en mm) Témoin 133,2975 71,5000 (a) 53,6394 (a) 3,5 (a)

Souche21 130,1150 82,0825 (a) 63,0846 (b) 5,0 (b)

Souche23 136,8050 100,3725 (c) 73,3690 (c) 6,0 (b)

Souche33 133,1350 101,4750 (c) 76,2196 (c) 8,4 (c)

Souche34 134,3550 93,4875 (b) 69,5824 (c) 5,5 (b)

Souche40 139,8300 89,1475 (b) 63,7542 (b) 5,5 (b)

Souche44 138,9375 94,5350 (b) 68,0414 (c) 6,0 (b)

Souche46 134,6725 89,0700 (b) 66,1382 (c) 6,5 (b)

Souche48 127,1275 92,7625 (b) 72,9681 (c) 8,0 (c)

Souche51 131,7025 94,8250 (b) 71,9994 (c) 8,0 (c)

Souche55 139,1325 95,3375 (b) 68,5228 (c) 7,0 (c)

Il est constaté que, généralement, il existe des différences significatives (p<0,05)

entre le pourcentage d’agrégats stables à l’eau pour le sol non inoculé (témoin) qui est de

53,639% et celui des sols inoculés avec les souches qui varie de 63,08% à 76,219%. Les poids

secs des agrégats des sols inoculés sont également significativement élevés par rapport à ceux

du sol non inoculé. Les souches 23, 33 et 48 sont les plus performantes quant à la stimulation

de la formation des agrégats dans le sol grâce aux EPS qu’elles ont produits.

Concernant la taille des agrégats, il y a une variation significative (p<0,05) entre la

taille des agrégats du sol témoin qui est de 3,5 mm et celle des agrégats des sols inoculés qui

varie de 5 mm à 8,4 mm. Toutefois, les diamètres les plus élevés sont obtenus avec les

souches 51, 55, 48 et 33.

La figure 14 illustre la différence entre le pourcentage en agrégats stables à l’eau du

sol témoin (non inoculé) et ceux des sols inoculés.

Résultats

52

Figure 14: pourcentage en agrégats stables à l’eau du sol inoculé par les souches après 10 jours d’incubation

VI.2. Solubilisation du phosphate par les souches bactériennes

Le repiquage des souches sur le milieu TCP montre que toutes les souches à

l’exception de celle n° 21 sont capables de solubiliser le phosphate ce qui signifie qu’elles

pourraient également jouer des rôles importants dans le mécanisme de solubilisation de cet

élément minéral dans le sol.

Le tableau 17 montre le diamètre du halo après 7 jours de culture sur le milieu TCP.

Tableau 17 : Diamètre du halo des souches après 7 jours de culture sur le milieu TCP

Souches Solubilisation du

phosphate Diamètre du halo en mm

21 - -

23 + 5,75

33 + 5,5

34 + 6,25

40 + 7,75

44 + 6,5

46 + 7,6

48 + 5,5

51 + 6

55 + 5,5

- : ne solubilise pas le phosphate et + : solubilise le phosphate

Les souches 34, 40, 44, 46 et 51 sont plus actives dans la solubilisation du phosphate

par rapport aux autres souches.

DISCUSSION

Discussion

53

L’objectif général de cette étude a été de montrer l’existence de bactéries

productrices d’EPS au sein du tube digestif du termite puis de décrire l’effet de l’inoculation

de ces bactéries sur la structure du sol.

Dans la première partie de l’étude qui visait principalement à isoler des bactéries

productrices d’EPS du tube digestif du termite, le dénombrement de ces bactéries, les

criblages puis la caractérisation partielle des souches isolées ont été effectués. Nos résultats

nous ont permis de confirmer que le tractus digestif du termite étudié renferme des bactéries

productrices d’EPS, soit 6,3636.104 UFC/par tube digestif. Jusqu’à présent et à notre

connaissance, peu de travaux ont été effectués sur le dénombrement de cette flore productrice

d’EPS. Cependant, lors de l’étude effectuée par Brauman et al (1986), la microflore totale

d’un termite supérieur du genre Nasutitermes arborum est de l’ordre de 106 bactéries/tube

digestif. La numération de cette flore de bactéries productrices d’EPS ne permet cependant

pas de différencier la flore de passage de la flore endogène spécifique du termite, ce qui

pourrait entraîner sa surestimation. Cette flore a également pu être sous-estimée pour des

raisons telles que le manque de facteurs de croissance spécifiques dans le milieu de culture.

En ce sens même, Tholen et al (1997) ont remarqué que, comparé au nombre de bactéries

observables directement dans l’intestin du termite par microscopie électronique, environ 90%

des bactéries échappent à la culture sur boîte.

Après isolement, dix souches ont été sélectionnées lesquelles ont fait l’objet de la

suite des expérimentations. L’identification partielle de ces souches a montré que

morphologiquement ce sont toutes des bacilles immobiles regroupées en chaînette et

biochimiquement elles sont toutes capables de dégrader le mannitol et certaines sont capables

d’utiliser le citrate comme seule source de carbone. Cette identification n’a pas pu permettre

de donner une classification exacte des souches. Néanmoins König et al (2006) ont montré

que l’isolement de souches issues de tube digestif des termites a abouti à la découverte de

nouvelles bactéries uniques dans leur genre et présentant des propriétés métaboliques

particulièrement intéressantes. La majorité des isolats appartiennent soit au phylum des

firmicutes avec une forte représentation des bacilles (Clostridia sp.) soit au phylum des

protéobactéries (dont les Pseudomonas sp., les Enterobacter sp., ou les Cyclobacter sp.), soit

encore au phylum des actinobactéries. De façon générale, le tube digestif des termites a

permis l’isolement de souches rares et/ou d’intérêt biotechnologique (Maeda et al. 1995 ;

Wenzel et al. 2002 ; König et al. 2006 ; Kurtböke & French 2007). Les investigations sur la

microflore intestinale des termites ont été plus souvent axées vers la recherche de bactéries

Discussion

54

axées vers la recherche de bactéries ligno-cellulolytiques (Schäfer et al. 1996 ; Wenzel et al.

2002). La nouveauté sur les bactéries productrices d’EPS isolées au cours de notre étude

présente donc un intérêt certain. Toutefois, il est intéressant de pouvoir effectuer

l’identification des souches performantes isolées, par l’utilisation des outils biomoléculaires,

comme il a été déjà proposé par Ohkuma et al (2006).

Dans le but d’étudier les potentialités de ces souches isolées hors de leur

environnement naturel, un essai de production d’EPS a été effectué dans un milieu de

fermentation, le milieu YM liquide à 30g/l de saccharose. Nos résultats ont montré que la

quantité d’EPS produits par les souches est assez faible, seulement entre 3,32 mg/l d’EPSs

(pour la souche 21) et 32,24mg/l (pour la souche 33), comparés avec les résultats obtenus par

Riccardi et Clementi (2000) qui ont montré que dans des conditions optimales de production,

en général des concentrations d’EPS de 50 à 500 mg ont été obtenues. Dans notre étude, cette

faible production pourrait s’expliquer par le fait que les conditions optimales de croissance

telles que le pH, la température, la quantité en oxygène, l’agitation et la taille de l’inoculum

des souches isolées et de la production d’EPS, n’ont pas encore été mises au point. De plus, la

source de carbone a une influence majeure sur la biosynthèse d’EPS. En plus du type de sucre

(glucose, galactose, lactose, mannose, fructose etc.) et du rapport entre eux, la concentration

des sucres peut avoir un effet stimulant sur la production (Gamar et al. 1997). En ce sens,

Cerning et al. (1994) ont étudié la production d’EPS par Lactobacillus casei CG11 en variant

la source de carbone (galactose, glucose, lactose, saccharose, maltose, mélibiose). Ils ont

trouvé qu’avec le lactose et le galactose, la production d’EPS a été la plus faible, alors que le

glucose a été de loin la source la plus efficace. Ainsi, il serait probable que le saccharose qui a

été utilisé comme source de carbone dans nos études ne soit pas la meilleure source de

carbone pour la production d’EPS. En outre, la durée de fermentation qui a été de 72 heures

pourrait aussi expliquer le faible rendement en EPS ; en effet un temps d’incubation plus long

influence le rendement en EPS (Riccardi et Clementi, 2000).

La cinétique de croissance des souches a été suivie tout au long de la fermentation.

Les résultats ont montré que 8 souches (33, 34, 40, 44, 46, 48, 51, 55) sont en phase

exponentielle de croissance tout au long de la fermentation et 2 souches (21 et 23) ont atteint

la phase stationnaire après 48heures de fermentation. Bien que la cinétique de production

d’EPS n’ait pas été étudiée au cours de notre étude, on peut supposer que cette production

serait associée à la croissance et l’EPS synthétisé serait alors un métabolite primaire, ce qui

expliquerait la faible quantité d’EPS produits par les souches 21 et 23 par rapport aux autres

Discussion

55

souches. Gamar et al. (1997) ont montré qu’une culture de Lactobacillus rhaminosus C83

dans un milieu défini sans contrôle du pH a révélé une production simultanée d'EPS, de

lactate et de la biomasse. Les auteurs ont conclu à une production d'EPS associée à la

croissance. Par contre, une culture de Lb. rhaminosus R dans le milieu BMM (Basal Minimal

Medium) et avec contrôle du pH a commencé à produire l'EPS seulement à la fin de la phase

exponentielle de croissance (Pham et al. 2000). De plus, la production d'EPS a continué

pendant la phase stationnaire de croissance dans le cas des cultures dans le glucose, tandis que

la production d'EPS a cessé dans le cas d'une culture dans un milieu additionné de lactose. Les

auteurs ont supposé que l'EPS produit par cette souche peut être considéré plutôt comme un

produit mineur détourné de la glycolyse que comme un métabolite secondaire.

En outre, les propriétés physiques (viscosité et élasticité) des EPS des dix souches

ont été étudiées selon les moyens disponibles. Les résultats ont montré que les souches

produisent une solution visqueuse une fois mises en culture et que l’élasticité des EPS varie

d’une souche à une autre. Bien que ces résultats aient été effectués à l’aide de tests simples, ils

nous permettent d’avoir un aperçu sur l’éventuelle application de ces EPS dans d’autres

domaines que l’agriculture. D’après Sutherland (1990), les solutions aqueuses de xanthane ont

un fort pouvoir viscosifiant et viscoélastique. Il est utilisé pour moitié dans l’industrie

agroalimentaire.

Pour connaitre l’effet général des EPS sur la structure du sol, les souches ont été

inoculées dans du sol prélevé dans le champ de culture du LME. Nos résultats ont montré que

cette inoculation a significativement augmenté la teneur en agrégats stables à l’eau pour les

dix souches. En effet, les relations établies entre les microorganismes et les particules du sol

sont multiples et synergiques : les particules minérales influencent l’activité biologique et la

survie des microorganismes, en partie grâce à la géométrie des pores et, par le contrôle des

conditions physicochimiques locales (particulièrement la disponibilité de l’eau et de

l’oxygène). Les microorganismes, à leur tour, modifient l’arrangement des particules du sol

(structure) ainsi que leur stabilité (agrégation) (Chenu et Stotzky, 2002). Ces auteurs ont

montré que la principale contribution des microorganismes à l’agrégation du sol est associée à

la production de sécrétions extracellulaires parmi lesquelles les EPS. Ces EPS augmentent la

cohésion des agrégats en liant les particules minérales entre elles. La présence de l’EPS

augmente ainsi la teneur en fraction d’agrégats stables à l’eau (Chenu et Guerif, 1991). En

outre, nos résultats confirment que la taille des agrégats après le test de désagrégation a

significativement augmenté. Bien qu’au cours de nos études l’inoculation n’a pas été

Discussion

56

effectuée dans du sol rhizosphérique d’une plante, nos résultats s’accordent avec ceux de

Amellal et al (1999) qui ont inoculé des racines du blé par la souche Pantoea agglomerans. Ils

ont montré que cette inoculation augmente significativement la teneur en agrégats stables à

l’eau, la taille moyenne des agrégats ainsi que la masse du sol adhérant aux racines par

rapport au tissu racinaire. De plus les EPS jouent également un rôle positif dans les

phénomènes de régulation de la teneur en eau, notamment dans des conditions de stress

hydrique. Le travail de Roberson et Firestone (1992) porte sur la culture de Pseudomonas sp.,

(isolé du sol rhizosphèrique) dans une matrice de sable. Les cultures sous stress hydrique

produisent plus d’EPS et moins de protéines en comparaison à la culture de référence (haute

teneur en eau). La production d’EPS semblerait compenser la pénurie en eau. Par ailleurs,

l’EPS a intrinsèquement la capacité de retenir plusieurs fois son poids en eau (Roberson et

Firestone, 1992). Tout cela suggère que l’application de ces souches productrices d’EPS en

agriculture serait très intéressante.

Les résultats ont également montré que, mise à part la n°21, toutes les souches qui

ont servi aux études sont toutes capables de solubiliser le phosphate. Cette propriété serait

encore un plus dans d’éventuelles applications en agriculture puisque la présence des

microorganismes capables de solubiliser cet élément au voisinage des mycorhizes et/ou du sol

environnant pourrait constituer un facteur améliorant la nutrition en phosphate de la plante.

Jusqu’à présent, aucun travail de recherche ne se rapporte au fait que les bactéries de la flore

intestinale du termite sont capables de solubiliser le phosphate, cependant Razakatiana (2010)

a montré que le sol termitière provenant du même site où l’on a récolté nos termites est

particulièrement riche en microorganismes présentant des activités spécifiques parmi lesquels

les bactéries solubilisatrices de phosphate. Ceci confirme le fait qu’il serait intéressant de

différencier la flore de passage de la flore endogène spécifique du termite.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Conclusions et perspectives

57

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Dans le souci de préserver la structure et la fertilité du sol, l’exploitation de nouvelles

ressources, à l’instar des bactéries productrices d’exopolysaccharides, constitue une

alternative intéressante.

Cette étude a permis de montrer que les termites possèdent une microflore très

diversifiée encore peu exploitée et notamment dans les pays en voie de développement

comme Madagascar. D’après les résultats obtenus :

- le tube digestif du termite est une source prometteuse de bactéries productrices

d’exopolysaccharides.

- ces bactéries ont été isolées et identifiées partiellement par des méthodes

biochimiques et en utilisant les techniques classiques de microbiologie. Les souches

bactériennes présentent des morphologies et des propriétés diverses qui pourraient être

en relation avec leur capacité à produire ou non des polysaccarides.

- l’essai de production a montré que ces bactéries sont particulièrement performantes

malgré le fait qu’elles ont été mises en culture en dehors de leur habitat naturel.

- du fait de leurs propriétés physiques, les EPS représentent également un fort potentiel

de valorisation dans le domaine de l’agronomie. Les échantillons de sol inoculés avec

les bactéries productrices d’EPSs ont présenté une forte teneur en agrégats stables à

l’eau.

- l’inoculation des souches productrices d’EPS dans le sol a permis de montrer leur

effet positif sur l’agrégation du sol inoculé. Cet effet a été démontré par l’augmentation

de la teneur en agrégats stables à l’eau et par l’augmentation de la taille des agrégats.

- de plus, ces souches bactériennes sont capables de solubiliser le phosphate. Ce qui

représente un atout considérable étant donné que c’est l’un des éléments indispensables

pour les plantes.

Bien que ces résultats soient préliminaires, ils permettent d’orienter les recherches

vers de nouvelles perspectives aussi bien dans l’agriculture que dans d’autres filières telles

que l’agro-alimentaire, la pharmacie ou les cosmétiques. De ce fait, dans l’avenir il serait

intéressant :

Conclusions et perspectives

58

- de pousser les activités sur l’identification des souches performantes dans la

production des exopolyssaccharides en utilisant d’autres outils ou d’autres

processus tels que l’analyse biomoléculaire ;

- de poursuivre les études déjà effectuées sur les propriétés chimiques et

biologiques des EPSs obtenus après des séries de purification. Ceci dans le but de

connaitre les principes actifs pour les utilisations ultérieures ;

- d’optimiser les conditions de fermentation de ces bactéries pour une production

des exopolyssaccharides ;

- d’approfondir les recherches sur l’implication des EPSs et des bactéries

productrices d’EPSs dans le processus d’agrégation du sol inoculé ;

- d’effectuer des essais sur l’inoculation des souches productrices dans le sol

rhizosphérique de différentes plantes notamment pour les espèces maraîchères en

conditions contrôlées et non contrôlées.

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ANNEXES

Annexes

Annexe 1 : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

YM (Yeast Molds) pH=7

Extrait de levure………………………………... 3g

Peptone ……………………………………… 5g

Extrait de malt …………………………………. 3g

Dextrose ……………………………………… 10g

Agar ……………………………………………. 15g

Eau distillée qsp………………………………….1000ml

Milieu TCP (phosphate tricalcique) pH=7

NH4Cl………………………………….5g

NaCl……………………………………1g

MgSO4 …………………………………1g

Ca3(PO4)2 ……………………………...4g

Glucose ………………………………10g

Agar…………………………………...20g

E.D qsp …… ……………………1000ml

Annexes

Annexe 2 : MILIEUX D’IDENTIFICATION

• Milieu citrate de Simmons (pH=7,1±0.2)

Sulfate de magnésium……………………………………………………………….…….0,2 g

Phosphate monoammoniaque……………………………………………………………….1 g

Phosphate bipotassique………………………………………………………………………1 g

Chlorure de sodium…………………………………………………………………..………5 g

Citrate de sodium…………………………………………………………………………….1 g

Bleu de bromothymol…………………………….………………………………………0,08 g

Agar ………………………………………………………………………………………..15 g

Eau distillée qsp………………………….…………… ……………………………1000 ml

• Milieu mannitol mobilité nitrate (pH=7,6±0.2)

Hydrolysat trypsique de caséine……………………………………………….…………...10 g

Nitrate de potassium…………..……………….…………………………………………….1 g

Mannitol………………………………………..…………………………………………..7.5 g

Rouge de phénol 10%……………………………………………………….....................0.04 g

Agar………………………….…………………..……........................................................3.5 g

Eau distillée stérile qsp……………………………………………………………… 1000ml

• Milieu lysine fer (pH=6,7±0.2)

Peptone bactériologique……………………………………………………………………...5 g

Extrait de levure……………………………………………………………………..……….3 g

Glucose……………………………………………………………………………………….1 g

L-lysine……………………………………………………………………………………..10 g

Citrate de fer ammoniacal…………………………………………..……………………...0.5 g

Thiosulfate de sodium…………………………………………………..………………...0.04 g

Pourpre de bromocrésol………………………………………………………..…………0.02 g

Gélose…………………………………………………………………………….……….14.5 g

Eau distillé qsp…………………………………………………………………….........1000 ml

Annexes

• Milieu Hajna Kligler (pH=7,5±0.2)

Peptone……..…………………………………………………………………………….....15 g

Extrait de viande…. ………………………............................................................................3 g

Extrait de levure……………..………………………..……………………………………...3 g

Peptone pepsique de viande...………………………..………………………..……………..5 g

NaCl………………………….……………………..…..........................................................5 g

Sulfate ferreux……………….……………………...………………………..…………….0.2 g

Thiosulfate de sodium……….……………………………………………………………..0.3 g

Lactose……………………...………………………………………………………………10 g

Glucose……………………..………………………………………………………………..1 g

Rouge de phénol…………...…………………………………………………………....0.24 ml

Agar………………………………………………….……………………………………..11 g

Eau distillée stérilisée qsp………… ……………………………………………......1000 ml

Annexes

Annexe 3 : REACTIFS POUR LA COLORATION GRAM

• Violet de gentiane

Violet de gentiane………………….………………….……………………………………..1 g

Acide phéniqué cristallisé..………………………….………………………………………2 g

Alcool à 95°……………...………………………………………………………………..10 ml

• Solution de lugol

Iode……………………...………………………………........................................................1 g

Iodure de potassium…….……………………………………………………………………2 g

Eau distillée……………..………………………………………………………..………200 ml

• Fuschine phéniqué de Zielh

Fuschine………………..…………………………………………………………...………..1 g

Acide phéniqué cristallisé..…………………………………………………………………..5 g

Alcool à 95°……………..…………………………….......................................................10 ml

Eau distillée…………….……………………….................................................................20 ml

Name : RANDRIANOFIDINA

First name : Mbolasitraka Andriampenomanana

Title : Implication of exopolysaccharides from the bacteria associated with termite’s gut on

soil aggregation process

SUMMARY

Exopolysaccharides bacteria producers (6,3636. 10-4UFC/per gut) have been isolated

from termite’s gut collected at the Arivonimamo sclerophyllous forest. Screening of microbial

strains on solid medium and on liquid medium allowed the selection of 10 microbial strains

such as n° 21, 23, 33, 34, 40, 44, 46, 48, 51 and 55 which grew well on medium supplemented

with sucrose with a generation time ranging from 6,71 hours (for stump n°44) to 22,96 hours

(for stump n°51). Partial characterization of the morphological characteristics of these 10

strains showed that they are all bacillus grouped in chains and not motile, GRAM+ or to

GRAM - group.

Cultivated in a fermentation medium enriched by 30g/l of sucrose, stumps had

produced exopolysaccharides that have been extracted from culture medium after

precipitation and centrifugation. The quantity of exopolysaccharides extracted was different

ranging from 3,32 mg/l to 32,24 mg/l according to the bacterial strain. These

exopolysaccharids showed also other properties which could be exploited in fields other than

agriculture.

Soil inoculation with these ten strains increased significantly the amount of stable

aggregates in water as well as the size of aggregates, after ten days of incubation. The most

efficient strain to form soil aggregates was the strain n° 33. It was also recorded that except

the strain n° 21 all strains were capable to solubilize the phosphate which means that there are

involved in the phosphorus cycle.

Key words : exopolysaccharides, termite’s gute , strains, inoculation, aggregation, aggregates

Advisors : Docteur RAMAMONJISOA Daniel Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana

Nom : RANDRIANOFIDINA

Prénoms : Mbolasitraka Andriampenomanana

Titre : Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube digestif des termites et leurs

implications dans le phénomène d’agrégation du sol

RESUME

Dans un premier temps, des souches de bactéries productrices d’exopolysaccharides

(6,3636.104UFC/par tube digestif) ont été isolées à partir du tube digestif de termites collectés

au sein de la forêt sclérophylle d’Arivonimamo. Des criblages sur milieu solide et sur milieu

liquide ont permis de sélectionner dix souches (n° 21, 23, 33, 34, 40, 44, 46, 48, 51 et 55) qui

ont montré une bonne faculté d’adaptation sur le milieu YM additionné de saccharose comme

unique source de carbone. Leurs cinétiques de croissance respectives ont été caractérisées par

un temps de génération variant entre 6,71 heures (pour la souche n°44) à 22,96 heures (pour la

souche n°51). Il a été également observé que ce sont toutes des bacilles immobiles regroupées

en chaînettes à GRAM+ ou à GRAM-. Ce qui témoigne l’existence d’une communauté

microbienne relativement diversifiée et dynamique contenue dans le tube digestif des

termites.

Une fois cultivées sur le milieu de fermentation enrichi de 30g/l de saccharose, les

dix souches ont montré une bonne capacité à produire des exopolysaccharides qui par la suite

ont été extraits du milieu de culture après précipitation et centrifugation. Les résultats ont

montré que la quantité en exopolysaccharides obtenus varie de 3,32 mg/l pour la souche n° 21

à 32,24 mg/l pour la souche n°33. L’étude des propriétés physiques des exopolysaccharides

tels que la viscosité et l’élasticité a été également effectuée afin d’envisager les possibilités de

leur utilisation à des fins autres qu’agronomiques.

L’inoculation du sol par les dix souches a augmenté significativement la teneur en

agrégats stables à l’eau ainsi que la taille des agrégats après dix jours d’incubation. La souche

n° 33 a été la plus performante pour stimuler la formation des agrégats du sol. Par ailleurs, la

majorité des souches microbiennes testées, mise à part la souche n°21, ont été capables de

solubiliser le phosphate. Ce qui signifie qu’ils participent activement dans la libération de

l’ion phosphore dans le sol.

Mots clés : exopolysaccharides, tube digestif de termite, souches, inoculation, agrégation, agrégats

Encadreurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana

Documents

Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube