Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl

Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommier :pommier :

identification, identification, caractérisation et caractérisation et

analyse de l’expression analyse de l’expression spatio-temporelle en spatio-temporelle en

réponse à une induction réponse à une induction par l'acibenzolar-S-par l'acibenzolar-S-

methyl (ASM).methyl (ASM). Presentation, PhD Thesis, Biology, Ecole doctorale de Rennes 1, France.Smaïl Ziadi © 2001

PR-10 genes in apple seedlings (Malus domestica): identification, characterization and spatio-temporal expression after induction by acibenzolar-S-methyl (ASM), a functional analogue of salicylic acid.

Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du pommier : du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression identification, caractérisation et analyse de l’expression

spatio-temporelle spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM).en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM).

1-1- Situation du sujet. Situation du sujet.

3-3- Objectifs. Objectifs.

5-5- Conclusion générale. Conclusion générale.

2-2- Présentation du modèle d’étude. Présentation du modèle d’étude.

4-4- Résultats obtenus. Résultats obtenus.

6-6- Perspectives. Perspectives.

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Réponse de la plante aux stressRéponse de la plante aux stress

Plante

Bactéries Champignons

Virus

Facteurs physiques et/ou chimiquesFacteurs de virulence et d’avirulence

Eliciteurs abiotiquesEliciteurs biotiques

SalinitéSécheresse

Eliciteurs chimiques Blessure

Stress

11 : Défense constitutive

22 : Défense inductible

Ziadi © 2001

RReprésentation spatio-temporelle des réponses de défense de la planteeprésentation spatio-temporelle des réponses de défense de la plante

Flux d’ions Burst oxydatifCascade de phospho- rylation

Mort cellulaire

Temps relatifTemps relatif

Rap

ide

Point de stress

Rap

ide/

inte

rméd

iair

eIn

term

édia

ire/

lon

g

Défense locale Défense systémique

Distance/site de stressDistance/site de stress

Voies des phényl- propanoïdes Protéines PR

HRHR

ProtéinesProtéines

PRPR ProtéinesProtéines

PRPR

Ziadi © 2001

Principales voies de signalisationPrincipales voies de signalisation

BlessureInfection par un agent pathogène

Production de l’AS Production de l’AJ et C2H4-

+

Protéines PRnon inductibles

par l’AS

Protéines PRinductibles

par l’AS

Protéines PRinductibles par toutes

les voies de signalisation

Ziadi © 2001

Définition des protéines PR*Définition des protéines PR*

Protéines de la plante induites dans des :Protéines de la plante induites dans des :

ouou

- Situations de pathologie.- Situations de pathologie.

- Situations liées à la pathologie.- Situations liées à la pathologie.

l’application des éliciteurs chimiques.l’application des éliciteurs chimiques.

* van Loon et al., 1994

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Classification des protéines PRClassification des protéines PR

Famille Propriétés Symboles des gènesPR-1 Inconnue Ypr1

PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)]

PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia

PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid

PR-5 Thaumatin-like Ypr5

PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’)

PR-7 Endoprotéinase Ypr7

PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib

PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx

PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10

PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic

PR-12 Défensine Ypr12

PR-13 Thionine Ypr13, Thi

PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp

Famille Propriétés Symboles des gènesPR-1 Inconnue Ypr1

PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)]

PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia

PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid

PR-5 Thaumatin-like Ypr5

PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’)

PR-7 Endoprotéinase Ypr7

PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib

PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx

PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10

PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic

PR-12 Défensine Ypr12

PR-13 Thionine Ypr13, Thi

PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp

van Loon et van Strien., 1999Ziadi © 2001

La famille PR-10La famille PR-10

2-2- Identification basée sur l’homologie de séquences. Identification basée sur l’homologie de séquences.

3-3- Particularités : Particularités :

4-4- Induction : Induction :

- Protéines PR acides intracellulaires - Protéines PR acides intracellulaires

- Pouvoir allergène- Pouvoir allergène

1-1- Poids moléculaire : 16 – 18 kDa. Poids moléculaire : 16 – 18 kDa.

- - Stress biotiques Stress biotiques - - Stress abiotiquesStress abiotiques- Stades physiologiques- Stades physiologiques

5-5- Activité enzymatique suspectée : Activité enzymatique suspectée :

- Ribonucléase- Ribonucléase

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Modèle d’étudeModèle d’étude

1-1- Gènes candidats : Gènes candidats :

Gènes Gènes PR-10.PR-10.

2-2- Matériel végétal : Matériel végétal :

Pommier, semis du cv. Golden Delicious.Pommier, semis du cv. Golden Delicious.

3-3- Activateur de la résistance : Activateur de la résistance :

acibenzolar-S-methyl (ASM).acibenzolar-S-methyl (ASM).

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Les protéines PR-10 du pommier : Les protéines PR-10 du pommier : connaissances actuellesconnaissances actuelles

1-1- Famille multigénique Famille multigéniqueaa..

3-3- La majorité des travaux sont de type allergologique. La majorité des travaux sont de type allergologique.

4-4- Analyse de la régulation du gène Analyse de la régulation du gène AP15 AP15 dd..

d Pühringer et al., 2000.

2-2- Identification de 2 gènes : Identification de 2 gènes : AP15AP15 bb et et Mal d 1Mal d 1cc..

b Atkinson et al., 1996. c Vanek-Krebitz et al., 1995.a Walter et al., 1996.

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Le pommierLe pommier

1-1- Modèle de référence. Modèle de référence.

- Mécanismes de défense- Mécanismes de défenseaa..

- Cartographie du génome du pommier- Cartographie du génome du pommierbb..

2-2- Intérêt agronomique. Intérêt agronomique.

a Laboratoire du Feu Bactérien, UMR PaVé, Angers. b European Apple Linkage Map : Prima x Fiesta.

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acibenzolar-S-methyl (ASM) acibenzolar-S-methyl (ASM)

1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..

2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes.2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes.

4- Nombreuses qualités pratiques.4- Nombreuses qualités pratiques.

3- Protège le pommier contre le feu bactérien.3- Protège le pommier contre le feu bactérien.

a Wendehenne et al., 1997.

1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..

Ziadi © 2001

acibenzolar-S-methyl (ASM):acibenzolar-S-methyl (ASM):analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueanalogue fonctionnel de l’acide salicylique

Acide salicyliqueAcide salicyliqueASAS

o oH

oH

Acide 2, 6-dichloroisonicotiniqueAcide 2, 6-dichloroisonicotiniqueINAINA

o oH

oH

NCl Cl

Acibenzolar-S-methylAcibenzolar-S-methylASMASM

o s

N

N

S

CH3

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Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl (ASM)(ASM)

Tissus non infectés

Tissus infectés

NécrosesExpression des

gènes de défense

Résistance Acquise

Locale

AcideAcideSalicyliqueSalicylique

Signal systémique

NahG

NahG

Expression desgènes de la SAR

RésistanceSystémique

Acquise

nim1npr1

nim1npr1

AcideAcideSalicyliqueSalicylique

ASM

cpr1?lsd2lsd4

ndr1?cpr1?cim2cim3

Interaction plante-agentpathogène

D’après Ryals et al., 1996Ziadi © 2001

acibenzolar-S-methyl (ASM) acibenzolar-S-methyl (ASM)

1-1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..

2-2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes Activateur de la résistance de plusieurs plantesbb..

4-4- Nombreuses qualités pratiques Nombreuses qualités pratiquesdd..

3-3- Protège le pommier contre le feu bactérien Protège le pommier contre le feu bactériencc..

c Brisset et al., 2000.b Ruess et al., 1996.a Wendehenne et al., 1997. d Godard et al., 1999.

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Objectifs de l’étudeObjectifs de l’étude

1-1- Identification et caractérisation des Identification et caractérisation des gènes gènes PR-10.PR-10.

2-2- Analyse de l’expression spatio-temporelle des Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes gènes PR-10PR-10 après application de l'acibenzolar-S- après application de l'acibenzolar-S-methyl (ASM).methyl (ASM).

3-3- Analyse de l’expression des gènes Analyse de l’expression des gènes PR-10PR-10 après après application application d’autres stress abiotiques.d’autres stress abiotiques.

4-4- Localisation Localisation in situin situ des produits des gènes des produits des gènes PR-PR-10.10.

Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommierpommier

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Résultats obtenusRésultats obtenus

Identification et caractérisation Identification et caractérisation des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier

Ziadi © 2001

Recherche des transcrits PR-10Recherche des transcrits PR-10

RACE avec des amorces dégénéréesRACE avec des amorces dégénérées

Série de restrictionsSérie de restrictions

4 classes d’inserts 4 classes d’inserts

Séquençage d’un insert de chaque classe Séquençage d’un insert de chaque classe

AP1, AP2, AP3, AP4 AP1, AP2, AP3, AP4

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Analyse phylogénétiqueAnalyse phylogénétique

Séquences PR-10 du pommier

Séquences PR-10 du bouleau

Séquences PR-10 cv. Golden Delicious

Séquences PR-10 proches du pommier

pru022521

Pyr065200

pru050001

Bet v 1-Sc1

Q9SYV6

Q9SYW3

Q9SYV3

P43211/Mal d 1Q40280/AP15

Q9SYV2 Q9SYV4 Q9SYV5

Q9SYV7 Q9SYV8 Q9SYV9

Q9S7M5 Q43549 Q43550

Q43551 Q43552

Séquences AP

AP1

AP3

AP4

AP2

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Analyse phylogénétiqueAnalyse phylogénétique

APbAPb

APaAPa

Ziadi © 2001

RReprésentation des séquences génomiques eprésentation des séquences génomiques

E

E

MJ

Ei

Ei

W

W

W

W

ET

T

T T

500 pb 1000 pb 1500 pb

AP2

AP3

AP4

tataaat

-502 +1

tataaat

-592 +1

-861

tataaat

+1

AP1

tataaat

+1-885+78atg

+555taa

+790

+80atg

+557taa

+816

+84atg

+732taa +993

+438aggc

+268aggt

+73atg

+717taa

+997+423aggc

+256aggt

APbAPb APaAPa

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Analyse de l’expression Analyse de l’expression spatio-temporelle spatio-temporelle

des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier

Ziadi © 2001

RReprésentation des séquences génomiques eprésentation des séquences génomiques

500 pb 1000 pb 1500 pb

AP2

AP3

AP4

AP1

tataaat

+1-885+78atg

+555taa

+790

-861

tataaat

+1+80atg

+557taa

+816

tataaat

-502 +1+84atg

+732taa +993

+438aggc

+268aggt

tataaat

-592 +1+73atg

+717taa

+997+423aggc

+256aggt

APbAPb APaAPa

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Expression constitutive des gènes Expression constitutive des gènes PR-10PR-10

F P T R

APa

APb

Feuilles TigePétioles RacinesRacines

R

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Analyse de l’expression inductible des gènes Analyse de l’expression inductible des gènes PR-10PR-10

Pulvérisation:-ASM (1 mM)-H2O

Prélèvement :

0 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 48 h 120 h

Prélèvement

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Expression inductible des gènes Expression inductible des gènes PR-10PR-10

Expression localeExpression locale

Au niveau transcriptionnel Au niveau traductionnel

18 kDa17 kDa

Bet v 1 8 h 24 h 48 h 8 h 24 h 48 h

17 kDa

H2O ASM

H H H AAA

8 h 24 h 48 h

APa

APb

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1 159AP3

Signature PR-10

Représentation schématique des séquences protéiquesReprésentation schématique des séquences protéiques

Hypothèse d’une modification post-traductionnelleHypothèse d’une modification post-traductionnelle

1

1

1

159

159

159

AP1

AP4

APaAPa

AP2

APbAPb

Ck Ck

Ck CkPk

Pk

Pk

Pk

Ck

Ck

Ck

Ck

Ck

Ck

CkSignature PR-10

Signature PR-10

Signature PR-10

P-loop

P-loop

P-loop

P-loop

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Analyse de l’expression systémiqueAnalyse de l’expression systémique

Pulvérisation:-ASM (1 mM)-H2O

Prélèvement :

Protection des deux jeunes feuilles

FNT

FT

- FT: feuilles traitées

- FNT: feuilles non traitées

0 h 48 h 120 h

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Expression systémiqueExpression systémique

FT FT FTFTFNT FNT

H HA A

48 h 120 h

APa

APb

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Analyse de l’expression Analyse de l’expression des gènes des gènes PR-10PR-10 après application après application

d’autres stress abiotiquesd’autres stress abiotiques

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1-1- Éthylène. Éthylène.

2-2- Acide jasmonique. Acide jasmonique.

3-3- Blessure. Blessure.

4-4- Capsicéine. Capsicéine.

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Application d’autres stress abiotiquesApplication d’autres stress abiotiques

ÉthylèneÉthylène

H H H 1 1010101 1

8 h 24 h 48 h

APa

APb

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Acide jasmonique (0,1 mM) Acide jasmonique (0,1 mM) etet Capsicéine (1 µg.mlCapsicéine (1 µg.ml-1-1))

H HCap AJ AJCap

48 h 120 h

APa

APb

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BlessureBlessure

T

APa

APb

TB BB T

8 h 24 h 48 h

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Localisation des produits Localisation des produits des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier

Ziadi © 2001

Localisation Localisation in situin situ des transcrits PR-10 des transcrits PR-10

XyXy

Barre d’échelle : 25 µm

EiEi

PpPp

EsEsPlPl


Ziadi © 2001

Localisation Localisation in situin situ des protéines PR-10 des protéines PR-10

EiEi

XyXy

EESS


EiEi

EESS

PPLLPpPp


PHPH

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ConclusionsConclusionsetet

PerspectivesPerspectives

Conclusions et PerspectivesConclusions et Perspectives

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ConclusionsConclusions

Identification et caractérisation des gènes Identification et caractérisation des gènes PR-10PR-10

2-2- Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3). Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3).

4-4- Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente. Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente.

3-3- Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés. Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés.

1-1- Quatre transcrits Quatre transcrits PR-10PR-10 ont été identifiés ont été identifiésaa dans les feuilles. dans les feuilles.

a GeneBank data base:

AY026909 (Ypr10*Md.d).

AY026908 (Ypr10*Md.b)AY026911 (Ypr10*Md.a)

AY026910 (Ypr10*Md.c)

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Expression spatio-temporelle des gènes Expression spatio-temporelle des gènes PR-10PR-10

2-2- Expression après application de l’ASM :Expression après application de l’ASM :

4-4- Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine. Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine.

3-3- Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène. Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène.

1-1- Expression constitutive uniquement au niveau des racines. Expression constitutive uniquement au niveau des racines.

1-1- Très forte au niveau local.Très forte au niveau local.

2-2- Significative au niveau systémique.Significative au niveau systémique.

Ziadi © 2001


Localisation Localisation in situin situ des produits des gènes des produits des gènes PR-10PR-10

1-1- Les tissus conducteurs. Les tissus conducteurs.

2-2- Les parenchymes palissadiques. Les parenchymes palissadiques.

Les tissus du phloème.Les tissus du phloème.

SMAÏL ZIADI, PASCAL POUPARD, MARIE-NOËLLE BRISSET, JEAN-PIERRE PAULIN and PHILIPPE SIMONEAU.

Characterization in apple leaves of two subclasses of PR-10 transcripts inducible by acibenzolar-S-methyl, a functional analogue of salicylic acid

Physiological and Molecular Plant Pathology (2001) 58, 33-43.

Ziadi © 2001

Rôles suggérés pour les protéines PR-10Rôles suggérés pour les protéines PR-10

2-2- Rôle dans le développement de la plante. Rôle dans le développement de la plante.

1-1- Rôle dans les mécanismes de défense. Rôle dans les mécanismes de défense.

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Fonction biologiqueFonction biologique

1- 1- Analyse de l’expression des gènes Analyse de l’expression des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier après un stress biotique.après un stress biotique.

2- 2- Localisation cellulaire des produits des gènes Localisation cellulaire des produits des gènes PR-10.PR-10.

3- 3- Cartographie des gènes Cartographie des gènes PR-10.PR-10.

4- 4- Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10.Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10.

Ziadi © 2001

Aspect allergénique des protéines PR-10Aspect allergénique des protéines PR-10

Breiteneder et Ebner, 2000Ziadi © 2001

Allergènes des aliments homologues aux protéines PRAllergènes des aliments homologues aux protéines PR

Allergènes

homologues àSources d’allergènes

PR-2 fruits et légumes.

PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane.

PR-4 navet.

PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23).

PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH).

PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge.

Breiteneder et Ebner., 2000; Hoffmann-Sommergruber, 2000

Allergènes

homologues àSources d’allergènes

PR-2 fruits et légumes.

PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane.

PR-4 navet.

PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23).

PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH).

PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge.

Ziadi © 2001

Aspect allergénique des protéines PR-10Aspect allergénique des protéines PR-10

H A50 A100 A200

APa

APb

ASM

Ziadi © 2001

Question ouverte Question ouverte

Protection des cultures par l’application des éliciteurs chimiquesProtection des cultures par l’application des éliciteurs chimiques

Induction des protéines allergènesInduction des protéines allergènes

Risques pour les consommateurs ? Risques pour les consommateurs ?

ÉÉvaluation des risques allergéniquesvaluation des risques allergéniques

Ziadi © 2001


Évaluation des risques allergéniquesÉvaluation des risques allergéniques

1-1- Vérification de l’allergénicité des protéines AP.Vérification de l’allergénicité des protéines AP.

3-3- Recherche d’autres activateurs de la résistance qui Recherche d’autres activateurs de la résistance qui n’induisent pas ou faiblement les gènes n’induisent pas ou faiblement les gènes PR-10.PR-10.

2-2- Suivi de l’expression des gènes Suivi de l’expression des gènes PR-10PR-10 dans les fruits dans les fruits avant et après application de l’ASM.avant et après application de l’ASM.

Ziadi © 2001

EncadrementEncadrement

- M. SIMONEAU P.- M. SIMONEAU P. Laboratoire de Microbiologie Végétale

- M. POUPARD P.- M. POUPARD P. Laboratoire de Microbiologie Végétale

- Melle. BRISSET M. –N.- Melle. BRISSET M. –N. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale

- M. PAULIN J. –P.- M. PAULIN J. –P. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale

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MerciMerci pour votre pour votre attentionattention

Ziadi © 2001

Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommier :pommier :

identification, identification, caractérisation et caractérisation et

analyse de l’expression analyse de l’expression spatio-temporelle en spatio-temporelle en

réponse à une induction réponse à une induction par l'acibenzolar-S-par l'acibenzolar-S-

methyl (ASM).methyl (ASM). Ziadi © 2001

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Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl