LES OUTILS POUR DÉCRIRE LA BIODIVERSITÉ · Au niveau écologique, elle permet le maintien des processus d'évolution du monde du vivant, la régulation des écosystèmes et de la

LES OUTILS POUR DÉCRIRELES OUTILS POUR DÉCRIRE LA BIODIVERSITÉLA BIODIVERSITÉ

Présenté parPrésenté par : : CONSTANT MelCONSTANT MelHUBE CamilleHUBE Camille

AA : : Monsieur Ansellem Monsieur Ansellem

LeLe : : 29 Novembre 201129 Novembre 2011

SOMMAIRESOMMAIREIntroduction :........................................................................................................................................3

1. Qu'est ce que la biodiversité ?..........................................................................................................4

1.1. Définition..................................................................................................................................4

1.2. Pourquoi s’intéresser à la biodiversité ?...................................................................................5

1.3. Conservation de la biodiversité.................................................................................................5

2. La biologie moléculaire....................................................................................................................6

3. Les techniques moléculaires actuelles..............................................................................................6

3.1. L'ADN cytoplasmique..............................................................................................................6

L'ADN mitochondrial et le barcoding :.......................................................................................7

3.2. L'ADN nucléaire.......................................................................................................................9

T-RFLP........................................................................................................................................9

DGGE et TGGE........................................................................................................................10

SSCP..........................................................................................................................................11

Exemple d'utilisation de ces trois techniques : l'analyse des micobiotes du lait.......................11

Conclusion..........................................................................................................................................12

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Les outils pour décrire la biodiversitéLes outils pour décrire la biodiversité

INTRODUCTIONINTRODUCTION ::

La biodiversité connaît, depuis le « Sommet de la Terre » de Rio en 1992, un essor considérable car même si son étude n'est pas récente avec C.V Linnée au XVIème siècle ou encore avec C. DARWIN au XIXèmesiècle, le grand public commence seulement à assimiler son importance. Ceci est sûrement dû à une meilleure compréhension globale du potentiel de la biodiversité écosystémique et des conséquences qui résulteraient de sa perte. Ce dernier point est notamment permis par la sur-médiatisation actuelle (documentaires, émissions, débats...).

Les motifs pour préserver la biodiversité afin d'en jouir durablement ne manquent pas. La préserver permettrait en effet de sauver de nombreuses espèces de l'extinction, des milieux de la destruction, et de conserver les ressource génétique actuelle voire de l’accroître. Pour cela, il faut mettre en place des plans de gestions spécifiques aux écosystèmes. Or cette mise en place ne peut pas être permise sans études préalables des milieux. Parmi les grandes étapes de ces études figure la description de la biodiversité du milieu, étape qui nécessite l'utilisation d'outils spécifiques. Ce sont ces outils, permettant de décrire la biodiversité, notamment les techniques apparues à la fin du XXème siècle dont fait l'objet ce rapport.

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1. QU'EST CE QUE LA BIODIVERSITÉ1. QU'EST CE QUE LA BIODIVERSITÉ ??

1.1. DÉFINITION1.1. DÉFINITION

La biodiversité est définie comme étant la variété et la diversité tant floristique que faunistique du monde vivant, on parle ainsi de diversité biologique.Cette diversité biologique comprends toutes les formes du vivant et se caractérise selon trois niveaux d'organisations :

– la diversité des écosystèmes ou écologique – la diversité des espèces ou inter-spécifique– la diversité génétique ou intra-spécifique

Ces trois niveaux d'organisation sont représentés selon le modèle suivant :

Figure 1 : interactions entre les trois composantes de la biodiversité

La diversité écologique correspond à la diversité des écosystèmes et des biomes présents tels que les forêts, les océans, les milieux montagnards, etc … Au sein de ces écosystèmes, on retrouve la diversité inter spécifique des espèces qui est caractérisée par le nombre d'espèces qui les composent.

Cependant, au sein d'une même espèce ou d'une population, on peut rencontrer une variabilité génétique. Cette variabilité définie la diversité génétique et dépend des chromosomes, des gènes et de l'ADN qui détermine le caractère unique de chaque individu à l'intérieur de chaque espèce.

Ces trois niveaux d'organisations entre les différentes formes de vie, entres elles et au sein d'un écosystème, évoluent ensembles, chacun des éléments étant interdépendants les uns des autres.

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1.2. POURQUOI S’INTÉRESSER À LA BIODIVERSITÉ1.2. POURQUOI S’INTÉRESSER À LA BIODIVERSITÉ ??

La préservation de la biodiversité est un enjeu qui touche de nombreux domaines et l'ensemble de l'espèce humaine.

Au niveau économique, elle est une ressource de matières premières quasiment illimitée (si sa gestion est correcte) et extrêmement diversifiée. Ainsi de nombreuses branches économiques y sont rattachées et dépendantes : l'agriculture (avec les produits alimentaires), l'élevage, la pharmaceutique (avec les médicaments), le tourisme etc... Elle offre également de nombreuses perceptives dans des branches telles que les biotechnologies où elle pourrait permettre de résoudre de nombreuses problématiques actuelles (la faim dans le monde, les énergies etc...)

Au niveau écologique, elle permet le maintien des processus d'évolution du monde du vivant, la régulation des écosystèmes et de la biosphère.

Au niveau de l'éthique et du patrimoine, la biodiversité fait partie de l'histoire de la terre et de la civilisation, elle constitue un héritage transmis par les générations précédentes et qu'il convient de transmettre dans le meilleur état possible. De plus, elle fait également partie de la culture et de l'identité des sociétés.

Au niveau de la vie quotidienne, sa présence est source de bien-être et peut offrir un cadre vie agréable, quand à sa diversité elle a tendance à rompre la monotonie.

1.3. CONSERVATION DE LA BIODIVERSITÉ1.3. CONSERVATION DE LA BIODIVERSITÉ

Depuis le Sommet de la Terre à Rio en 1992, la biodiversité apparaît comme un bien vital qu'il est indispensable de préserver dans un intérêt scientifique, éthique, économique et social. De plus, celle-ci est un héritage de l’humanité qu'il est important de préserver. Ainsi en sauvant de nombreuses espèces de extinction des écosystèmes sont maintenus ainsi que les ressources génétiques.

De ce fait, de nombreux systèmes de protection et de revalorisation ont été mis en place. Des inventaires floristiques et faunistiques ont permis de définir les enjeux écologiques des milieux observés et de créer des espaces appropriés tels que des espaces naturels sensibles (ENS), des parcs régionaux (PR), des réserves naturelles régionales (RNR) - nationales (RNN) , des zones Natura 2000… avec pour chacun d'entre eux un plan de gestion adéquate. D'autres mesures permettent également la protection des ressources et des espèces tout comme des directives cadres (ex : directive cadre sur l'eau 2000), la liste rouge des espèces en voies d'extinction de l'UICN ou encore des ligues de protection pour les oiseaux par exemple.

De plus des missions de campagnes sont également mises en place par les organismes de protection de la nature afin de sensibiliser les citoyens à une utilisation et à une gestion raisonnée des milieux qui les entourent.

Toutes ces actions ont pour but de maintenir la biodiversité et les équilibres biologiques actuels.

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2. LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE2. LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

La biologie moléculaire est une branche assez récente de la biologie. Elle s'intéresse à l'étude de la diversité génétique, notamment au niveau inter et intra espèce. En effet chaque individu est génétiquement différent mais il est plus ou moins proche des autres individus suivant l'apparentement ou appartenance à une sous-population, une population ou à une espèce. Ainsi la biologie moléculaire permet de caractériser ses différences aux seins entre ces trois niveaux et ainsi décrire la biodiversité et les interactions qui en découlent. Cette variabilité s'explique par les variations de séquences d'ADN due à des processus évolutifs complexes, corrélant impact génétique et environnemental.

Cette discipline apparaît dans les années 30 avec les marqueurs phénotypiques mais connaît un essor considérable avec l'étude plus approfondie de l'ADN, l'ARN ou encore des protéines et qui va être marquée par la découverte de la structure en double hélice de l'ADN en 1953. Depuis cette discipline n'a cessé d'évoluer, de manière quasi exponentielle, jusqu'à devenir un outil indispensable dans la description de la diversité génétique. Cette évolution a bien sûr était marquée par différents événements notamment le séquençage de l'ADN dans les années 70 (note : séquençage en entier du génome humain date de 2003) et l'apparition de la PCR dans les années 80. Actuellement de nombreux domaines, tels que la phylogénie ou encore la microbiologie (domaine où seulement 1% des bactéries peuvent être décrites par les méthodes classiques (culture sur gélose, gram, morphologie)) utilise la biologie moléculaire car elle offre des perceptives intéressantes et de nouveaux champs de recherche pour décrire la biodiversité et comprendre les phénomènes d'évolution.

3. LES TECHNIQUES MOLÉCULAIRES ACTUELLES.3. LES TECHNIQUES MOLÉCULAIRES ACTUELLES.

Les techniques de biologie moléculaires actuelles utilisées afin de décrire la biodiversité s'effectuent à partir de 2 types d'ADN :

– l'ADN cytoplasmique – l'ADN nucléaire

Pour chaque type d'ADN, il existe des techniques spécifiques. Ce sont ces techniques que nous allons aborder.

3.1. L'ADN CYTOPLASMIQUE.3.1. L'ADN CYTOPLASMIQUE.

L'ADN cytoplasmique est situé, comme son nom l'indique dans le cytoplasme (contenu) d'une cellule vivante.

Cet ADN est composé de l'ADN mitochondrial et de l'ADN chloroplastidique. Dans le cadre de notre étude nous nous intéressons uniquement à l'ADN mitochondrial.

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▪ L'ADN mitochondrial et le barcoding :

Le barcoding ou « code barre » est une technique moléculaire d'identification et d'étude de la biodiversité à partir de l'analyse de l'ADN mitochondrial.

Figure 2 : représentation d'une cellule avec les mitochondries comprenant l'ADN mitochondrial

Le fragment d'ADN choisi est un gène codant pour une protéine qui intervient dans la chaîne respiratoire de la mitochondrie appelée cytochrome oxydase (COI). Ce gène est choisi car chaque cellule contenant un grand nombre de mitochondries entraîne la présence de nombreuses copies de COI, ce qui facilite son séquençage. De plus ce gène présente une variabilité génétique importante. En effet, les différences de séquences de ce gène chez différents individus, apparues par mutations au cours du temps, sont faibles pour des individus d'une même espèce et élevées pour des individus d'espèces différentes.

Figure 3 : Mise en évidence de la cytochrome oxydase COI

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Cette méthode permet dont d'identifier des espèces inconnues en comparant leurs séquences avec celles déjà répertoriées. Ainsi, la méthode du barcoding consiste à extraire l'ADN d'un individu puis de séquencé le gène COI s'y trouvant. Il est notamment utilisée afin de comparer deux espèces cryptiques, c'est-à-dire que ont une apparence morphologique quasi identique.On peut alors citer comme exemple, une analyse effectuée sur les éléphants d’Afrique Loxodonta africana vivant soit dans la forêt ou dans la savane, en 2003 par Herbert. Il est alors apparu une diversité génétique entre les individu des différents milieux qui a permis de les classer dans deux sous espèces différentes : Loxondonta africana africana pour les éléphant de la savane et Loxodonta africana cyclotis pour les éléphants de la forêt.

La différenciation de 2 individus d'une même espèce ou la découverte de nouvelles à partir de cette technique moléculaire ont permis d'obtenir de nombreux séquençages de « code barres » à ADN pour de nombreux organismes tels que les oiseaux, les poissons ou les insectes, dans le cadre de projets « barcoding of life », lancé en 2003 par Paul Hebert et son équipe. Ce projet à pour but d'aboutir à un répertoire des séquences d'ADN des environs deux millions d'espèces identifiées à ce jour par les scientifique afin d'identifier plus rapidement celles qui seront découvertes dans le futur.

Réalisé à partir d'un ADN mitochondrial 5 à 10 fois plus spécifique que l'ADN nucléaire, le barcoding est une méthode standardisée, rapide et caractérisant un individus quelque soit son stade de développement (larve, nymphe, jeune, adulte etc …) et son état de conservation. Cependant cette méthode présente tout de même quelques limites. En effet, les marqueurs mitochondriaux sont à hérédité maternelle seule ce qui signifie qu'ils ne reflètent pas les possibles flux de gènes et peuvent ainsi donner une image fausse des limites entre chaque espèce. De plus les résultats obtenus peuvent être altérés lorsqu’il existe des copies des marqueurs mitochondriaux en marqueurs nucléaires.

De ce fait, le barcoding présente un grand intérêt aujourd'hui dans la description et la classification de la biodiversité, mais pour plus d'efficacité cette technique doit être combinée aux relevés faunistiques, botaniques, anatomiques et physionomiques déjà répertoriés.

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Figure 4 : l'éléphant de la savane africaineLoxodonta africana africana

Figure 5 : l'éléphant des forêts d'AfriqueLoxodonta africana cyclotis


http://www.barcodeoflife.org/

3.2. L'ADN NUCLÉAIRE3.2. L'ADN NUCLÉAIRE

L'ADN nucléaire correspond à l'ADN situé dans le noyau des cellules eucaryotes sous la forme de chromosome. Il est différent de l'ADN mitochondrial en plusieurs points. Il est plus important en terme de paire de base, son hérédité est partagée donc issue pour la moitié du père et pour l'autre moitié de la mère et le code génétique qu'il code est également différent de l'ADN mitochondrial comme de toutes les autres formes d'ADN.

Il existe de nombreuses techniques moléculaires qui utilisent cet ADN mais cet exposé se focalise sur les trois principales. Elles sont basés sur le même schéma, mais diffèrent dans toute dans la méthode de différentiation des polymorphismes. En effet, elles comportent toutes les trois les étapes suivantes :1 - Récupération d'un échantillon2 - Concentration de l'échantillon 3 - Extraction de l'ADN génomique4 - Amplification d'une région par PCR 5 - Électrophorèse 6 - Étude de l'électrophorégramme (par comparaison des bandes obtenues).

La différence va donc se faire sur la technique utilisée pour obtenir des électrophorégrammes différents d'une séquence à l'autre.

▪ T-RFLP

La T-RFLP (terminal restriction fragment lenght polymorphism) utilise des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont utilisées pour couper l'ADN uniquement au niveau des sites de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît un palindrome (site de restriction) différent et va couper l'ADN au niveau de ces palindromes. Il en résulte un découpage de l'ADN en fragments, dont le nombre dépend du nombre de sites de restriction contenus dans la région et dont la taille dépend de la position des sites. Ces fragments vont ensuite être séparés par électrophorèse (le plus petit fragment migrant le plus loin). Une étape supplémentaire, où les extrémités 5' des produits de PCR sont rendus fluorescents, est effectuée dans le but de caractériser plus facilement les fragments quand ils sont en trop grand nombre (provoquent des trainés sur l'électrophorégramme).

Résumé des étapes : 1 - Récupération d'un échantillon2 - Concentration de l'échantillon 3 - Extraction de l'ADN génomique4 - Amplification la région 16 par PCR 5 – Marquage des extrémités par fluorescence 6 - Traitement des produits de la PCR par les enzymes de restriction7 - Électrophorèse 8 - Étude de l'électrophorégramme. Figure 6 : étape d'une analyse moléculaire par T-RFLP

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▪ DGGE et TGGE

La DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) est une technique qui utilise la dénaturation de l'ADN par des agents dénaturant soit chimiques, soit physiques mais principalement thermiques. La technique utilisant la température comme agent dénaturant est la TGGE (Temperature gradient gel electrophoresis). La dénaturation consiste en la rupture des liaisons hydrogènes entre les brins d'ADN qui vont donc se dissocier.

À noter que les liaisons des paires AT sont plus faibles et vont donc se dissocier en premier, les liaisons des paires CG se sépareront donc à une température ou une concentration plus forte.

En appliquant un gradient d'agent dénaturant donc soit de température ou de concentration à une électrophorèse et sachant que la migration dans le gel s'arrête lorsque les deux brins d'une molécule d'ADN se sépare, il est possible d'obtenir un électrophorégramme caractéristique d'une séquence d'ADN. En effet, la séparation de l'ADN va se faire en fonction des pourcentages en paires de bases GC, puisque plus la séquence comportera de paires de base CG plus elle migrera loin.

Résumé des étapes : 1 - Récupération d'un échantillon2 - Concentration de l'échantillon 3 - Extraction de l'ADN génomique4 - Amplification la région 16 par PCR 5 - Traitement des produits de la PCR par les enzymes de restriction6 - Électrophorèse à gradient de température (TGGE) ou gradient de concentration d'un composé chimique dénaturant7 - Étude de l'électrophorégramme

Figure 7 : analyse moléculaire par DGGE / TGGE

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▪ SSCP

La technique SSCP (single strand conformation pofile) étudie le polymorphisme de conformation des simples brins. Les bases de l'ADN sont légèrement hydrophobes donc elles minimisent leur contact avec l'eau . Pour cela l'ADN a une structure en double hélice et l'ARN se recroqueville en une structure tige boucle. Suivant leur composition c'est à dire leurs séquences les simples brins se recroquevillent différemment, et vont donc avoir une conformation différente. Cette conformation va impliquer une migration plus ou moins importante lors d'une électrophorèse. La technique SSCP est basée sur ce principe. Elle consiste donc à séparer les brins puis les faire migrer par électrophorèse.

Résumé des étapes : 1 - Récupération d'un échantillon2 - Concentration de l'échantillon 3 - Extraction de l'ADN génomique4 - Amplification la région 16 par PCR 5 - Séparation des deux brins d'ADN (qui vont se recroqueviller)6 – Électrophorèse7 – Étude de l'électrophorégramme

Figure 8 : analyse moléculaire par SSCP

▪ Exemple d'utilisation de ces trois techniques : l'analyse des micobiotes du lait.

Dans cette étude (datée de 2010) il était question d'analyser le microbiote du lait, notamment en ce qui concerne le stockage du lait traité et non traité entreposé à basse température. Pour cela les trois méthodes moléculaires présentées ont été utilisées. Elles ont permis d'établir une vision globale de la communauté microbienne, d'identifier et de quantifier avec précision les bactéries dominantes, de déterminer les effets des traitements sur la composition des populations bactériennes et enfin d'estimer l'abondance relative ainsi que la diversité du microbiote du lait. Elle met en évidence l'intérêt de l'utilisation des techniques moléculaires pour décrire la biodiversité. En effet elles offrent de nombreux avantage tel que l'analyse d'un grand nombre d'échantillons, une reproductibilité élevée et la génération de donnée à haut débit.

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CONCLUSIONCONCLUSION

La description de la biodiversité apparaît donc comme nécessaire à son maintien. Cette description emploie actuellement de plus en plus de techniques issues de la biologie moléculaire. Il existe deux principales techniques, celles qui utilisent l'ADN cytoplasmique et celles qui étudient l'ADN nucléaire. Elles ont chacun leurs avantages et leurs inconvénients, et il convient qu'elles ne peuvent remplacer les outils de description plus classiques, qui les complètent.

Les derniers recensements portent à moins de 2 millions le nombre d'espèces décrites. Chaque année environ 7000 nouvelles espèces sont décrites. Les spécialistes pensent que la biodiversité totale des eucaryotes serait comprise entre 10 et 100 millions d'espèces, ce qui signifie qu'au rythme actuel, il faudrait 1500 à 15000 ans pour décrire l'ensemble de la biodiversité. Il apparaît donc important d'améliorer les techniques actuelles, notamment les techniques moléculaires qui font leurs preuves mais qui pourraient encore gagner en rapidité, en précision et quantité d'informations gérées.

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