Ann&e Biol. (1998) 78, l-9 0 Elsevier, Paris

Les principales voies enzymatiques de l’assimilation de l’azote chez les microalgues eucaryotes

Marie Charpin *, Jean Devaux

Laboratoire de biologie compare’e des protistes, UPRESA 60236, L.es CPzeaux, 63 I77 Aubikres cedex, France

(Recu le 4 juin 1997, accept6 le 30 juin 1997)

RCsumC - L’utilisation des elements nutritifs azotCs par les microalgues eucaryotes necessite leur absorption du milieu extracellulaire, leur conversion tventuelle en ammo- nium, qui demeure la seule forme d’azote directement assimilable dans le pool interne des acides amines et qui precede leur incorporation au sein des macromolCcules. La forma- tion d’acides amines a partir de l’ammonium peut s’effectuer selon differentes voies enzy- matiques, dont les principales sont la voie GSJGOGAT et la voie enzymatique catalysee par la GDH. Nous prCsentons les principales caracteristiques de ces differentes enzymes et les connaissances actuelles concernant le role de ces differentes voies enzymatiques dans l’assimilation de I’ammonium par les microalgues eucaryotes. S’il est classiquement admis que l’essentiel de cette assimilation est effect&e par la voie GUGOGAT, il appa- rait que chez certaines especes la GDH joue Cgalement un role non negligeable dans cette assimilation. Chez les especes ou cette enzyme n’intervient pas dans cette &ape du m&a- bolisme azote, il a et& suggere que la GDH permettait la rCgCnCration de l’ammonium intracellulaire a partir du glutamate. La presence d’isoenzymes utilisant des cofacteurs differents complique encore tout essai de gCnCralisation concernant la principale voie d’assimilation d’azote chez les microalgues eucaryotes. glutamine synthCtase / glutamate synthase I glutamate dCshydrogCnase / microalgues eucaryotes

Abstract - The chief enzymatic pathways for the ammonia assimilation in euka- ryotic microalgae. Nitrogen utilization by eukaryotic microalgae involves 1) the uptake of the nutrient nitrogen, 2) the intracellular processing of the nitrogen to convert it to ammonia if necessary, 3) the assimilation of the ammonia into small organic molecules (amino acids) and 4) the synthesis of larger organic macromolecules. The ammonia is assimilated into the intracellular amino acid pool of eukaryotic microalgae primarily by

* Correspondance et tires a part

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either the GS/GOGAT pathway or the reaction of GDH. Here we review our current knowledge on the characteristics of these enzymes and on their putative functions in ammonia assimilation. It seems to be generally accepted that the GWGOGAT pathway is the main pathway for the ammonia assimilation in eukaryotic microalgae. There is, however, evidence for the role of GDH in ammonia assimilation in some species. In other species the role of this enzyme is thought to be in catalysing the conversion of glutamate to ammonia. The distribution of the isoforms of glutamate dehydrogenase that use NADH or 97 NADPH as reductant make any generalisation difficult.

glutamine synthetase / glutamate synthase / glutamate dehydrogenase / eukariotic microalgae

1. - INTRODUCTION

Chez tous les &tres vivants, l’azote entre dans la composition de molecules exer- Fant un role majeur au niveau cellulaire : constituants structuraux, enzymes, pigments photosynthetiques, acides nucleiques et molecules necessaires a l’expression gene- tique. Dans une cellule algale ne presentant aucune carence nutritive, cet element chimique represente environ un douzitme de la matibre s&he [24,27]. En conse- quence, l’azote est dune importance vitale pour le maintien, la viabilite et la crois- sance de toute cellule en general et des cellules phytoplanctoniques en particulier.

En milieu aquatique, les composes azotes susceptibles de servir de source d’azote pour les microalgues eucaryotes incluent des formes mintrales telles que l’ammo- nium (NH,+), les nitrites (NO,-) ou les nitrates (N03-) et des composes organiques tels que l’uree, les acides amines et certaines bases puriques ou pyrimidiques qui peu- vent constituer des sources d’azote non negligeables pour les communautes phyto- planctoniques [23].

L’utilisation de ces differents elements nutritifs azotes peut artificiellement &tre scindee en plusieurs Ctapes [23, 291 (figure I) : - 1) l’absorption des elements nutritifs azotes, qui permet leur passage du milieu exttrieur au milieu intracellulaire ; - 2) la conversion Cventuelle des elements nutritifs azotes absorb& en ammonium, cette forme ionique Ctant la seule forme d’azote directement assimilable dans le pool d’acide amines intracellulaires ; - 3) l’assimilation, qui consiste en la conversion d’ammonium en petits metabolites organiques represent& essentiellement par les acides amines ; - 4) l’incorporation de ces metabolites au sein des macromolecules (proteines, pig- ments photosynthetiques et acides nucleiques).

L’ensemble de ces quatre Ctapes concourt a former un flux unidirectionnel a partir de I’absorption initiaie jusqu’a la synthese finale de macromolecules, mais il existe une cinquittme categoric de processus du metabolisme azote du phytoplancton. 11 s’agit du catabolisme intracellulaire [5] qui permet la mobilisation de molecules bio- logiques contenant de l’azote.

M. Charpin - Les principales voies enzymatiques de I’assimilation de I’azote 3

Milieu extracellulaire l/,ay

CONVERSION ASSIMILATION 1NCORPORATlON

Ammonium + MFdites ---F ~acromokw~rs OrgZUllq”l3

3

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t

Figure 1. Processus majeurs impliques dans I’utilisation de I’azote par les microalgues (adapt& de [29]). Le schema ne tient pas compte de la compartimentation cellulaire.

Les produits azotes en resultant peuvent alors &tre reutilists dans d’autres reac- tions cellulaires importantes, provoquant ainsi la redistribution d’au moins une partie de l’azote total intracellulaire, ou Ctre excretes dans le milieu extracellulaire.

Bien que la connaissance de chacune de ces &apes soit fondamentale pour la comprehension du metabolisme azote, nous nous proposons de ne detailler ici que certains aspects de l’assimilation de l’azote.

2. - LES PRINCIPALES VOIES ENZYMATIQUES DE L’ASSIMILATION DE L’AZOTE

Lorsque l’azote est present dans les cellules sous forme d’ammonium, soit au terme dune reduction prtalable, soit apres absorption directe, il peut alors &tre assi- mile au sein du pool des acides amines intracellulaires.

Bien que des enzymes telles que l’alanine-deshydrogenase, l’aspartate-deshydro- gtnase et une troisibme voie mttabolique impliquant l’incorporation d’ammonium dans du carbamylphosphate aient tte tvoquees comme jouant un role dans l’assimila- tion de l’ammonium chez les vegetaux [23 1, il est desormais generalement admis [ 10, 15, 16, 23, 24, 291 que cet ion est assimile dans les acides amines des microalgues eucaryotes essentiellement par l’une des deux voies enzymatiques suivantes :

- celle catalysee par faction successive de la glutamine-synthetase (GS) et de la gluta- mate-synthase aussi appelee glutamine-oxoglutarate-aminotransferase (GOGAT) :

GS NH,+ + ATP + glutamate ----F glutamine + ADP + Pi + H,O

NAD(P) c 3 NAD(P)H glutamate + ou + glutamate f--- glutamine + a-cetoglutarate + ou + H+

rnxox GOGAT FDXred

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- ou celle catalysee par la glutamate-deshydrogenase (GDH) : GDH

a-cetoglutarate + NH,+ + NAD(P)H ---w glutamate + NAD(P)+ + H,O

Pour fonctionner, ces enzymes utilisent les formes rtduites de coenzymes speci- fiques telles que la NADH, la NADPH ou la ferredoxine (FDX) et de l’tnergie, essentiellement sous forme d’ATP. Dans chaque cas, la resultante du fonctionnement de ces deux voies enzymatiques est la production nette dune molecule de glutamate, grace a la consommation dune molecule d’a-cttoglutarate et d’ammonium.

Les autres acides amints sont form&, suite a cette production de glutamine et de glutamate, grace aux reactions de transamination [lo, 161.

3. - CARACTtiRISTIQUES PRINCIPALES DES ENZYMES CATALYSANT L’ASSIMILATION DE L’AMMONIUM CHEZ LES MICROALGUES

3.1. Glutamine synthktase

Deux isoformes de la GS (E.C. 6.3.1.2) sont connues : la GS, et la GS,. Chez les plantes suptrieures, il est clairement Ctabli que la GS, a une localisation cytosolique, alors que la GS, est chloroplastique. Chez les microalgues, deux isoforrnes simi- laires peuvent &tre distinguees et, en grande partie par analogie avec les plantes supe- rieure, la GS, est consideree comme &ant cytosolique, et la GS, comme &ant chloro- plastique [5, 111. Alors que plusieurs microalgues (Chlorella fusca, Phaedodactylum tricornutum) contiennent les deux isoformes, d’autres ne contiennent que la forme chloroplastique (Chlorella stigmatophora, Euglena gracilis). Un petit groupe ne contiendrait que la GS, [5]. Chez Chlorella pyrenoi’dosa, la glutamine synthetase a un poids moleculaire de 320 000 Da et semble &tre composeee de six unites d’un poids mokulaire de 53 000 Da [ 181.

3.2. Glutamate synthase

De mCme que chez les plantes superieures, il existe. au moins chez certaines algues eucaryotes (et peut-&tre chez toutes), deux enzymes glutamate synthase, l’une (E.C. 1.4.1.14) qui utilise la NADH comme reducteur, et I’autre (E.C. 1.4.7.1) qui utilise la ferredoxine [28]. L’enzyme NADP-dtpendante pourrait &tre cytosolique et principalement responsable de I’assimilation de l’ammonium nouvellement absorb& alors que l’enzyme ferredoxine-dependante pourrait &tre chloroplastique et respon- sable de la reassimilation de l’ammonium produit au tours de la photorespiration. L’enzyme NADH-dependante de Chlamydomonas a un poids moleculaire d’environ 370 000 Da, I’enzyme ferredoxine-dtpendante est une molecule de masse inferieure contenant probablement un groupe fer-soufre [28].

3.3. Glutamate dkshydrogknase

La presence de GDH a &te Ctablie chez de nombreuses espbces algales. Talley et al. [25] ont detect& deux isoenzymes de la GDH dans une souche thermophile de

M. Charpin - Les principaies voies enzymatiques de l’assimilation de I’azote 5

C~~~rellu ~yre~u~do~~. La premiere est consideree comme &ant NAD-d~pendant~ (E. C. 1.4.1.2) et a un rapport d’activite NADH/NADPH de 5 : 1, alors que la seconde est NADP-dependante (E.C. 1.4.1.4) et a un rapport d’activite NADH/NADPH de 1:33. Shatilov et Kretovih [20] ont montre l’existence de trois enzymes de la GDH chez la mc?me espece microalgale qui different par leur mobillite Clectrophoretique. Selon ces auteurs, coexisteraient une enzyme constitutive NAD-dependante et deux isoenzymes NADP-dkpendantes inductibles. Toutefois, aucune generalite ne peut &tre Cnoncee, dans la mesure ou les msultats obtenus par Shatilov et al. [21] chez sept especes de Chlorophyctes sont parfois divergents. 11 existe effectivement chez les sept espbces Ctudiees. une isoenzyme constitutive (utilisant indiff~remment la NADH ou la NADPH comme cofacteur) dont la presence ne depend pas de I’appari- tion de fortes concentrations en ammonium dans le milieu. Chez cinq de ces sept especes, existe une autre isoenzyme NADP~-d~pendante. Pour deux d’entre elles, cette isoenzyme est constitutive et pour les trois restantes, la NADP-GDH n’est syn- thCtis6e que lorsque les cellules disposent d’ammonium. Cela conduit Stewart et Rhodes [22] B emettre l’hypothese que l’existence de plusieurs formes de l’enzyme pourraient &tre associees B la compartimentation cellulaire et/au B une fonction phy- siologique. D’apres Falkowski [lo], il semble que les enzymes NADP-dependantes soient localisees dans les chloroplastes, alors que les enzymes NAD-dependantes seraient plutiit associees aux mitochondries.

Le poids mol~culaire de la GDH NADP-d~pendante de C~lo~el~a ~oro~i~iun~ [12] est de 290 000 Da, alors que les sous-unites ont un poids moleculaire de 48 000 Da, indiquant que l’enzyne est hexamerique. La GDH NAD-d~pend~te de cet orga- nisme (qui presente toutefois une certaine affinite avec la NADP) a un poids molecu- laire de 180 000 alors que les sous-unites ont un poids molCculaire de 45 000, indi- quant qu’au contraire cette enzyme est tetramerique.

4. - Rli)LES DES VOIES GS/GOGAT ET GDH DANS L’ASSIMILATION DE L’AMMONIUM

Avant la decouverte de la GOGAT chez les plantes superieures puis ehez Ies algues eucaryotes par Mi~in et Lea 1161, l’opinion g&&ale Ctait que l’azote Ctait incorpore dans les acides amines grace 2 l’action de la GDH. Depuis la confirmation de l’existence de la GS chez de nombreuses especes algales [8, 13, 16, 261 et de ses implications concernant l’existence de la voie GSIGOGAT, il est classiquement admis que cette derniere constitue la voie principale d’assimilation d’azote par les cellules phytoplanctoniques.

L’opinion selon laquelle l’assimilation de l’ammonium a prbferentiellement lieu par la voie GS/GOGAT plutot que par la voie catalysee par la GDH est fondee en partie sur la plus forte affinite de la GS pour l’ammonium que la GDH, et en partie sur les resultats obtenus grace a ~utilisation dun inhibiteur spgcifique de la GS.

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Les etudes sur les enzymes purifiees de Chlorella sorokiniana [ 121 ou Chlorella- pyrenoidosa [20] aboutissent respectivement a des valeurs de K, pour l’ammonium d’enzymes GDH NADP-dependantes de 69 mmol.L-* et 18 mmol.L-t ; Ahmed et al [4] rapportent des valeurs de K,,apparent de l’ordre de 4 a 10 mmol.L-t pour huit especes de microalgues marines. A titre de comparaison, la valeur de Km pour l’am- monium de la GS de Chlamydomonas sp. est seulement de 0,2 mmol.L-I [7]. La faible affinite de la GDH pour cet ion azote, confrontte aux concentrations intracel- lulaires et extracellulaires en ammonium gentralement mesurees en milieu naturel, a conduit a admettre que la GDH ne pouvait vraisemblablement pas jouer un role fon- damental dans l’assimilation de cet ion. Toutefois, d’autres etudes Ctaient indispen- sables pour confirmer cette hypothbse.

L’utilisation d’un inhibiteur irreversible de la GS sans effet sur la GDH [19] : la L-methionine-DL-sulfoximine (L-MSX) permet de dissocier les deux voies d’assi- milation de I’ammonium. Cullimore et Sims [7] ont montre que l’incubation de Chla- mydomonas reinhardii en presence de L-MSX pendant deux heures inhibait comple- tement l’activite GS et arretait completement l’assimilation d’ammonium chez cette espece. L’etude cinetique des pools intracellulaires de glutamine et de glutamate apres une perturbation du milieu de culture par ajout d’azote ou transfer? des cellules dans un milieu carence en cet element permet Cgalement de confirmer ce resultat. En effet, Turpin et Harrison [26] ont demontre chez Gymnodinium simplex qu’une aug- mentation de la teneur en ammonium du milieu se traduisait, a court terme, par une augmentation du pool interne de glutamine et par une diminution de celui de gluta- mate, traduisant ainsi une activite de la GS et rendant fort improbable l’intervention de celle de la GDH. Enfin, en utilisant simultanement la L-MSX, la separation par HPLC des acides amines intracellulaires et le marquage radioactif de ceux-ci g&e au t3N Zehr et Falkowski [30] ont demontre de facon indiscutable que puisque, dans toutes ;es conditions testees et m&me en presence de tres fortes concentrations intra- cellulaires en ammonium, le premier acide amine apparaissant dans la cellule Ctait la glutamine, la voie GS/GOGAT etait la seule voie d’assimilation de l’ammonium chez Thalassiosira pseudonana. L’ensemble de ces resultats a done conduit Syrett [24] a affirmer que chez les microalgues, la GDH joue un role essentiellement catabolique, i. e. elle catalyse la conversion du glutamate en cx-cetoglutarate et ammonium. Selon Hipkin et al. [ 141 et Clayton [6], cette fonction desaminatrice pourrait &tre particulie- rement importante dans la mesure oti elle permettrait a l’ammonium intracellulaire d’etre rtgCnCrC et recycle dans les fonctions cellulaires fondamentales en absence d’element nutritif azote dans le milieu extracellulaire.

Cependant, il existe des preuves que cette enzyme peut jouer un role dans l’assi- milation de I’ammonium chez certaines especes microalgales. En effet, Chlorella autotrophica peut assimiler l’amonium en presence de L-MSX grace a l’activite dune NADPH-GDH [l, 21. Peltier et Thibault [17], travaillant sur Chlamydomonas, ont egalement demontre que lorsque le carbone ne constituait pas un Clement limitant pour la photosynthese, la GDH pouvait &tre responsable dune assimilation non negligeable de l’ammonium, celle-ci pouvant meme representer jusqu’a 30 % de I’as- similation totale. Ces auteurs ont alors emis l’hypothese que, puisque I’assimilation dune molecule d’ammonium par la voie GWGOGAT necessite I’hydrolyse dune molecule supplementaire d’ATP par rapport a la voie GDH (cf. II), les cellules

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algales utilisent, dans ces conditions, la voie enzymatique Cnergetiquement la plus favorable pour assimiler l’azote, &servant ainsi leur pouvoir de phosphorylation a la fixation du CO,. Everest et Syrett 193 ont Cgalement demontrk que la GDH jouait un role dans t’assimilation d’azote chez Stichococcus bacillaris, qui presente en outre la particular&e de contenir une NADPH-GDH dont le Km pour l’ammonium (de l’ordre de I mmol.L-‘) est tres largement inferieur aux autres valeurs rapportees pour cette enzyme dans la litterature [4]. Encore plus &range est la demonstration de Ahmad et Heliebust [3] selon laquelle, au moins certaines cellules dune population de Sticho- coccus ~~c~~~~ris peuvent se developper en presence de L-MSX. De telles cellules ont une activite NADPH-GDH &levee et une activite GS faible mais discernable. Cette demiere maintient probablement un apport de glutamine suffisant pour la syn- these de proteines, bien que la principale voie d’assimilation de l’azote soit probable- ment celle catalyde par la GDH.

S.-CONCLUSIONS

Ces observations, ainsi que celles sur la distribution des isoformes de la GS, de la GGGAT et de la GDH, posent la question de savoir si l’assimilation de l’ammonium par la voie NADPH-GDH est correlee avec l’absence de GS et GOGAT fonction- nelle. 11 est clair que chez Stichocacus bacilluris, comme chez d’autres especes microalgales, l’activid des differentes enzymes metabolisant I’ammonium depend de la nature et de la concentration de la source d’azote utilisee pour la croissance. En effet, l’activite de la GDH NADP-dependante de cette microalgue est superieure dans les cellules cultivees en presence de nitrates ou en presence de faibles concentrations en ammonium f3, 97. Alors que des concentrations de I mmol.L-t de L-MSX inhi- bent presque completement l’assimilation d’ammonium par des cellules qui sont cul- tivees en presence d’ammonium, elles inhibent de fagon moins prononcde l’assimila- tion d’ammonium par des cellules cultivees en presence de nitrates [9]. Pour le moment, nous manquons d’etudes dans lesquelles les activites des differentes formes de la GDH, de la GS et de la GOGAT aient &te examinees chez la m&me espece cul- tivee, dans differentes conditions de regime nutritif azott?. De telles etudes semblent indispensables afin de clarifier le role de ces differentes enzymes.

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