Les toxines peptidiques dans les venins d'araignées

Les toxines peptidiques dans les venins d’araignbes

Pierre Escoubasl’, Sylvie Diochot*

L’Ctude des venins d’araignees est en plein essor, en raison du potentiel represent6 par les toxines de ces venins, pour l’etude des recepteurs cellulaires. Les venins d’araignees contiennent une variete de composes organiques et de proteines dans une gamme Ctendue de poids moleculaires. La pharmacologic des toxines peptidiques est extr& mement diversifiee ; les canaux ioniques membranaires sont cibles avec une haute affinite. Ces propriCtCs pharmacologiques apparaissent accompagnees d’une homogCnCit6 structurale et d’une conservation de leur squelette mokulaire.

1 Universite Pierre-et-Marie-Curie, Paris, France. ENS Laboratoire signaux endo- crines, 46, rue d’lJlm, 75230 Paris cedex 05. [email protected] 2 lnstitut de pharmacologic molkculaire et cellulaire, CNRS UPR411 Sophia-Antipolis, Valbonne, France.

D e longue date, les araignees figurent en bonne place dans l’imaginaire collectif, par leur

aspect souvent effrayant et leur venimosite. Malgre leur immense diver-site ecologique et taxonomique (40 000 especes environ), tres peu d’especes representent en fait un danger medical pour l’homme. Les araignees sont divisees en deux groupes principaux, labidognathes et orthognathes selon la position de leurs cheliceres. Chez les orthognathes, ou mygalomorphes, la grande taille des araignees n’est pas accompagnee en regle generale d’une activite toxique prononcee du venin, a l’exception des Atrax et Hadronyche (Hexathelidae) d’Australie, dont le venin et l’agressivite ont provoque de nombreux accidents, des T’echo- na (Dipluridae) et des Harpactirella (Barychelidae). C’est essentiellement chez les labidognathes (araignees c( evoluees >F) que l’on retrouve les araignees les plus dangereuses pour l’homme : Latrodectus (Theri- diidae), Loxosceles (Loxoscelidae), Phoneutria (Ctenidae) sont les principales responsables des accidents d’envenimation graves et docu- ment&. D’autres especes sont reputees dangereuses dans les familles Segestviidae (Segestvia), Age- lenidae (Tegenaria), Salticidae (Phidip- pus, Mopsus), Gnaphosidae (Mega- myrmecion, Herpyllus), Thomisidae Phrynarachne), Heteropodidae (Hete- ropoda, Polybetes), Clubionidae (Chi- racanthium) et Lycosidae (Lycosa). La verification de la realite de cette

dangerosite est souvent difficile et il faut egalement prendre en compte le polymorphisme des reactions a l’envenimation, propre a chaque individu, ainsi qu’une identification taxonomique souvent impos- sible. Seuls les trois genres Atrax, Latrodectus et Loxosceles sont recon- nus comme responsables de cas recenses de mortalite humaine. Cependant, toutes les araignees a l’exception dune famille (Ulobori- due) sont munies d’un appareil venimeux, et secretent done des neurotoxines destinees a la capture et a I’immobilisation de leurs proies. Ce sont ces toxines qui ont fait l’objet d’efforts de recherche soutenus dans la derniere decen- nie, en raison de leur affinite pour de nombreux recepteurs cellulaires. Les progres recents de la biologie moleculaire ont permis des avan- tees rapides dans l’identification, le clonage et l’expression de genes codant pour de nouveaux recepteurs. La comprehension du role physiologique de ces structures reste cependant souvent limitee par le manque de pharmacologic et l’absence de ligands specifiques permettant d’elucider l’implication des recepteurs dans des processus cellulaires complexes. Les toxines animales representent dans cette perspective une vaste source d’outils pharmacologiques pour le bio- chimiste. L’evolution a dote les animaux venimeux dun eventail de toxines ciblant les recepteurs de leurs proies avec une exquise sensi-

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bilite et une haute selectivite. L&u- de des venins permet done d’offrir de nouvelles perspectives en biologie et en pharmacologic moleculaire. Les venins d’araignees, dont l’etude est en plein essor, se rev& lent @ire une source extremement riche de nouveaux ligands, en particulier pour les canaux ioniques membranaires, grace a la presence de toxines polypeptidiques courtes, hautement reticulees par des ponts disulfure. Nous discutons ici l’etat des connaissances sur la biochimie des venins d’araignees, et les progres recents dans le domaine de la biochimie, de la structure et de la pharmacologic des toxines peptidiques.

1. Composition des venins d’araign6es Les venins d’araignees sont des systemes multicomposants dont la complexite est encore ma1 compri- se, en particulier du point de vue de l’interaction entre les differents composants et leur implication respective dans le phenomene de toxicite. On peut regrouper les composants des venins en trois grands compartiments chimiques : les composes organiques de faible poids moleculaire (< 1000 Da), les polypeptides de poids moleculaire 3 000-10 000 Da et les proteines de haut poids moleculaire (> 10 000 Da).

n 1.1. Constituants organiques et inorganiques

On trouve dans les venins des acides amines libres, des neurotransmetteurs (glutamate, aspartate, GABA, histamine, dopamine, serotonine, epinephrine, epinine), des amines biogenes (spermine, spermidine, putrescine, cadaveri- ne), des nucleotides (AMP, ADP, ATP, inosine), des acides (citrique, lactique, dihydroxyphenylace- tique), du glucose, et des ions (Ca2+, Na+, K+, Mg2+, Cl-) [16, 28, 36,80-82, 105, 106, 1271.

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Bien que le role exact de la plupart de ces constituants reste a determiner, il semble qu’ils puissent poten- tialiser l’action des toxines dans certains cas. 11 est egalement possible que le processus de collecte du venin entraine une degradation tissulaire, responsable en partie de la presence de certains de ces composants, souvent detect& a l’etat de traces. Une autre classe chimique, les acylpolyamines, a ete caracterisee pour la premiere fois dans les venins d’araignees [4-6, 122, 1231. Les acylpolyamines d’araignees sont constituees de l’assemblage d’une partie hydrophile, et d’une chaine hydrophobe. Celle-ci comprend de une a neuf unites aminopropyle, aminobutyle ou aminopentyle, avec la presence eventuelle de methylations ou d’hydroxylations, pour une longueur totale de 7 a 43 atomes. La chaine peut etre com- plexifiee par la presence d’acides amines internes ou a l’extremite de la chaine acyle. La partie hydrophile de la molecule est constituee d’un acide carboxylique aroma- tique de type acide benzoi’que hydroxyle, ou indoleacetique mono- ou di-hydroxyle. On recon- nait a l’heure actuelle cinq types structuraux de ces polyamines (A-E) [41]. La combinaison de ces differents elements represente de la part de l’araignee une veritable chimie combinatoire, resultant en une diversification des proprietes pharmacologiques des polyamines 1661. Toutes les polyamines contenant des acides amines ont ete d&rites chez les Araneidae 112,371; les acylpolyamines ne contenant pas d’acides amines ont ete d&rites dans differentes familles : Therupho- sidue (APQ,,~, Apt,,,) 113, 80-82, 1121, Dipluvidae, Ctenizidae, Ageleni- dae (a-agatoxines) 1921 et Pisauvidae (CNS2103) 1671. Ces toxines agissent comme antagonistes de differents sous-types de recepteurs ionotropiques au glutamate 1861. Certaines bloquent plus specifiquement les recepteurs de type NMDA (N-methyl-D-aspartate) ou AMPA (a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-

isoxazolepropionate). Les toxines agissent de facon voltage-dependante comme bloqueurs des canaux a l’etat ouvert, et l’hypothese d’un blocage par insertion de la toxine dans le pore du canal associe au recepteur a ete avancee 1271. Les acylpolyamines agissent a de multiples sites sur le recepteur au glutamate, mais egalement sur les canaux calcium dependants du voltage (Arg,,,, CNS2103) 1671. L’une d’entre elle (FIX : funnel web toxin) a permis la decouverte du canal calcium de type I’ dans les cellules de Purkinje du cervelet du rat 1621. Les polyamines agissent egalement sur les recepteurs nicotiniques a l’acetylcholine. Plusieurs articles recents presentent une synthese des travaux effect&s sur les polyamines, leur mode d’action, leur synthese chimique et leurs proprietes pharmacologiques 1271. Bien que certaines soient toxiques pour les vertebres, notamment en injection intracerebrale, il semble que les polyamines aient essentiellement une activite insecticide. En bloquant la conduction nerveuse dans la jonction neuromusculaire de l’insecte, ces toxines sont responsables d’une paralysie rapide des proies, souvent reversible, et permettent leur immobilisation. Nos propres travaux ont permis de deceler leur presence d’une facon variable dans les venins d’arai- g&es Theruphosidae, en particulier les mygales sud-americaines. Dans certains venins, elles representent le compartiment biochimique majoritaire, un profil rare chez les Theraphosidae [Escoubas, non publiel. Ces toxines semblent done faire partie de l’arsenal toxique glo- bal des araignees mais leur presence ou leur abondance relative, pourrait etre lice a l’ecologie des animaux et a une part plus ou moins importante des insectes dans le regime alimentaire, la plupart de ces toxines ne semblant pas avoir d’effet sur les vertebres lors de l’envenimation [31].

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n 1.2. Polypeptides courts

La majorite des toxines d’araignees identifiees jusqu’a present sont des proteines courtes, de poids moleculaire compris environ entre 3 000 et 8 000 Da, compactes et hautement reticulees par plusieurs ponts disulfure. Associees ou non avec des polyamines, ces peptides semblent former l’essentiel de l’arsenal toxique des araignees. Leur presence est aisement confirmee par chro- matographie liquide en phase inverse. Les profils d’elution des venins bruts permettent une identification immediate des differents constituants. Avec un gradient lineaire acetonitrile/eau en presence d’acide trifluoroacetique (pente 1 %/mm>, les polyamines forment un premier groupe d’elution, avec des temps de retention de 10-20 min environ. Les polypeptides sont clairement &pares en un deuxieme groupe, avec des temps d’elution de 20 a 50 min environ. Ce schema general d’elution a ete demontre dans de nombreux exemples decrits dans la litterature et nous avons pu egalement confir- mer sa generalite dans les venins d’araignees mygalomorphes 1321. Lutilisation dun detecteur a bar- rettes de diodes permet l’identification des polyamines grace a un spectre d’absorption UV caracteristique de leurs groupements aroma- t:ques. A ce jour, plus de 50 toxines peptidiques ont ete d&rites, toutes activites confondues (figure 1). Ces peptides semblent cibler plus parti- culierement les canaux ioniques membranaires. Leur action peut se traduire par un blocage de l’exocytose des vesicules presynaptiques contenant les neurotransmetteurs, et induire des modifications anor- males de la transmission synap- tique conduisant a une paralysie de type <c flasque )>. Ces peptides peuvent egalement provoquer une paralysie c< contracturante )) resultant dune activite de type paroxys- tique declenchee par des depolarisations excessives. Leur activite peut egalement montrer une specificite pour un groupe zoologique

particulier (insectes, vertebres). Les paragraphes suivants decrivent en detail leur structure et leur phar- macologie.

n 1.3. ProtCines

Celles-ci comprennent a la fois des toxines de haut poids moleculaire, et des enzymes. Hormis les venins a haut pouvoir necrotique comme celui de LoxosceZes, dans lesquels la presence d’enzymes a ete bien caracterisee, l’activite enzymatique d&rite dans les venins d’araignees doit etre consideree avec prudence. Des activites de type protease, hya- luronidase [105,1061, sphingomye- linase, phospholipase et isomerase ont ete mises en evidence, indi- quant la presence d’enzymes. Cependant, dans de nombreux cas la technique de collecte des venins doit @tre remise en cause et une eventuelle contamination par la salive pourrait expliquer les activites detectees. La digestion etant externe chez les araignees, la regurgitation de salive a haut pouvoir lytique permet la digestion des proies apres l’envenimation et suit immediatement la capture. La stimulation electrique des muscles des cheliceres, thoraciques et peri- cesophagiens, couramment utilisee pour la collecte des venins provoque egalement la regurgitation gastrique. Sans des precautions particulieres au moment de la collecte du venin, une contamination salivaire ou digestive est presque inevitable et pourrait expliquer certaines des activites enzymatiques d&rites, en particulier dans les travaux les plus anciens. Les resultats publies sont parfois contradic- toires, la presence de ces enzymes n’ayant pas ete detectee par certains auteurs 11141. L’activite hemolytique et dermone- crotique du venin de Loxosceles est due a la presence de sphingomyeli- nases D de poids moleculaire 35 kDa environ 11211. La presence de hyaluronidases dans les venins peut rep&enter un facteur de potentialisation des autres composants du venin, facilitant la pene-

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tration des toxines dans les tissus et les differents compartiments cellulaires. Le role exact de la plupart des enzymes dans l’activite des venins reste cependant a determiner. La presence d’une isomerase a ete mise en evidence dans le venin d’Agelenopsis aperta 11101. Cette enzyme catalyse l’isomerisation L+D d’un residu serine, dans la toxine o-agatoxine IVB. Bien que cet exemple soit le seul decrit dans la litterature, on peut penser qu’il n’est pas unique. Lisomerisation L/D de certains acides amines peut permettre une augmentation de la selectivite des toxines envers leur recepteur, et represente un mecanisme supplementaire de diversification moleculaire. La presence d’isomeres D dans d’autres toxines d’araignees semble probable mais ne peut @tre mise en evidence lors de la degradation d’Edman, classi- quement utilisee pour l’analyse de la structure primaire. 11 faut noter qu’aucun autre isomere D n’a ete mis en evidence dans les toxines peptidiques synthetisees a ce jour, et il reste done a prouver que ce mecanisme moleculaire soit general chez les araignees. Plusieurs toxines de haut poids moleculaire ont ete decouvertes chez les araignees. Dans le genre Latrodecttls (veuves noires), la haute neurotoxicite du venin pour les vertebres et les invertebres est due a la presence d’une famille de toxines appelees latrotoxines (PM > 110 kDa) 1381. La plus toxique pour les vertebres est l’a- latrotoxine qui provoque une liberation massive de neurotransmetteurs. Le mecanisme d’action moleculaire n’est pas completement elucide, et comporte deux composants. Dans le premier, calcium- independant, la toxine forme des canaux membranaires cationiques non-selectifs, qui permettent un flux de calcium et de petites molecules (glutamate, acetylcholine). Dans le deuxieme, la toxine se fixe sur la latrophiline, un recepteur proteique de la famille de la secre- tine et des proteines couplees aux

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A

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hanatoxin I ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS hanatoxin II ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS w-grammotoxine DCVRFWGKCSQTSDCCPHLACKSKWPRNICVWDGSV huwentoxin-I ACKGVFDACTPGICNECCPNRVCSDKHKWCKWKL SNX482 GVDKAGCRYMFGGCSVNDDCCPRLGCHSLFSYCAWDLTFSD PhTX2-9 SFCIPFKPCKSDENCCKKFKCKTTGIVKLCRW

w-agatoxine IVA KKKCIAKDYGRCKWGGTPCCRGRGCICSIMGTNCECKPRLIMEGLGLA w-agatoxine IVB EDNCIAEDYGKCTWGGTKCCRGRPCRCSMIGTNCECTPRLIMEGLSFA m-agatoxine 1 ECVPENGHCRDWYDECCEGFYCSCRQPPKCICRNNN m-agatoxine 2 ECATKNKRCADWAGPWCCDGLYCSCRSYPGCMCRPSS aptotoxine III CNSKGTPCTNADECCGGKCAYNVWNCIGGGCSKTCGY aptotoxine VII WLGCARVKEACGPWEWPCCSGLKCDGSECHPQ curtatoxine I SCVGEYGRCRSAYEDCCDGYYCNCSQPPYCLCRNNN curtatoxine II ADCVGDGQRCADWAGPYCCSGYYCSCRSMPYCRCRSDS PhTx3-2 ACAGLYKKCGKGASPCCEDRPCKCDLAMGNCICK PhTx3-1 AECAAVYERCGKGYKRCCEERPCKCNIVMDNCTCKKFISE Plectoxine IX CAKHSETCKNGNCCTCTQYRGKDEPMACRRGTHGQRCQCVMKIMKH aptotoxine I EIAQNLGSGIPHIRTKLPNGQWCKTPGDLCSSRSECCKAEDSVTYSSGCSRQWSGQQGTFINQCRTC~

aptotoxine IV EIPQNLGSGIPHDRIKLPNGQWCKTPGDLCSSSSECCKAKHSNSVTYASFCSREWSGQQGLFINQCRTC

CSTX-1 SCIPKHEECTNDKHNCCRKGLFKLKCQCSTFDDESGQPTERCACGRPMGHQAIETGLNIFRGLFKGKKK

-ESSMC

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Robustoxine CAKKRNWCGKNEDCCCPMKCIYAWYNQQGSCQTTITGLFKKC Versutoxine CAKKRNWCGKTEDCCCPMKCVYAWYNEQGSCQSTISALWKKC

PLTX-II ADCSATGDTCDHTKKCCDDCYTCRCGTPWGANCRCDYYKARCDT PhTXI-1 ATCAGQDKPCKETCDCCGERGECVCALSYEGKYRCICRQGNFLIAWHKLASCK PhTX2-6 ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK plectoxine V AVKCIGWQETCNGNLPCCNECVMCECNIMGQNCRCNHPKATNECES plectoxine VIII AVKCIGWQETCNGKLPCCDGCVMCECNIMGQNCRCNHPKMTSECGS plectoxine X GCKGFLVKCDSNSECCKTAIVKGKKKQLSCLCGAWGAGCSCSFRCGNRC plectoxine XI EVKCIGWQEYCRGNLPCCDDCVMCECNIMGQNCRCNHPRITSECGS

PhTx3-6 ACIPRGEICTDDCECCGCDNQCYCPPGSSLGIFKCSCAHANKYFCNRKKEKCKKA w-agatox.IIIA SCIDIGGDCDGEKDDCQCCRRNGYCSCYSLFGYLKSGCKCQCYNSDPDKCES

-HNKPKRR

PhTXl AELTSCFPVGHECDGDASNCNCCGDDVCGCGWGRWNCKCKCKVADQSYAYGICKDKVNCPNRHLWPAKVC

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w-agatoxine IA AKALPPGSVCDGNESDCKCYGKWHKCRCPWKWHFTGEGPCTCEKGMKHTCITKLHCPNKAEWGLNW-

EsTX BsTXl LpTXl

IFECVFSCDIEKEGKPCKPKGEKKCSGG-----------WKCKIKLCLKI IFECVFSCDIEKEGKPCKPKGEKKCSGG-----------WKCKIKLCLKI FFECTFECDIKKEGKPCKPKGC-KCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF

Figure 1. Structure primaire de quelques toxines d’araign6e.s. Les toxines sont groupkes par nombre de pants disulfure : 2 (A), 3 {S), 4 fC et D), 5 (E) 6 (F) et 7 (G), Les groupes H (w-agatoxine IA h&&odim&ique) et I (toxines BrachypelmaEurypelmallasiodora) repr&entent /es sfructures particuli&res. Dans chaque groupe les toxines sont alignees sw le doublet de cystkines central (gras) lorsque celui-ci est p&sent. (Rbfkences dans le texte).

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proteines G. Ce mecanisme calcium-dependant, conduit a une modulation positive de l’exocytose des petites vesicules synaptiques, et done a une liberation massive de neurotransmetteurs [22, 54, 611. Leffet macroscopique de l’action de la latrotoxine est done une paralysie contra&m-ante rapide, resultant de l’hyperstimulation des recepteurs post-synaptiques. On a egalement mis en evidence dans le venin de Latrodectus mactans tredecimguttatus, cinq toxines specifiques pour les insectes (a-, B-, y-, 6, et e-latroinsec- totoxines), et une toxine specifique des crustaces (a-latrocrustatoxine), de structure homologue mais de specificite variable. Toutes les especes du genre Latrodectus semblent partager un mode d’action commun de leur venin, et il est probable que des toxines similaires existent dans les venins d’autres representants de la famille des The- ridiidae. Lactivite pharmacologique du venin de Steatoda paykullianus, et de Steatoda capensis sur des preparations cardiaques de rat apparait similaire 2 celle de Latrodectus et suggere done la presence de toxines de meme mode d’action 1491. 11 existe peu de mentions d’autres toxines de haut poids moleculaire dans les venins d’araignees. Deux toxines insecticides de poids moleculaire 22 850 et 27 704 Da ont ete isolees a partir du venin de Filistata hibernalis (Filistatidae) 1421. D’autres proteines insecticides de poids moleculaire > 100 kDa ont egalement ete mises en evidence dans le venin de Phidippus audax (Saltici- due), mais la structure complete de ces proteines n’a pas encore ete rendue publique. Ces donnees montrent que la diversite de la bio- logic des araignees est accompagnee d’une diversite biochimique encore largement inexploree.

2. Pharmacologic des toxines peptidiques La purification des toxines peptidiques a partir des venins d’araignees a permis ces vingt dernieres

an&es l’etude electrophysiolo- gique, pharmacologique et structurale d’une grande variete de canaux ioniques. Les canaux ioniques sont des proteines inse- rees dans la bicouche lipidique de nombreuses cellules excitables ou non excitables. 11s forment des pores qui peuvent etre ouverts soit par une variation de potentiel membranaire (canaux ioniques dependants du voltage) soit par la liaison d’un ligand a un recepteur (canaux ioniques actives par les recepteurs). 11s controlent ainsi de facon selective les flux d’ions calcium (Ca2+), sodium (Na+) potassium (K+) et chlore (Cl-1 de part et d’autre de la membrane plasmique et generent une activite electrique qui se propage sous la forme de potentiels d’action. Les courant ioniques, en modulant la forme et la duree de ces potentiels d’actions, influent sur de nombreuses fonctions telles que le couplage excita- tion-contraction, la secretion d’hor- mones et de neurotransmetteurs, l’expression de genes. L’etude macroscopique des courants uni- taires au niveau dune cellule a ete developpee grace a la technique du patch-clamp et a permis de mettre a jour l’extraordinaire diversite de canaux ioniques responsables de fonctions physiologiques ou pathologiques. Les peptides de venin d’arachnides se sont aver& @tre d’excellents <c outils j) pour le clonage et la caracterisation fine des proprietes electrophysiologiques et pharmacologiques des canaux ioniques dans les cellules. L’enjeu, dans le domaine de la recherche fondamentale, est de trouver, parmi les toxines d’un m@me venin, celles qui sont les plus specifiques tout en ayant la meilleure affinite pour un seul canal ionique, afin de les utiliser comme outils pour la dissection fine des courants ioniques natifs des cellules.

n 2.1. Toxines et canaux calcium

On sait aujourd’hui que la plupart des araignees produisent dans leur venin des toxines actives sur les

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canaux calcium dependants du voltage. En controlant l’homeostasie calcique, les canaux calcium jouent un role fondamental dans les fonctions physiopathologiques cardiaques, musculaires et neuronales. 11s sont classes en plusieurs types en fonction de leur seuil d’activation, des proprietes cinetiques de leurs courants et de leur pharmaco- logie [15, 74, 116, 1241. Le courant Ca2+ de type T (transitoire) s’active pour de faibles depolarisations et s’inactive rapidement. Son role serait de moduler l’activite repetiti- ve de type pace-maker du cceur. Les autres types de courants Ca2+ s’activent pour de fortes depolarisations et se differencient en plusieurs sous-types. Les courants Ca2+ de type L (longue duree) tres represent& dans les cellules cardiaques, sont la cible d’antagonistes calciques de la classe des dihydropyridines (DHP) utilises dans le traitement des maladies cardio-vasculaires (hypertensions, angor). Le type N (neuronal), le type I’ (d’abord identifie dans les cellules de Purkinje), le type Q et le type R ont ete decrits dans les cellules des systemes nerveux central et peripherique (au niveau presynaptique) et sont essentiellement impliques dans la liberation de neurotransmetteurs. Dun point de vue structural les canaux calcium d&pendants du voltage sont form& de l’association dune sous-unite al qui forme le pore du canal et de sous-unites auxiliaires (a2, (3, y et 6 dans le muscle squelettique) dont le role est de moduler les proprietes cinetiques et electrophysiologiques des courants calcium. Les genes codant pour les sous-unites al ont 6t6 classes (classes A, B, C, D, E, F, G et S) en fonction de leurs homologies de sequences puis rattaches aux divers types repertories parmi les courants natifs. Le venin d’Age- lenopsis aperta (Agelenidae) a ete a l’origine de la decouverte des premieres toxines d’araignees actives sur les canaux calcium. Une polyamine @TX, la seule polyamine active sur un canal ionique dependant du voltage) a d’abord ete puri-

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free [62] ainsi qu’une serie de peptides, les o-agatoxines [l-3, 29, 71, 72,125] qui bloquent avec une affinite de l’ordre du nanomolaire et une selectivite plus ou moins grande les courants calcium a haut seuil d/activation de type L, I’, Q et N [17]. Ces toxines ont permis non seulement de caracteriser et de dif- ferencier les canaux calcium dans des cellules du systeme nerveux central, mais aussi de mettre en evidence un courant Ca2+ de type R, resistant a toutes les toxines connues a ce jour. Toutes ces toxines a l’exception de la FIX sont des peptides de 30 a 80 acides amines reticulees par 3 a 7 ponts disulfure. Les o-agatoxines ont et& classees en differents types selon leur activite sur les differents canaux Ca2+ (N, L, P/Q). Certaines sont tres specifiques comme les w-agatoxines de type I, II et IV qui bloyent respectivement les canaux Ca + de type L, N et I? 12, 1251. Les o-agatoxines de type III, moins selectives, bloquent de facon equivalente les canaux Ca2+ de type N et L [17,711.11 a ete montre que l’action de l’o-agatoxine IVA sur les canaux Ca2+ de type P/Q est dependante du voltage. Ces toxines ne bloquent pas le pore du canal mais modifient ses proprietes d’ouverture. Elles se lient de preference au canal a Y&at ferme (polaris@, sur un site externe proche du pore et leur liaison est defavorisee par de fortes depolarisations 1681. En plus de leur diversite d’action sur les sous-types de canaux Ca2+, les o-agatoxines ont des effets selectifs sur les canaux Ca2+ de certains groupes d’animaux (mammiferes/oiseaux/insectes). A titre d’exemple, les o-agatoxines IA et IIIA sont inactives respectivement sur les canaux Ca2+ de poulet et d’insecte 1881. A l’inverse, d’autres toxines comme les o-atracotoxines d’Hudronyche bloquent uniquement les canaux Ca2+ d’insecte [351. Ces toxines selectives suggerent l’existence de variants moleculaires de canaux Ca2+ dans differents phylums du regne animal.

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A la suite de la decouverte des o- agatoxines, une grande variete de peptides actifs sur les canaux calcium dependants du voltage ont ete purifies dans les venins d’arai- g&es mygalomorphes (o-grammotoxine SIA de G~ammostola spa- tu2ata 153, 69, 871, toxines PhTX de Phoneutria nigriventev [14,20,39], o- atracotoxines d’fluduonyche 1351) et araneomorphes (PLTX-II de Plec- treuvys t&is [641, SNX325 de Seges- tria floventina [751, DW13.3 de Fili- stata hibernalis [1171, toxines de Hololena cuvta [631). Une decouverte recente importante est celle de la toxine SNX482 (Neurex Corp.) dans le venin de la mygale Hystero- crates gigus [76]. Cette toxine represente le premier ligand du canal Ca2+ de type R et a permis d’etablir clairement l’identite moleculaire du courant calcium de type R (gene de la sous-unite alE) grace a une pharmacologic qui lui est specifique. Le mecanisme moleculaire d/interaction de la toxine avec le canal calcium reste encore inconnu. Le role de toutes ces toxines pour l’araignee pourrait @tre la paralysie musculaire de leur proie ou de leur agresseur par un blocage de l’en- tree de calcium responsable de la liberation de neurotransmetteurs au niveau presynaptique.

W 2.2. Toxines et canaux sodium

La decouverte des l.r-agatoxines, les premieres toxines d’araignees actives sur les canaux sodium est relativement recente 111 par rapport aux tres nombreuses toxines de scorpions decouvertes dans les annees 1980-1990. Ces toxines aug- mentent les flux cellulaires d’ions sodium par l’intermediaire des canaux Na+ dependants du voltage. Les cellules sont alors depolari- sees de facon intense et durable et il s’ensuit une stimulation neuronale presynaptique qui provoque une liberation massive de neurotransmetteurs. Ces toxines sont done responsables de symptomes graves qui surviennent lors d’envenima- tions par les morsures d’araignees des genres Phone&via, Atmx, Hadvo-

nyche, tels que paralysie contracturante, hypertension, deshydrata- tion intense, vomissements. Les canaux Na+ actives par le voltage majoritairement presents dans les neurones et les muscles sont responsables de la phase de depolarisation du potentiel d’action @‘A) et contribuent done de facon majeure a la genese et la propagation du PA dans les cellules excitables. Leur structure est similaire a celle des canaux Ca2+ (sous-unite al tetra- merique), et des sous-unites p auxiliaires modulent leurs proprietes electrophysiologiques 115, 65, 981. La tetrodotoxine (TTX), un bloqueur de type guanidine, a largement ete utilisee pour elucider la structure et le fonctionnement des canaux Na+ et a permis de les partager en deux grands groupes : les canaux Na+ TTX-sensibles (genes I, II, III, PNI, NaCh6 et SkMl) presents essentiellement dans le cerveau et dans le muscle squelettique, et les canaux Na+ TTX-insensibles presents dans le cceur (gene hl) et les neurones sensoriels des gan- glions peripheriques (gene SNS) 11261. Plusieurs sites de liaison pour des neurotoxines polypeptidiques de cones marins (CL-conotoxines), d’anemones de mer, et de scorpions (toxines a et p) ont ete cartogra- phi& sur les canaux Na+ dependants du voltage 121, 551. D’autres molecules de type alcalo’ide (batra- chotoxine, veratridine), des pyre- throi’des, la ciguatoxine et les breve- toxines de dinoflagelles, les anes- thesiques locaux, sont des bloqueurs ou des activateurs des canaux Na+ et agissent sur des sites differents de ceux des neurotoxines polypeptidiques. Les peptides d’araignees actifs sur les canaux Na+ dependants du voltage ont tous un mode d’action commun a celui des toxines a de scorpions ou des toxines d’anemones de mer. 11s ralentissent la phase d’inactivation des courants Na+ et empechent ainsi la fermetu- re du canal. 11s induisent done des potentiels d’action repetitifs et une liberation accrue de neurotransmetteurs au niveau des terminaisons


des nerfs moteurs. Les premieres toxines d’araignees dont l’activite pharmacologique a ete trouvee sur des canaux Na+ TTX-sensibles d’insectes sont les toxines d’Agelenopsis aperta (u-agatoxines) 11, 1111. Ce sont des peptides de 36-37 acides amines reticules par quatre ponts disulfure. D’autres toxines ont ete purifiees a partir du venin de Pho- neutria nigriventer (PhTx2) [71 et forment un groupe de peptides de 48-53 acides amines reticules par cinq ponts disulfure. Des etudes electrophysiologiques sur des preparations de muscle squelettique de batracien montrent leurs effets sur des canaux Na+ dependants du voltage 171. Enfin dans le groupe des Atrux et Hadronyche d’Australie, des mygales dont le venin possede une forte neurotoxicite pour l’homme [lOBI, on a identifie plusieurs toxines dont la structure et le mode d’action sont maintenant bien defi- nis 111, 1091. La Gatracotoxine Arl (robustoxine) d’Atrax robustus et la &atracotoxine Hvl (versutoxine) d’Hudronyche versutus different de quelques acides amines seulement et entrent en competition avec une affinite de l’ordre du nanomolaire avec les toxines a de scorpions sur des preparations de cerveau de rat ou de neurones d’insecte exprimant des canaux Na+ TTX-sensibles 177-791. Ces toxines partageraient done le site de liaison des toxines a de scorpions sur les canaux Na+ 1601. Enfin, une nouvelle toxine qui bloque les canaux Na+ TTX-insensibles exprimes dans les ovocytes de xenope vient d’etre decouverte dans le venin dune mygale, Prosha- palopus anomcllus (toxine 1). Ce peptide de 3 988 Da comporte des homologies de sequence avec les hanatoxines de Grammostola spatu- Mu actives sur des canaux K+. Cette toxine modulerait par ailleurs les proprietes d’ouverture des canaux Ca2+ de type T [70].

n 2.3. Toxines et canaux potassium

Les canaux K+ sont ubiquitaires et constituent la classe la plus diversi- free de canaux ioniques par leurs proprietes electrophysiologiques et structurales. Cette diversite a notamment ete mise en evidence par le clonage de nombreux sous- types (plus de 60 genes). 11s contribuent a la phase de repolarisation lors du potentiel d’action et sont responsables du maintien du potentiel de repos des cellules. 11s controlent ainsi la frequence et la duree des signaux electriques dans les cellules excitables 143, 89, 991. Cependant, la contribution des nombreux sous-types de canaux K+ clones dans les processus physiopathologiques apparait complexe compte tenu de leurs proprietes electrophysiologiques extremement differentes et de la grande variete de symptomes observes lors d’un blocage de leur fonctionnement chez l’animal in vivo. La decouverte des premieres toxines d’araignees bloquant une sous- famille clonee de canaux K+ dependants du voltage (Kv2.1) est tres recente t1181 et n’a fait que confir- mer la richesse et la diversite pharmacologique extreme des venins d’araignees. On peut penser que les toxines d’araignees qui bloquent les canaux K+ agissent en synergie avec les toxines canal Na+ pour depolariser de facon continue les membranes excitables et provoquer la liberation de neurotransmetteurs. L’ubiquite et la grande diversite de fonctions qui sont regulees par ces canaux en font des cibles privilegiees pour le develop- pement de nouveaux agents thera- peutiques et diagnostiques. Trois grandes classes de canaux K+ sont definies par leur structure : 1) les canaux K+ voltage-dependants sortants (Kv) et les canaux K+ actives par le calcium intracellu- laire (KCa) sont des tetrameres form& de l’association de quatre sous-unites cI a six segments transmembranaires ; une region conser- vee d’environ 20 acides amines contribue a la formation du pore


du canal (domaine I’) ; 2) les canaux K+ a rectification entrante (Kir) sont des t&ram&es dont les domaines ne comportent que deux segments transmembranaires et un domaine I’ ; et 3) les canaux K+ a deux domaines P insensibles au voltage, entrants ou sortants, clones tres recemment. Tous ces canaux peuvent etre modules par des sous-unites p ou des proteines auxihaires. Les canaux K+ sont la cible de nombreuses toxines animales, qui ont permis d’etudier en particulier certaines des sous- familles de canaux K+ clones a six segments transmembranaires : Kvl (scorpions, anemones de mer, serpents), KCa (scorpions et abeille), Kv3 (anemones de mer) [25, 95, 1071. Les toxines de venins d’araignees ont permis d’aborder tout recemment l’etude de nouvelles sous-familles de canaux Kv (Kv2 et Kv4) grace a l’expression des genes dans des systemes heterologues comme les ovocytes de x&nope ou bien les cellules de mammifere (type COS). On ne connait cependant aujourd’hui qu’un nombre reduit de toxines d’araignees actives sur ces canaux. Les hanatoxines de Grammostola spatulata, premieres decouvertes 11181, ont ete rapidement synthetisees par des techniques de recombinai- son genetique et ont permis la premiere caracterisation pharmacologique des canaux Kv2.1 [118-1201. Ce sont des peptides minoritaires dans le venin, qui ne possedent pas d’homologie de sequence avec d’autres toxines connues actives sur les canaux K+. Avec la decouverte des heteropodatoxines chez Heteropoda venatoria (araneomorphe) 11011 puis des phrixotoxines (PaTX) de Phrixotri- thus aurutus (mygalomorphe) [261 sont apparues les premieres toxines bloquant des canaux potassium de la sous-famille Kv4. Aujourd’hui, un faisceau d’arguments concernant la distribution tissulaire, les proprietes cinetiques et la pharma- cologie des canaux Kv4.2 et Kv4.3, permet d’affirmer qu’ils sont les constituants moleculaires du cou-

241

rant potassium-transitoire It01 caracterise dans les cellules cardiaques de mammiferes. Ce courant module la duree et la forme du potentiel d’action et joue un role important dans la physiologie cardiaque en contrebalancant le courant sodium entrant rapide dans la phase 1 du potentiel d/action. D’autres canaux potassium fortement exprimes dans le ceur tels que Kvl.4 et Kvl.5 ont ete proposes comme candidats potentiels de l’identite moleculaire du courant Itol, mais les heteropodatoxines et les phrixotoxines ont permis une identification sure de ses compo- santes moleculaires 126, 1011. Des etudes sur ECG in vivo chez la souris, lors de l’administration intra- veineuse de PaTxl, ont pu etablir un role des courants Itol dans la phase de repolarisation ventriculai- re cardiaque (figure 2). Le blocage des courants Itol par la PaTxl se traduit par une augmentation de l’intervalle QT et une diminution de l’amplitude de la composante rapide de l’onde T sur l’ECG. Les etudes electrophysiologiques montrent que le mode d’action du blocage des canaux Kv4 par ces toxines est identique a celui des hanatoxines, par un blocage prefe- rentiel du canal a l’etat ferme, et dependant du voltage [261. Le mode d’action des toxines d’araignees sur les canaux Kv est commun a celui de l’w-agatoxine IVA sur les canaux Ca2+ de type l? A l’inverse des toxines de scorpions qui bloquent les canaux K+ par occlusion du pore, les toxines d’araignees se lient sur des sites externes du canal et en modifient les proprietes d’ouverture [119, 1201. Les etudes detaillees du mode d’action de l’hanatoxine a l’aide de chimeres des canaux Kv2.1 ont permis d’etablir un modele moleculaire dans lequel plusieurs toxines se lient simultanement sur quatre sites externes equivalents. Linter- action hanatoxine-canal Kv2.1 se fait par l’intermediaire de residus hydrophobes et/au basiques situ& sur les boucles S3-S4 du canal. Les venins d’araignees apparaissent

b 0 Controle ; PaTxl (50 nM)

i

:k -60 -40 -20 0 20 40

0

Qp L 0

“0 N L 100 ms

-10 mV

430mvn

Potentiel test (mV)

B

50 ms

PaTxl (12 nmoles)

Figure 2. Exemple de /‘etude du mode d’action. (Aa) Effef de /a foxine PaTxf de Phrixotrichus auratus sur /a relation conductance-voltage des courants Kv4.2 enregisfres par /a fechnique du patch-clamp en configurafion cc//u/e enfiere dans des cellules COS fransfecfees. Courbe d’acfivafion normafisee femoin (0) et en presence de PaTxf (50 nM} (0). Hnhibifion du couranf Kv4.2 par PaTxl esf dependante du voltage. E//e se caracferise par un dep/acemenf de la courbe d’acfivafion vers /a droife. Le canal Kv4.2 esf bfoque preferenfiellemenf dans des zones de faibles depolarisafions (enfre -40 et t10 mV) et seulemenf parfiellemenf au tours de fortes depolarisafions (au-de/a de + 1OmV). (Ab) Traces du couranf Kv4.2 active a -10 mV a parfir dun pofenfiel de mainfien de -80 mV en absence (0) et en presence (0) de PaTxl (30 nM). La foxine PaTxl bloque rapidemenf 70 % du couranf Kv4.2 de facon reversible et ralenfif /es cinefiques d’acfivafion et d’inacfivafion du couranf, La concentration 9ui inhibe 50 % du couranf (IC50) esf de 5 nM. (6) Blectrocardiogramme (ECG) enregisfre chez la souris BALBlc au tours dune injection infravei- neuse de 12 nmoles de PaTxl. Sur /‘&CG temoin sent annotes : onde P [depolarisation afria/e), interval/e PR (conduction atriovenfricufaire), onde QRS (depolarisation venfriculaire), onde T bipha- sique (repolarisafion venfriculaire). La toxine PaTxf induif de facon dose-dependante une diminution de /‘amplitude de l’onde T (f/.&he) et un prolongemenf de /‘interval/e QT ainsi 9ue /‘apparition d’ex- trasystofes ventricufaires (rk). Cetfe augmentation de la repolarisation venfriculaire esf reversible.


done comme une source riche de nouveaux bloqueurs pour les canaux K+ et il ne fait aucun doute que les prochaines an&es vont &re marquees par un grand essor dans la decouverte de nouveaux outils pharmacologiques dans ces venins.

H 2.4. Toxines et rkepteurs postsynaptiques

Hormis les polyamines deja men- tionnees, le seul exemple de toxine polypeptidique d’araignee agissant sur un recepteur postsynaptique est celui de l’huwentoxine I, decouverte dans le venin d’une mygale asiatique Selenocosmia huwena 1591. La toxine bloque de facon irrever- sible la transmission de l’influx nerveux obtenu par stimulation indirecte de preparations musculaires de souris. Des enregistre- ments intracellulaires sur muscle de grenouille ont montre une reduction du potentiel associe a l’acetylcholine et une reduction de la probabilite d’ouverture des canaux ioniques associes au recepteur nicotinique de l’acetylcholine 11291. L’huwentoxine semble done partager le mode d’action des a- neurotoxines de serpents ou de cones.

n 2.5. SClectivitC des toxines

La selectivite des toxines peut inter- venir a trois niveaux : moleculaire (sous-types de recepteurs), cellulaire (differents tissus) ou organisme entier (vertebre/invertebre). La selectivite des toxines d’araignees envers differents organismes et en particulier leur specificite pour les insectes 181 represente un champ d’application potentiel des toxines en agronomie, par le biais de pathogenes genetiquement modifies. Cette specificite a ete demontree pour plusieurs toxines. Les u- agatoxines I et IV (Agelenopsis aperta> 11111, les curtatoxines I, II et III (Hololena curta) 157, 93, 1151 et les toxines DTX9.2, 10 et 11 (Diguefia canities) 19, 501 activent specifiquement les canaux sodium des insectes. De meme, les o-aga-

toxines IA, IIA et IIIA (Agelenopsis aperta) 12, 1251, les plectoxines V a XI (Plectreurys trisfis) 156, 941 et les o-atracotoxines (Haduonyche ssp.) 1351 sont des bloqueurs specifiques des canaux calcium d’insectes. 11 existe cependant une graduation des effets en fonction du sous-type de canal et de l’origine phyletique, comme l’ont demontre des etudes comparatives avec les w-agatoxines de type I 1881. Enfin, plusieurs toxines dont la cible moleculaire reste indeterminee ont ete isolees en fonction de leur activite insecticide : aptotoxines I B IX (Aptostichus schlingeri) 11131, CSTXl (Cupiennus salei) 1521, toxine TX4(6-1) (Phoneu- tria nigrivenfer) [331, toxines de Tegenaria agrestis (NPS326, NPS331, NPS373) 1511, Segestria sp. (peptide A) 1441, de Calisoga sp. (peptides A,B,C) [451 et de Filistata hibernalis (FIL376,377,501 et 502) 1421. Les relations entre le degre de specificite des toxines envers des insectes ou des vertebres et leur structure primaire n’ont pas ete elucidees. Les poids moleculaires de ces toxines varient de 3 300 a 27 000 Da et les determinants moleculaires de la specificite restent pour l’instant inconnus.

3. Structure et biologie molhlaire des toxines

H 3.1. Structure primaire et structure spatiale

Comparativement aux informa- tions concernant d’autres groupes animaux, relativement peu d’infor- mations structurales ont ete obte- nues a ce jour sur la structure spatiale des toxines polypeptidiques d’araignees. Les deux dernieres annees ont cependant vu la publi- cation de plusieurs structures, affi- nant notre comprehension de cette organisation spatiale : o-agatoxines IVA 1961 et IVB 11281, l.t-agatoxine-I 1831, o-atracotoxine-Hvl 1351, 6- atracotoxines ArI (robustoxine) 1851 et HvI (versutoxine) 1341, huwentoxine-I [90, 911. Les structures determikes experimentalement

par RhJN (resonance magnetique nucleaire) permettent en outre de construire des modeles moleculaires fiables pour des toxines apparent&es (y-agatoxine-IV par exemple). Les toxines peptidiques d’araignees etudiees se conferment a un motif structural en triple feuillet B antiparallele, stabilise par plusieurs ponts disulfure formant un (< nceud )b interne de cysteines (figure 3). Quatre elements structuraux sont presents : un premier feuillet PI connect6 a un feuillet PI1 par un coude ou une courte helice 310, un coude B et un troisieme feuillet BIII. Pour les toxines a trois et quatre ponts disulfure etudiees, les ponts disulfure sont conserves au sein d’une sequence consensus cx cx c x c x cx I 3-7 II 4-6 III O-5 IV l-4 V 4- i3CW, dans laquelle l’appariement des cysteines se fait selon le motif I- IV, II-V et III-VI. Les cysteines et les chaines laterales de residus adja- cents aux cysteines forment un (< coeur j) globulaire et hydrophobe, alors que la majorite des autres residus forme une surface exposee au solvant. Le squelette moleculaire est fortement stab&se par les ponts disulfure, le pont III-VI pas- sant a l’interieur d’un anneau forme par le squelette peptidique et les ponts I-IV et II-V pour consti- tuer le <c nceud >> de cysteines. Dans les toxines a quatre ponts, un pont supplementaire, independant du nceud de cysteines, est forme soit dans une boucle (w-agatoxine IVA) soit entre une boucle et l’extremite C-terminale (robustoxine). Ce repliement caracteristique est determine par la presence des ponts disulfure, et sa stabilite est determinee par la presence conco- mitante des ponts disulfure et des feuillets B. 11 represente l’une des conformations globulaires les plus compactes et les plus stables pour une proteine de cette taille. Ce squelette moleculaire est organise pour permettre une exposition maximale au solvant des residus formant la chaine polypeptidique, et optimise done leur presentation envers la surface d’un recepteur. Ce type de repliement (knottin fold) est

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1999) IO,2 243

w-agatoxine IVA o-atracotoxine Hvl

Satracotoxine ArI (robustoxine) b-atracotoxine HvI (versutoxine)

Figure 3. Structure spatiale de quelques toxines d’araignhes : w-agatoxine /VA [96], w-atracotoxine Hvl[35], Gatracotoxine Art (robustoxine) 1851 et 6 atracotoxine Hvl (versutoxine) [34]. Les structures ont Bt& prbpakes avec le programme Rasmol, B park de cdordonnkes d6poskes dans la base de donnke PDB (http ://molbio.info.nih.gov/cgi-bin/pdb/doc/mrus/searching. html).

retrouve egalement dans les toxines de gasteropodes marins venimeux (cones) [731, et dans de nombreux inhibiteurs de proteines presents dans les plantes, ainsi que dans un peptide inhibiteur du gout, la gurmarine. Cette structure semble caracteriser des proteines possedant des proprietes inhibi- trices envers un recepteur (toxines) ou une enzyme 183,841. Les toxines de ce type possedent de facon constante plusieurs zones de surface, chargees positivement ou negativement, ainsi qu’une region

hydrophobe. Ces zones sont proba- blement importantes dans l’interaction avec le recepteur, bien qu’a ce jour la nature exacte des residus impliques dans les interactions toxine-recepteur n’ait pas et6 eluci- dee. De facon remarquable, les variations de structure primaire supportees par ce squelette moleculaire permettent d’accommoder une variabilite pharmacologique tres importante. Dans le groupe des molecules deja etudiees, les o-agatoxines et w-atracotoxines bloquent specifiquement les canaux calcium

presynaptiques actives par le voltage, les &atracotoxines et CL-agatoxines sont des activateurs des canaux sodium voltage-dependants sensibles a la tetrodotoxine, et l’huwentoxine-I est un bloqueur des recepteurs postsynaptiques a l’acetylcholine. Parmi les toxines d’araignees dont la structure primaire est en concor- dance avec ce modele structural mais dont la structure tridimensionnelle n’a pas encore et6 deter- mince, on retrouve des toxines bloquant les canaux potassium volta-


ge-dependants de type Kv2.1 (hanatoxines), Kv4.2 et Kv4.3 (heteropodatoxines, phrixotoxines), d’autres toxines actives sur les canaux calcium (o-grammotoxine SIA, SNX325) et sodium (u-agatoxines, DTX9.21, ainsi que des toxines dont la cible moleculaire reste inconnue a ce jour (BsTX5, plectoxines). De facon interessante, ce motif structural est retrouve pour des toxines d’araignees orthognathes (mygalomorphes) et labidognathes (araneomorphes), montrant une grande conservation structurale au tours de la phylogenese. La majorite des toxines d’araignees decouvertes a ce jour semble se conformer h ce modele structural, caracterise par le doublet central de residus cysteine, et trois ou quatre ponts disulfure. La seule toxine possedant seulement deux ponts disulfure est un peptide insecto- toxique (SIT) present dans le venin de Segestria florentina, de poids moleculaire 3 988 Da [1001.11 existe egalement un certain nombre de toxines de plus grande taille, de 60 a 80 acides amines environ, possedant de 8 a 14 cysteines appariees en ponts disulfure (aptotoxines, CSTXI, o-agatoxine IIIA, PhTXl). La presence dans ces peptides du doublet Cys-Cys central semble indiquer une homologie structurale dans cette famille, et la presence de ponts supplementaires pourrait @tre attribuee a la stabilisation de chaines polypeptidiques plus longues. Cela demeure hypothe- tique car aucune de ces toxines n’a fait a ce jour l’objet d’etudes structurales. 11 sera done interessant de determiner si le <c nceud >> de cysteines et le cceur hydrophobe de la toxine sont conserves, ainsi que le repliement en triple feuillet, les ponts supplementaires stabilisant la chaine dans un repliement similaire a celui des toxines courtes, ou si les toxines adoptent un repliement spatial different. 11 existe par ailleurs plusieurs toxines d&rites dont la sequence differe de ce modele. Lo-agatoxine IA est caracterisee par une chaine

polypeptidique heterodimerique constituee d’une cha^me longue de 66 acides amines et d’une chaine courte de trois acides amines (Ser- Pro-Cys), reliees par un pont disulfure 11021. Cette toxine est la seule pour laquelle ce motif ait ete decrit. La chaine la plus longue presente done la particularite de posseder un nombre impair de residus Cys. 11 semble cependant probable que cette structure dont la determination est delicate, puisse etre retrouvee pour d’autres toxines possedant un nombre impair de residus Cys, comme l’o-agatoxine IB ou les toxines actives sur les canaux calciques de Hololena curta. Les toxines a trois ponts disulfure presentes en series homologues dans les venins de mygales d’Am& rique centrale, des genres Brachy- pelma 130, 461 et Eurypelma 1103, 1041, ne possedent pas le doublet central de cysteines. Cependant, l’etude de BsTXl, la toxine majoritaire du venin de Brachypelma smi- thi a montre que l’appariement des ponts se faisait selon le motif conserve I-IV, II-V et III-VI 1461. La structure tridimensionnelle de cette toxine est encore indeterminee. Ces toxines sont caracterisees par une moindre toxicite contre les verte- b&s et une succession de symptomes caracteristiques (mou- vement giratoire, convulsions, mortalite), apres injection intracerebrale chez la souris [Escoubas, non publie]. Leur recepteur reste cependant inconnu a ce jour. On retrouve les memes symptbmes toxicologiques pour la toxine LpTXl , composant peptidique majoritaire du venin de Lasiodova parahybana, une mygale bresilienne [311. LpTXl montre une forte homologie de sequence avec les toxines de Brachypelma et Euypel- ma, mais se caracterise par l’addition dun segment de dix acides amines supplementaires en position interne et de deux residus Cys additionnels. Le role exact de cette sequence supplementaire reste indetermine du fait du manque d’information pharmacologique sur ce groupe de toxines, mais la


presence de residus charges positivement (5 Lys) permet d’avancer l’hypothese d’un role de cette boucle supplementaire dans l’interaction avec le recepteur et la modulation des proprietes toxiques du peptide. L’etendue des connaissances actuelles ne permet pas encore de relier structure des toxines et mode d’action, comme cela a pu etre fait avec les toxines de scorpion. Les toxines <c courtes FX a trois ou quatre ponts disulfure se lient a differents types de canaux ioniques (Na+, Ca2+ et K+), avec des affinites et des specificites variables. Des travaux recents ont egalement montre que ces toxines de structure spatiale identique, etaient capables de reconnaitre des recepteurs differents tels que des canaux ioniques de selectivite differente 1581, sugge- rant une conservation importante des structures fonctionnelles de ces canaux lors de la phylogenese. Pour les toxines plus longues de type o-agatoxines III, on n’a sim- plement jusqu’a maintenant identifie que des activites contre les canaux calcium dependants du voltage. Bien que ces resultats frag- mentaires ne permettent pas de conclusion g&kale, il demeure possible que la complexite crois- Sante de la structure des toxines puisse @tre correlee avec une plus grande specificite envers certains types particuliers de recepteurs membranaires, en particulier les canaux Ca*+.

W 3.2. Structure gCnCtique

Peu de travaux ont explore la structure des genes codant pour les toxines d’araignees. Les genes codant pour plusieurs toxines canal calcium ou sodium (Phoneu- tria Tx2-1, w-agatoxine IA, Plectueu- ys PITX, DTX9.2 de Diguetia canities) apparaissent relativement semblables 124, 47, 48, 50, 561. 11s correspondent B des proteines com- prennant, en position N-terminale, un peptide signal de 17 a 20 acides amines, homologue pour une m@me serie de toxines, puis un pro-

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peptide de 13 a 44 acides amines souvent riche en residus glutamate, suivi de la sequence codante pour la forme mature de la toxine. On trouve souvent en position C-terminale, plusieurs residus suppl& mentaires qui seront excises lors de la maturation de la toxine. Un role dans le repliement de la toxine ou dans une modification post-traductionnelle de l’extremite C-terminale a ete suggere pour ces acides amines. La sequence-signal contient un site consensus de clivage par une pepti- dase, et une intervention possible du propeptide dans les modifications post-traductionnelles ou dans le repliement de la toxine a egalement ete suggeree [561.

H 3.3. VariabilitC structurale et kvolution mol&ulaire

De nombreux venins n’ayant fait l’objet que d’une exploration t&s partielle, souvent guidee par un certain type d’activite biologique, il est interessant de tenter d’obtenir une perspective plus g&k-ale de la diversite structurale des venins. Le cas le mieux decrit dans la litterature est celui d’Agelenopsis aperta, une araneomorphe (Agelenidae), dans le venin de laquelle ont ete identifiees polyamines (a-agatoxines) et toxines polypeptidiques de differents types (o-agatoxines de type I, II, III et IV et u-agatoxines), dont la longueur et le nombre de ponts disulfure est variable. L’autre espece dont le venin a ete explore avec le plus de detail est Phoneutria nigriuentev (Ctenidue) [18,19,23,97], qui possede des toxines de structure similaire. Dans le but de determiner la distribution des differents types de toxines dans un groupe d’araignees, nous avons mene une etude structurale par HPLC (high performance liquid chromatography) et spectrometrie de masse MALDI- TOF (matrix-assisted laser desorption- ionization time-of-flight), dans laquelle les profils des venins de 55 especes de mygales (mygaIo- morphes Theraphosidae) ont ete rea- lises 1321. L’analyse des profils

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chromatographiques a montre la presence conjointe de polyamines et de peptides dans certaines especes, mais une preponderance globale des toxines peptidiques dans la plupart des venins. Une analyse detaillee des profils de poids moleculaires obtenus par spectrometrie de masse montre une distribution bimodale pour environ 1 500 peptides identifies. Toutes espPces confondues, les poids moleculaires se repartissent autour de deux classes principales, cent&es respectivement sur les masses 4 0004 500 et 6 500-7 000. Les peptides de poids moleculaire 3 5004 500 sont les constituants majoritaires de ces venins. Ces resultats sont compatibles avec les structures des toxines peptidiques identifiees dans d’autres venins, correspondant aux deux grands groupes de toxines courtes a trois ou quatre ponts disulfure d’une part (masse environ 4 000 Da) et a quatre ponts disulfure et plus, d’autre part (masse 6 500 Da et plus). Dans la famille des Therupho- sidae, la diversite pharmacologique des venins d’araignees s’accom- pagne globalement dune certaine homogeneite structurale, peut-@tre fondle sur la presence d’un type de repliement commun, bien que cette hypothese reste speculative. On peut egalement faire l’hypothese que ce modele soit applicable a d’autres familles, a l’examen des don&es de la litterature. Considerant cette relative homogeneite structurale, la diversite pharmacologique de ces toxines reste remarquable. Les araignees semblent avoir adopte au tours de leur phylogenese, un modele d’evolution moleculaire similaire a celui des mollusques gasteropodes venimeux de la famille des Conidae (cones). Chez les cones, un squelette moleculaire unique identique a celui des arai- g&es, est conserve et la diversification pharmacologique est accom- plie par hypermutation des residus situ& entre les cysteines qui defi- nissent le squelette moleculaire. La faible homologie de sequence

observee pour les toxines d’araignees de structure proche mais dont les cibles moleculaires sont distinctes semble faire appel au meme mecanisme evolutif. Chez les cones, seul le peptide mature est ainsi modifie, le reste de la sequence codee par le g&tome restant relativement inchange. On observe done une veritable chimie combinatoire, bake sur un squelette conserve, et conduisant a une specificite et a une diversification pharmacologique tres poussees. On observe egalement dans les venins d’especes voisines ou dans une meme espece, la presence de toxines hautement homologues ne differant que par un nombre res- treint d’acides amines (toxines de Brachypelma, Eurypelma, Lasiodora, hanatoxines, agatoxines). Ces mutations ponctuelles vont permettre un contrble fin de l’affinite des toxines envers leur recepteur. Comme decrit plus haut, un autre mecanisme de diversification moleculaire est l’addition d’une sequence interne, ne modifiant pas le squelette mais permettant de modifier notablement les proprietes electrostatiques de la toxine par addition de nombreux residus charges (BsTXl, LpTXl). Une autre strategie evolutive est l’isomerisation D/L qui a ete demontree pour l’o-agatoxine IVB (ou o-agatoxine-TK) [llO]. La presence d’un acide amine D permet de modifier de facon ponctuelle la structure d’une toxine, et semble resulter d’une modification post- traductionnelle, due a l’intervention dune isomerase. Une etude menee sur les deux isomeres o- agatoxines IVB et IVC a montre l’importance de l’isomerisation pour la selectivite de la toxine et sa stabilisation par rapport a la pro- teolyse enzymatique 1401. D’autres modifications post-traductionnelles ont ete d&rites chez les araignees. La presence dune amidation C-terminale est relativement courante. Une modification plus rare, d&rite pour la toxine PlTX-II de Plectreurys t&is, est la presence d’un groupement O-pal-


mitoyl sur le residu threonine- amide C-terminal [lo], modifiant significativement l’encombrement sterique, l’hydrophobicite et les proprietes de surface de la toxine.

Conclusion L’ensemble de ces mecanismes permet aux araignees la production d’un bouquet complexe de neurotoxines, et la formation de venins de haute efficacite comme l’attes- tent les analyses structurales et bio- logiques. Cela offre en retour l’avantage d’une diversite pharmacologique extremement complete, permettant de cibler avec precision de multiples sous-types de recepteurs presents dans le systeme nerveux central. Cette complexite represente done un avantage evolutif certain, par la production dun arsenal neurologique complet, permettant la capture d’un &entail de proies tres diversifie. Pour le pharmacologiste, ces venins se presentent done comme une source d’outils d’une tres grande richesse biochimique, qui per- mettront l’exploration des mecanismes les plus intimes du fonctionnement des cellules excitables, et la comprehension des interactions ligand-recepteur au niveau moleculaire.

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Les toxines peptidiques dans les venins d'araignées