LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4docnum.univ-lorraine.fr/public/INPL/2006_LARBAT_R.pdf · 2016-12-13 · Catherine Larrière mes deux secrétaires préférées

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Unité mixte de recherche INPL-INRA

Agronomie et environnement

Contribution à l’étude des P450

impliqués dans la biosynthèse des

furocoumarines

Thèse en vue de l’obtention du grade de

Docteur de l’INPL mention sciences agronomiques

Présentée par

Romain Larbat

Mémoire soutenu publiquement le 30-05-2006 devant un jury composé de :

- Dr. D. Werck-Reichhart (CNRS- IBMP, Strasbourg ) Rapporteur

- Pr. C. Jay-Allemand (Université Montpellier II) Rapporteur

- Pr. P. Dizengremel (INRA-UHP, Nancy) Examinateur

- Pr. J.L. Goergen (CNRS-INPL, Nancy) Examinateur

- Pr. F. Bourgaud (ENSAIA-INRA, Nancy) Directeur de thèse

- Dr. E. Gontier (ENSAIA-INRA, Nancy) Co-directeur de thèse

1

Remerciements

Je tiens à remercier le Pr. Sylvain Plantureux, directeur du laboratoire agronomie et environnement, de m’avoir accueilli au sein de son équipe

Je remercie bien évidemment le Pr. Frédéric Bourgaud qui m’a accordé toute sa confiance en me proposant ce projet de thèse en dépit d’un classement en DEA « assez moyen ». Durant ces trois ans et demi, j’ai énormément apprécié sa façon d’encadrer, me laissant une grande autonomie dans mon travail, tout en se rendant disponible en cas de besoin. Je le remercie en particulier de m’avoir fait confiance et avoir soutenu financièrement le développement d’une plate-forme de modélisation au laboratoire.

Je remercie également le Dr. Éric Gontier et le Pr. Jean-Louis Goergen, mes deux co-directeurs de thèse, pour leurs conseils avisés et leur disponibilité.

J’aimerais exprimer toute ma reconnaissance à Madame Danièle Werck-Reichhart, directrice de recherche à l’IBMP de Strasbourg, à Monsieur Christian Jay-Allemand, professeur à l’université de Montpellier II, ainsi qu’à Monsieur Pierre Dizengremel, professeur à l’UHP de Nancy, pour avoir accepté de juger mon travail.

Un grand merci au Dr. Alain Hehn, le « Monsieur bio mol » du labo, pour tous ces coups de main, tous ces conseils, ainsi que sa disponibilité d’écoute et son positivisme qui m’ont souvent permis de repartir de l’avant lors de mes instants de doute.

Je remercie tous les stagiaires avec qui j’ai pu travailler : Cuong Nguyen et Vincent Sauveplane, dans le cadre d’un stage de DEA, ainsi que Terence Courbariaux et Violaine Raffot, lors de stages d’orientation professionnel et de BTS, qui ont contribué à la caractérisation de mutants de CYP73A32 et aux développement des modèles 3D.

Je tiens également à remercier l’ensemble des personnes que j’ai pu côtoyer au cours de ces trois ans et demi passés au laboratoire, en particulier le Dr. Emmanuel Guédon pour ces discussions sur notre beau pays rochefortais et pour ces nombreux conseils en biologie moléculaire, Thamara Olivier et Catherine Larrière mes deux secrétaires préférées ainsi que Chantal et Denise les tornades blanches du mercredi matin.

J’adresse un grand merci à tous mes amis de la Thésard Valley et d’ailleurs, pour tous ces bons moments de franches rigolades avant, pendant et surtout après le boulot :

2

- Cinzia et Reine, toutes deux fraîchement diplômées qui m’ont fait découvrir les merveilleux paysages et les délices culinaires du Piémont et du Liban.

- Les « tout jeunes » : Camille, Flore, Robert, Grand Seb, Michael, Boris et Dao à qui j’adresse tous mes vœux de réussite.

- Tous les jet-setters de la rue Drouin : David, Jim, Rami, P’tit Ben, Fredo et les autres…

- Un merci tout particulier à Sandrine et Seb, mes deux collocs, pour ces deux années de vie en communauté pleine de complicité et de bonne humeur.

J’exprime enfin, mes plus tendres remerciements à mes parents et mes amis saint laurentais pour leur soutien constant et leur générosité sans limite.

3

Table des matières

Remerciements……………………………………...……………………...1 Table des matières…………………………………………...……………..3 Abbréviations…………………………………………………...………….8 Nom vernaculaire des espèces citées………………………......…………10

Chapitre I : Synthèse bibliographique et présentation des objectifs de recherche………………………....…………11 1 LES FUROCOUMARINES ................................................................... 11

1.1 Nature................................................................................................ 11 1.2 Distribution ....................................................................................... 12 1.3 Rôle écologique................................................................................ 12 1.4 Propriétés biologiques .................................................................... 13

1.4.1 Interaction avec les macromolécules .......................................... 13 1.4.2 Photooxydation et photolyse ....................................................... 16 1.4.3 Activation de la mélanogenèse ................................................... 16 1.4.4 Activité antiproliférative ............................................................... 17 1.4.5 Phototoxicité ............................................................................... 17

1.5 Biosynthèse et stockage des furocoumarines linéaires............... 19 1.5.1 Voie de synthèse des phénylpropanoïdes .................................. 19 1.5.2 Voie de synthèse des furocoumarines linéaires.......................... 21 1.5.3 Stockage dans la plante.............................................................. 22 1.5.4 Inductibilité de la synthèse .......................................................... 23

2 RUTA GRAVEOLENS ET AMMI MAJUS : DEUX PLANTES PRODUCTRICES DE FUROCOUMARINES............................................................................. 25

2.1 Description botanique ..................................................................... 25 2.1.1 Ruta graveolens .......................................................................... 25 2.1.2 Ammi majus ................................................................................ 26

2.2 Intérêt de ces deux modèles pour l’étude de la voie de synthèse des furocoumarines................................................................. 26 2.3 Synthèse des furocoumarines par les cultures in vitro ................ 27

3 LES CYTOCHROMES P450 ............................................................... 29 3.1 Définition........................................................................................... 29 3.2 Classification .................................................................................... 29 3.3 Cycle catalytique .............................................................................. 30 3.4 Origine du pouvoir réducteur.......................................................... 32 3.5 Diversité et évolution des P450....................................................... 33 3.6 Rôles des P450 végétaux................................................................. 35

3.6.1 Rôles des P450 dans les voies de biosynthèse .......................... 35 3.6.2 P450 et dégradation de composés exogènes ............................. 38

3.7 Structure des P450........................................................................... 39 3.8 Etude des relations structure-fonction des P450 .......................... 42

4

3.8.1 Modélisation par homologie ........................................................ 43 3.8.2 Mutagenèse dirigée..................................................................... 44

3.9 P450 et inactivation autocatalytique............................................... 45 3.9.1 Les inactivateurs autocatalytiques : définition ............................. 45 3.9.2 Caractérisation d’un MBI............................................................. 46 3.9.3 MBI de P450 ............................................................................... 47

4 LA CINNAMATE-4-HYDROXYLASE..................................................... 48 4.1 Description de la famille des CYP 73.............................................. 49 4.2 Les C4H de type II ............................................................................ 49 4.3 Expression et régulation de la C4H ................................................ 50 4.4 Modification de l’activité C4H in vivo ............................................. 51 4.5 Caractérisation biochimique ........................................................... 54 4.6 Inhibition de la C4H.......................................................................... 55

5 . OBJECTIF DE THESE : ETUDE FONCTIONNELLE ET CLONAGE DE P450 DE LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES FUROCOUMARINES ................................ 55

Chapitre II: Matériel et méthodes……………………….59 1 MATERIEL ...................................................................................... 61

1.1 Matériel végétal ................................................................................ 61 1.2 Souches bactériennes ..................................................................... 61 1.3 Souches de levure............................................................................ 61 1.4 Vecteurs ............................................................................................ 61 1.5 Plasmides recombinants ................................................................. 64

2 MILIEUX DE CULTURE ...................................................................... 65 2.1 Milieux de culture pour bactéries ................................................... 65 2.2 Milieux de culture pour levures....................................................... 66

3 METHODES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE............................................ 66 3.1 Amplification d’un fragment d’ADN par PCR................................. 66 3.2 Électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose....................................... 67 3.3 Extraction d’ADN à partir d’un gel d’agarose ................................ 67 3.4 Digestion par des enzymes de restriction...................................... 67 3.5 Ligations ........................................................................................... 68 3.6 Précipitation d’ADN.......................................................................... 68 3.7 Préparation de bactéries compétentes .......................................... 68 3.8 Transformation de bactéries par électroporation.......................... 69 3.9 Extraction d’ADN plasmidique ........................................................ 69 3.10 Séquençage .................................................................................... 71 3.11 Construction de banque d’ADNc .................................................. 71

3.11.1 Extraction d’ARN total : ............................................................. 71 3.11.2 Synthèse des ADNc simple brin par reverse transcription ........ 72 3.11.3 Amplification des ADNc par PCR.............................................. 72 3.11.4 Digestion par la protéinase K .................................................... 73 3.11.5 Digestion des ADNc bicaténaires par l’enzyme Sfi I ................. 73 3.11.6 Fractionnement des ADNc sur colonne Chroma 400................ 74

5

3.11.7 Ligation des ADNc dans le vecteur TriplEx2 ........................... 75 3.11.8 Encapsidation des vecteurs recombinants................................ 75 3.11.9 Titration de la banque ............................................................... 76 3.11.10 Amplification de la banque ...................................................... 76

3.12 Criblage d’une banque d’ADNc..................................................... 77 3.12.1 Synthèse des sondes marquées............................................... 77 3.12.2 Étalement de la banque d’ADNc ............................................... 77 3.12.3 Transfert et fixation des ADN sur membrane ............................ 77 3.12.4 Hybridation................................................................................ 79 3.12.5 Révélation ................................................................................. 79 3.12.6 Récupération des plages de lyse .............................................. 80 3.12.7 Excision des plasmides............................................................. 80

4 METHODES DE BIOCHIMIE ................................................................ 81 4.1 Transformation de levures .............................................................. 81 4.2 Expression des P450 dans les levures et préparation des microsomes .............................................................................................. 82 4.3 Dosage de protéines ........................................................................ 83 4.4 Quantification des P450 par spectre CO ........................................ 83 4.5 Mesure d’activités enzymatiques.................................................... 84

4.5.1 Substrats..................................................................................... 84 4.5.2 Détermination des constantes catalytiques................................. 84 4.5.3 Mesure de l’inhibition par le psoralène........................................ 85

4.6 Détection des produits formés par HPLC ...................................... 85 4.7 Spectrométrie de masse.................................................................. 86

5 MODELISATION DE CYP73A32 ET CYP71AJ1 ................................ 86

Chapitre III: Recherche des déterminants moléculaires de l'inactivation différentielle des C4H de rue et de topinambour……………………………………………..89 1 INTRODUCTION ............................................................................... 89

2 RESULTATS.................................................................................... 93 2.1 Caractérisation de l’inactivation autocatalytique de la C4H d’Arabidopsis par le psoralène ............................................................... 93 2.2 Recherche des acides aminés responsables de la sensibilité différentielle des C4H vis à vis des furocoumarines............................. 95

2.2.1 ............... Première approche : Mutagenèse dirigée sur les résidus conservés de CYP73A32, A10 et A41 ................................................. 95 2.2.2 Deuxième approche : Étude de protéines chimères de CYP73A32 et CYP73A1 ....................................................................................... 101 2.2.3............... Construction d’un modèle 3D de CYP73A32 et étude de l’orientation du psoralène dans le site actif ........................................ 107

3 DISCUSSION ................................................................................. 112 3.1 Origine évolutive de la résistance de CYP73A32, A10 et A41

6

à l’inactivation par le psoralène ........................................................... 112 3.2 Expression hétérologue dans les levures WAT 11...................... 113 3.3 Impact de la modification de l’extrémité N-terminale sur l’affinité de CYP73A32 pour le psoralène ........................................................... 115 3.4 Recherche des résidus contrôlant la vitesse d’inactivation par le psoralène ............................................................................................ 117

4 CONCLUSION ................................................................................ 120

Chapitre IV: Recherche de P450 de la voie de biosynthèse des furocoumarines : identification et caractérisation fonctionnelle de la psoralène synthase d'Ammi majus……….…………………………………………..123 1 INTRODUCTION ............................................................................. 123

2 RESULTATS.................................................................................. 126 2.1 Résumé de l’isolement des séquences réalisé par l’équipe du Pr. Matern. ......................................................................................... 126 2.2 Expression hétérologue des P450 d’Ammi majus et identification de la psoralène synthase....................................................................... 127

2.2.1 Séquences et classification des 3 P450 étudiés ....................... 127 2.2.2 Clonage des ADNc dans le vecteur pYeDP60 .......................... 129 2.2.3 ....... Introduction des plasmides pYe71AJ1, pYe76B8 et pYe82H1 dans les levures WAT 11 ................................................................... 131 2.2.4 Mise au point des conditions d’expression dans WAT 11 ......... 131 2.2.5 Modification de l’extrémité N-terminale de CYP71AJ1.............. 134 2.2.6 Expression de CYP71AJ1-NT dans WAT 11 ............................ 135 2.2.7 Criblage fonctionnel de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 .... 137

2.3 Caractérisation enzymatique de la psoralène synthase ............. 141 2.3.1 Détermination du pH optimal d’activité...................................... 141 2.3.2 Détermination de la température optimale ................................ 143 2.3.3 Linéarité de la réaction.............................................................. 143 2.3.4 Constantes cinétiques de la psoralène synthase ...................... 143 2.3.5 Mesure de la sensibilité de CYP71AJ1-NT à l’inactivation autocatalytique par les furocoumarines ............................................. 144 2.3.6 .... Recherche d’une inhibition compétitive des furocoumarines sur CYP71AJ1-NT ................................................................................... 145 2.3.7... Bioconversion de la (+)-marmésine en psoralène par les levures exprimant les formes natives et modifiées de CYP71AJ1.................. 147 2.3.8.Test de la métabolisaton de la (+)-columbianetine par CYP71AJ1-NT ...................................................................................................... 149

2.4 Etude in silico de la psoralène synthase...................................... 151 2.4.1 Création d’un modèle tridimensionnel de CYP71AJ1 ............... 151 2.4.2.................. Simulation d’ancrage de la (+)-marmésine et de la (+)-columbianetine................................................................................... 153

7

3 DISCUSSION ................................................................................. 155 3.1 Clonage de P450 de la voie des furocoumarines par differential display.................................................................................. 155 3.2 Expression hétérologue des CYP d’Ammi majus dans WAT 11 156 3.3 Identification et caractérisation de la psoralène synthase ......... 158 3.4 Comportement de la psoralène synthase vis à vis de l’inhibition par les furocoumarines.......................................................................... 162 3.5 Spécificité de CYP71AJ1 dans la voie de synthèse des furocoumarines linéaires....................................................................... 163

4 CONCLUSION................................................................................ 163

Chapitre V : Recherche de P450 de la voie de biosynthèse des furocoumarines : clonage de P450 candidats à partir de tissus élicités de Ruta graveolens……………………...165 1 INTRODUCTION ............................................................................. 165

2 RESULTATS.................................................................................. 169 2.1 Recherche de fragments de gènes codant des P450 chez Ruta graveolens à l’aide de la stratégie CODEHOP ............................ 169

2.1.1 Choix des amorces CODEHOP ................................................ 171 2.1.2 PCR CODEHOP sur ADN génomique ...................................... 172

2.2 Elicitation de la production de furocoumarines dans les feuilles de Ruta graveolens ................................................................................ 173

2.2.1 Impact des UV sur la quantité en furocoumarines .................... 175 2.2.2 Impact des UV sur l’expression des P450 isolés ...................... 176

2.3 Recherche des ADNc complets des P450 isolés à partir d’une banque de feuilles de Ruta graveolens traitée aux UV ....................... 177

2.3.1 Marquage des sondes............................................................... 177 2.3.2 Criblage de la banque............................................................... 177 2.3.3 Nature des séquences isolées par criblage de la banque......... 179 2.3.4 Tentative d’isolement des séquences entières ......................... 180

3 DISCUSSION ................................................................................. 181 3.1 Tentative d’élicitation de plantes de rue par les UV.................... 181 3.2 Clonage de P450 candidats pour la synthèse des furocoumarines chez Ruta graveolens ................................................ 182

4 CONCLUSION................................................................................ 184

Conclusion générale et perspectives…………………...185 Références bibliographiques……………………………………...……..193

Listes des figures et tableaux………………………………...………….211

Annexes………………………………………………………...……….217

8

Abbréviations

2EN : 2-éthynylnaphtalène

2HN : 2-hydroxy-1-naphtoate

3PA : trans-3-(pyrid-4-yl)-acrylic acid

4CL : 4-coumarate ligase

4PB : acide 4-propynyloxybenzoique

5-MOP : 5-méthoxypsoralène ; bergaptène

5-8-MOP : 5-8-méthoxypsoralène ; isopimpinelline

8-MOP : 8-méthoxypsoralène ; xanthotoxine

ADN : acide désoxyribonucléique

ADNc : ADN complémentaire

ARN : acide ribonucléique

ATP : adénine tri-phosphate

BCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphate

C2H : cinnamate/p-coumarate-2-hydroxylase

C3’H : p-coumaroyl-3’-hydroxylase

C4H : cinnamate-4-hydroxylase

CO : monoxyde de carbone

CYP : cytochrome P450

DAG : diacylglycérol

DIMBOA : 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one

DIG : digoxygénine

DMAPP :diméthyl-allyl-pyrophosphate

DMS : déméthylsubérosine

DMSO : diméthylsulfoxyde

DO : Densité optique

EDTA : acide ethylène diamine tétraacétique

EGF : epidermal growth factor

EOR : espèce oxygénée réactive

EST : expressed sequence tag : étiquette de séquneces exprimées

F2H : Férulate-2-hydroxylase

F3’H : flavonoïde-3’-hydroxylase

F3’5’H : flavonoïde-3’-5’-hydroxylase

F5H : férulate-5-hydroxylase

F6H : flavonoïde-6-hydroxylase

FAD : flavine adénine dinucléotide

FMN : flavine mononucléotide

9

GC-MS : chromatagraphie gazeuse-spectrométrie de masse

HPLC : High performance liquid chromatography / chromatographie liquide haute performance

IPP : isopentényl-pyrophosphate

IPTG : isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

LB : Luria Bertani

MBI : mechanism based inactivation

NADH : nicotinamide adénine dinucléotide, forme réduite

NADP : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme oxydée

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme réduite

NBT : 4-nitro-blue-tetrazolium

N2O : protoxyde d’azote

NO : oxyde d’azote

PA : acide pipéronylique

PAL : phénylalanine ammonia-lyase

PCR : polymerase chain raction

PDB : protein data bank

PEG : polyéthylène glycol

pI : point iso-électrique

P-UVA : psoralène-UVA-thérapie

RMN : résonance magnétique nucléaire

SDS : sodium dodécyl sulfate

SRS : substrate recognition site. site de reconnaissance du substrat

TAL : tyrosine ammonia-lyase

TEA : tris acétate EDTA

UV : ultra-violet

10

Nom vernaculaire des espèces citées

Ammi majus : Queen Anne’s Lace

Apium graveolens : Céleri

Arabidopsis thaliana : Arabette des dames

Catharanthus roseus : Pervenche de Madagascar

Cicer arietinum : Pois chiche

Citrus bergamia : Bergamottier

Citrus lemon : Citronnier

Citrus paradisi : Pamplemoussier

Citrus sinensis : Oranger

Coronilla : Coronille

Ficus carica : Figuier

Heracleum mantegazzianum : Berce du Caucase

Helianthus tuberosus : Topinambour

Hydrangea macrophylla : Hortensia

Melilotus alba : Melilot

Mesembryanthemum crystallinum : Mésembryanthème à cristaux

Nicotiana tabacum : Tabac

Pastinaca sativa : Panais

Petroselinum crispum : Persil

Phaseolus aureus : Soja

Phaseolus vulgaris : Haricot vert

Populus tremuloides : Peuplier

Psoralea cinerea : Psoralée

Ratus norvegicus : Rat des champs

Ruta graveolens : Rue officinale

Saccharomyces cerevisiae : Levure de boulanger

Zea mays : Maïs

Chapitre I

Synthèse bibliographique et

présentation des objectifs de

thèse

11

Chapitre I : Synthèse bibliographique et présentation des objectifs de thèse

1 Les furocoumarines

1.1 Nature

Les furocoumarines sont des molécules tricycliques, produites par la

condensation de deux hétérocycles, coumarine (ou benzo-alpha-pyrone) et furane. La

position du cycle furane permet de distinguer deux types de furocoumarines (Fig. I-1) :

les linéaires dont la forme de base est le psoralène (I-1-a) et les angulaires représentées

par l’angélicine (I-1-b). Les furocoumarines constituent une classe de molécules

abondantes, où chaque membre se distingue par la présence de divers groupements

(hydroxy, alkoxy, géranyloxy...) sur les carbones 2, 5, et 8 (Matern et al. 1988). Les

furocoumarines linéaires les plus communes sont des dérivés méthoxylés du psoralène :

Le 5-méthoxypsoralène ou bergaptène (5-MOP) (I-1-c), le 8-méthoxypsoralène ou

xanthotoxine (8-MOP) (I-1-e) et le 5-8-diméthoxypsoralène ou isopimpinelline (5-8-

MOP) (I-1-j). La présence des cycles aromatiques confère à ces molécules une forte

absorbance pour des longueurs d’ondes comprises entre 270 et 320 nm.

O OO

R1

R2

O OO

R2

R1

(a) Psoralène : R1 = H ; R2 = H (c) Bergaptène (5-MOP) : R1 = OCH3 ; R2 = H (e) Xanthotoxine (8-MOP) : R1 = H ; R2 = OCH3 (g) Bergaptol : R1 = OH ; R2 = H (i) Xanthotoxol : R1 = H ; R2 = OH (j) Isopimpinelline : R1 = OCH3 ; R2 = OCH3

(b) Angélicine : R1 = H ; R2 = H (d) Isobergaptène : R1 = H ; R2 = OCH3

(f) Sphondine : R1 = OCH3 ; R2 = OH (h) Pimpinelline : R1 = OCH3 ; R2 = OCH3

Figure I-1 : Structure chimique des principales furocoumarines linéaires et angulaires

Chaptre I : Synthèse bibliographique et présentation des objectifs de thèse

12

1.2 Distribution

On retrouve les furocoumarines majoritairement dans 4 familles taxonomiques :

les Légumineuses (Psoralea sp. et Coronilla sp.), les Moracées (Ficus carica), les

Rutacées (Ruta graveolens, Citrus lemon, Citrus paradisi, Citrus bergamia) et les

Apiacées (Ammi majus, Pastinaca sativa, Apium graveolens, Petroselinum crispum…)

(Pathak et al. 1962). La répartition en furocoumarines varie d’une famille à l’autre.

Alors que les Moracées et les Légumineuses ne synthétisent principalement que deux

types de molécules (psoralène et bergaptène pour les Moracées ; psoralène et angélicine

pour les Légumineuses), les Rutacées et surtout les Apiacées en synthétisent un large

panel. Le bergaptène, la xanthotoxine et l’isopimpinelline constituent néanmoins les

formes principales dans ces deux familles (Bourgaud et al. 1989).

1.3 Rôle écologique

Les furocoumarines sont des phytoalexines présentant un spectre d’action

relativement large. En effet, ces molécules protègent la plante contre les herbivores et

les microorganismes pathogènes grâce à leurs propriétés phototoxiques d’une part (Mc

Cloud et al. 1992 ; Ojala et al. 2000), d’autre part elles sont impliquées dans des

processus d’allélopathie, inhibant la germination et la croissance des plantes

concurrentes (Baskin et al. 1967 ; Hale et al. 2004).

En raison de leur rôle de protection, les furocoumarines sont principalement

localisées dans et à la surface des organes les plus exposés à la prédation. On trouve

ainsi les concentrations les plus importantes dans les jeunes feuilles, dans les fruits et

surtout dans les graines (Pathak et al. 1962, Zobel et al. 1990). Cette localisation

préférentielle au niveau des organes « clés » permettrait à la plante d’alléger le coût

métabolique engendré par la synthèse de ces molécules (Nitao et Zangerl, 1987). Dans

une même idée « d’économie métabolique », chez certaines plantes comme le céleri

(Apium graveolens), la synthèse de furocoumarines est fortement induite en conditions

de stress (Chadhary et al., 1985).


13

1.4 Propriétés biologiques

Les propriétés des furocoumarines ont été utilisées depuis des millénaires à

travers l’usage d’Ammi majus et de Psoralea corylifolia respectivement dans les

médecines traditionnelles égyptienne et indienne (Scott et al., 1976 ; Pathak et

Fitzpatrick, 1992). Des textes tirés du livre sacré indien Atharva-Veda, datant du XVième

siècle avant J.C., relatent notamment l’utilisation d’extraits de Psoralea corylifolia pour

traiter le vitiligo, maladie caractérisée par une dépigmentation de la peau. En 1947,

Famhy et Abu-Shady démontrèrent que la xanthotoxine, première furocoumarine isolée

à partir de fruits d’Ammi majus, est responsable de la repigmentation de la peau

observée dans le traitement du vitiligo (Famhy et Abu-Shady, 1947). A partir de 1950,

les travaux décrivant l’isolement et la synthèse de furocoumarines s’accumulent. Les

propriétés biologiques de ces molécules s’avèrent très nombreuses et nécessitent dans la

plupart des cas une exposition aux UV (pour revue, Scott et al. 1976). Depuis 1974, le

psoralène est utilisé en association avec une exposition aux UVA sous la dénomination

P-UVA thérapie pour traiter certaines maladies de peau dont le vitiligo et le psoriasis

(Parrish et al. 1974, Henseler et al. 1981).

1.4.1 Interaction avec les macromolécules

Liaisons aux acides nucléiques

L’une des propriétés fondamentales des furocoumarines est la

photocycloaddition avec les acides nucléiques. En 1965, Musajo est le premier à décrire

une telle interaction avec l’ADN (Musajo et al., 1965). Le mécanisme, largement étudié

depuis, comprend deux étapes : dans un premier temps la furocoumarine s’intercale

entre les deux brins d’ADN, l’ensemble formant un complexe à faible énergie ; dans un

second temps, la furocoumarine est activée par l’énergie lumineuse, ce qui aboutit à

l’établissement de liaisons covalentes entre les carbones 3-4 du groupement pyrone

et/ou 2’-3’ du cycle furane, et les bases thymines de l’ADN (Fig. I-2) (Song et Tapley,

1979). Dans le cas d’une liaison bivalente, la furocoumarine joue le rôle d’un pont

moléculaire reliant les thymines des deux brins d’ADN et bloquant la réplication et la

traduction de l’ADN. Cette propriété expliquerait en grande partie le caractère

antimitotique et mutagène des furocoumarines (Dardhallon et al., 1998). La


14

Figure I-2 : Photoaddition du psoralène sur la thymine La photoaddition forme soit des liaisons monovalentes sur les carbones 4’-5’ ou 3-4 de la furocoumarine, soit des liaisons bivalentes. D’après Song et Tapley, (1979).

Figure I-3 : Photoaddition du psoralène avec le méthyl ester d’acide linolénique

D’après Dall’Acqua et Martelli, (1991).

h

O

O

O

O

H3C

OCH3

9

10

11

1213

14

15

4 3

16

HN

NH

O

OO O

O

H3C

43

HN

NH

OO

H3C OO O

Thymine

Psoralène

+

h

HN

HN

O

O

CH3

OO

O

3'2'

HN

HN

O

O

CH3

OO O

HN

NH

OO

H3C

3'2'

43


15

fixation aux ARN et à l’ADN simple brin a également été démontrée mais semble être

moins efficace qu’avec de l’ADN bicaténaire (Song et Tapley, 1979). En biologie

moléculaire, de part leur capacité à fixer et induire des cassures dans l’ADN, les

furocoumarines constituent un outil pratique pour l’analyse des mécanismes de

réparation de l’ADN (Brendel et al., 2003), ainsi que pour l’étude de la chromatine

(Song et Tapley, 1979).

Liaisons aux lipides

L’établissement de photocycloadditions a pu être montré avec des acides gras

insaturés (Specht et al., 1989 ; Caffieri et al., 1989). Comme avec les acides nucléiques,

les furocoumarines sont d’abord photoactivées avant de former une liaison covalente

avec l’acide gras (Dall’Acqua et Martelli, 1991) (Fig. I-3). Bien que son importance

physiologique ait été minimisée dans un premier temps, la photocycloaddition des

furocoumarines avec les lipides permettrait en partie d’expliquer certains effets de la P-

UVA thérapie, comme la mélanogenèse (Dall’Acqua et Martelli, 1991 ; Zarebska et al.

2000).

Liaisons aux protéines

Bien que la majorité des études se soit intéressée aux interactions

furocoumarines / ADN, une grande partie des autres composants cellulaires sont

impliqués dans des mécanismes de photoaddition. Ainsi, Beijersbergen a montré sur des

cellules épidermiques de rat traitées avec du 8-MOP et exposées aux UV, qu’une faible

proportion seulement du 8-MOP est lié à l’ADN (17 %), le reste étant associé

principalement aux protéines (57 %) et aux lipides (26 %) (Beijersbergen et al., 1989).

La photoaddition de furocoumarines a déjà été démontrée sur une large gamme de

protéines (ribonucléase, albumine bovine, lysozyme, histone…) (Schmitt et al. 1994).

Ces liaisons ont récemment été caractérisées entre le psoralène et des résidus tyrosine

(Sastry, 1997), mais pourraient impliquer plus généralement tous les résidus cycliques

(histidine, tryptophane, phénylalanine, tyrosine) (Bensasson et al., 1978 ; Veronese et

al., 1982). La fixation des furocoumarines à un large panel de protéines est susceptible

d’induire une grande variété d’effets (modification de voie de signalisation intracellulaire,

induction / répression de facteurs de transcription…) qui sont encore difficiles à

caractériser.


16

1.4.2 Photooxydation et photolyse

Outre les réactions de photoaddition décrites précédemment, les furocoumarines

excitées par les UVA (320-400 nm) peuvent générer la formation d’espèces oxygénées

réactives (1O2, H2O2, H2O•) dont l’implication dans l’apoptose a déjà été démontrée

(Mignotte et Vayssière, 1998), ou former des produits de photolyse. Les travaux de

Marley (Marley et al., 1995) ont ainsi montré que l’irradiation du psoralène par les

UVA provoque la formation de dérivés carbonyl (aldéhydes, acides) hautement

toxiques. Ces réactions de photooxydation pourraient avoir une importance dans le

caractère phototoxique des furocoumarines.

1.4.3 Activation de la mélanogenèse

Cette propriété est la première à avoir été mise en évidence comme en

témoignent les écrits du XVième siècle avant notre ère sur le traitement du vitiligo. La

combinaison furocoumarine / UV (365 nm) induit une augmentation de la pigmentation

Figure I-4 : Mécanisme proposé d’activation de la mélanogenèse par P-UVA thérapie (1) photoaddition de la furocoumarine sur les phospholipides. (2) La phospholipase A2

(PLA2) dégrade le phospholipide et relargue des acides gras photoliés à la furocoumarine (3). (4) Les acides gras photoliés favorisent l’activation de la protéine kinase C (PKC) par le diacylglycérol (DAG). (5) En phosphorylant des protéines spécifiques, la PKC active la voie de signalisation provoquant la mélanogenèse. D’après Zarebska et al. (2000)


17

de la peau due à la mélanine. Ceci est la conséquence d’une stimulation de l’activité

mitotique des mélanocytes ainsi que d’un transfert plus important des mélanosomes vers

les couches superficielles de la peau (Forlot, 1994). Un modèle, impliquant la

photoaddition des furocoumarines aux acides gras, a été proposé pour expliquer

l’induction de la mélanogenèse (Zarebska et al., 2000) (Fig. I-4) : les photoproduits

obtenus entre les furocoumarines et les acides gras insaturés mimeraient le

diacylglycérol (DAG) en activant la protéine kinase C, point de départ d’une voie de

signalisation stimulant la mélanogenèse.

L’idée de stimuler la mélanogenèse, dans une démarche de prévention pour

limiter les cancers de la peau causés par l’excès de soleil, a été envisagée par la société

Bergaderm qui commercialisa des crèmes solaires contenant du psoralène. Cependant

les soupçons portant sur le caractère naturellement mutagène des furocoumarines

(Roelandts, 1984) ont rapidement abouti à leur retrait du commerce.

1.4.4 Activité antiproliférative

Les propriétés antiprolifératives des furocoumarines ont été décrites très tôt sur

plusieurs modèles (cellules, racines…) (Musajo et al., 1967 ; Juntilla et al., 1976). Cette

propriété s’explique par plusieurs facteurs dont le principal est la formation de liaisons

avec l’ADN provoquant une inhibition de l’activité mitotique. La liaison des

furocoumarines à certains récepteurs membranaires ainsi qu’aux molécules signal (par

exemple le facteur de croissance EGF), joue un rôle de contrôle de la prolifération

cellulaire (Dall’Acqua et Martelli, 1991).

L’action antiproliférative des furocoumarines est à l’origine de leur utilisation

dans le traitement du psoriasis. Cette pathologie se caractérise par une multiplication

anarchique des cellules épidermiques causant un épaississement et une desquamation de

la peau.

1.4.5 Phototoxicité

Les furocoumarines, en association avec une exposition aux UV, engendrent des

lésions érythèmo-bulleuses sur la peau (rougeurs, boursouflures, brûlures). Cet effet dit

photosensibilisant était déjà mentionné dans un livre de contes allemand du XVIIIème


18

Figure I-5 : Voie générale simplifiée des phénylpropanoïdes et représentation de ses principaux dérivés

O

OHcinnamate

HO O

OHp-coumarate

HO O

p-coumaroylCoASCoA

H2N

HO O

OHtyrosine

OO

furocoumarineO

OO

coumarine

HO

O

HO

acide salicylique

stilbene

OH

HO

R

R R'

O

O

flavoneOH

HO

OH

R

R

O

O

isoflavoneOH

R

R

OH

HO

O

O

OH

flavonolOH

HO

OH

R

R

OHHO

alcool coniferyl

OMe

OHHO

alcool sinapyl

OMe

OMe

acide chlorogénique

OH

OH

QuinOOC

O

anthocyanine

HO

R

R

R

OGluc

OGluc

Flavonoïdes Monomères de lignines

TAL

PAL

C4H

4CL

H2N

O

OH

phenylalanine


19

siècle, le héros souffrant de photodermatite après avoir mangé des figues et s’être

exposé au soleil (Scott et al., 1976). La photosensibilisation par les furocoumarines

représente un des effets secondaires possibles de la P-UVA thérapie. Il constitue

également un problème dans le milieu agricole, lors de la récolte à la main de plantes

productrices de furocoumarines comme le céleri (Diawara et al. 1995).

Par ailleurs, les furocoumarines photoactivées possèdent des propriétés

mutagènes et sont susceptibles d’induire des aberrations chromosomiques, comme l’ont

démontré des études aussi bien sur des microorganismes que sur des cultures de cellules

animales (Alderson et Scott, 1970 ; Alshwood-Smith et al., 1977). L’effet mutagène de

chaque furocoumarine est étroitement lié avec sa capacité à former des photoadditions

avec l’ADN. Des propriétés carcinogènes ont également été montrées chez la souris

(Griffin et al., 1958). L’existence de telles propriétés chez l’Homme a été étudiée du fait

du développement de la P-UVA thérapie à partir de 1974. Un suivi clinique de centaines

de patients traités en P-UVA thérapie semble montrer que le risque de développer un

cancer de la peau via ce traitement est faible à court terme (Roelandts, 1984). Les effets

à long terme sont néanmoins encore difficiles à apprécier de part le manque de recul

concernant ce traitement (Mc Neelly et Goa, 1998). Pour limiter les risques liés à cette

thérapie, des améliorations ont été apportées, comme l’administration de compléments

(rétinoïdes) qui optimisent l’efficacité des furocoumarines tout en diminuant leurs effets

secondaires (Roelandts, 1984). L’émergence de furocoumarines de synthèse moins

toxiques et plus actives pourrait constituer un nouveau progrès (Chilin et al., 2003).

1.5 Biosynthèse et stockage des furocoumarines linéaires

1.5.1 Voie de synthèse des phénylpropanoïdes

Les phénylpropanoïdes sont des métabolites secondaires dont la structure, dite

en C6-C3 comprend un cycle benzène sur lequel sont greffés 3 atomes de carbone. Ils

sont synthétisés chez les plantes supérieures et dérivent de la phénylalanine ainsi que de

la tyrosine dans le cas des monocotylédones. La voie des phénylpropanoïdes (Fig. I-5)

constitue le point de départ de la synthèse de nombreux métabolites secondaires comme

les flavonoïdes, les monomères de lignines, l’acide salicylique et les furocoumarines.


20

Figure I-6 : Voie générale de biosynthèse des furocoumarines linéaires Les étapes identifiées comme P450 dépendantes sont marquées par un point bleu. La voie principale est représentée par des flèches noires, les voies alternatives proposées chez Ruta graveolens et Ficus carica (Innocenti et al., 1981) sont indiquées par des flèches en pointillés.

O OO

OH

O OO

O OO

OH

O OO

OMe

O OO

OMe

OH

NH2HOOC HOOC

HOOC

OH

OH

O OHO

O OHO

O OO

HO

HOOC

OH

O OO

HO

OH

O OO

HO

OH

O OO

HO

OMe

O OO

HO

OMe

O OO

OMe

O OO

OMe

OH

O OO

OMe

OMe

(1) (2) (3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9) (10)

(11) (12)

(13) (14)

(15) (16)

(17) (18)

(19)

(1) : Phénylalanine(2) : Cinnamate(3) : p-Coumarate(4) : 2-4 Dihydroxycinnamate(5) : Umbelliférone(6) : Déméthylsubérosine(7) : (+)-Marmésine(8) : Psoralène(9) : 8-Hydroxymarmesine(10) : 5-Hydroxymarmesine

(11) : 8 -Méthoxymarmesine(12) : 5 -Méthoxymarmesine(13) : 8 -Hydroxypsoralène(14) : 5 -Hydroxypsoralène(15) : Xanthotoxine (8-MOP)(16) : Bergaptène (5-MOP)(17) : 5 -Hydroxyxanthotoxine(18) : 8 -Hydroxybergaptène(19) : Isopimpinelline

PAL C4H

C2H

UPT

MS

PS

P5MP8M

BMTXMT

PAL: phényalanine ammonia-lyaseC4H: cinnamate-4-hydroxylaseC2H: coumarate-2-hydroxylaseUPT: umbelliferone prenyl transferaseMS : (+)-marmésine synthase

PS : psoralène synthaseP5M : psoralène-5-monooxygenaseP8M : psoralène-8-monooxygenaseBMT : bergaptol-O-methyltransferaseXMT : xanthotoxol-O-methyltransferase

O OO

OH

O OO

O OO

OH

O OO

OMe

O OO

OMe

OH

NH2HOOC HOOC

HOOC

OH

OH

O OHO

O OHO

O OO

HO

HOOC

OH

O OO

HO

OH

O OO

HO

OH

O OO

HO

OMe

O OO

HO

OMe

O OO

OMe

O OO

OMe

OH

O OO

OMe

OMe

(1) (2) (3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9) (10)

(11) (12)

(13) (14)

(15) (16)

(17) (18)

(19)





PAL C4H

C2H

UPT

MS

PS

P5MP8M

BMTXMT

PAL: phényalanine ammonia-lyaseC4H: cinnamate-4-hydroxylaseC2H: coumarate-2-hydroxylaseUPT: umbelliferone prenyl transferaseMS : (+)-marmésine synthase

PS : psoralène synthaseP5M : psoralène-5-monooxygenaseP8M : psoralène-8-monooxygenaseBMT : bergaptol-O-methyltransferaseXMT : xanthotoxol-O-methyltransferase


21

Cette voie est initiée par la conversion de la phénylalanine en cinnamate, catalysée par

la phénylalanine ammonia lyase (PAL). Le cinnamate est ensuite hydroxylé, soit sur le

carbone C2 pour ouvrir la voie de synthèse de la coumarine (Kindl, 1971), soit sur le

carbone C4 pour donner le p-coumarate. L’hydroxylation en C4 est catalysée par la

cinnamate-4-hydroxylase (C4H), un cytochrome P450 végétal intensément étudié qui

fera l’objet d’une description plus large dans les paragraphes suivants. Dans le cas des

monocotylédones, le p-coumarate peut être obtenu en une seule étape, par déamination

de la tyrosine. Cette réaction est catalysée par la tyrosine ammonia lyase (TAL). Le p-

coumarate constitue une molécule centrale d’où vont rayonner de multiples voies de

biosynthèse. La plus importante est celle menant à la synthèse des monomères de

lignine. Dans ce cas, le p-coumarate est estérifié avec un coenzyme A par la p-

coumarate:CoA ligase (4CL). Le p-coumaroyl-CoA est ensuite pris en charge par de

multiples enzymes pour former l’un des monomères de lignines. Le p-coumaroyl-CoA

est également le précurseur de la grande famille des flavonoïdes. Les furocoumarines

sont issus du p-coumarate. Plusieurs étapes de ces voies sont catalysées par des

cytochromes P450.

1.5.2 Voie de synthèse des furocoumarines linéaires

La première étape spécifique de la voie de synthèse des furocoumarines est

l’hydroxylation du p-coumarate (3) sur le carbone C2 pour donner le 2-4

dihydroxycinnamate (4) capable par cyclisation spontanée de former l’umbelliférone (5)

(Fig. I-6). Cette réaction, pourrait prendre place dans les chloroplastes comme l’attestent

les travaux de Gestetner et Conn (1975). Ces résultats restent néanmoins controversés

car ils n’ont pu être confirmés depuis (Brown et Zobel, 1990). Lors de la deuxième

étape, l’umbelliférone est prénylée par l’ajout d’une unité isoprène (DMAPP). Le

groupement prényl peut être ajouté sur les carbones C6 ou C8 de l’umbelliférone,

orientant la synthèse respectivement vers les furocoumarines linéaires ou angulaires.

Des expériences de marquage isotopique réalisées sur des feuilles de céleri avec du

déoxy-D-xylulose deutéré montre que le prényl ajouté sur l’umbelliférone est issu de la

voie chloroplastique de Rohmer (Stanjek et al., 1999, a). Actuellement, seule l’enzyme

catalysant l’ajout du prényl en C6 pour former la déméthylsubérosine (DMS) (6) a été

caractérisée à partir de cellules de Ruta graveolens (Ellis et Brown, 1974). La DMS est


22

ensuite convertie en (+)-marmésine (7) par cyclisation du prényl sur l’hydroxyl en C7.

La (+)-marmésine est ensuite transformée en psoralène (8) par libération d’une molécule

d’acétone. Ces deux étapes sont catalysées par des cytochromes P450, la marmésine

synthase (MS) et la psoralène synthase (PS), localisés dans le réticulum endoplasmique

chez Ammi majus (Hamerski et Matern, 1988, a). Le psoralène peut être hydroxylé en

position 5 ou 8 donnant respectivement le bergaptol (14) ou le xanthotoxol (13). Jusqu’à

présent, seule l’activité de la psoralène-5-monooxygénase (P5M), un autre P450, a pu

être caractérisée à partir de cellules d’Ammi majus (Hamerski et Matern, 1988, b). Le

bergaptol et le xanthotoxol sont ensuite O-méthylés pour donner le bergaptène (16) et la

xanthotoxine (15). Les bergaptol- et xanthotoxol-O-méthyl transférases (BMT ; XMT)

ont été purifiées à partir de cellules de Ruta graveolens et isolées chez le persil

(Thompson et al., 1978 ; Sharma et al., 1979 ; Hauffe et al., 1986). Dernièrement la

séquence codante de la BMT a été isolée à partir de cellules d’Ammi majus (Hehmann et

al., 2004). Chez Ficus carica et Ruta graveolens, la biosynthèse du bergaptène et de la

xanthotoxine prend aussi une voie parallèle passant par une hydroxylation en 5 ou 8 de

la (+)-marmésine convertie en hydroxy psoralène qui est ensuite O-méthylée (Innocenti

et al., 1981).

Bien que la voie décrite ici ne concerne que les furocoumarines linéaires, il

semble que les mêmes étapes aient lieu dans le cas des furocoumarines angulaires, la

divergence se faisant lors de l’étape de prénylation de l’umbelliférone (Gray et

Waterman, 1977).

1.5.3 Stockage dans la plante

En raison de la forte réactivité des furocoumarines pour les constituants

cellulaires, des mécanismes de stockage ont été mis en œuvre par les plantes pour éviter

une auto-intoxication. Pour diminuer leur réactivité, les molécules sont glycosylées par

des glucosyl-transférases présentes dans le compartiment cytosolique, puis sont

stockées dans la vacuole. Ces molécules glycosylées peuvent être converties en formes

libres par l’action de ß-glycosidases localisées dans le cytosol. Lors d’une blessure

engendrée, par exemple, par un prédateur herbivore, la cellule est décompartimentée.

Les furocoumarines glycosylées deviennent alors accessibles aux ß-glycosydases et

sont converties en molécules libres et toxiques. Cette stratégie de défense constitue ainsi


23

une réponse rapide et locale à une agression mécanique. La proportion de glycosylation

est variable selon les plantes. Ainsi, chez Psoralea cinerea, la totalité des

furocoumarines est glycosylée (Nguyen, 1992), alors que dans le cas de Ruta

graveolens, seulement 1/3 le sont (Zobel et Brown, 1990). Les furocoumarines peuvent

également être stockées sous forme libre à l’extérieur de la cellule, dans les espaces

intercellulaires ou à la surface des feuilles. Par ailleurs, des études

d’immunohistolocalisation ont montré que le psoralène et la xanthotoxine sont

étroitement associés au xylème chez Ruta graveolens (Massot et al., 2000). Cette

localisation favoriserait une défense systémique en réponse à une agression.

1.5.4 Inductibilité de la synthèse

D’une manière générale, et au même titre que de nombreux métabolites

secondaires, la production de furocoumarines par les plantes est souvent dépendante des

conditions environnementales. Leur synthèse est induite en réponse à un grand nombre

de stress comme l’attaque de pathogènes, les agressions mécaniques, le froid,

l’exposition aux UV. Chez le panais (Pastinaca sativa L.), la synthèse est modulée par

la teneur du sol en nutriments (N, P, K) (Zangerl et Berenbaum, 1987), et chez le céleri

(Apium graveolens L.) celle-ci est sensible à la pollution atmosphérique (Derks et al.,

1990).


24

Figure I-7 : (A) Représentation de Ruta graveolens ; (B) Buisson de Ruta graveolens

A B

Figure I-8 : (A) Représentation de Ammi majus ; (B) Ammi majus à la floraison

A B


25

2 Ruta graveolens et Ammi majus : Deux plantes productrices de furocoumarines

2.1 Description botanique

2.1.1 Ruta graveolens

Ruta graveolens (Fig. I-7), communément appelée rue officinale, est une plante

méditerranéenne semi-arbustive, d’un mètre de haut environ, très ramifiée et ligneuse à

la base. Ses feuilles, persistantes, d’un vert terne, sont souvent trilobées et sont un peu

charnues. La floraison s’étend de mai à août. Ses fleurs, distribuées en corymbe, sont

composées de 4 à 5 pétales jaunes. Les fruits sont des capsules déhiscentes libérant à

maturité de petites graines noires. Ruta graveolens se caractérise par une odeur forte et

pénétrante émise par les huiles contenues dans les poches à essence à la surface des

feuilles.

Ruta graveolens fut utilisée en médecine traditionnelle dès l’antiquité par les

Romains et les Grecs en raison de ses propriétés abortives. Son utilisation s’est ensuite

diversifiée. Les fruits et les parties aériennes, administrés de façons diverses (infusion,

décoction, poudre…), entraient dans le traitement des maux de tête, des vertiges et des

rhumatismes (De Foe et Senatore, 1993). Ruta graveolens constitue également un

excellent vermifuge et antiparasitique (Guarrera, 1999 et 2005). Elle entrait notamment

dans la composition du « vinaigre des quatre voleurs » censé protéger de la peste.

Actuellement, Ruta graveolens est utilisée dans l’élaboration de plusieurs médicaments

essentiellement homéopathiques. L’utilisation thérapeutique de la rue pourrait

néanmoins connaître un nouvel essor. De récents travaux ont démontré que l’utilisation

combinée d’extraits de rue dilués (« Ruta 6 ») et de Ca3(PO4)2 provoque une régression

souvent totale de certains cancers cérébraux. L’intérêt de ce traitement est qu’il cible

uniquement les cellules cancéreuses. Le mécanisme d’action précis reste encore à

déterminer, mais il semble que le traitement « Ruta 6 » + Ca3(PO4)2, favorise l’entrée en

apoptose des cellules cancéreuses (Pathak et al., 2003).


26

2.1.2 Ammi majus

Ammi majus (Fig. I-8) est une plante annuelle méditerranéenne de la famille des

Apiacées. Haute de 30 cm à 1 m, Ammi majus est composée d’une tige principale

ramifiée à son sommet. Les feuilles inférieures, de teinte vert clair, sont brillantes et

disposées en rosette. Les feuilles supérieures sont finement dentées. Les fleurs blanches

sont réunies en ombelles de 20 à 30 rayons avec des pétales échancrés.

D’un point de vue thérapeutique, Ammi majus fut très tôt utilisée en association

avec une exposition solaire, dans le traitement de maladie de peau telles que le vitiligo

et le psoriasis.

2.2 Intérêt de ces deux modèles pour l’étude de la voie de synthèse des furocoumarines

Ruta graveolens et Ammi majus sont deux plantes présentant une grande variété

et de fortes teneurs en métabolites secondaires. Certains d’entre eux sont d’ailleurs

relativement peu représentés dans le règne végétal. C’est le cas des furocoumarines,

mais également des alcaloïdes acridones et des furoquinolines distribués exclusivement

chez les Rutacées (Stashenko et al., 2000). Des analyses effectuées sur des extraits de

rue ont abouti à l’identification de 39 quinolines et alcaloïdes distincts, 34 coumarines

et furocoumarines et une trentaine de composés oxygénés (cétones, aldéhydes…)

(Stashenko et al., 2000).

Ruta graveolens et Ammi majus appartiennent aux deux familles taxonomiques

les plus riches en furocoumarines, respectivement les Rutacées et les Apiacées. Leur

composition en furocoumarines est différente. Dans le cas d’Ammi majus, les formes les

plus courantes sont l’umbelliférone, le psoralène et ses deux formes méthoxylées

(xanthotoxine et bergaptène) ainsi que l’impératorine (Krolicka et al., 2001). Chez Ruta

graveolens, quatre furocoumarines linéaires sont produites majoritairement : le

psoralène, la xanthotoxine, le bergaptène et l’isopimpineline. Ces molécules se

répartissent principalement dans les parties aériennes et de façon plus importante dans

les fruits au niveau du péricarpe (Milési, 2001). Cette localisation est en accord avec la

théorie de la défense optimale évoquée précédemment. Par ailleurs, Ruta graveolens

synthétise une majorité de bergaptène, molécule provoquant moins d’effets secondaires


27

que la xanthotoxine dans les traitements de P-UVA thérapie (Berg et Ross, 1993). Ces

deux critères, en plus des bonnes propriétés agronomiques de la plante (plante vivace,

bonne résistance au froid…) font de la rue une bonne candidate pour une production de

furocoumarines au champ (Milési et al., 2001).

2.3 Synthèse des furocoumarines par les cultures in vitro

L’utilisation de cultures in vitro (cals, cultures cellulaires, hairy roots, tiges

feuillées) constitue un moyen de production de métabolites secondaires parfois plus

intéressant que la culture des plantes en champ (production plus rapide tout au long de

l’année, qualité des produits constante et indépendante des conditions climatiques). En

raison de leur intérêt thérapeutique, la possibilité d’une production de furocoumarines

par des cultures in vitro de Ruta graveolens et Ammi majus a été étudiée.

Malheureusement, les gains en productivité restent dérisoires face aux coûts de

maintenance de tels systèmes, ce qui interdit à l’heure actuelle le passage à une échelle

industrielle (Massot, 2001 ; Milési, 2001 ; Koul et Koul, 1993).

Les cultures in vitro constituent néanmoins un outil de choix pour l’étude des

voies de biosynthèse en fournissant un matériel homogène en quantité importante pour

l’isolement d’enzymes et la caractérisation de gènes d’intérêt. L’essentiel des enzymes

de la voie des furocoumarines a été isolé ou caractérisé à partir de cultures cellulaires de

rue, d’Ammi majus ou de persil (Ellis et Brown, 1974 ; Hauffe et al., 1986 ; Hamerski et

Matern, 1988 a et b).

Les cultures cellulaires de Ruta graveolens et d’Ammi majus sont élicitables

pour la synthèse des furocoumarines. Les travaux menés au laboratoire montrent que

dans le cas de Ruta graveolens, la production de furocoumarines est élicitable par des

extraits du champignon Verticilium sp.. L’importance de la réponse dépend cependant

du niveau de synthèse basal : plus celui-ci est important, moins l’élicitation est marquée

(Milési, 2001). Les cultures in vitro d’Ammi majus ne produisent pas de furocoumarines

de manière constitutive. En absence d’élicitation, seule l’umbelliférone, un

intermédiaire de synthèse, peut être détécté (Hamerski et al.,1990). L’addition dans le

milieu de culture d’extrait de microorganismes (Phytophtora megasperma,

Enterobacter sakazaki) induit, par contre, une synthèse importante de bergaptène


28

(Staniszewska et al., 2003 ; Hamerski et Matern, 1988 b.). Ces cultures cellulaires

fortement inductibles constituent un outil très intéressant pour le clonage de gènes

impliqués dans la synthèse de furocoumarines. Récemment la séquence codante de la

bergaptol-O-méthyl-transférase a été clonée à partir de ces cultures cellulaires induites

(Hehmann et al., 2004).

Figure I-9 : Exemples de réactions oxydatives catalysées par les P450 D’après Mansuy (1998)


29

3 Les cytochromes P450

3.1 Définition

Les cytochromes P450 (ou P450) représentent une superfamille d’hémoprotéines

distribuée chez quasiment tous les organismes vivants. La découverte de ce type de

protéine est attribuée à Klingenberg qui, à la fin des années 50, mit en évidence

l’existence, dans une fraction microsomale de foie, d’un pigment présentant une forte

absorbance à 450 nm en présence d’un agent réducteur et de monoxyde de carbone

(Klingenberg, 1958). Cette propriété spectrale est à l’origine de leur appellation actuelle

de P450, P signifiant Pigment et 450 correspondant au maximum d’absorption. Depuis

bientôt 50 ans, les découvertes de nouvelles isoformes et les informations sur la

biochimie de cette famille de protéines se sont accumulées. Actuellement on dénombre

plus de 4500 séquences de P450, tous organismes confondus

(http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html). Contrairement aux autres

cytochromes qui ont une fonction de transporteurs d’électrons, les P450 catalysent

principalement l’addition d’un atome d’oxygène sur un substrat. Cette réaction de

monooxygénation est réalisée à partir du dioxygène et nécessite un pouvoir réducteur

fourni le plus souvent par du NADPH ou du NADH. Ainsi, la réaction générale d’un

P450 peut être décrite par la formule suivante :

RH + O2 + NADPH,H+ ROH + H2O + NADP+

Cependant, de nombreuses autres réactions catalysées par les P450 ont été

décrites. Celles ci impliquent des réactions oxydatives de déformylation, de clivage de

liaison C=N ou de déshydrogénation, ainsi que des réactions non oxydatives de

réduction ou d’isomérisation (Fig. I-9) (Mansuy, 1998).

3.2 Classification

En raison du grand nombre de séquences de P450 déjà isolées, la mise en place

d’une nomenclature s’est rapidement avérée nécessaire. La classification, établie par le

Dr David Nelson, est consultable sur internet à l’adresse suivante :

http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html. Les P450 sont classés en famille et

sous famille en se basant sur l’identité des séquences protéiques. A partir de 40 %

http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html



30

d’homologie, deux membres appartiennent à la même famille. L’appartenance à la

même sous-famille nécessite 55 % d’homologie. Les séquences identiques à plus de

97 % sont considérées comme variants allèliques. Chaque P450 est immatriculé avec la

racine CYP (pour Cytochrome P450) suivie d’un numéro de famille, une lettre de sous-

famille et un numéro de gène. Ainsi d’après cette nomenclature, la progestérone-21-

hydroxylase de lapin est dénommée CYP2C5 et la cinnamate 4 hydroxylase de

topinambour CYP73A1. Dans le cas des P450 de plantes, les familles sont numérotées

de 71 à 99 puis à partir de 701.

En dépit de cette classification et au vu du nombre toujours croissant de P450

isolés, un nouveau degré d’organisation a été introduit. Les familles proches sont

désormais réunies en clans en se basant sur les arbres phylogénétiques récemment

réalisés. Ces clans pourraient rassembler les familles de P450 divergeant d’un gène

ancestral commun (Nelson, 1999). Le clan est désigné par le plus petit numéro de la

famille représentée.

3.3 Cycle catalytique

Le mécanisme d’action des P450 est le sujet d’études approfondies depuis

bientôt trente ans. Il semble que malgré des séquences protéiques très différentes, la

majorité des P450 fonctionnent suivant le même mécanisme. Le site actif de ces

enzymes est constitué d’un hème du type protoporphyrine IX contenant un atome de fer.

Le fer, lié aux 4 atomes d’azote de l’hème, possède une 5ème liaison thiolate avec une

cystéine très conservée dans la partie C-terminale des P450. En absence de substrat, le

fer est à l’état ferrique (Fe3+) et il forme une sixième liaison avec le groupement

hydroxyle d’une molécule d’eau présente dans la poche à substrat (Fig. I-10). A ce

stade, le fer est dit en spin bas et possède une symétrie maximale par rapport au plan de

l’hème (a). L’arrivée du substrat provoque le déplacement d’une ou plusieurs molécules

d’eau dans le site actif et perturbe la 6ème coordinance du fer. L’atome de fer (Fe3+)

passe alors en état de haut spin pentacoordiné et se déplace par rapport au plan de

l’hème (b).


31

Cette transition est observable en spectrométrie avec le déplacement du maximum

d’absorption de 420 à 390 nm lors de la formation du complexe enzyme / substrat. Elle

porte le nom de spectre de type I et permet de déterminer la constante de dissociation

(Ks) du complexe (Jeafcoate, 1978). Le fer ferrique (Fe3+) est ensuite réduit en fer

ferreux (Fe2+) pentacoordiné par le transfert d’un électron (c). Une molécule de

dioxygène vient alors se lier au Fe2+ pour donner un intermédiaire Fe2+-O2 (d) réduit à

son tour par un autre électron en complexe peroxoferrique (e). L’apport de deux protons

aboutit à la formation d’un complexe ferryl-oxo et d’une molécule d’eau (f). C’est à

partir de ce complexe ferryl-oxo que l’oxygène est transféré au substrat. Le produit

formé est ensuite relargué et le fer se retrouve à l’état initial. Dans certains cas, le

NADPH et l’oxygène peuvent être remplacés par des molécules de type alkyl

hydroperoxyde, peroxyde d’hydrogène ou peroxyacides. Le P450 fonctionne alors en

cycle court passant directement de l’état (b) à l’état (e). Cette voie alternative est

nommée « shunt peroxyde ». En condition normale, un cycle catalytique complet

s’accompagne de la consommation d’une molécule d’oxygène et d’une molécule de

NADPH fournissant deux électrons. Il existe néanmoins des cas de découplage entre la

consommation de NADPH et la formation du produit. Ce découplage aboutit à la

Figure I-10 : Schéma du cycle catalytique d’un P450 Les flèches noires représentent l’enchaînement des étapes d’un cycle catalytique normal. Les flèches bleues représentent les réactions de découplage. RH : Substrat ; ROH : Produit hydroxylé (D’après Zangar et al., 2004)


32

formation d’espèces oxygénées réactives (EOR) comme H2O2 et O2•. Les trois voies

amenant à la formation d’EOR sont représentées en bleu sur la figure I-10. Les EOR

sont des molécules toxiques impliquées, entre autre, dans la signalisation de l’apoptose

(Mignotte et Vayssière, 1998). En tenant compte du fort degré de découplage et de

l’abondance des P450 chez les eucaryotes, certains auteurs considèrent que le cycle

catalytique des P450 est une des sources principales de stress oxydant (Zangar et al.,

2004). La production d’EOR par les P450 est étroitement contrôlée par la cellule. Ce

contrôle s’exerce d’une part au niveau transcriptionnel (répression de l’expression de

certains P450 et induction de l’expression d’enzymes anti-oxydantes comme la catalase)

(Barouki et Morel, 2001 ; Mari et Cederbaum, 2001) et, d’autre part, par modulation

directe de l’activité des P450. Le cytochrome b5 joue un rôle important dans ce type de

contrôle (Zangar et al., 2004). Bien que non essentiel au fonctionnement des P450, le

cytochrome b5 permet néanmoins d’augmenter considérablement l’activité et le

couplage des P450 avec les réductases, diminuant du même coup la production d’EOR.

Le cytochrome b5 pourrait agir à plusieurs niveaux, en favorisant la formation du

complexe P450 / réductase ou en facilitant le transfert d’électron de la réductase au

P450 (Gruenke et al., 1995 ; Perret et Pompon, 1998).

3.4 Origine du pouvoir réducteur

Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, le fonctionnement des

P450 nécessite l’apport d’un pouvoir réducteur fourni généralement par le NADPH ou

le NADH. Suivant le mode de transfert des électrons, les P450 sont répartis en 4 classes

(Werck-Reichhart et Feyereisen, 2000 a.). Les P450 de la classe I fonctionnent avec une

NAD(P)H réductase à FAD associée à une protéine fer-soufre. Les P450 de classe I sont

représentés essentiellement chez les procaryotes sous forme soluble, et chez les

eucaryotes associés à la membrane interne des mitochondries. Les P450 de classe II

représentent la majeure partie des P450 eucaryotes. Ces P450 acceptent les électrons

d’une NADPH réductase constituée d’un domaine FAD et d’un domaine FMN. Au

même titre que le P450 de classe II, la réductase est associée au réticulum

endoplasmique par son extrémité N-terminale. Les réductases présentent peu de

sélectivité d’interaction avec les P450. La diversité des réductases est d’ailleurs très

faible en comparaison du nombre de P450 présents dans chaque organisme. On


33

dénombre en effet un seul gène de réductase chez l’Homme et la levure, alors que deux

ou trois isoformes sont présentes en moyenne chez les plantes (Benveniste et al., 1991 ;

Mizutani et Ohta, 1998). Ces différentes isoformes végétales pourraient avoir des rôles

physiologiques différents (Ohta et Mizutani, 2004). Chez Arabidopsis thaliana,

l’isoforme 1 (AthR1) est exprimée de façon constitutive, tandis que l’isoforme 2

(AthR2) est fortement induite par des blessures ou par la lumière (Mizutani et Ohta,

1998). Les P450 de classe II peuvent aussi recevoir des électrons via le cytochrome b5

et la cytochrome b5 réductase (Perret et Pompon, 1998). Quelques P450 de classe II

sont également présents chez les procaryotes. Ces enzymes ont la particularité d’être

solubles et de posséder des domaines P450 et réductase fusionnés. Les P450 de classe

III sont des enzymes autosuffisantes, fonctionnant sans O2 ni apport externe d’électrons.

Ces enzymes sont exclusivement eucaryotes. Elles sont impliquées dans la synthèse de

molécules signal et notamment de l’acide jasmonique chez les plantes (Tijet et Brash,

2002). A ce jour, la classe IV est représentée par un seul membre : la Nitric Oxide

Reductase (P450nor). Cette enzyme responsable de la réduction du NO en N2O, utilise

directement le NADH comme source d’électrons (Daiber et al., 2005).

3.5 Diversité et évolution des P450

En janvier 2005, on comptabilisait plus de 4500 séquences de P450 identifiées

chez les procaryotes et eucaryotes (http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html.).

Les données des séquençages systématiques disponibles ont permis de montrer que les

P450 sont distribués dans la quasi-totalité des organismes en nombre plus ou moins

important : seulement 3 gènes de P450 chez Saccharomyces cerevisiae, 55 gènes et 25

pseudogènes chez l’Homme et 80 gènes chez le nématode Caenorhabditis elegans.

C’est cependant chez les plantes que l’on trouve le plus de P450 : 272 gènes chez

Arabidopsis thaliana et 458 chez le riz. Cette explosion du nombre de P450 chez les

végétaux résulte en grande partie de l’évolution rapide de cette famille d’enzymes

impliquée dans la synthèse d’une multitude de métabolites secondaires. La construction

d’arbres phylogénétiques basés sur l’alignement des séquences protéiques permet de

distinguer deux catégories de P450 végétaux : les P450 du groupe A dérivent tous d’un

ancêtre commun. Ces P450 sont tous impliqués dans des réactions spécifiques des

plantes, notamment la synthèse de métabolites secondaires. Les autres P450

http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html.


34

Tableau I-1 : Liste des fonctions de P450 identifiés chez Arabidopsis thaliana au 30/05/06 D’après http://www.p450.kvl.dk/

79A2 Conversion of phenylalanine to oxime Benzylglucosinolate79B2 Conversion of tryptophan and analogs to oxime Indole glucosinolate79B3 Conversion of tryptophan to oxime Indole glucosinolate79F1 Aliphatic glucosinolate

79F2 Aliphatic glucosinolate

83A1 Oxidation of methionine-derived oximes Aliphatic glucosinolate

83B1 oxidation of indole-3-acetyldoxime Indole glucosinolate84A1 Phenylpropanoid

85A1 C6-oxidase for 6-deoxycastasterone, other steroids Brassinolide85A2 C6-oxidase for 6-deoxycastasterone, other steroids Brassinolide

Conversion of castasterone to brassinolide 86A1 -hydroxylase for (un)satur. C12 to C18 fatty acids Fatty acids86A8 -hydroxylase for (un)satur. C12 to C18 fatty acids Fatty acids88A3 Multifunctional ent-kaurenoic acid oxidase Gibberellin 88A4 Multifunctional ent-kaurenoic acid oxidase Gibberellin 90A1 23-a-hydroxylase for 6-oxo-cathasterone Brassinolide 90B1 22-a-hydroxylase for 6-oxo-campestanol Brassinolide 90C1 Conversion of typhasterol to castasterone Brassinolide 90D1 Exact substrate in BR synthesis not identified Brassinolide 97C1 e-ring hydroxylase on carotenes Carotenoid98A3 C3'H for p- coumaryl shikimic/quinic acids Phenypropanoid701A3 Multifunctional ent-kaurene oxidase Gibberellin 707A1 8’-hydroxylase for ABA 707A2 8’-hydroxylase for ABA 707A3 8’-hydroxylase for ABA 707A4 8’-hydroxylase for ABA

734A1 26-hydroxylase for brassinolide and castasterone (72B1) 735A1 Trans-hydroxylase for isopentenyladenine, Cytokinins(709A1) Tri/di/monophosphates 735A2 Trans-hydroxylase for isopentenyladenine, Cytokinins(709A2) Tri/di/monophosphates

Degradation of brassinolides

Degradation of ABA Degradation of ABA Degradation of ABA Degradation of ABA

Mono to hexahomomethionine in synthesis of shortand long aliphatic glucosinolateLong chain penta and hexahomomethionine insynthesisof short and long aliphatic glucosinolates

Oxidation of p-hydroxyphenyl-acetaldoxime,indole-3- acetyldoxime

Coniferaldehyde, coniferyl alcohol and ferulic acid (F5H)

P450 Activité Voie métabolique51G1/51G2 Obtusifoliol 14-a-demethylase Sterols/steroids 71B15 Exact substrate not identified Camalexin

73A5 Cinnamic acid 4-hydroxylase (t-CAH) Phenylpropanoid 74A1 Allene oxide synthase Oxylipin74B2 Hydroperoxide lyase Oxylipin75B1 F3'H for naringenin, dihydrokaempferol Phenylpropanoid

72C1 Exact substrate not identified Brassinolide inactivation

76C1 Geraniol-10-hydroxylase Sterol

710A2 Sterol C-22-desaturase Steroid710A1 Sterol C-22-desaturase Steroid

724A1 Exact substrate not identified Brassinolide


















Conversion of castasterone to brassinolide 86A1 -hydroxylase for (un)satur. C12 to C18 fatty acids Fatty acids86A8 -hydroxylase for (un)satur. C12 to C18 fatty acids Fatty acids88A3 Multifunctional ent-kaurenoic acid oxidase Gibberellin 88A4 Multifunctional ent-kaurenoic acid oxidase Gibberellin 90A1 23-a-hydroxylase for 6-oxo-cathasterone Brassinolide 90B1 22-a-hydroxylase for 6-oxo-campestanol Brassinolide 90C1



















76C1 Geraniol-10-hydroxylase Sterol

710A2 Sterol C-22-desaturase Steroid710A1 Sterol C-22-desaturase Steroid

724A1 Exact substrate not identified Brassinolide

http://www.p450.kvl.dk/


35

constituent le groupe non A. En fonction des arbres phylogénétiques, les P450 de ce

groupe dériveraient de 4 à 6 ancêtres différents. Ces enzymes sont impliquées dans des

fonctions primordiales que l’on retrouve dans d’autres phylum (synthèse de stérol…)

(Werck-Reichhart et Feyereisen, 2000). La détermination de ces deux groupes basée sur

les alignements de séquence a été confirmée récemment par l’étude de l’organisation

des introns (Paquette et al., 2000). Une grande majorité des P450 du groupe A

possèdent un intron en position bien conservée. Au contraire, les séquences du groupe

non A, contiennent généralement plusieurs introns non conservés.

3.6 Rôles des P450 végétaux

Bien que la fonction de chacun des P450 végétaux soit loin d’être identifiée, il

apparaît déjà que cette famille d’enzyme est impliquée dans une grande variété de voies

métaboliques. L’ensemble des fonctions déjà identifiées se distribue en deux

catégories : le métabolisme de molécules endogènes et la dégradation de molécules

exogènes et d’herbicides.

3.6.1 Rôles des P450 dans les voies de biosynthèse

Les P450 participent à la biosynthèse de métabolites impliqués dans des

fonctions aussi diverses que le maintien de la plante (lignines), son interaction avec

l’environnement (anthocyanine, flavonoïdes, méthyl jasmonate…), sa défense vis à vis

des prédateurs (glucosinolates, glucosides cyanogéniques, alcaloïdes,

furocoumarines…) ou sa régulation hormonale (auxines, gibbérellines…). Le tableau I-

1 résumant toutes les fonctions de P450 identifiées chez Arabidopsis thaliana, illustre

bien la diversité des voies concernées.

Biosynthèse des phénylpropanoïdes et de ses dérivés

Dans la voie générale des phénylpropanoïdes, la cinnamate-4-hydroxylase

(C4H ; famille des CYP73A) représente le P450 végétal le plus étudié à ce jour. En

raison de son rôle central dans la voie des phénylpropanoïdes et de ses dérivés, l’activité

C4H est présente chez toutes les plantes. A l’heure actuelle, plus de quarante séquences

codant une C4H ont été déposées (http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450.html).

Les membres de la famille des CYP98 catalysent la méta-hydroxylation des esters p-



36

coumaroyl shikimate et quinate pour donner respectivement le caffeoyl shikimate et

l’acide chlorogénique (Schoch et al., 2001). Dans la voie des lignines, les CYP84

possèdent une activité férulate / coniféraldéhyde-5-hydroxylase (F5H) impliquée dans la

synthèse des unités syringyls (Humpreys et al., 1999). La voie de synthèse des

flavonoïdes et des anthocyanes fait intervenir un grand nombre de P450 parmi lesquels

nous pouvons citer la flavonoïde-3’-hydroxylase (F3’H ; CYP75B) (Brugliera et al.,

1999), la flavonoïde-3’5’-hydroxylase (F3’5’H ; CYP75A) (Kaltenbach et al., 1999), la

flavonoïde-6-hydroxylase (F6H ; CYP71D9) (Latunde-Dada et al., 2001) ou la

dihydroxyisoflavanone synthase (CYP93C2) (Akashi et al., 1999). L’étude et le

contrôle des activités P450-dépendantes d’hydroxylation des flavonoïdes suscitent un

double intérêt économique, d’une part en horticulture pour modifier la coloration des

fleurs et d’autre part dans le domaine de la santé car le pouvoir antioxydant de ces

molécules est lié à leur état d’hydroxylation (pour revue Koes et al., 2005 ; Schijlen et

al., 2004)

La voie des furocoumarines nécessite l’intervention de nombreux P450. Sur les

8 étapes permettant la synthèse du 8-MOP et du 5-MOP à partir du p-coumarate, 4 sont

catalysées par des P450. Actuellement, aucune séquence codant pour ces P450

(marmésine synthase, psoralène synthase, psoralène-5 et 8- monooxygénases) n’a

encore été isolée.

Biosynthèse d’acides gras modifiés

Les acides gras oxydés constituent des éléments de base pour la formation de la

cuticule des feuilles, première protection physique contre les pathogènes.

L’hydroxylation des acides gras courte et longue chaîne en position O

est catalysée par

deux familles de P450 : CYP86 et CYP94 (Benveniste et al., 1998 ; Tijet et al., 1998).

L’oxygénation d’acides gras polyinsaturés donne naissance à la famille des oxylipines,

des molécules de défense et de signalisation dont le représentant le plus connu est le

jasmonate. La synthèse de ces molécules fait intervenir la famille des CYP74 (Allène

oxyde synthase CYP74A, Hydroperoxyde lyase CYP74B et C ; Divinyl ester synthase

CYP74D), des P450 atypiques fonctionnant sans apport d’oxygène et sans pouvoir

réducteur (Howe et Schilmiller, 2002).


37

Métabolisme des terpènoïdes

Les terpènoïdes regroupent un large spectre de molécules aux propriétés aussi

diverses que des hormones (gibbérellines, brassinostéroïdes, acide abscissique), des

pigments (caroténoïdes), des transporteurs d’électrons (quinones) ou des molécules de

défense (menthol). Les brassinostéroïdes sont des phytohormones favorisant la croissance

de la plante. Elles dérivent du campestérol par deux voies de biosynthèse distinctes, dites

« C6-précoce » et « C6-tardive ». Dans ces voies de synthèse, interviennent deux familles

de P450 : CYP85 et CYP90 (Szekeres et al., 1996 ; Kim et al., 2005 ; Shimada et al., 2001).

Par ailleurs, CYP72B1 est responsable de l’inactivation de la brassinolide (la

brassinostéroïde la plus active) en l’hydroxylant en position 26 (Turk et al., 2003). Les

gibbérellines sont également des phytohormones régulant la croissance et le développement

des plantes. Leur voie de synthèse fait intervenir deux P450, la ent-kaurène oxydase

(CYP701A3) et la ent-kaurenoic oxydase (CYP88A), responsable de trois réactions

successives (Helliwell et al., 1998 ; Helliwell et al., 2001). Le catabolisme de l’acide

abscissique, une hormone impliquée notamment dans l’entrée en dormance des graines et la

fermeture des stomates, est contrôlé par la famille des CYP707 (Saito et al., 2004). La

description de la voie de synthèse du menthol a fait l’objet d’une revue récente (Croteau et

al., 2005). La voie de synthèse de ce monoterpène implique 8 étapes enzymatiques à partir

de l’isopentényl pyrophosphate (IPP). Une de ces étapes, l’hydroxylation du carbone C3 du

(-)-limonène, est catalysée par le CYP71D13 chez Mentha piperita.

Biosynthèse des alcaloïdes

Les alcaloïdes constituent un large groupe de molécules de structures variées

impliquées dans la défense de la plante. Les alcaloïdes se caractérisent par la présence d’un

atome d’azote dans un des hétérocycles. Ils dérivent généralement d’acides aminés ou de

leurs précurseurs (Tryptophane, Lysine, Ornithine…). Certains de ces métabolites, comme

les alcaloïdes terpéniques, sont dotés de propriétés pharmaceutiques majeures

(Vimblastine : anticancéreux ; Ajmaline : antiarhytmique…). Actuellement, trois séquences

de P450 de la voie des alcaloïdes terpéniques ont été isolées : la tabersonine-16-hydroxylase

(CYP71D12) ; la sécologanine synthase (CYP72A1) et la géraniol/nérol-10-hydroxylase

(CYP76B6) (Schröder et al. , 1999 ; Collu et al., 2001). La voie de synthèse de la berbérine

fait intervenir le CYP80B1 et le CYP719 (Pauli et Kutchan, 1998 ; Ikezawa et al., 2003). Le


38

2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one (DIMBOA) est un alcaloïde

responsable de la résistance aux pathogènes chez quelques monocotylédones. Quatre P450

de la famille des CYP71 (dénommés BX2, BX3, BX4 et BX5) se succèdent pour la

synthèse de ce métabolite (Frey et al., 1997, 2003 ; Glawischnig et al., 1999).

Biosynthèse des glucosinolates

Les glucosinolates sont des dérivés d’acides aminés possédant une liaison thio-

glucose ainsi qu’un sulfate lié à une fonction oxyme. Ils sont impliqués dans les interactions

plante-pathogène et constituent, pour l’Homme, une source de molécules préventives vis à

vis de certains cancers (pour revue Halkier et Du, 1997). La première étape de la synthèse

(formation de l’oxyme à partir de l’acide aminé) est catalysée par la famille des CYP79

(CYP79A1 et CYP79B1) (Sibbesen et al., 1995 ; Bak et al., 1998). L’oxyme est ensuite

pris en charge par des P450 de la famille des CYP83 pour donner un intermédiaire réactif

qui est ensuite conjugué avec une cystéine (Hemm et al., 2003).

3.6.2 P450 et dégradation de composés exogènes

En plus de leur implication dans les voies de biosynthèse, les P450 sont

responsables de l’inactivation de molécules exogènes, en particulier des herbicides et des

pesticides. L’inactivation s’opère généralement par hydroxylation ou déalkylation P450-

dépendante du substrat, suivie de la complexation avec un sucre et le stockage dans la

vacuole ou dans la paroi végétale (Schuler et Werck-Reichhart, 2003). Au vu de la grande

variété d’herbicides métabolisés (phénylurés, sulfonylurés, chloroacétamides…) et des

différentes réactions réalisées pour un même substrat, il semble qu’il y ait plusieurs P450

responsables de la détoxification dans chaque plante. La question se pose quant à la nature

des P450 impliqués dans ce processus. Sont-ils spécialisés dans la détoxification de ces

molécules, ou sont-ils des P450 de biosynthèse accessoirement capables de métaboliser des

herbicides? Certains P450 pourraient être spécialisés dans la détoxification. C’est le cas de

CYP76B1 d’Helianthus tuberosus. Cette enzyme catalyse la déalkylation de plusieurs

herbicides (chlortoluron, isoproturon, linuron) avec des vitesses de réaction élevées

(Robineau et al., 1998). Pour l’heure, aucune activité de biosynthèse ne lui a été attribuée.

Les travaux de Siminszky et de Yamada ont également montré la métabolisation de

l’isoproturon et du linuron par CYP71A10 et CYP71A11 (Siminszky et al., 1999 ;


39

Yamada et al., 2000, pour revue Werck-Reichhart et al., 2000 b.). Par ailleurs, certains

P450 impliqués dans le métabolisme secondaire comme CYP73A1, CYP71C6 et CYP81B1

(phénylpropanoïdes, DIMBOA et lipides respectivement) sont aussi capables de dégrader

certains herbicides (Pierrel et al., 1994 ; Cabello-Hurtado et al., 1998, Wen-Sheng et al,

2005).

3.7 Structure des P450

Les données structurales de plus d’une vingtaine de P450 sont actuellement

disponibles. Ces structures cristallisées concernent, pour la majorité, des P450

bactériens solubles plus facilement cristallisables que les formes eucaryotes associées à

la membrane du réticulum endoplasmique. L’obtention et l’analyse de ces structures ont

permis d’accroître considérablement les connaissances sur le fonctionnement et

l’architecture de ces enzymes, ainsi que leurs interactions avec les partenaires redox.

Dans le cas du P450 bactérien P450cam, pas moins de 36 structures ont été résolues à

différents stades du cycle catalytique et en présence de différents substrats et inhibiteurs

(http://www.rcsb.org/pdb/). La première structure d’un P450 eucaryote a été obtenue

récemment, en 2000 (soit 13 ans après le premier P450 bactérien) avec la résolution de

CYP2C5 (progestérone-21-hydroxylase) de lapin (Williams et al., 2000 a et b). Ce tour

de force a été réalisé en modifiant au préalable l’enzyme à l’origine associée au

réticulum endoplasmique, pour la rendre plus soluble. Pour ce faire, l’ancre

transmembranaire N-terminale a été tronquée et 5 acides aminés ont été remplacés dans

la région F-G impliquée dans l’association à la membrane (Cosme et Johnson, 2000).

Cette stratégie a été appliquée avec succès sur d’autres P450 de mammifères (CYP2B4)

et humains (CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4, CYP2A6) (Scott et al., 2003 ; Schoch et al.,

2004 ; Wester et al., 2004, Yano et al., 2004 ; Williams et al., 2004 ; Yano et al., 2005)

(cf. Liste des structures de P450 eucaryotes cristallisées en Annexes).

La principale information apportée par les structures cristallisées est que, malgré

des homologies de séquences très faibles entre les P450 procaryotes et eucaryotes (17 %

d’homologie entre CYP3A4 et CYP101) ainsi qu’entre P450 eucaryotes (24 %

d’homologie entre CYP3A4 et CYP2C5), l’architecture globale des enzymes est

conservée. Ces protéines sont composées d’une majorité d’hélices a (annotées de A à L)

http://www.rcsb.org/pdb/


40

Figure I-12 : Représentation de la structure tridimensionnelle de CYP2C5 complexé avec la progestérone L’hème est réprésenté en rouge et la progestérone en jaune. Les zones d’interaction membranaire sont en rouge sur la chaîne protéique. D’après Williams et al.. (2000) b.

aA aB aC aD aE aF aG aH aI aJ aK aL

F-X-X-G-X-R-X-C-X-G A/G-G-X-D/E-T-T/S

NH2- -COOH

Figure I-11 : Représentation schématique de la structure primaire d’un P450 eucaryote

Ancre membranaire Région SRS définies par Gotoh (1992)

Acides aminés basiques

Coude proline


41

et de quelques feuillets ß

s’associant en deux domaines globulaires a et ß

(Fig. I-11 ;

Fig I-12).

L’association des P450 eucaryotes à la membrane du réticulum endoplasmique fait

intervenir une hélice hydrophobe d’une vingtaine de résidus à l’extrémité N-terminale

de l’enzyme. Ces résidus hydrophobes sont suivis par quelques résidus basiques

délimitant l’ancre membranaire. Une région riche en proline (séquence consensus P-P-

G-P-X-P-X-P) définit un coude permettant au reste de l’enzyme de s’accoler à la

membrane. La substitution des résidus proline et glycine de la séquence consensus par

mutagenèse dirigée a montré que cette région est également importante pour le

repliement de la protéine (Chen et Kemper, 1996). D’après un modèle établi par

Kemper, cette région stabiliserait le repliement en établissant des interactions de type

Van der Waals avec d’autres résidus de la séquence (Tyr 61 ; Phe 219 ; Tyr 376 du

CYP 2C5) (Kemper, 2004). D’autres portions de la protéine participent à l’interaction

avec la membrane. Pour le CYP2C5, c’est le cas des régions 30-45, 60-69, 376-379 et

de la partie C-terminale de la boucle F-G qui est plus longue et plus hydrophobe que

chez les P450 procaryotes (Williams et al., 2000 b.).

L’hème est niché au cœur de l’enzyme dans un environnement hydrophobe,

entre les hélices L et I. L’atome de fer forme une liaison thio-ester avec une cystéine de

la séquence consensus F-X-X-G-X-R-X-C-X-G très conservée en amont de l’hélice L.

Le positionnement de l’hème est maintenu par l’interaction du propionate des cycles A

et D avec des résidus en amont des hélices L et C et du feuillet ß 2-2 (S426, R430,

W120, R124 et H365 chez CYP2C5). L’hélice I, qui compose une partie du site actif,

contient une autre séquence consensus (A/G-G-X-D/E-T-T/S) impliquée dans

l’activation de l’oxygène. Les régions de l’enzyme responsables de l’entrée et du

positionnement du substrat à proximité de l’hème (dénommées SRS pour Substrate

Recognition Site) ont été définies dans un premier temps pour la famille des CYP2 en se

basant sur les données des P450 bactériens (Gotoh, 1992) (Fig I-11). Le positionnement

de ces SRS a depuis été confirmé par des travaux de mutagenèse dirigée. Ces SRS sont

numérotés de 1 à 6 et correspondent, chez CYP2C5, à la boucle B-C (SRS1), la face

interne des hélices F et G (SRS2 et SRS3), l’hélice I (SRS4), la région entre l’hélice K

et le feuillet ß1-4 (SRS5) et la boucle entre les deux brins du feuillet ß 4-1 (SRS 6)


42

(Williams et al., 2000 b.). La position de ces SRS semble bien conservée entre P450 en

particulier pour les SRS1, 4, 5 et 6. Suivant les P450, l’accès du substrat au site actif fait

intervenir deux canaux différents. Le premier fait passer le substrat par la boucle F-G

(correspondant aux SRS2 et 3). Du fait de la nature hydrophobe de cette région et de

son rôle dans l’adhésion membranaire, ce canal semble adapté à des substrats lipophiles.

Un autre canal, initialement démontré chez le CYP51 de Mycobacterium tuberculosis,

permet l’entrée par la boucle B-C (Podust et al., 2001). Des travaux de mutagenèse

dirigée sur cette région vont dans le sens de l’existence de ce canal chez certains P450

eucaryotes, comme CYP4A2 et CYP2B6 (Hoch et al., 2000 ; Domanski et al., 1999).

Les dernières structures de CYP2C5 et CYP2B4 en présence de substrats ou

d’inhibiteurs ont permis de mettre en évidence une grande flexibilité des hélices F et G

et de la boucle B-C, le reste de la protéine demeurant relativement stable (Wester et al.,

2003 a et b ; Scott et al., 2004). Au contraire, dans le cas de CYP3A4, l’arrivée de

l’inhibiteur métapyrone dans le site actif ne provoque aucune modification de structure

(Williams et al., 2004).

3.8 Etude des relations structure-fonction des P450

La résolution des structures tridimensionnelles de P450 procaryotes et plus

récemment de P450 membranaires de mammifères représente une grande avancée pour

la compréhension des relations structure-fonction de ces enzymes. Dans l’industrie

pharmaceutique notamment, ces structures sont des outils de choix pour le

développement de nouveaux agents thérapeutiques et la prédiction de leur dégradation

par les P450. En ce sens, les formes cristallisées de CYP2C9 et CYP3A4, deux P450

humains impliqués dans la détoxification de xénobiotiques, se révèlent particulièrement

intéressantes.

L’obtention de structures de P450 membranaires reste néanmoins complexe,

principalement à cause des fortes quantités de détergents nécessaires à la solubilisation

des enzymes mais qui perturbent leur cristallisation. Actuellement, six P450

membranaires représentant seulement 2 familles (CYP2 et 3) ont été cristallisés. Devant

le nombre grandissant de P450 isolés (en grande partie grâce aux campagnes de

séquençage du génome humain, d’Arabidopsis, du riz…), des méthodes d’étude


43

alternatives se sont développées. Les deux plus notables sont la modélisation par

homologie (ou comparative) et la mutagenèse qui se révèlent être très complémentaires.

3.8.1 Modélisation par homologie

La modélisation par homologie est basée sur l’observation que deux protéines

possédant une forte homologie de leur séquence primaire ont tendance à adopter une

structure 3D similaire (Chothia et Lesk, 1986). Il est donc possible de prédire la

structure d’une protéine en disposant seulement de sa séquence primaire et de la

structure 3D d’une protéine relativement proche. Le modèle obtenu, bien que moins

précis que les structures 3D expérimentales, permet d’étayer des hypothèses sur le rôle

fonctionnel de certains acides aminés qui seront confirmées par un travail de

mutagenèse dirigée. La génération du modèle implique une étape de création propre du

modèle et une étape de validation de ce dernier (pour revue, Kirton et al., 2002 ; Kemp

et al., 2005).

Création du modèle

La modélisation par homologie nécessite de disposer (i) de la séquence primaire

de la protéine d’intérêt et (ii) de la structure 3D des protéines les plus proches (appelées

références), accessible à partir de la banque de donnée des protéines (PDB)

(http://www.rcsb.org/pdb/). L’étape critique dans la construction du modèle est

l’alignement de la protéine d’intérêt avec les protéines de références. Dans le cas des

P450, cette étape est particulièrement délicate à cause de la faible conservation des

séquences primaires (souvent pas plus de 20 % d’homologie entre deux familles). Un

soin particulier est donc apporté pour (i) aligner correctement les résidus très conservés

dans les séquences consensus décrites précédemment et (ii) limiter au maximum le

nombre d’insertion/délétion dans les hélices a

et les feuillets ß.

Une fois que

l’alignement est réalisé, le modèle 3D peut être élaboré via différents programmes

(MODELLER, COMPOSER, SWISS-MODEL, MOE…).

Validation du modèle

La qualité du modèle peut être estimée par un ensemble de tests

complémentaires et indépendants. Ces tests consistent en général à comparer des



44

paramètres calculés à partir du modèle avec ceux définis pour les structures 3D déjà

résolues. Trois aspects principaux sont mesurés par ces tests :

- La qualité stéréochimique : ces tests permettent de mesurer la présence de

molécules ou d’atomes mal configurés (liaisons ou angles aberrants,

conformation des acides aminés en cis…). Un test couramment utilisé est

l’établissement du diagramme de Ramachandran qui permet d’évaluer la

distribution des angles f et des acides aminés composant la protéine.

- La qualité de l’environnement moléculaire : ces tests mesurent les énergies

d’interaction de chaque résidu avec le reste de la protéine. Le programme

Prosa II permet d’établir un profil d’énergie sur toute la protéine. Les

zones à haute énergie (caractérisées par un Z-score positif) reflètent des

régions de la protéine mal conformées.

- La stabilité thermodynamique : dans ce type de test dit de dynamique

moléculaire, les réarrangements structuraux du modèle soumis à des

conditions données (température, pression …) sont mesurés pendant 100 à

200 ps. La stabilité des structures secondaires du modèle est un indicateur

de bonne qualité.

3.8.2 Mutagenèse dirigée

La mutagenèse dirigée est une technique, née au début des années 80, qui permet

d’identifier les acides aminés impliqués dans la fonction de l’enzyme. L’étude de

mutants représente un outil complémentaire à la modélisation pour l’analyse des

relations structure / fonction des P450. Par cette méthode, de nombreux travaux ont

décrit des résidus impliqués dans la reconnaissance du substrat ou d’inhibiteurs et ont

confirmé l’importance des régions SRS définies par Gotoh (Gotoh, 1992 ). D’autres

travaux portés sur l’interaction des P450 avec leur partenaire rédox, ont mis en évidence

le rôle des résidus des hélices C et G pour la fixation de la réductase (pour revue,

Hlavica et al., 2003).

L’analyse structure / fonction de P450 végétaux reste encore peu développée en

comparaison de ce qui est fait pour les P450 humains en particulier. Deux articles

portant sur CYP93C2 et CYP94A2 décrivent l’importance des résidus Serine 310


45

(SRS4) et Lysine 375 (SRS5) d’une part et de la Phénylalanine 494 (SRS6) d’autre part,

pour la régio-sélectivité d’hydroxylation de leur substrat respectif (Kahn et al., 2001 ;

Sawada et al., 2002). La cinnamate-4-hydroxylase d’Helianthus tuberosus (CYP73A1)

a servi de modèle pour identifier le rôle d’acides aminés inhabituels spécifiques aux

P450 végétaux. Ces travaux ont ainsi montré que la Proline 448 est essentielle pour

l’incorporation de l’hème dans l’apoprotéine et que les Alanines 306 et 307 de l’hélice I

sont impliquées dans la stabilité de l’enzyme et dans le positionnement du substrat

(Schalk et al., 1999). Les travaux de Schoch ont par ailleurs décrit l’Asparagine 302

(SRS4), l’Isoleucine 371 (SRS5) et la Lysine 484 (SRS6) comme résidus critiques pour

la fixation du substrat (Schoch et al., 2003). Plus récemment, l’importance des résidus

Sérine 368 (SRS5) et Isoleucine 486 (SRS6) pour la régio-spécificité de l’hydroxylation

du 5-épiaristolochène par CYP71D20 a été mise en évidence par l’étude d’un modèle

3D de l’enzyme, puis confirmée par mutagenèse dirigée (Takahashi et al., 2005). Enfin,

le rôle de la Phénylalanine 363 dans la régio-spécificité de l’hydroxylation du limonène

par CYP71D15 a été démontrée par une approche de « domain swapping » (Schalk et

Croteau, 2000).

3.9 P450 et inactivation autocatalytique

3.9.1 Les inactivateurs autocatalytiques : définition

Les inactivateurs autocatalytiques ont été décrits pour la première fois par

Helmkamp et al. (1968). Ce sont des analogues de substrats capables d’entrer dans le

site actif de l’enzyme et d’être métabolisés. La métabolisation de ces molécules aboutit

à la formation d’un intermédiaire réactif qui se fixe de manière irréversible ou quasi-

irréversible au sein du site actif de l’enzyme provoquant son inactivation. Ce type

d’inhibiteur est également nommé inhibiteur suicide (en anglais Mechanism-Based

Inactivators, MBI) car sa métabolisation par l’enzyme est assimilable à un acte de

suicide. Les inhibiteurs suicides sont potentiellement plus efficaces et plus sélectifs que

les inhibiteurs classiques (compétitifs et non compétitifs). Ils doivent être assez proches

du substrat naturel pour être acceptés et métabolisés par l’enzyme. De plus, les enzymes

inactivées de façon irréversible sont retirées du pool catalytique. Dans le cas des P450,

on peut distinguer quatre types de MBI en fonction du type de liaison covalente mis en


46

jeu : (i) ceux qui se fixent de façon quasi-irréversible sur le fer de l’hème, (ii) ceux se

fixant irréversiblement à la protéine, (iii) ceux se fixant irréversiblement à l’hème et

enfin (iv) ceux provoquant la dégradation de l’hème.

3.9.2 Caractérisation d’un MBI

Plusieurs critères sont requis pour démontrer l’inactivation autocatalytique d’une

enzyme par une molécule (pour revue Silverman, 1996). Ils comprennent : (i)

l’implication d’une étape catalytique nécessaire à l’inactivation, (ii) une inhibition

dépendante du temps d’incubation et de la concentration de l’inhibiteur, (iii) une

saturation de la vitesse d’inhibition pour de fortes concentrations en inhibiteur, (iv) un

rapport entre le nombre de moles d’inactivateurs fixés et d’enzymes inactivées qui tend,

après une longue incubation, vers une stœchiométrie de 1:1, (v) la protection de

l’enzyme par la présence du substrat et (vi) une fixation de l’inhibiteur avant sa sortie du

site actif.

Figure I-13 : Représentation de la cinétique d’inactivation de CYP73A1 par le psoralène.

L’insert correspond à la représentation de Kitz-Wilson permettant de définir le t1/2 et le Ki. D’après Gravot et al., 2004

2,5

3

3,5

4

4,5

0 2 4 6 8 10

Preincubation time with psoralen (min)

Ln (

% o

f res

idua

l CY

P73

A1

activ

ity)

2µM4µM10µM50µM

0

5

10

0 0,25 0,51 / [psoralen](µM-1)

t1/2

(m

in)

[inh

ibite

ur]

2,5

3

3,5

4

4,5

0 2 4 6 8 10

Preincubation time with psoralen (min)

Ln (

% o

f res

idua

l CY

P73

A1

activ

ity)

2µM4µM10µM50µM

0

5

10

0 0,25 0,51 / [psoralen](µM-1)

t1/2

(m

in)

[inh

ibite

ur]


47

Le MBI se caractérise par deux constantes cinétiques. Le kinact définit la vitesse

d’inactivation de l’enzyme pour une concentration saturante d’inactivateur. Cette

constante est généralement exprimée en min-1. Le KI quant à lui, représente l’affinité de

l’enzyme pour l’inactivateur. De même que pour le Km, qui caractérise l’affinité d’une

enzyme pour son substrat, plus la valeur de KI est faible plus l’affinité pour

l’inactivateur est forte. De façon plus synthétique, le rapport kinact/KI (KI exprimé en mM

et kinact en min-1) permet d’évaluer l’efficacité d’un inactivateur pour une enzyme

donnée. Plus ce rapport est proche de 0 moins l’inactivateur est efficace.

Le KI et le kinact peuvent être déterminés de façon expérimentale. L’enzyme est

préincubée en présence de 4 ou 5 concentrations d’inactivateur. Après différents temps

de préincubation, l’activité résiduelle de l’enzyme est mesurée en présence du substrat

saturant. Les valeurs d’activité résiduelle après préincubation en présence d’inactivateur

sont rapportées en % de la valeur de l’activité résiduelle d’un témoin préincubé sans

inactivateur. Une représentation des résultats en semi-log népérien permet de tracer les

droites de régression linéaire et de calculer une constante d’inactivation k (la pente de la

droite de régression) et une demi-vie (t1/2 = Ln(2)/k) pour chaque concentration en

inactivateur (Fig. I-13). Les t1/2 sont ensuite exprimés en fonction de l’inverse de la

concentration en inhibiteur dans une représentation dite de Kitz-Wilson. Les points

obtenus dessinent une droite qui coupe l’axe des ordonnées positives, ce qui indique que

la vitesse d’inactivation est saturée pour de fortes concentrations en inactivateur. Ce

point d’intersection détermine le t1/2max (temps de demi-vie de l’enzyme en

concentration saturante d’inactivateur). Le point d’intersection de la droite avec l’axe

des abscisses permet d’obtenir la valeur du –1/ KI à partir duquel est défini le KI. Le

kinact est calculé par la relation kinact = Ln(2)/ t1/2max

3.9.3 MBI de P450

De multiples MBI de P450 ont déjà été identifiés. Ces molécules possèdent

généralement une fonction activable par le P450 de type amine, méthylène dioxy,

hydrazine ou acétylène. Les molécules contenant un noyau furane dont les

furocoumarines ont également été décrites comme des MBI efficaces de P450 (Sahali-

Sahly et al., 1996 ; Fouint-Fortunet et al., 1986). L’inactivation autocatalytique des

furocoumarines sur les P450 pourrait représenter un moyen de défense des plantes vis à


48

vis des insectes ravageurs. Plusieurs P450 d’insecte, dont CYP6D1 sont en effet

inactivés par les dérivés du psoralène (Scott, 1996). Les travaux de Zumwalt et Neal

(1993) ont, par ailleurs, montré que chez Papilio polyxenes, un insecte se nourrissant

majoritairement de plantes productrices de furocoumarines, les P450 sont globalement

plus résistants à l’inactivation par ces molécules en comparaison d’espèces apparentées

ne se nourrissant pas de plantes à furocoumarines.

La majorité des études d’inactivation a été réalisée sur des P450 de mammifère

et notamment sur les familles CYP2 et CYP3 (Roberts et al., 1997 ; Blobaum et al.,

2005 ; Lightning et al., 2000) impliquées principalement dans la détoxification de

xénobiotiques. En tant qu’inhibiteurs spécifiques et irréversibles, les MBI sont en effet

susceptibles de modifier la clearance des médicaments normalement dégradés par les

P450. Des études ont ainsi montré que CYP3A4, qui métabolise 45 à 60 % des

médicaments, est inhibé par la bergamottine, une furocoumarine contenue dans le jus de

pamplemousse (Zhou et al., 2004). Au début des années 90, les MBI capables de se

fixer covalemment sur la partie protéique des P450, ont été utilisés pour identifier des

peptides voire des acides aminés présents dans le site actif de l’enzyme et impliqués

dans la métabolisation du substrat. Cette approche a été utilisée avec succès sur

CYP2B1 inactivé par le 2-éthynylnaphtalène (2EN), ce qui a permis d’identifier et de

localiser la thréonine 302 dans le site actif (Roberts et al., 1993). Les travaux portant sur

l’inactivation de CYP2A6 et CYP2B1 par le 8-MOP ont montré que ce dernier est

converti en un furanepoxyde capable de se fixer sur un acide aminé nucléophile du site

actif. La nature des acides aminés adduits n’a toutefois pas été déterminée (Koenigs et

Trager, 1998). L’inactivation de CYP3A4 par le L-754,394, molécule synthétique

possédant un noyau furane comme le 8-MOP, est également initiée par la formation

d’un intermédiaire furanepoxyde qui pourrait se fixer sur le glutamate 307 situé dans

l’hélice I et participant au site actif (Chiba et al., 1995 ; Lin et al., 1995).

4 La cinnamate-4-Hydroxylase

La cinnamate-4-hydroxylase est le P450 végétal le plus étudié à ce jour. Cette

enzyme catalyse la conversion du cinnamate en p-coumarate, première réaction

oxydative de la voie des phénylpropanoïdes. L’activité C4H a été rapportée très tôt, il y


49

a bientôt 40 ans, dans des pousses de Pisum sativum (Russel et Conn, 1967). Depuis,

cette activité végétale a été détectée dans de très nombreuses plantes supérieures. La

C4H joue, en effet, un rôle majeur dans la synthèse des phénylpropanoïdes et en

particulier des lignines. Récemment, cette activité a été également rapportée chez une

bryophyte (Petersen, 2003).

4.1 Description de la famille des CYP 73

En raison de l’instabilité et de la localisation membranaire des cytochromes

P450, la C4H est longtemps restée difficile à purifier. C’est seulement au début des

années 90 que deux équipes réussirent ce tour de force en isolant l’enzyme à partir de

tubercules de topinambour (Helianthus tuberosus) (Gabriac et al., 1991) et de plantules

de soja (Phaseolus aureus) (Mizutani et al., 1993 a.). La séquence des protéines

purifiées permit ensuite d’isoler les ADNc correspondants (Teutsch et al., 1993 ;

Mizutani et al., 1993 b.). Ces deux protéines, identiques à plus de 80%, présentaient

moins de 40% d’homologie avec les P450 isolés précédemment. Au regard de la

nomenclature, elles constituaient les deux premiers membres d’une nouvelle famille :

les CYP73. Les données apportées par les séquences des deux premières C4H ont

permis le clonage de nombreux orthologues par PCR ou criblage de banques de tissus

élicités (Ro et al., 2001, Hubner et al., 2003). Actuellement, la famille des CYP73 est

composée de 47 membres issus de différentes plantes et codant tous des C4H.

4.2 Les C4H de type II

Les CYP73 constituent une famille d’enzyme homogène dont les membres, pour

la plupart, sont homologues à plus de 80 %. Six séquences, issues de Zea mays

(CYP73A8), Phaseolus vulgaris (CYP73A15), Mesembryanthemum crystallinum

(CYP73A22), Nicotiana tabacum (CYP73A27 et CYP73A28) et Citrus sinensis

(CYP73A29), présentent néanmoins des divergences importantes. Leur homologie de

l’ordre de 60 %, avec les autres membres, bien que faible, assure leur appartenance à la

sous-famille des CYP73A. Néanmoins, pour les différencier des séquences plus

classiques, elles ont été dénommées C4H de type II (Nedelkina et al ., 1999).


50

Les C4H de type II se distinguent par une extrémité N-terminale plus longue

(une vingtaine d’acides aminés supplémentaires) riche en résidus sérine et thréonine et

dépourvue du cluster d’acides aminés basiques responsables de l’arrêt du transfert de

l’ancre membranaire. Cette région N-terminale atypique pourrait favoriser le ciblage de

la C4H dans un autre compartiment subcellulaire que le réticulum endoplasmique

(Nedelkina et al., 1999). Plusieurs autres divergences existent dans la séquence (petites

délétions, insertions) mais leur localisation reste spécifique à chaque individu. Les C4H

de type II présentent également un pI de l’ordre de 8,5, légèrement inférieur à celui des

types I estimé à 9,5-10 (Nedelkina et al., 1999 ; Betz et al., 2000). En dépit de ces

modifications, les C4H de type II possèdent une activité C4H avec des constantes

catalytiques comparables aux types I. Ceci peu paraître étonnant lorsqu’on sait que la

substitution d’un ou de quelques acides aminés chez un P450, peut provoquer de

profondes modifications de son activité catalytique (Lindberg et Negishi, 1989).

Le rôle de ces enzymes de type II n’est pas encore clarifié et n’est sans doute pas

généralisable dans toutes les plantes. Il est en effet étonnant de constater que certaines

plantes comme Citrus sinensis ou Zea mays possèdent les deux types de C4H, alors que

chez les autres, seul un des deux types a été identifié. Dans le cas de l’étude de

CYP73A15, les auteurs avancent l’hypothèse d’une fonction liée à la lignification. En

effet, la quantité de transcrits de CYP73A15 augmente fortement dans les cellules de

Phaseolus vulgaris entrant en xylogenèse (Nedelkina et al., 1999). Les auteurs étudiant

la C4H de type II de Citrus sinensis, CYP73A29, posent quant à eux, l’hypothèse d’un

rôle dans la réponse au stress (Betz et al., 2001). Cette isoforme de type II n’est

exprimée que dans des tissus soumis à un stress « blessure » au contraire de l’isoforme

de type I dont l’expression bien qu’élicitable, est constitutive.

4.3 Expression et régulation de la C4H

La régulation de l’expression de la C4H a fait l’objet d’études dans la plante

entière et dans les cellules en culture. La C4H est une enzyme exprimée de façon

constitutive dans les tissus ligneux et plus généralement dans les tissus dont la voie des

phénylpropanoïdes est active (Koopmann et al., 1999 ; Zhao et al., 2005). L’expression

de cette enzyme est augmentée en réponse à de nombreux stress comme la lumière, les


51

blessures et les infections de pathogènes (Benveniste et al., 1976 ; Bell-Lelong et al.,

1997 ; Hubner et al., 2003, Fahrendorf et Dixon, 1993). Cette induction de l’expression

est principalement régulée au niveau transcriptionnel (Weisshaar et Jenkins, 1998).

L’utilisation de techniques de localisation in situ (hybridation in situ, protéines

étiquetées avec la GFP…) a permis de montrer que l’expression spatio-temporelle de la

C4H est corrélée à celles de la PAL et de la 4CL (Bell-Lelong et al., 1997 ; Koopmann

et al., 1999 ; Reinold et Hahlbrock, 1996). L’analyse des promoteurs a d’ailleurs permis

de déterminer la présence de plusieurs éléments cis conservés pour ces trois gènes.

Certains de ces éléments, comme les boîtes P, L et H peuvent fixer des facteurs de

transcription du type Myb et bHLH en réponse aux stress « lumière », « UV »,

« blessure » et « infection par un pathogène » (Whitebred et Schuler, 2000 ; Zhao et al.,

2005). Jin et al. (2000) ont pu identifier chez Arabidopsis thaliana le facteur de

transcription AtMyb4 et montrer qu’il agit comme répresseur de l’expression du gène

de la C4H. Des plantes déficientes pour AtMyb4 présentent en effet un niveau

d’expression élevé de la C4H et des teneurs en sinapoyl esters plus élevées leur

conférant une plus grande résistance aux UV. AtMyb4 pourrait agir soit en réprimant

directement l’expression de gène, soit en entrant en compétition avec les autres facteurs

activateurs.

Des mécanismes post-transcriptionnels pourraient également participer au

contrôle de l’activité C4H. La C4H de type II de Phaseolus vulgaris, possède un site

potentiel de phosphorylation dans sa partie N-terminale, mais son rôle n’a cependant

pas été déterminé (Nedelkina et al., 1999). Les gènes de C4H contiennent tous un ou

deux introns dont les positions sont bien conservées (Whitebred et Schuler, 2000 ;

Urban et al., 1997). Il est intéressant de noter que dans des cultures de Phaseolus

vulgaris l’efficacité de l’épissage de CYP73A15 semble dépendre des conditions de

culture (Nedelkina et al., 1999).

4.4 Modification de l’activité C4H in vivo

Depuis une dizaine d’année, grâce au développement des techniques de

transgenèse, de nombreux travaux se sont portés sur la compréhension et le contrôle de la

voie de synthèse des monomères de lignine. La lignine revêt une importance économique


52

Tableau I-2 : Résumé des constantes d’activité C4H des différents CYP73

Tableau I-3 : Constantes d’inhibition des principaux inhibiteurs de C4H

D’après Schoch et al., 2002 et Gravot et al., 2004

CYP Km (µM)Activité spécifique

(pkat.mg-1prot.tot.)kcat (min-1) Références

73A1 5 313 ± 5 297 Pierrel et al., 199473A1 1,9 ± 0,3 683 ± 23 70,2 ± 1,7 Schalk et al., 199973A1 157 ± 15,3 Schoch et al., 200173A1 287 Schoch et al., 200173A1 1 ± 0,2 129,1 ± 15,7 Gravot et al., 200473A5 8 ± 2 200 ± 20 Urban et al., 199773A5 68 Mizutani et al., 1997

73A10 5 10^6 Koopmann et al., 199973A15 6,4 ± 0,7 168 ± 15 Nedelkina et al., 1999

73A1/A15 2,3 ± 0,2 183 ± 2 Nedelkina et al., 199973A17 11 ± 2 Batard et al., 2000

73A17R3 148 ± 3 Batard et al., 200073A32 1 ± 0,1 161,8 ± 1,4 Gravot et al., 200473A41 8,9 2,5 Hubner et al., 2003

73 A.agrestis 5 Petersen 2003

Inhibiteurs Compétitif

KI (µM) kinact (min-1) Ki (µM)MBI3PB 10,5 0,3464PO 580 0,224PB 53 0,41

3-(2,4-Dichlorophenox

y)-1-propyne94 0,122

PIP 17 0,064Psoralène 5,4 0,243

8MOP 4,8 0,289réversibles

3PA 22HN 0,048

MBI


53

particulière notamment dans l’industrie papetière où son élimination est coûteuse et

polluante, et en élevage où elle constitue un facteur limitant pour la digestibilité des

fourrages. La possibilité de moduler l’expression de chacune des enzymes impliquées

dans cette voie de synthèse permet d’évaluer leur importance (pour revue, Anterola et

Lewis, 2002). Dans cette démarche, les effets d’une dérégulation des C4H de type I et II

ont été mesurés. Les travaux réalisés dans le laboratoire du Dr. Dixon ont montré que la

réduction de l’activité C4H chez le tabac par des constructions antisens avec une C4H de

type I, a pour conséquence une diminution proportionnelle de la quantité de lignine totale

ainsi qu’une baisse de la proportion en unités syringyl (Sewalt et al., 1997). Dans ces

mêmes plantes, il a été montré que l’activité de la PAL se trouve également réduite. Les

auteurs en tirent la conclusion que la PAL est régulée par le cinnamate par un mécanisme

de feed-back (Blount et al., 2000). Les détails de cette régulation (inhibition enzymatique,

répression de la transcription…) sont encore à éclaircir. De la même façon qu’avec les

C4H de type I, les constructions antisens de C4H de type II dans le tabac se caractérisent

par une légère réduction de la teneur en lignine (Blee et al., 2001).

De manière plus générale, moduler l’expression de la C4H est susceptible de

modifier les teneurs des nombreux phénylpropanoïdes présents dans la plante. En

parallèle de leurs études sur la composition de la lignine, Blount et al. (2000) ont

observé une réduction des teneurs en acide chlorogénique et en ester de cafféate dans les

tabacs portant les constructions antisens de C4H de type I. Les mêmes auteurs ont

également mis en évidence l’accumulation d’acétosyringone dans des cellules de tabac

surexprimant la C4H de luzerne (Blount et al., 2002). Un fait étrange est que, malgré la

surexpression constitutive de la C4H, l’accumulation d’acétosyringone n’est observée

qu’après élicitation des cellules par des extraits de levure. L’impact de la C4H sur la

synthèse des esters sinapoyl a été mis en évidence en modulant l’expression du facteur

de transcription AtMyb4 (cf. § 4.4). L’utilisation d’inhibiteurs de C4H a également été

décrite dans des cultures cellulaires de tabac pour rediriger les voies métaboliques et

favoriser l’accumulation de métabolites en amont de la C4H. Deux inhibiteurs

autocatalytiques, l’acide pipéronylique (PA) et l’acide 4-propynyloxybenzoique (4PB),

provoquent ainsi l’accumulation d’acide salicylique dans des cultures de tabac élicitées

(Schoch et al., 2002). Des travaux précédents réalisés sur ces mêmes cultures cellulaires


54

ont par ailleurs, montré que le PA induit une accumulation de cinnamate et une déplétion en

p-coumarate et scopolétine, deux métabolites en aval de la C4H (Schalk et al., 1998).

L’impact d’une modulation de l’activité de la C4H sur la synthèse des

furocoumarines a été étudié au laboratoire dans le cadre de la thèse de K. Lièvre

(Lièvre, 2004). Des plantules de rue ont été transformées pour surexprimer leur propre

gène de C4H sous le contrôle d’un promoteur constitutif 35 S. Les transformants

obtenus ont ensuite été analysés pour leurs teneurs en furocoumarines. Ces derniers

présentent un rapport [(5-MOP + 8-MOP) / psoralène] légèrement plus élevé que les

plantes sauvages. La surexpression de la C4H aurait ainsi un effet positif sur les étapes

en aval de méthoxylation du psoralène. Ces résultats nécessitent néanmoins d’être

confirmés avant d’en tirer une conclusion définitive.

4.5 Caractérisation biochimique

Les premiers travaux de caractérisation de l’activité C4H ont été réalisés à partir

de microsomes de tubercules de topinambour (Benveniste et al., 1976). Dans de

nombreux cas, l’activité C4H a été démontrée et étudiée en exprimant la protéine dans

un système hétérologue : expression dans des cellules d’insecte dans le cas du

CYP73A5 d’Arabidopsis thaliana (Mizutani et al., 1997), dans des bactéries pour le

CYP73A4 de Catharanthus roseus fusionné à une réductase (Hotze et al., 1995), mais

le système d’expression le plus utilisé demeure celui dans les levures WAT 11 et

WAT 21 (Urban et al., 1997). Ces souches de levure, modifiées pour exprimer une

réductase d’Arabidopsis thaliana (AthR1 pour WAT 11 et AthR2 pour WAT 21)

permettent d’obtenir de très bonnes activités spécifiques. Elles ont été utilisées

notamment pour l’expression du CYP73A1 de topinambour, du CYP73A32 de rue, du

CYP73A13 de Populus tremuloides, du CYP73A19 de Cicer arietinum ainsi que pour

d’autres P450 végétaux (Overkamp et al., 2000 ; Ro et al., 2001 ; Batard et al., 1998,

Gravot et al., 2004). Les études biochimiques les plus complètes ont été réalisées sur le

CYP73A1 d’Helianthus tuberosus (Pierrel et al., 1994). Cette enzyme présente un

spectre de substrat assez restreint. Le cinnamate est biensûr le substrat préférentiel avec

des constantes d’affinité (Km) inférieures à 10µM et des vitesses de métabolisation

importantes (kcat de 100 à 300 min-1) (Tab. I-2) (Pierrel et al., 1993 ; Gravot et al.,


55

2004 ; Hubner et al., 2003). La métabolisation peu efficace de quelques substrats

artificiels ou exogènes comme le 7-éthoxy-coumarine, le chlortoluron et le 2-naphtoate

ont été rapportés (Pierrel et al., 1994 ; Schalk et al., 1997). D’une manière générale, les

molécules acceptées par la C4H sont des molécules planes, aromatiques, de petite taille

possédant un site anionique à l’opposé du site d’hydroxylation.

4.6 Inhibition de la C4H

Les études contribuant à la caractérisation biochimique exhaustive de CYP73A1,

ont permis d’identifier plusieurs inhibiteurs efficaces de l’activité C4H. Ils se

distribuent en deux catégories : les inhibiteurs compétitifs, comme le 2-hydroxy-1-

naphtoate (2HN) et le trans-3-(pyrid-4-yl)-acrylic acid (3PA), et les inactivateurs

autocatalytiques (Pierrel et al., 1993 ; Schalk et al., 1997). Les quatre inactivateurs

autocatalytiques (Tab. I-3) définis par Schoch et al. (2002) sont des molécules

structurellement proches du cinnamate possédant soit une fonction alkyne terminale,

soit une fonction méthylènedioxy. Ces inactivateurs autocatalytiques s’avèrent être des

molécules intéressantes pour moduler le métabolisme des phénylpropanoïdes in vivo.

L’addition d’acide pipéronylique dans des cultures cellulaires de tabac provoque d’une

part l’accumulation d’acide salycilique et d’autre part une carence en scopolétine

(Schalk et al., 1998 ; Schoch et al., 2002)

5 Objectif de thèse : étude fonctionnelle et clonage de P450 de la voie de biosynthèse des furocoumarines

En dépit d’un intérêt thérapeutique reconnu, et malgré le développement récent

de stratégies de clonage de plus en plus élaborées, la voie de biosynthèse des

furocoumarines reste un champ d’investigation encore peu exploré au niveau

moléculaire, contrairement à celle d’autres métabolites secondaires comme le taxol, ou

la famille des alcaloïdes (Walker et Croteau, 2001 ; Facchini, 2001). La thématique

« Furocoumarines », mise en place au laboratoire Agronomie et Environnement en

1998, a très nettement évolué, passant d’une approche agronomique de la production de

furocoumarines à une approche désormais moléculaire de l’étude de la voie de synthèse

développée il y a maintenant 6 ans.


56

Les efforts dans la recherche de gènes impliqués dans la biosynthèse de ces

molécules sont concentrés sur la famille des P450 car (i) ils participent à plus de la

moitié des étapes de cette voie (4 à 5 étapes sont catalysées par des P450 sur les 8

spécifiques de la voie) et (ii) ce sont des enzymes possédant des vitesses d’activité

relativement faibles qui en font souvent des étapes limitantes et donc de bons candidats

pour une démarche de génie métabolique destinée à augmenter la synthèse de ces

molécules. Avant mon arrivée au laboratoire, un premier gène de P450 (CYP73A32),

codant une C4H, a été cloné chez la plante modèle productrice de furocoumarines Ruta

graveolens. Comme de nombreux P450 de mammifères et d’insectes, CYP73A32 est

sensible à l’inactivation autocatalytique de deux furocoumarines, le psoralène et le 8-

MOP. Cependant cette inactivation est faible comparée à celle d’une C4H de

topinambour (CYP73A1), plante ne produisant pas de furocoumarines. Le niveau

d’inhibition de CYP73A10 codant une C4H de persil qui contient aussi des

furocoumarines, est comparable à celui de CYP73A32, laissant supposer que ces deux

enzymes ont évolué afin de pouvoir fonctionner dans un environnement riche en

furocoumarines. La spécificité d’un P450 pour un substrat est souvent gouvernée par un

petit nombre d’acides aminés et il n’est pas rare que deux P450 fortement homologues

présentent une spécificité de substrat ou une sensibilité à un inhibiteur différentes

(Lindberg et Negishi, 1989 ; Strobel et al., 1999 ). Un premier objectif de mon travail

de thèse était de déterminer quelle base moléculaire définit la sensibilité différentielle

vis à vis des furocoumarines observée entre les C4H de plantes productrices de

furocoumarines et celles de plantes n’en produisant pas. Cette étude a été abordée par

l’utilisation d’outils devenus essentiels dans l’analyse structure-fonction d’une

protéine : la chiméragenèse, la mutagenèse dirigée ainsi que l’étude de modèles

tridimensionnels. Les résultats de ces travaux seront présentés dans le chapitre III.

Le deuxième objectif de thèse était de poursuivre la recherche de nouveaux P450

de la voie des furocoumarines. Pour ce type de travail, l’approche classique consistant à

purifier les enzymes puis cloner le gène par PCR à l’aide d’amorces déduites de la

séquence protéique n’est pas très adaptée, en raison de la difficulté de purifier des P450

végétaux. Les approches de génomique inverse, impliquant le clonage de séquences de

P450 candidats puis la recherche de la fonction de la protéine exprimée dans un système

hétérologue, se sont révélées plus « heureuses » et ont permis de cloner plusieurs P450


57

impliqués dans la voie des alcaloïdes et des terpènes par exemple (Ralston et al., 2001 ;

Bertea et al., 2000 ; Schoendorf et al., 2001). Un projet impliquant les laboratoires du

Pr. Matern à Marburg, du Dr. Werck-Reichhart à Strasbourg ainsi que le nôtre a été mis

en place autour du clonage de P450 candidats par differential display à partir de cultures

cellulaires d’Ammi majus. Ces cultures cellulaires présentent le double avantage d’être

fortement élicitables pour la synthèse des furocoumarines, et d’être un système très bien

caractérisé puisque étudié depuis bientôt vingt ans. Cinq séquences de P450 ont été

clonées par differential display. La mise au point des conditions d’expression

hétérologue et la caractérisation fonctionnelle pour trois d’entre elles a constitué une

partie importante de mon travail de thèse dont les résultats seront présentés dans le

chapitre IV. En parallèle à ce projet, nous avons également entamé un travail de clonage

chez Ruta graveolens. La rue constitue un matériel intéressant pour l’étude de la voie de

synthèse des furocoumarines en raison des fortes teneurs qui y sont produites. Le

clonage de P450 chez cette plante est cependant plus délicat que chez Ammi majus en

raison du caractère constitutif et de la faible élicitation de la voie qui ne permet pas

d’envisager une approche en differential display. L’approche que nous avons préconisé

consiste à rechercher des familles de P450 particulières par PCR à partir de tissus

enrichis en furocoumarines. Ces travaux feront l’objet du chapitre V.

58

Chapitre II

Matériel et méthodes

59

Chapitre II : Matériel et méthodes

1 Matériel

1.1 Matériel végétal

Plantes de rue :

Les plantes de rue, utilisées pour la construction de la banque d’ADNc, ont été

cultivées en conditions artificielles en phytotron : température de 22 °C, humidité

relative de 55 % , intensité lumineuse de 160 µmol.m2.s-1 avec une photopériode de

16 H.

1.2 Souches bactériennes

E. Coli XL1 Blue :

Cette souche est utilisée pour l’amplification des constructions plasmidiques

ainsi que la propagation des phages TriplEx2. Elle est déficiente pour l’activité de

restriction (hsdR-) mais comporte un système de méthylation actif (hsdM+).

Génotype : endA1, gyrA96, hsdR17(rk-mk

+), lac, recA1, relA1, supE44 thi-1,

F’[proAB, lacIqZ M15, Tn10(TetR)].

E. Coli BM25.8 :

Cette souche bactérienne dispose de l’activité Cre-recombinase. Elle est utilisée

pour l’excision et la recircularisation du plasmide pTriplEx2 à partir du phagemide

TriplEx2, par le biais du système Cre-Lox.

Génotype : SupE44, thi

(lac-proAB) [F’ traD36, proAB+, lacqZ M15]

imm434 (kanR) P1 (camR) hsdR (rK12-mK12-)


60

Figure II-1 : Cartes de restriction des plasmides pGEM-T (A) et pYeDP60 (B) Sur la carte du vecteur pGEM-T, sont représentés la position des principaux sites de restriction, le gène de résistance à l’ampicilline (Ampr), le gène lacZ, le polylinker et l’origine de réplication bactérienne f1. Sur la carte du vecteur pYeDP60 sont représentés, les trois gènes de sélection URA3, ADE2 et Ampr, l’origine de réplication du plasmide chez E.coli et celle dans la levure, le polylinker, ainsi que les principaux sites de restriction.

A

B


61

1.3 Souches de levure

S. cerevisiae WAT 11

Cette souche de S. cerevisiae dérivée de W303 est modifiée par un vecteur intégratif

(Pompon et al., 1996) en vue de la surexpression d’un gène codant pour une des P450

réductases d’Arabidopsis thaliana, l’AthR1. Ce gène de AthR1 est sous le contrôle du

promoteur GAL10-CYC1 réprimé par le glucose et induit par le galactose. Lorsque cette

souche est transformée avec le plasmide pYeDP60 contenant un gène codant un P450,

la surexpression de ces deux protéines permet d’étudier l’activité du P450 dans la

fraction microsomale. La souche WAT 11 exprime aussi le cytochrome b5 endogène de

levure, qui peut participer à l’activité P450.

S. cerevisiae WAT 21

Cette souche se différencie de WAT 11 par le remplacement de l’AthR1 par

l’AthR2 d’Arabidopsis thaliana.

S. cerevisiae W(R)

Dans cette souche de Saccharomyces cerevisiae, c’est la P450 réductase

endogène qui est placée sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1.

1.4 Vecteurs

pGEM-T

Le vecteur pGEM-T (Promega) (Fig. II-1.A) est utilisé pour cloner des produits

de PCR. Il est constitué du vecteur pGEM-5Zf(+) coupé par EcoRV auquel est ajouté un

résidu thymine à chaque extrémité 3’. Ces 3’-T permettent la ligation de produits de

PCR (i) en empêchant la recircularisation du vecteur et (ii) en offrant une extrémité

complémentaire aux produits PCR dont les extrémités 3’ sont additionnées d’une

adénine grâce à certaines Taq DNA polymerases.

Le pGEM-T est un vecteur « high copy » composé de la séquence oriC, du gène

amp responsable de la résistance à l’ampicilline, de l’opérateur lac suivi d’une sous-

unité de la -galactosidase. Il possède également les promoteurs reconnus par les RNA


62

Figure II-2 : Cartes de restriction et détail du site multiple de clonage des vecteurs pUC19 (A) et pTriplEx2 (B) Sur le vecteur pUC19 sont représentés, le gène de résistance Ampr, l’origine de replication bactérienne (pMB1), le gène lacZ, la position du polylinker et les principaux sites de restriction. Sur le vecteur pTriplex, sont représentés, le gène de résistance Ampr, les origines de réplication pUC et f1, le promoteur Plac, le gène lacZ, le polylinker, la séquence lox P nécessaire au système d’excision/recircularisation Cre-lox, ainsi que les principaux sites de restriction. La séquence des deux polylinkers est représentée plus en détails.

A

B


63

polymérases T7 et SP6 des deux cotés du « polylinker », ce qui permet une éventuelle

transcription in vitro. Ce « polylinker » est lui-même inséré dans la région codante de la

sous-unité

de la -galactosidase. L’insertion d’un produit de PCR inactive ce gène, ce

qui permet de sélectionner les clones recombinants par criblage coloré sur milieu LB

contenant l’indicateur coloré X-Gal et de l’IPTG induisant le gène par l’intermédiaire de

l’opérateur lac.

pYeDP60

Ce plasmide (Fig. II-1.B) nous a été fourni par Denis Pompon du Laboratoire

d’Ingénierie des Protéines Membranaires (LIPM) du CNRS à Gif-sur-Yvette. C’est un

vecteur d’expression réplicatif doté d’une origine de réplication 2µ de levure, d’un

polylinker BamHI/SmaI/KpnI/SacI/EcoRI encadré en amont par un promoteur GAL10-

CYC1 inductible par le galactose et réprimé par le glucose, et en aval par un terminateur

PGK. Une origine de réplication E. coli et un gène de résistance à l’ampicilline

autorisent les sous-clonages et deux gènes URA3 et ADE2 permettent la

complémentation pour l’auxotrophie pour l’uracile et l’adénine. Le pYeDP60 est très

stable dans des milieux riches, à de fortes densités cellulaires, et il a été conçu

spécialement pour l’expression de P450 dans une série de souches de Saccharomyces

cerevisiae (W(R), WAT 11, WAT 21).

pUC 19

pUC 19 (Fig. II-2.A) est un petit plasmide réplicatif bactérien (2696 pb). Il a été

construit par recombinaison d'un fragment de pBR322 (2250 pb) et d'un fragment de

M13 double brin (446 pb). L'ADN issu de pBR322 contient le gène ampR qui permet la

sélection par la résistance à l’ampicilline. L’ADN issu de M13 contient le promoteur du

gène lacZ suivi d’une séquence modifiée comprenant un polylinker et la séquence

codant l’extrémité N-terminale de la ß-galactosidase. Ceci permet de réaliser une

sélection positive des clones recombinants.

pTriplEx2 (Clontech):

Ce vecteur (Fig. II-2.B) est obtenu par excision et recircularisation à partir du

phagemide TriplEx2. Il est composé du régulateur et du promoteur lac d’E. coli,

permettant une régulation de l’expression des inserts dans les souches possédant le


64

represseur lacIq. pTriplEx2 dispose d’une cassette de traduction dans trois cadres de

lecture. Le polylinker, en aval de la cassette de traduction, est localisé dans la séquence

du gène lacz, ce qui permet une sélection des clones recombinants par criblage “blanc-

bleu”. Le gène de résistance à l’ampicilline du vecteur pUC, assurent la propagation et

la sélection de pTriplEx2 chez E. coli.

TriplEx2 (Clontech) :

Ce phagemide de 42 kb est utilisé pour la construction des banques d’ADNc

Smart cDNA à forte titration. Il permet le criblage des clones recombinants par sélection

blanc / bleu, ainsi que la régulation de l’expression des inserts. La conversion de ce

phagemide en plasmide, est facilitée par le système d’excision / circularisation Cre-lox.

1.5 Plasmides recombinants

pUC19-73A32

Ce plasmide est constitué du vecteur pUC19 contenant la séquence codante de

CYP73A32 (n° acc. AJ309127) entre les sites de restriction BamHI et EcoRI. Il a été

utilisé comme matrice lors de la génération des simples et multi-mutants de CYP73A32

ainsi que lors de la construction des C4H chimères.

pYeDP60-73A1

Ce plasmide est constitué du vecteur pYeDP60 contenant la séquence codante de

la C4H d’Helianthus tuberosus (CYP73A1; n° acc. Z17369) entre les sites de

restriction BamHI et KpnI. Il a été utilisé d’une part pour l’expression de CYP73A1

dans les levures WAT 11, et d’autre part comme matrice de PCR lors de la construction

des C4H chimères.

pYeDP60-73A5

Ce plasmide nous a été fourni par le Dr. Danièle Werck-Reichhart (IBMP,

Strasbourg). Il contient la séquence codante de la C4H d’Arabidopsis thaliana

(CYP73A5 ; n° acc. U37235) dans le vecteur pYeDP60 (BamHI / BglII). Ce plasmide a

été utilisé pour l’expression de la protéine CYP73A5 dans la souche WAT 11.


65

2 Milieux de culture

2.1 Milieux de culture pour bactéries

Le milieu LB (Luria-Bertani) est utilisé pour la croissance des souches XL1Blue

et BM25.8.

- LB liquide : Ce milieu est obtenu en mélangeant NaCl (10 g/l),

bactotryptone (10 g/l) et extraits de levure (5 g/l) dans de l’eau ultrapure.

Le milieu est autoclavé puis conservé à température ambiante.

- LB agar : Pour obtenir un milieu LB solide, 16 g/l d’agar sont ajoutés au

LB liquide avant autoclavage.

- LB MgSO4 soft agar : Ce milieu est utilisé lors de l’étalement des

banques d’ADNc. Il est composé d’un milieu LB classique additionné de

MgSO4 à 10mM et d’agar (7,2 g / l).

Antibiotiques

Les antibiotiques sont utilisés pour la sélection d’une souche recombinante

particulière. Ils sont utilisés à la concentration finale indiquée dans le tableau II-1, après

dilution de la solution stock. Les antibiotiques sont toujours ajoutés au milieu après

autoclavage. Dans le cas des milieux solides, ils sont ajoutés lorsque le milieu est en

surfusion (environ 50 °C) juste avant de couler les boîtes.

Concentration stock

Concentration finale

Ampicilline 100 mg / ml dans H2O

100 µg / ml

Tétracycline 15 mg / ml dans EtOH

15 µg / ml

Kanamycine 50 mg / ml dans H2O

50 µg / ml

Tableau II-1 : Antibiotiques utilisés au cours des travaux de microbiologie


66

2.2 Milieux de culture pour levures

Trois milieux sont utilisés pour la culture des souches de levure WAT 11,

WAT 21 et W (R). La composition des milieux est décrite dans le tableau II-2.

YPGA SGI YPGE Yeast extract (g / l) 10

10

Bactopeptone (g / l) 10

10

Bactocasaminoacids (g / l)

1

Yeast nitrogen base (g / l)

7

Tryptophane (mg / l)

20

Adénine (mg / l) 30

Glucose (g / l) 20 20 5

Ethanol

3 % (v / v)

Galactose (g / l)

20 après épuisement

du glucose

Le milieu YPGA est un milieu complet, complémenté en adénine, utilisé pour la

croissance des souches WAT 11, WAT 21 et W (R) non transformées. L’introduction

dans les levures, du plasmide pYeDP60, leur confère l’auxotrophie pour l’adénine. Les

transformants sont ainsi sélectionnés sur milieu SGI.

Le milieu YPGE est utilisé pour l’expression du P450 d’intérêt dans les levures

transformées. Les conditions d’expression des P450 dans les levures sont décrites plus

loin (§ 4.2).

3 Méthodes de biologie moléculaire

3.1 Amplification d’un fragment d’ADN par PCR

Toutes les amplifications PCR sont conduites dans un thermocycler Icycler (Bio

Rad). De façon générale, les réactions sont réalisées dans un volume de 25 µl

contenant : 0,4 µM de chaque amorce sens et antisens, 0,4 mM de dNTP, 2,5 µl de

Tableau II-2 : Composition des milieux de culture pour levures


67

tampon d’activité polymérase 10X, 2 à 5 U de polymérase et de 10 à 100 ng d’ADN

matrice.

La réaction débute par une étape de dénaturation de l’ADN à 95 °C pendant

5 min, suivie de 25 à 35 cycles comprenant une étape de dénaturation (95 °C pendant

30 s), une étape d’hybridation (entre 50 et 60 °C pendant 1 min) et une étape

d’élongation (72 °C en comptant 1 min pour 1000 pb). La température d’hybridation

dépend de la température de fusion (Tm) des deux amorces déterminée par leur

longueur et leur teneur en base purique. Le Tm est définit par l’équation :

Tm = 69,3 + 0,41 x (% GC) – 650/N, où N est la longueur en paire de base. La

température d’hybridation correspond généralement à Tm – 5 °C.

3.2 Électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

Les fragments d’ADN sont séparés en fonction de leur poids moléculaire, sur gel

d’agarose 1 %. Avant le dépôt, les échantillons d’ADN (25 µl) sont additionnés de 5 µl

de tampon de charge (Tris 50 mM pH 7,5 ; EDTA 100 mM pH 7,5 ; 10 % glycérol ;

0,05 % bleu de bromophénol). Lors de la migration, le gel d’agarose, baigné dans du

tampon TAE (Tris acétate 40 mM, EDTA 1 mM), est soumis à une tension

généralement de 100 V pendant 45 minutes. Le gel est ensuite trempé 10 min dans un

bain de bromure d’éthidium (10 mg/ml), puis les ADN sont observés aux UV

(

= 254 nm).

3.3 Extraction d’ADN à partir d’un gel d’agarose

Après migration et révélation aux UV, les bandes de gel contenant l’ADN sont

coupées à l’aide d’une lame de scalpel, puis placées dans un tube de 1,5 ml. L’ADN est

extrait à l’aide d’un kit d’extraction Qiagen (cf. Annexes).

3.4 Digestion par des enzymes de restriction

La réaction de digestion est généralement réalisée dans 10 µl contenant : 1 µl de

tampon d’activité 10 X, 10 U d’enzyme de restriction et entre 0,1 et 1 µg d’ADN à

digérer. Au besoin, et si les tampons d’activité sont compatibles, la réaction peut être


68

menée avec deux enzymes en même temps. La digestion est généralement incubée 1 H à

la température d’activité optimale de l’enzyme.

3.5 Ligations

Ligation dans le pGEM-T

La ligation d’un produit PCR dans le vecteur pGEM-T est réalisée dans un

volume de 10 µl contenant : 5 µl de tampon d’activité 2X, 3 U de T4 DNA ligase

(Promega), 1 µl de vecteur (50 ng / µl), et 3 µl d’insert (de 50 à 100 ng / µl). La ligation

peut être réalisée 2 H à température ambiante, mais son efficacité est augmentée en la

laissant toute la nuit à 4 °C.

Ligations dans d’autres vecteurs

Dans le cas des ligations avec les vecteurs pUC19 ou pYeDP60, la réaction est

généralement réalisée dans 20 µl contenant : 4 µl de tampon d’activité 5X, 3 U de T4

DNA ligase (Invitrogen), 5 µl de vecteur et 10 µl d’insert en essayant de respecter un

rapport insert / vecteur de 3 / 1. La ligation est réalisée pendant une nuit à 16 °C.

3.6 Précipitation d’ADN

La précipitation d’ADN a pour objectif de concentrer le matériel disponible

et / ou d’éliminer les sels contaminant les échantillons. La précipitation de l’ADN est

réalisée en présence d’éthanol (1 mL à 100 %) et de NaCl (200 mM). 10 µg d’ARNt de

levure peuvent être ajoutés comme entraineur pour améliorer l’efficacité de l’opération.

L’échantillon est ensuite placé à – 20 °C durant 1 H. L’ADN précipité est culotté par

centrifugation (20 min à 11000 g), puis rincé avec 1 ml d’éthanol 70 %. L’excès

d’éthanol est éliminé en séchant l’échantillon à l’air libre. L’ADN est enfin resuspendu

dans un petit volume (un dizaine de µl) d’eau ultra pure.

3.7 Préparation de bactéries compétentes

Une préculture de E. Coli XL1Blue est réalisée par ensemencement de 10 ml de

milieu LB avec 4 colonies indépendantes. Après une nuit sous agitation à 37 °C, 2 ml de

cette préculture sont utilisés pour ensemencer 200 ml de milieu LB. Cette culture est


69

incubée à 37 °C sous agitation pendant 3 à 5 H jusqu’à obtenir une DO700nm entre 0,5 et

0,9. La culture est ensuite placée pendant 2 H sur la glace, puis les bactéries sont

sédimentées par centrifugation à 3500 g pendant 15 min. Pour éviter que les bactéries ne

se lysent, les centrifugations sont réalisées à 4 °C et sans frein. Le culot est resuspendu

une première fois dans 50 ml d’eau stérile froide, puis de nouveau sédimenté par

centrifugation à 3500 g 15 min. Un second lavage à l’eau est effectué suivi de deux

lavages dans 20 ml de glycérol 10 % froid. Enfin, le culot est resuspendu dans 1 à 2 ml

de glycérol froid puis congelé dans le l’azote liquide et stocké à – 80 °C sous forme

d’aliquots de 45 µl.

3.8 Transformation de bactéries par électroporation

L’électroporation consiste à introduire une construction plasmidique dans des

bactéries dont les membranes sont ponctuellement rendues poreuses par un choc

électrique court et de haut voltage. La manipulation est réalisée en mélangeant 1 à 10 ng

de plasmide à un aliquot de bactéries compétentes. Après les avoir mélangés doucement

à la pipette, les bactéries et le plasmide sont déposés dans une cuve à électroporation,

placée dans un Pulseur (Bio-Rad). Les bactéries sont soumises à un choc électrique

(V = 2,5 kV ; R = 200 O

; C = 25 µF), puis reprises dans 500 µl de milieu LB et placées

pendant 1 H à 37 °C. Ce laps de temps permet aux bactéries transformées d’acquérir la

résistance à l’antibiotique apportée par le plasmide. Les bactéries sont enfin étalées sur

boîte LB sélective puis placées à 37 °C pendant la nuit.

3.9 Extraction d’ADN plasmidique

Une colonie contenant le plasmide d’intérêt est repiquée dans 2,5 ml de milieu

LB liquide additionné de l’antibiotique approprié. Après une nuit de culture sous

agitation à 37 °C, les bactéries sont sédimentées par centrifugation (7000 g pendant

5 min). Les plasmides sont extraits à l’aide du kit « genelute miniprep plasmid kit »

(Sigma), dont le principe est basé sur une lyse alcaline des bactéries, suivie d’une

purification des plasmides sur colonnes d’affinité (cf. Annexes).


70

Figure II-3 : Electrophorèse de l'ARN total extrait de feuilles de Ruta graveolens

exposée aux UV pendant 24 H Les bandes majoritaires correspondent aux ARN ribosomiques cytoplasmiques et chloroplastiques M : marqueur 1 kb (Invitrogen)

Figure II-4 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la RT-PCR sur l’ARN total extrait de feuilles de Ruta graveolens M : marqueur 1 kb (Invitrogen)

M

1 kb

2 kb

500 pb

M

500 pb

1,5 kb

3 kb


71

3.10 Séquençage

Le séquençage des ADN est réalisé par le service de séquençage d’ADN de

l’IBMP à Strasbourg.

3.11 Construction de banque d’ADNc

Les travaux présentés dans le chapitre V nous ont conduit à construire une

banque d’ADNc de feuilles de rue traitée aux UV. Le détail de la construction de cette

banque est décrit dans les paragraphes suivants.

3.11.1 Extraction d’ARN total :

L’extraction des ARN est une opération délicate du fait de leur dégradation rapide

par les RNases. Une attention particulière est donc portée pour éviter tout contact de

l’ARN extrait avec ces enzymes. Ceci implique l’utilisation de gants durant tout le

déroulement de l’extraction et l’utilisation de matériel certifié « RNase free ».

L’extraction d’ARN total a été réalisée à l’aide du kit « RNeasy Plant Mini Kit »

de Qiagen. Les tissus végétaux (100 mg) sont d’abord broyés dans de l’azote liquide à

l’aide d’un petit pilon, puis le broyat est lysé dans 450 µl d’un tampon RLC contenant de

l’isothiocyanate de guanidine et du ß-mercaptoéthanol. Suivant le tissu de départ, la lyse

peut être favorisée par une courte incubation (1 à 3 min) à 56 °C. Le lysat est ensuite

transféré sur colonne QIAshredder, puis centrifugé 2 min à 13000 g afin d’éliminer les

gros débris. Le surnageant récupéré est additionné de 225 µl d’éthanol 100 %, puis le tout

est déposé sur une colonne de silice. Après une centrifugation de 15 s à 13000 g, l’ARN

total reste associé à la silice et l’éluat est éliminé. Ensuite, trois lavages successifs (une

fois 600 µl de tampon RW1 et deux fois 500 µl de RPE) permettent d’éliminer les

impuretés (sel, protéines, débris cellulaires). L’ARN total est enfin élué par l’addition de

deux volumes de 30 µl d’eau ultra pure. La qualité de l’extraction est estimée en déposant

3 µl sur gel d’agarose 1 %, et la quantité est déterminée par lecture optique à 260 nm. La

figure II-3 représente le profil de migration d’ARN extraits de feuilles de rue soumise à

une exposition aux UV. La taille des ARN est comprise entre 500 pb et 3000 pb. Trois

bandes plus intenses sont également observables et représentent les ARN ribosomiques


72

nucléaires et chloroplastiques. La présence de ces bandes et d’ARN de grande taille est

un indicateur de la bonne qualité et de la faible dégradation des ARN extraits.

3.11.2 Synthèse des ADNc simple brin par reverse transcription

L’ADNc simple brin est synthétisé à partir de 600 ng d’ARN totaux en utilisant

la PowerScript Reverse Transcriptase et les amorces CDS III et Smart IV fournis dans

le kit SMART cDNA Construction (Clontech). CDS III possède une séquence polydT

ainsi qu’un site de restriction Sfi IB. Les ARN sont tout d’abord dénaturés pendant

2 min à 72 °C en présence des deux amorces, puis placés sur la glace pendant 2 min. La

synthèse est initiée par l’ajout de 2 µl de first strand buffer 5X, 1 µl de DTT (20 mM),

1 µl de dNTP (10 mM) et 1 µl de PowerScript Reverse Transcriptase, et le tout est

incubé pendant 1 H à 42 °C. La PowerScript Reverse Transcriptase a la capacité

d’ajouter une séquence polydC excédentaire en 3’ de l’ADNc simple brin. Cette

séquence polydC permet l’hybridation de l’amorce SMART IV composée de la

séquence complémentaire polydG et du site de restriction Sfi IA. La réaction est arrêtée

sur la glace.

3.11.3 Amplification des ADNc par PCR

Les ADNc sont amplifiés à l’aide des amorces utilisées lors de la synthèse de

l’ADNc simple brin. Ce système permet d’amplifier spécifiquement les ADNc

complets. Le mélange réactionnel de la PCR est composé de 2 µl d’ADNc simple brin

(synthétisés à l’étape précédente), 80 µl d’eau ultra pure, 10 µl de tampon 10X

Advantage 2 PCR buffer, 2 µl de dNTP 50X, 2 µl d’amorce PCR 5’ (10 µM), 2 µl de

CDS III (10 µM) et 2 µl de 50X Advantage 2 Polymerase Mix. La réaction est débutée

par 1 min de dénaturation à 95 °C, suivie de 20 cycles composés d’une étape de

dénaturation (95 °C 15 s) et d’une longue étape d’hybridation/élongation (68 °C

pendant 6 min). Le résultat de l’amplification est vérifié en déposant 5 µl de mélange

réactionnel sur gel d’agarose 1 %. La taille des ADNc synthétisés à partir des ARN de

feuilles de rue soumise aux UV s’échelonne de 600 pb à 4000 pb avec quelques bandes

plus intenses autour de 1000 pb et 1400 pb pouvant correspondre aux ADNc des

transcrits les plus abondants dans les feuilles (Fig. II-4).


73

3.11.4 Digestion par la protéinase K

Un traitement à la protéinase K est nécessaire pour inactiver l’ADN polymérase.

La digestion est réalisée sur 50 µl du mélange de PCR en y ajoutant 2 µl de

protéinase K (20 µg / µl) et en incubant 20 min à 45 °C. Suite à la digestion, l’ADN est

purifié par un traitement au phénol/chloroforme. Le volume est d’abord ajusté à 100 µl

avec de l’eau, puis 100 µl d’un mélange phénol / chloroforme / alcool isoamylique

(25 / 24 / 1) sont ajoutés. Le tube est mélangé 1 à 2 min par inversion puis les phases

sont séparées par une centrifugation de 5 min à 11000 g. La phase supérieure acqueuse

contenant l’ADN est récupérée et transférée dans un nouveau tube. Afin d’éliminer

toute trace de phénol, 100 µl de chloroforme / alcool isoamylique (24 / 1) sont ajoutés.

Après avoir mélangé par inversion et centrifugé 5 min à 11000 g, la phase acqueuse est

placée dans un nouveau tube auquel sont ajoutés 10 µl d’acétate de sodium 3 M, 1,3 µl

de glycogène (20 µg / µl) et 260 µl d’éthanol 100 %. Le tube est maintenu à

température ambiante pour éviter la co-précipitation d’impuretés. Après une

centrifugation de 20 min à 11000 g, le surnageant est éliminé, puis le culot d’ADN est

séché et resuspendu dans 79 µl d’eau ultra pure.

3.11.5 Digestion des ADNc bicaténaires par l’enzyme Sfi I

En vue de leur ligation dans le vecteur TriplEx2, les ADNc sont digérés par

Sfi I. Cette enzyme de restriction peut reconnaître et couper deux sites différents : Sfi I

A, présent à l’extrémité 5’ de tous les ADNc grâce à l’amorce SMART IV, et Sfi I B

présent en 3’ grâce à l’amorce CDS III. (Fig. II-5) La digestion va donc générer des

ADNc avec des extrémités asymétriques, ce qui permettra un clonage orienté dans le

vecteur TriplEx2.

Site Sfi IA 5’-GGCCATTA|TGGCC-3’ 3’-CCGGT|AATACCGG-5’

Site Sfi IB 5’-GGCCGCCT|CGGCC-3’ 3’-CCGGC|GGAGCCGG-5’

Figure II-5 : Comparaison des sites de restriction de Sfi I


74

La digestion est réalisée dans 100 µl final avec 79 µl de produit PCR, 10 µl de

tampon d’activité 10X, 1 µl de BSA 100X et 10 µl de Sfi I (20 U / µl). Après

homogénéisation, le mélange est incubé pendant 2 H à 50 °C.

3.11.6 Fractionnement des ADNc sur colonne Chroma 400

Il est nécessaire d’éliminer les ADNc de petite taille ainsi que les

oligonucléotides libres pour qu’ils n’entrent pas en compétition avec les ADNc pendant

la ligation avec le TriplEx2. Les ADNc sont donc purifiés en fonction de leur taille par

gel filtration sur colonne Chroma 400. Les colonnes stockées à 4 °C sont réchauffées à

température ambiante et retournées pour resuspendre la matrice. Après avoir vérifié

qu’il n’y a pas de bulles dans la matrice, le bas de la colonne est débouchée afin que le

tampon de stockage puisse s’écouler. A la fin de l’écoulement, 700 µl de tampon

d’élution sont déposés au sommet de la colonne pour l’équilibrer. Une fois que le

tampon d’élution est sorti, les 100 µl d’échantillon sont déposés au sommet de la

colonne où ils sont rapidement absorbés. Pour perdre le moins possible d’ADNc, le tube

contenant le mélange de digestion est rincé avec 100 µl de tampon d’élution qui est

déposé sur la colonne. Lorsque plus aucun liquide ne reste au dessus de la résine, 600 µl

de tampon d’élution sont ajoutés et l’éluat est récolté goutte par goutte dans des tubes

collecteurs (16 au total). Une électrophorèse sur gel d’agarose est réalisée en déposant

3 µl de chaque fraction pour déterminer lesquelles (3 à 4 fractions) contiennent les

ADNc (Fig. II-6).

Figure II-6 : Electrophorèse sur gel d’agarose des fractions collectées après passage des ADNc sur colonne Chroma 400 lors de la construction de la banque d’ADNc de feuilles de rue traitée aux UV Les fractions contenants les ADNc coupés par Sfi I sont encadrés en rouge M : marqueur 1 kb (Invitrogen)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M M


75

Les fractions sont poolées puis les ADNc sont précipités en présence de 1/10 de

volume d’acétate de sodium 3 M, 1,3 µl de glycogène et 2,5 volumes d’éthanol 100 %

froid. L’ensemble est mélangé, placé à – 20 °C pendant une nuit, puis centrifugé 20 min

à 11000 g. Le culot séché est enfin resuspendu dans 7 µl d’eau ultra pure.

3.11.7 Ligation des ADNc dans le vecteur TriplEx2

Les ADNc coupés par Sfi I vont être ligués dans le vecteur TriplEx2 possédant

une extrémité Sfi I A et une autre Sfi I B. Pour cette étape, le ratio insert / vecteur est

très important car il va influencer le titre de la banque. Pour déterminer le ratio optimal,

le fournisseur du kit préconise de réaliser, pour une même banque, trois ligations avec

des quantités d’insert différentes (0,5 ; 1 et 1,5 µl). Cependant pour limiter le nombre

d’aliquots d’encapsidation à utiliser, nous nous sommes inspirés des travaux de thèse de

A. Gravot (2002) qui avait obtenu les meilleurs résultats avec 0,5 µl d’insert. Ainsi pour

chaque banque, une seule ligation est réalisée avec 0,5 µl d’insert, 1 µl de TriplEx2

(0,5 µg / µl), 0,5 µl de tampon de ligation 10X, 0,5 µl d’ATP (10 mM) et 0,5 µl de T4

DNA ligase (400 U / µl) dans 5 µl final. Le mélange est homogénéisé et est incubé toute

la nuit à 16 °C.

3.11.8 Encapsidation des vecteurs recombinants

Les vecteurs recombinants sont encapsidés à l’aide du kit « Gigapack II Gold

Packaging Extract » (Stratagene, La Jolla, USA). Les aliquots contenant le mélange

d’encapsidation sont sortis du congélateur à –80 °C et sont rapidement réchauffés à la

main jusqu’à l’amorce de la décongélation. La totalité de la ligation (5 µl) est ajoutée à

l’aliquot et le tout et homogénéisé par un pipetage délicat en évitant au maximum de

former des bulles. L’encapsidation est réalisée pendant 2 H à température ambiante

(22 °C). A la fin de l’incubation, 500 µl de tampon SM (Tab. II-3) et 20 µl de

chloroforme sont ajoutés au mélange. Après avoir bien mélangé, le tube est centrifugé

5 min à 11000 g et le surnageant est récupéré. Ce dernier, qui est transféré dans un tube

stérile, constitue la banque non amplifiée. Elle est stockée à 4 °C en attendant la titration

et l’amplification.


76

3.11.9 Titration de la banque

La titration a pour objectif de déterminer le nombre de plages de lyses obtenues

par unité de volume de banque. Le soir avant la titration, une colonie de bactéries E.

Coli XL1 blue est incubée à 37 °C dans 15 ml de milieu LB additionné de MgSO4

10 mM et de maltose 0,2 %. Le lendemain, les bactéries sont centrifugées 5 min à

5000 g et resuspendues dans 7,5 ml de MgSO4 10 mM. 200 µl de bactéries sont ensuite

infectées avec 1 µl de la banque non amplifiée diluée au 1 / 5, 1 / 10 et 1 / 20 dans du

MgSO4 10 mM. L’infection est réalisée à 37 °C pendant 15 min. Les bactéries infectées

sont ensuite mélangées avec 2 ml de LB soft agar maintenu à 45 °C et les réactifs du

test blanc / bleu, puis le tout est étalé sur des petites boîtes (90 mm de diamètre) LB

agar MgSO4 10 mM préchauffée à 37 °C. Les boîtes sont incubées 8 à 10 H à 37 °C,

puis les plages de lyses sont comptées. Le titre de la banque est exprimé en plage de

lyse par ml de banque (pfu / ml). Il est déterminé par la relation :

Pfu / ml = (nombre de plages de lyse par boîte x facteur de dilution) / ml de

phage déposés

L’efficacité de la ligation est déterminée par le rapport du nombre de plages de

lyse blanches sur le nombre de bleus.

Par cette méthode, le titre de la banque non amplifiée d’ADNc de rue traitée aux

UV a été estimé à 1,5.106 ce qui est en accord avec les valeurs annoncées par le

fournisseur.

Pour la titration des banques amplifiées, l’infection des bactéries est réalisée

avec 5, 10 et 20 µl de phages dilués au 1 / 10000, et le tout est étalé sur boîte de 90 mm.

Le titre moyen de la banque d’ADNc de feuilles de rue traitée aux UV est de 4,1.109

clone / ml.

3.11.10 Amplification de la banque

L’amplification a pour but d’obtenir un grand nombre de copies de chaque

clone. Les bactéries XL1 blue sont préparées de la même façon que pour la titration. Les

phages doivent être étalés à hauteur de 6 x 104 plages par boîte. Le volume adéquat de

phages est mélangé à 500 µl de bactéries. Après une incubation de 15 min à 37 °C, les

bactéries infectées sont mélangées à 5 ml de LB soft agar maintenu à 45 °C et sont


77

étalées sur des grandes boîtes (150 mm de diamètre) de LB MgSO4 10 mM. Les boîtes

sont incubées 10 H à 37 °C jusqu’à ce que les plages de lyse soient confluentes, puis 12

ml de tampon SM sont ajoutés et les boîtes sont incubées une nuit à 4 °C. Le lendemain,

les boîtes sont placées pendant 1 H à température ambiante sous agitation (50 rpm) puis

le tampon SM est récupéré. Le tampon est réparti dans un nombre de tubes

polypropylène de 50 ml nécessaires auxquels sont ajoutés 10 ml de chloroforme. Après

une agitation forte de 10 à 20 s, les tubes sont centrifugés 10 min à 5000 g. Les phases

acqueuses de chaque tube sont récupérées et poolées dans une bouteille stérile. Cette

banque amplifiée est conservée à 4 °C. Des aliquots de 1 ml sont additionnés de DMSO

à 7 % et sont stockés à – 80 °C.

3.12 Criblage d’une banque d’ADNc

3.12.1 Synthèse des sondes marquées

Le criblage est réalisé sur une banque d’ADNc, à l’aide de sondes froides,

marquées à la Digoxigénine. La synthèse des sondes se fait par PCR avec le mélange

suivant : 1 µl de plasmide matrice (entre 50 et 100 ng / µl), 100 pmol de chaque amorce,

10 µl de tampon d’activité 10 X, 2 U de Taq DNA poymerase, 10 µl de dNTP DIG

labelled mix (Roche) dans un volume final de 100 µl.

Les sondes sont amplifiées par 30 cycles de PCR (30 s à 95 °C, 30 s à 50 °C et

1 min à 72 °C). Les sondes sont ensuite séparées sur gel d’agarose et purifiées.

3.12.2 Étalement de la banque d’ADNc

La banque d’ADNc est étalée de la même façon que lors de l’amplification, à

hauteur de 6 x 104 plages par boîte.

3.12.3 Transfert et fixation des ADN sur membrane

Les plages de lyses sont transférées sur une membrane de nylon par application

sur chaque boîte pendant 1 min. L’ADN phagique est d’abord libéré des phages en


78

Tableau II-3 : Composition des tampons utilisés pour le criblage des banques

Tampon de dénaturation Tampon de neutralisation

NaOH 0,5 M NaCl 1,5 MNaCl 1,5 M Tris HCl pH 7 1 M

SSC 20X Tampon d'hybridation

NaCl 3 M N-lauroyl-sarcosine 0,1% (p/v)Citrate de Na 0,3 M SDS 0,02% (p/v)ajuster le pH à 7 avec de l'HCl fumant Blocking reagent 1% (p/v)

SSC 5X

Blocking reagent stock à 10% (p/v) (Roche)Tampon Maléique

Acide maléique 0,1 MNaCl 0,15 MAjuster le pH à 7,5 avec de la soude

Tampon de lavage Blocking solution

tampon maléique + tween 20 0,3% Blocking reagent 1 % dans de l'acide maléique

Tampon de détection Tampon SM

Tris pH 9,5 0,1 M NaCl 0,1 MNaCl 0,1 M MgSO4-7H20 0,01 M

Tris-HCl pH 7,5 0,035 MGélatine 0,01 % (p/v)

Dissolution de la poudre à 60°C dans du tampon maléique


79

plaçant les membranes dans un tampon de dénaturation basique (Tab. II-3) pendant

5 min. La dénaturation est stoppée en baignant les membranes dans un tampon de

neutralisation durant 15 min, puis ces dernières sont rincées 10 min dans du tampon

SSC 2X (Tab. II-3). Les ADN sont fixés aux membranes sous l’effet d’un rayonnement

UV (254 nm, 0,12 J pendant 30 s). Après une étape de digestion des débris protéiques

par la protéinase K (2 mg) (1 H à 37 °C), les membranes sont déposées sur du papier

Wattman humidifié pour éliminer les restes d’agarose.

3.12.4 Hybridation

Pour pouvoir isoler un maximum de clones à l’aide de nos sondes, des

conditions d’hybridation peu stringentes ont été appliquées. Ainsi, bien que la

température d’hybridation conseillée par le fournisseur soit de 68 °C, nous avons décidé

de la minorer de 10 °C.

Dans un premier temps, les membranes sont placées en préhybridation à 58 °C

pendant 1 à 2 H, dans le tampon d’hybridation dépourvu de sonde. Après avoir dénaturé

les sondes à 100 °C pendant 10 min, celles-ci sont ajoutées au tampon d’hybridation et

les membranes sont incubées toute la nuit, sous agitation à 58 °C.

3.12.5 Révélation

La révélation du marquage avec les sondes froides marquées à la digoxigénine

se fait par l’intermédiaire d’un anticorps antiDIG (Roche) couplé à la phosphatase

alcaline. Suite à l’hybridation, les membranes sont d’abord baignées 1 min dans un

tampon de lavage, puis incubées durant 1 H dans une solution de blocage destinée à

masquer les sites de reconnaissance non spécifiques de l’anticorps (Tab. II-3).

L’anticorps est ajouté dans la solution à une dilution de 1 / 5000, et les membranes sont

incubées à température ambiante pendant 30 min. Après deux bains de 15 min dans le

tampon de lavage, les membranes sont placées dans une boîte de pétri contenant 20 ml

de tampon de détection. Les complexes sonde DIG / anticorps seront ensuite révélés soit

par chimioluminescence, soit par réaction colorimétrique.

révélation par chimioluminescence : Les membranes sont trempées pendant

quelques secondes dans une solution contenant la molécule phosphorylée CDP-star


80

(Applied Biosystems). Les membranes sont ensuite placées dans un film plastique pour

éviter qu’elles ne se déssèchent et mises en contact avec un film photographique. La

déphosphorylation du CDP-star par la phosphatase alcaline génère une émission de

lumière qui va marquer le film.

Révélation par réaction colorimétrique : les membranes sont incubées dans

10 ml de tampon de détection contenant 45 µl de NBT et 35 µl de BCIP (Roche).

L’élimination du phosphate du BCIP par la phosphatase alcaline favorise la formation

d’un précipité violet facilement détectable en présence de NBT. La réaction est laissée à

l’obscurité pendant une nuit, puis les membranes sont rincées à l’eau.

3.12.6 Récupération des plages de lyse

Les plages de lyse correspondant aux spots sur les membranes, sont prélevées

par carottage de la gélose à l’aide de pointes de pipette coupées. Les carottes de gélose,

correspondant à plusieurs plages de lyse, sont placées dans des tubes de 1,5 ml

contenant 500 µl de tampon SM additionné de 100 µl de chloroforme. Les tubes sont

placés à 4 °C durant une nuit pour que les phages diffusent dans le tampon SM.

3.12.7 Excision des plasmides

Afin d’éliminer d’éventuels faux positifs, une PCR est réalisée sur 5 µl du

tampon SM contenant les phages, avec les amorces spécifiques des sondes utilisées. Les

plasmides contenus dans les phages positifs en PCR, sont excisés à l’aide du système

Cre / Lox. La veille de l’excision une culture de E. Coli BM 25.8 est réalisée dans 10 ml

de LB contenant 10 mM de MgCl2, à 31°C. 200 µl de la culture sont mélangés à 100 µl

de la suspension de phages et le tout est incubé pendant 30 min à 31 °C sans agitation.

Après avoir ajouté 400 µl de milieu LB et incubé pendant 1 H à 31 °C avec agitation,

10 µl de chaque mélange sont étalés sur boîte LB additionné de 100 µg / ml

d’ampicilline. Les boîtes sont placées à 31 °C toute la nuit. Sur chaque boîte, quelques

colonies sont repiquées dans 3 ml de LB liquide en vue de l’extraction des plasmides.

Ces derniers sont envoyés à séquencer, puis les séquences sont comparées à celles

enregistrées dans les banques de données à l’aide du programme blastx

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST


81

4 Méthodes de biochimie

4.1 Transformation de levures

Préparation de levures compétentes

La veille de la transformation, une préculture est réalisée en repiquant une

colonie de levure WAT 11 dans 10 ml de milieu YPGA. Les levures sont incubées

durant une nuit à 30 °C. Le lendemain matin, la préculture est diluée dans 50 ml de

YPGA pour obtenir une DO =700nm de départ de 0,2. La culture est ensuite placée à

30 °C pendant 4 à 5 heures jusqu’à ce que la DO =700nm atteigne 0,8. Les levures sont

ensuite sédimentées par une centrifugation de 5 min à 3000 g. Le culot est repris dans 1

ml d’eau stérile, transféré dans un tube de 2 ml, puis est soumis à une centrifugation de

1 min à 3000 g. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 1 ml d’acétate de

lithium 100 mM / TE 1X. Après une autre centrifugation, le surnageant est éliminé et le

culot est finalement repris dans 200 µl d’acétate de lithium 100 mM / TE 1X.

Transformation de levures

La transformation est initiée en mélangeant dans un tube de 1,5 ml, 50 µl de

levures compétentes, 50 µl d’acétate de lithium 100 mM / TE 1X dilué dans du PEG

4000 (50 %), 10 µl d’ADN de sperme de saumon dénaturé (10 mg / ml) pendant 30 min

à 100 °C et 50 à 200 ng de plasmide à transformer. Le tout est incubé 30 min à 30 °C

sous agitation, puis 15 min à 42 °C avant d’être placé dans de la glace pendant 2 min.

Le mélange est ensuite centrifugé pendant 2 min à 3000 g et le surnageant est éliminé à

la pipette. Les levures transformées sont lavées dans 1 ml d’eau stérile, resuspendues

dans 300 µl de milieu YPGA et placées pendant 2 heures à 30 °C. Cette incubation

permet aux levures transformées d’exprimer leur gène de sélection. A l’issue de

l’incubation, le milieu YPGA est éliminé et les levures sont resuspendues dans 500 µL

de milieu sélectif SGI, puis étalées sur boîte contenant ce même milieu. Les boîtes sont

placées à 30 °C. L’apparition des colonies de levures transformées est observable au

bout de 3 jours de croissance.


82

4.2 Expression des P450 dans les levures et préparation des microsomes

L’expression des P450 dans les levures et la préparation des microsomes ont été

adaptées des métodes mises au point par Pompon et al. (1996) et Diesperger (1974).

Culture de levures et expression des P450

Une colonie de levure transformée est utilisée pour ensemencer 10 ml de milieu

minimum SGI. La culture est incubée 24 H à 28 °C. 5 ml de cette culture sont ensuite

prélevés pour ensemencer 200 ml de milieu YPGE contenant du glucose en faible

concentration (5 g / l) et de l’éthanol (3 % (v / v)). Après 24 H de culture à 28 °C sous

agitation orbitale (200 rpm), les levures atteignent la concentration de 8 x 107 cellules / ml.

A ce stade, le glucose est entièrement consommé et les levures utilisent l’éthanol comme

source carbonée. L’expression du P450 est induite par addition de galactose (20 g / l).

L’induction est généralement conduite pendant 15 H à 28 °C. Dans le cas du CYP71AJ1,

l’induction a été réalisée pendant 24 H à 20 °C.

Préparation de microsomes de levure

Toute la procédure est réalisée à 4 °C afin de limiter la dégradation des protéines.

Les levures en culture sont sédimentées par centrifugation (10 min à 7000 g) puis lavées

dans 20 ml de TEK (Tab. II-4). Après une centrifugation de 10 min à 7000 g pour éliminer

le TEK, le culot de levures est resuspendu dans 2 ml de tampon d’extraction froid (Tab. II-

4). Des billes de verre (Glass beads 400-625 µm, Sigma) sont ajoutées jusqu’à ce qu’elles

affleurent à la surface, puis les levures sont broyées en agitant rapidement les tubes cinq fois

1 min. Entre-temps, les tubes sont placés dans la glace pour éviter qu’ils ne se réchauffent.

A l’issu du broyage, les billes sont lavées 4 fois avec 10 ml de tampon d’extraction froid.

Ces fractions combinées dans de nouveaux tubes sont centrifugées à 10000 g durant 15 min

pour éliminer les gros débris cellulaires. A la sortie de la centrifugation, le contenu des

tubes est filtré sur papier. Les microsomes sont précipités par l’addition, goutte par goutte,

de 2,5 ml de MgCl2 1 M aux 40 ml d’extraits cellulaires. Le volume est ajusté à 50 ml par

l’addition de tampon d’extraction et les tubes sont incubés dans la glace durant 30 min. Une

dernière centrifugation de 20 min à 15000 g, permet de récolter les microsomes, qui sont

repris et homogénéisés dans 3 ml de tampon TEG (Tab. II-4) à l’aide d’un potter. Les

microsomes sont aliquotés puis stockés au congélateur à – 80 °C.


83

4.3 Dosage de protéines

Les teneurs en protéines sont déterminées par une méthode dérivée de la

méthode de Bradford (1976), à l’aide du réactif Protein assay (Bio-Rad). Les teneurs en

protéines sont calculées à partir d’une gamme étalon d’albumine bovine.

4.4 Quantification des P450 par spectre CO

La quantification de P450 par spectre CO est une méthode mise au point par

Omura et Sato (1964 a et b) . Cette méthode est basée sur la capacité du monoxyde de

carbone à interagir avec le fer de l’hème des P450. Cette interaction provoque un

changement d’état du fer et modifie le spectre d’absorption du P450, qui présente un pic

d’absorbance à 450 nm.

La mesure est réalisée sur les microsomes de levure, dilués 5 à 10 fois dans du

TEG et réduits par l’addition de dithionite de sodium. L’échantillon dilué est séparé

dans deux cuves de spectrophotométrie, et une ligne de base est réalisée entre 400 et

500 nm. Les microsomes d’une des cuves sont saturées en CO, grâce à un bullage de

30 s. Le spectre différentiel d’absorbance entre la cuve témoin et la cuve saturée en CO

est mesurée entre 400 et 500 nm. L’apparition d’un pic à 450 nm témoigne de la

présence de P450 dans les microsomes. La concentration molaire est déterminée en

mesurant la hauteur du pic entre 450 nm et 480 nm et en utilisant le coefficient

Tableau II-4 : Composition des tampons pour la préparation des microsomes de levures

TEK Tampon d'extraction

Tris HCl pH 7,5 50 mM Tris HCl pH 7,5 50 mMEDTA 1 mM EDTA 1 mMKCl 100 mM Sorbitol 0,6 M

BSA * 1 % (p/v)ß mercapto éthanol * 20 mM

TEG* ces produits sont ajoutés extemporanément

Tris HCl pH 7,5 50 mMEDTA 1 mMglycérol 30 % (v/v)


84

d’extinction molaire e450 = 91 mM-1cm-1. La quantité en moles de P450 est ensuite

rapportée à la quantité de protéines dans l’échantillon déterminée par le test de

Bradford.

4.5 Mesure d’activités enzymatiques

4.5.1 Substrats

L’umbelliférone, le psoralène, le 8-MOP, la (+)-pulégone et le cinnamate

proviennent de Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne). Le 5-MOP, le bergaptol, le

xanthotoxol, l’isopimpinelline, l’angélicine, le p-coumarate proviennent

d’Extrasynthèse (Genay, France). La menthofurane provient de Roth (Karlsruhe,

Allemagne). Le chlortoluron et l’isoproturon proviennent de CIL (Paris, France). La

déméthylsubérosine (DMS), la (+)-marmésine et la (+)-columbianetine nous ont été

fournies respectivement par le Pr. U. Matern (université de Marburg), le Pr. G.

Innocenti (Faculté de pharmacie, Padoue) et le Pr. W. Boland (Institut Max Planck,

Jena). Pour constituer les solutions stock (5 à 10 mM) les molécules sont dissoutes dans

du DMSO ou de l’éthanol, puis stockées à – 20 °C.

4.5.2 Détermination des constantes catalytiques

Les réactions sont conduites dans des tubes de 2 ml, dans lesquels sont dilués

entre 30 et 50 µl de microsomes dans 300 µl de tampon d’activité phosphate de sodium

(NaPi) 0,1 M pH 7 contenant 1 mM de NADPH et 200 µM de substrat. L’incubation est

menée pendant 5 à 30 min sous agitation, à 27 °C. La réaction est stoppée par l’ajout de

200 µl d’acétonitrile / HCL (1 %). La solution est ensuite centrifugée à 8000 g pendant

20 min, puis le surnageant est prélevé avant d’être analysé en HPLC.

Pour déterminer les constantes cinétiques de l’enzyme, l’incubation est réalisée

avec des concentrations en substrat croissantes. Le temps et la quantité de microsomes

utilisés sont adaptés pour que la conversion du substrat n’excède pas 50 % pour les

concentrations les plus faibles. L’activité enzymatique est exprimée en pmol de produit

formé par unité de temps et par unité de P450 déterminé par spectre CO. Une

représentation en double inverse de Lineweaver-Burk, exprimant l’inverse de l’activité


85

enzymatique en fonction de l’inverse de la concentration en substrat, permet d’obtenir

les valeurs de Km et de Vm de l’enzyme.

4.5.3 Mesure de l’inhibition par le psoralène

Les microsomes (30 µl) sont pré-incubés dans 100 µl de tampon phosphate de

sodium 0,1 M pH 7 contenant 1 mM de NADPH et une gamme de concentration de

psoralène (entre 0 et 30 µM). La pré-incubation est maintenue sous agitation, à 27 °C

durant des temps précis (1 min, 3 min, 6 min et 10 min), à l’issue desquels, l’activité

enzymatique résiduelle est mesurée en mélangeant 30 µl de la pré-incubation dans

300 µl d’un mélange d’incubation (NaPi 0,1 M pH 7, NADPH 1 mM, cinnamate

200 µM). L’incubation est maintenue pendant 15 min à 27 °C, puis est stoppée par ajout

de 200 µl d’acétonitrile / HCl (99 : 1). Le mélange d’incubation est ensuite centrifugé à

8000 g pendant 20 min, puis le surnageant est récupéré et analysé par HPLC. Pour

chaque concentration d’inhibiteur, la quantité de p-coumarate formé en fonction du

temps est rapportée à celle obtenue sans inhibition. Une représentation des résultats en

semi-log népérien permet de tracer les droites de régression linéaire et de calculer une

constante d’inactivation k (la pente de la droite de régression) et une demi-vie (t1/2 =

Ln(2)/k) pour chaque concentration en inhibiteur. Les t1/2 sont ensuite exprimés en

fonction de l’inverse de la concentration en inhibiteur dans une représentation dite de

Kitz-Wilson. Le point d’intersection de la droite avec l’axe des ordonnés détermine le

t1/2max (temps de demi-vie de l’enzyme en concentration saturante d’inactivateur). Le

point d’intersection de la droite avec l’axe des abscisses permet d’obtenir la valeur du

–1/ Ki à partir duquel est défini le Ki. Le kinact est calculé par la relation

kinact = Ln(2) / t1/2max.

4.6 Détection des produits formés par HPLC

Les échantillons sont séparés sur une colonne en phase inverse Purospher 125-4

(Merck, Darmstadt, Allemagne). La séparation du cinnamate et du p-coumarate

nécessite l’utilisation de deux solvants : Un solvant A (H2O, acide acétique 1 %,

acétonitrile 1 %) et un solvant B (méthanol 50 %, acétonitrile 50 %). La méthode utilise

un gradient linéaire où la concentration de solvant B passe de 0 à 67 % en 25 min. La


86

détection des deux molécules se fait à 310 nm. Par cette méthode le p-coumarate est

élué en 15 min et le cinnamate en 20 min.

L’analyse et la séparation du psoralène et de la (+)-marmésine sont opérées sur

la même colonne avec les mêmes solvants. L’élution est réalisée grâce à un gradient

convexe de solvant B (0 à 60 %) pendant 25 min. Les molécules sont détectées à

300 nm. La (+)-marmésine est éluée en 18,5 min tandis que le psoralène sort à 20,5 min.

4.7 Spectrométrie de masse

Le produit de la réaction catalysée par CYP71AJ1 est analysé et identifié en

spectrométrie de masse. Vingt fractions d’HPLC contenant le produit sont collectées. Le

solvant est évaporé puis le culot est resuspendu dans du chloroforme. Le spectre de

masse est analysé sur 1 µl de l’échantillon en utilisant un appareil Varian Star 3400 CX

branché sur une colonne Varian factor 5MS (15 m X 0,25 mm de diamètre interne, film

de 0,1 µM). La colonne est traversée par un flux d’He à 5,5 psi. La colonne est

maintenue à 90 °C pendant 3 min, puis la température est amenée à 180 °C à raison de

10 °C.min-1, puis 230 °C à 5 °C.min-1 et finalement à 250 °C à 10 °C.min-1. Le flux

élecronique utilisé pour la fragmentation des molécules est de 70 e/V.

5 Modélisation de CYP73A32 et CYP71AJ1

Les modèles par homologie de CYP73A32 et CYP71AJ1 ont été réalisés à l’aide

du logiciel Molecular Operating Environnement (MOE) (Chemical Computing Group,

Montreal) en se référant à la méthode décrite par Baudry (Baudry et al., 2003). Les

données structurales d’1 P450 procaryote [P450 BM3 (PDB : 1BU7)] et 6 P450

eucaryotes [CYP2C5 (PDB : 1DT6) ; CYP2C9 (PDB : 1OG2) ; CYP2C8 (PDB :

1PQ2), CYP2B4 (PDB : 1PO5), et CYP2A6 complexé avec la coumarine (1Z10) et la

xanthotoxine (1Z11)] ont été obtenues à partir du site Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb/). CYP71AJ1 et CYP73A32 ont été alignés avec les

séquences des P450 pré-cités à l’exception de CYP2A6, dans le cas de CYP73A32, dont

les données structurales n’étaient pas encore disponibles. L’alignement a été réalisé en

utilisant la matrice blosum 62 du logiciel MOE. Le résultat de l’alignement a ensuite été

modélisé en utilisant respectivement comme matrices 1PQ2 et 1OG2 pour CYP71AJ1



87

et CYP73A32. Pour chaque candidat, 10 modèles ont été générés par le logiciel. Ces

derniers ont été soumis à une minimisation d’énergie destinée à éliminer les interactions

de Van der Waals improbables. Le meilleur modèle de chaque enzyme, présentant

l’énergie la plus faible, a été sélectionné et un groupement héminique a été ajouté sur les

cystéines 435 (CYP71AJ1) et 447 (CYP73A32). Une minimisation d’énergie globale a

ensuite été appliquée aux modèles avec le champs de force CHARMm22 et un gradient

d’énergie devant passer en dessous 0,01 kcal.mol-1.Å-1. La qualité des modèles a été

évaluée par l’établissement du diagramme de Ramachandran qui définit la distribution

des angles f et et par une simulation de dynamique moléculaire qui permet d’évaluer

la stabilité du modèle. Pour ce dernier test, la dynamique moléculaire a été réalisée sans

molécule d’eau, pendant 160 à 200 ps, avec une température fixée à 300 K. La stabilité

des modèles au cours de la dynamique moléculaire a été déterminée en enregistrant

d’une part la RMSD (Root square mean deviation) des structures générées au cours de

la dynamique en comparaison de la structure initiale, et d’autre part en mesurant le rgyr

des modèles au cours de la simulation.

Pour réaliser les simulations d’ancrage de substrat dans le site actif de

CYP71AJ1 et CYP73A32, un atome d’oxygène a été ajouté sur le fer de héminique afin

de représenter l’état intermédiaire ferroxo. Les simulations d’ancrage ont été effectuées

à l’aide de l’application Monte Carlo du logiciel MOE. Pour chaque substrat testé, 25

modèles d’orientation ont été générés et classés en fonction de la somme de l’énergie de

Van der Waals, de l’énergie électrostatique de l’interaction et de l’énergie propre du

ligand. Le modèle le mieux classé a été sélectionné, puis le complexe protéine-substrat a

subi une étape de minimisation d’énergie à l’aide du champ de force CHARMm22.

Chapitre III

Recherche des déterminants

moléculaires de

l’inactivation différentielle

des C4H de rue et de

topinambour par le psoralène

89

Chapitre III : Recherche des déterminants moléculaires de l’inactivation différentielle des C4H de rue et de topinambour par le

psoralène

1 Introduction

Les phénylpropanoïdes constituent une famille de métabolites secondaires variés

impliqués dans le port dressé des plantes (monomères de lignine) ainsi que dans les

interactions plante / environnement et plante / pathogènes (coumarines, furocoumarines,

flavonoïdes, acide chlorogénique, acide salycilique…). La cinnamate-4-hydroxylase

catalyse la conversion du cinnamate en p-coumarate, deuxième étape de la voie des

phénylpropanoïdes. Cette enzyme appartient à la famille des P450 et à la sous-famille

des CYP73A. De part son rôle majeur dans le métabolisme secondaire des plantes, la

C4H est une enzyme ubiquiste dans le monde végétal, et constitue également le P450

végétal le plus abondant. La C4H de topinambour (CYP73A1) peut, en effet,

représenter plus de 50 % des P450 totaux dans les tubercules de topinambour élicités

(Batard et al., 1997). Actuellement, 47 séquences de CYP73A issues de 31 plantes ont

été isolées (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html). Elles codent, pour la

majorité d’entre elles, des protéines très fortement homologues (homologie supérieure à

80 %) à l’exception de quelques individus plus divergents présentant une homologie de

l’ordre de 60 % (Betz et al., 2001 ; Nedelkina et al., 1999). La caractérisation

fonctionnelle de certains de ces CYP73 a permis de confirmer leur activité C4H (Pierrel

et al., 1993 ; Koopmann et al., 1999 ; Urban et al., 1997). L’étude biochimique la plus

poussée a été réalisée sur le CYP73A1 de topinambour. En plus du cinnamate qui est

métabolisé avec la plus grande efficacité, CYP73A1 possède la capacité de métaboliser

de petites molécules planes et aromatiques analogues du cinnamate, comme

l’herniarine, l’acide indole-2-carboxilique ou certains herbicides de la classe des

phénylurées (Pierrel et al., 1993 ; Schoch et al., 2003 a.). Plusieurs inhibiteurs

compétitifs ou inactivateurs auto-catalytiques ont été également mis en évidence. Ces

derniers sont généralement des analogues du cinnamate portant une fonction alkyne

http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html

Chapitre III : Inactivation différentielle des C4H par le psoralène

90

terminale ou méthylène dioxy (Schoch et al., 2002). CYP73A1 représente le premier

modèle d’étude structurale de P450 végétaux. A défaut de disposer de la structure

tridimensionnelle de l’enzyme, des études de RMN et l’utilisation de la mutagenèse

dirigée ont permis (i) de préciser l’orientation du cinnamate dans le site actif et (ii) de

montrer que les résidus N302, A306, I371 et K484 sont impliqués dans le positionnement

du substrat au niveau du site actif (Schoch et al., 2003 a et b ; Schalk et al., 1999).

Le clonage de CYP73A32 a été réalisé chez Ruta graveolens en 2001.

L’expression hétérologue dans les levures WAT 11 et la caractérisation de l’enzyme ont

permis de vérifier que CYP73A32 code une C4H présentant une affinité pour le

cinnamate (Km = 1 µM) comparable aux autres C4H précédemment identifiées. La

particularité de CYP73A32 tient au fait qu’il est issu d’une plante produisant de grandes

quantités de furocoumarines. Ces molécules, en particulier le psoralène, le 8-MOP et la

bergamottine, sont couramment décrites comme des inactivateurs autocatalytiques de

P450 de mammifères et d’insectes (Zumwalt et Neal, 1993 ; Koenigs et al., 1997). Cette

propriété est conférée par le cycle furane de ces molécules qui, après avoir été oxydé par

le P450, réalise une liaison covalente avec l’apoprotéine et inactive l’enzyme. En raison

de sa nature de P450 et de son implication dans la synthèse des furocoumarines, la

sensibilité de CYP73A32 vis à vis de ces molécules a été testée. Il en résulte que deux

furocoumarines, le psoralène et le 8-MOP, inhibent l’enzyme. Cette inhibition est

caractéristique d’une inactivation autocatalytique : elle est dépendante de la présence de

NADPH ainsi que du temps et de la concentration en inhibiteur, de plus, les inactivateurs

se fixent covalemment sur la partie protéique de l’enzyme avec une stoechiométrie proche

de 1 (Gravot et al., 2004). L’inactivation autocatalytique par les furocoumarines n’est pas

spécifique à CYP73A32 et a pu être étendue à deux autres C4H : CYP73A1 de

topinambour et CYP73A10 de persil. Le fait le plus important est que ces trois enzymes

ne présentent pas la même sensibilité à l’inactivation. Pour CYP73A32 et CYP73A10,

celle-ci est en effet 5 à 60 fois plus faible que pour CYP73A1. Or CYP73A32 et

CYP73A10 sont des C4H de plantes productrices de furocoumarines alors que CYP73A1

est issu du topinambour qui n’en produit pas. Ces résultats pourraient donc laisser penser

que les C4H de plantes à furocoumarines ont évolué afin de pouvoir fonctionner dans un

environnement riche en ces molécules (Gravot et al., 2004). Une forte résistance aux

furocoumarines a également été rapportée pour la C4H d’Ammi majus (CYP73A41), une


91

autre plante productrice de furocoumarines (Hubner et al., 2003). Il est intéressant de

constater qu’en dehors de la sensibilité aux furocoumarines, toutes ces C4H possèdent

des propriétés catalytiques similaires pour le cinnamate (Gravot et al., 2004 ;

Koopmann et al., 1999 ; Hubner et al., 2003).

Depuis ces dernières années, les travaux portant sur l’étude des relations

structure-fonction des P450 eucaryotes se sont multipliés. L’analyse de protéines

chimères, la mutagenèse dirigée et plus récemment le développement de modèles 3D de

P450 a permis l’identification de résidus contrôlant la régiospécificité d’une réaction, la

sélectivité d’un substrat ou la sensibilité à un inhibiteur (pour revue Domanski et

Halpert, 2001). Ces travaux ont notamment mis en évidence que la modification d’un à

deux acides aminés peut complètement modifier les propriétés catalytiques d’une

enzyme. En raison de la forte homologie entre les séquences protéiques des C4H, il est

vraisemblable que la sensibilité différentielle vis à vis du psoralène soit contrôlée par

seulement quelques acides aminés. L’objectif de cette étude est d’identifier ces acides

aminés en question en faisant appel aux techniques précédemment cités de

chiméragenèse et de mutagenèse dirigée, ainsi que par l’étude de modèles

tridimensionnels.


92

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Temps (min)

Ln

(% a

ctiv

ité

rési

duel

le)

0

10

20

-0,4 0,1

1/[Psoralène] (µM-1)

t1/2

(m

in)

Figure III-1 : Représentation de la perte d’activité de CYP73A5 en fonction du temps et de la concentration en psoralène dans le milieu de préincubation La représentation de Kitz-Wilson en encart permet de déterminer le t1/2 et le KI de cette inactivation. [Psoralène] :2 µM ;4 µM ; 8 µM ; 12µM

Tableau III-1 : Constantes d’inactivation autocatalytique des C4H de topinambour (CYP73A1), d’Arabidopsis (CYP73A5), de persil (CYP73A10) et de rue (CYP73A32)

CYP73A1 CYP73A5 CYP73A10 CYP73A32KI (µM) 4,6 ± 2 3 ± 0,4 8 ± 5,1 8 ± 1,4

kinact 0,18 ± 0,02 0,113 ± 0,01 0,036 ± 0,009 0,066 ± 0,03

kinact/KI 41 37 4 8


93

2 Résultats

2.1 Caractérisation de l’inactivation autocatalytique de la C4H d’Arabidopsis par le psoralène

Au début de ces travaux, la faible sensibilité aux furocoumarines des C4H de

plantes productrices de furocoumarines avait pu être montrée pour trois individus

(CYP73A32 de rue, CYP73A10 de persil et CYP73A41 d’Ammi majus). En contrepartie,

seule une C4H représentante des plantes sans furocoumarines avait été testée (CYP73A1 de

topinambour). Afin de confirmer le comportement de ce type de C4H vis à vis des

furocoumarines, la sensibilité au psoralène de CYP73A5 d’Arabidopsis a été testée. Bien

que de la scopolétine et de la scopoline (une coumarine hydroxylée et sa forme glycosylée)

aient été récemment détectées dans les racines et les feuilles d’Arabidopsis, aucune étude

n’a rapporté la présence de furocoumarine chez cette plante (Kai et al., 2006).

La cinétique d’inactivation de CYP73A5 par le psoralène a été réalisée comme

définie dans le chapitre matériel et méthodes. Les microsomes sont pré-incubés en présence

de concentrations croissantes en psoralène (0 µM, 2 µM, 4 µM, 8 µM et 12 µM) dans un

tampon d’activité phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,5 contenant 1 mM de NADPH.

L’activité C4H résiduelle est mesurée sur un échantillon de microsomes pré-incubés

pendant 1 min, 3 min, 6 min et 10 min. L’incubation est réalisée dans du tampon phosphate

de sodium 0,1 M pH 7,5 pendant 15 minutes en présence de NADPH 1 mM et de

cinnamate 200 µM. La figure III-1 représente le logarithme népérien de l’activité C4H

résiduelle mesurée pour chaque concentration d’inhibiteur en fonction du temps. La perte

d’activité pour une concentration en inhibiteur suit une cinétique d’ordre 1 dont on

détermine la constante k en mesurant la pente de la droite. Les constantes d’inactivation de

CYP73A5 ont été déterminées graphiquement comme décrit dans le chapitre matériel et

méthodes. Elles donnent un KI de 3 µM et un kinact de 0,113 min-1. Ces constantes sont très

proches de celles déterminées pour CYP73A1. Ces deux enzymes possèdent donc une

sensibilité pour le psoralène comparable et nettement plus marquée que pour CYP73A32 et

CYP73A10. Ce résultat conforte l’hypothèse d’une adaptation des C4H de plantes à

furocoumarines à la présence de ces molécules.


94

1 65 CYP73A32 -MDLLLLEKA LLGLFAAAVV AIAVSKLRGK RFKLPPGPFG FPVFGNWLQV GDDLNQRKLA NLSKK CYP73A10 MMDFVLLEKA LLGLFIATIV AITISKLRGK KLKLPPGPIP VPVFGNWLQV GDDLNQRNLV DYAKK CYP73A41 -MDFVLLEKA LLGLFIATIV AITISKLRGK KLKLPPGPIP VPVFGNWLQV GDDLNQRNLV EYAKK CYP73A1 -MDLLLIEKT LVALFAAIIG AILISKLRGK KFKLPPGPIP VPIFGNWLQV GDDLNHRNLT DLAKR CYP73A2 -MDLLLLEKT LLGLFLAAVV AIVVSKLRGK RFKLPPGPLP VPIFGNWLQV GDDLNHRNLT QLAKR CYP73A5 -MDLLLLEKS LIAVFVAVIL ATVISKLRGK KLKLPPGPIP IPIFGNWLQV GDDLNHRNLV DYAKK

66 _______ SRS 1_________ 130 CYP73A32 FGDVY LLRMGQRNLV VVSSPEMAKE VLHTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGKGQDMVF TVYSEHWRKM CYP73A10 FGDLF MLRMGQRNLV VVSSPELAKD VLHTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGKGQDMVF TVYSEHWRKM CYP73A41 FGDLF LLRMGQRNLV VVSSPDLAKD VLHTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGKGQDMVF TVYSEHWRKM CYP73A1 FGEIL LLRMGQRNLV VVSSPELAKE VLHTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGKGQDMVF TVYGEHWRKM CYP732 FGDIF LLRMGQRNLV VVSSPDLAKE VLHTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGEGQDMVF TVYGEHWRKM CYP73A5 FGDLF LLRMGQRNLV VVSSPDLTKE VLLTQGVEFG SRTRNVVFDI FTGKGQDMVF TVYGEHWRKM

131 195 CYP73A32 RRIMTVPFFT NKVVQQQRFN WEDEAARVVE DVKKDPQAAT TGIVLRRRLQ LLMYNNMYRI MFDRR CYP73A10 RRIMTVPFFT NKVVQQYRFG WEDEAARVVE DVKANPEAAT NGIVLRNRLQ LLMYNNMYRI MFDRR CYP73A41 RRIMTVPFFT NKVVQQYRFG WEDEAARVVE DVKANPEAAT NGIVLRNRLQ LLMYNNMYRI MFDRR CYP73A1 RRIMTVPFFT NKVVQQYRYG WEAEAAAVVD DVKKNPAAAT EGIVIRRRLQ LMMYNNMFRI MFDRR CYP73A2 RRIMTVPFFT NKVVQQYRHG WEAEAAAVVD DVRKNPDAAV SGLVIRRRLQ LMMYNNMYRI MFDRR CYP73A5 RRIMTVPFFT NKVVQQNREG WEFEAASVVE DVKKNPDSAT KGIVLRKRLQ LMMYNNMFRI MFDRR

196 __SRS 2__ __ SRS 3___ 260 CYP73A32 FESVD DPLFNKLKAL NGERSRLAQS FEYNYGDFIP ILRPFLRGYL KLVKEVKERR LKLFKDYFVE CYP73A10 FESVD DPLFLKLKAL NGERSRLAQS FEYHFGDFIP ILRPFLRGYL KLCQEIKDKR LKLFKDYFVD CYP73A41 FESVD DPLFLKLKAL NGERSRLAQS FEYNFGDFIP ILRPFLRGYL KLCQEIKDKR LKLFKDYFVD CYP73A1 FESED DPLFLKLKAL NGERSRLAQS FEYNYGDFIP ILRPFLRNYL KLCKEVKDKR IQLFKDYFVD CYP73A2 FESEE DPLFQRLKAL NGERSRLAQS FEYNYGDFIP ILRPFLKGYL KICKEVKETR LKLFKDYFVD CYP73A5 FESED DPLFLRLKAL NGERSRLAQS FEYNYGDFIP ILRPFLRGYL KICQDVKDRR IALFKKYFVD

261 ______SRS 4_____ 325 CYP73A32 ERKKLTSTKS MTEEN-FKCA IDHVLDAQQK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV CYP73A10 ERKKLESIKS VDNNS-LKCA IDHIIEAQQK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV CYP73A41 ERKKLESIKS VGNNS-LKCA IDHIIEAQEK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV CYP73A1 ERKKIGSTKK MDNNQ-LKCA IDHILEAKEK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV CYP73A2 ERKNIGSTKS TNNEG-LKCA IDHILDAEKK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV CYP73A5 ERKQIASSKP TGSEG-LKCA IDHILEAEQK GEINEDNVLY IVENINVAAI ETTLWSIEWG IAELV

326 ___SRS 5___ 390 CYP73A32 NHPDI QKKLRAEIDR VLGPDHQITE PDTHKLPYLQ AVIKETLRLR MAIPLLVPHM NLNDAKLAGY CYP73A10 NNPEI QKKLRHELDT VLGAGVQICE PDVQKLPYLQ AVIKETLRYR MAIPLLVPHM NLHDAKLAGY CYP73A41 NNPEI QKKLRHELDT VLGAGVQICE PDVQKLPYLQ AVIKETLRYR MAIPLLVPHM NLHEAKLAGY CYP73A1 NHPEI QAKLRHELDT KLGPGVQITE PDVQNLPYLQ AVVKETLRLR MAIPLLVPHM NLHDAKLGGF CYP73A2 NHPEI QQKVRDEIDR VLGVGHQVTE PDIQKLPYLQ AVVKETLRLR MAIPLLVPHM NLHDAKLGGY CYP73A5 NHPEI QSKLRNELDT VLGPGVQVTE PDLHKLPYLQ AVVKETLRLR MAIPLLVPHM NLHDAKLAGY

391 455 CYP73A32 DIPAESKILV NAWWLANNPA HWKDPQVFRP ERFLEEESGV EANGNDFRYI PFGVGRRSCP GIILA CYP73A10 DIPAESKILV NAWWLANNPA HWNKPDEFRP ERFLEEESKV EANGNDFKYI PFGVGRRSCP GIILA CYP73A41 DIPAESKILV NAWWLANNPA HWNKPDEFRP ERFLEEESKV EANGNDFKYI PFGVGRRSCP GIILA CYP73A1 DIPAESKILV NAWWLANNPD QWKKPEEFRP ERFLEEEAKV EANGNDFRYL PFGVGRRSCP GIILA CYP73A2 DIPAESKILV NAWWLANNPA HWKKPEEFRP ERFFEEESHV EANGNDFRYL PFGVGRRSCP GIILA CYP73A5 DIPAESKILV NAWWLANNPN SWKKPEEFRP ERFFEEESHV EANGNDFRYV PFGVGRRSCP GIILA

456 __SRS 6__ 508 CYP73A32 LPILG ITIGRMVQNF ELLPPPGQSK IDTSEKGGQF SLFILNHSTI VLKPRSSV CYP73A10 LPILG IVIGRLVQNF ELLPPPGQSK IDTAEKGGQF SLQILKHSTI VCKPRSL- CYP73A41 LPILG IVIGRLVQNF ELLPPPGQSK IDTAEKGGQF SLQILKHSTI VCKPRSL- CYP73A1 LPILG ITIGRLVQNF ELLPPPGQSK IDTDEKGGQF SLHILKHSTI VAKPRSF- CYP73A2 LPILG ITLGRLVQNF ELLPPPGQSQ IDTSEKGGQF SLHILKHSTV VAKPRSF- CYP73A5 LPILG ITIGRMVQNF ELLPPPGQSK VDTSEKGGQF SLHILNHSII VMKPRNC-

Figure III-2 : Alignement des séquences protéiques de C4H réalisé à l’aide du logiciel ClustalX Les résidus communs aux C4H de plantes productrices de furocoumarines et non conservées chez les autres C4H sont représentés en rouge. Le résidu V415 atypique dans la séquence de CYP73A32 est représenté en vert. Les sites de reconnaissance du substrat (SRS) potentiels repositionnés par Rupasinghe (2003) pour CYP73A5 sont indiqués par un trait au dessus des séquences. Pour des raisons de clarté seule une partie des séquences de C4H utilisées pour l’alignement est représenté.


95

2.2 Recherche des acides aminés responsables de la sensibilité différentielle des C4H vis à vis des furocoumarines

2.2.1 Première approche : Mutagenèse dirigée sur les résidus conservés de CYP73A32, A10 et A41

En raison du fait que les trois C4H de plantes à furocoumarines présentent toutes

une faible sensibilité pour ces molécules, il est envisageable qu’elles aient acquis cette

propriété grâce à une ou des mutations d’acide(s) aminé(s) commun(s). Un alignement

de séquences a donc été réalisé entre toutes les C4H disponibles au moment de ce

travail avec l’objectif d’identifier les acides aminés communs à CYP73A32, CYP73A10

et CYP73A41 et différent des autres C4H provenant de plantes ne produisant pas de

furocoumarines (Fig. III-2). Cette approche a permis de cibler 7 acides aminés qui sont

dans la séquence de CYP73A32 : Q55, S123, L181, V198, Q414, I438 et F491. En

dehors de Q414 et F491 qui sont remplacés chez CYP73A10 et CYP73A41

respectivement par D et Q, tous sont conservés et présents uniquement dans les

séquences de C4H de plantes à furocoumarines. Parmi les 7 résidus ciblés, Q55, S123 et

F491 paraissent les plus intéressants. Les deux derniers sont localisés dans 2 des 6

régions SRS (SRS1 et SRS6) définies par Gotoh pour la famille des CYP 2 et

récemment repositionnées chez les CYP73 par Rupasinghe (Gotoh, 1992 ; Rupasinghe

et al., 2003). Bien qu’il ne soit pas dans une région SRS, Q55 est positionné dans une

zone pour laquelle plusieurs mutations modifiant la sensibilité à l’inhibition par l’azole

ont été rapportées pour le CYP51 de Mycobacterium tuberculosis (Podust et al., 2001).

Un huitième acide aminé spécifique à CYP73A32 ressort de cet alignement. Il s’agit de

la valine 415 qui remplace un glutamate conservé chez toutes les autres C4H. Q414 et

V415 représentent deux résidus atypiques dans une région pourtant très conservée dans

les séquences protéiques des C4H.

Le rôle des résidus identifiés par l’alignement de séquence, est vérifié par

mutagenèse dirigée en remplaçant chacun d’entre eux dans la séquence de CYP73A32

par celui retrouvé à la même position dans la séquence de CYP73A1. Sept mutants

simples sont ainsi créés : Q55H, S123G, L181M, V198E, Q414E, I438L et F491H. Le

rôle des deux résidus voisins V415 et Q414 est analysé par l’étude du mutant double

Q414E / V415E. Les ADNc des 8 mutants de CYP73A32 sont générés par PCR en

Tableau III- 2 : Amorces utilisées pour la création des mutants ponctuels de CYP73A32

Mutation Amorces sens (3) Amorces antisens (4)

Q55H 5’ CGGCGATGACTTGAACCACCGGAAACTTGCCAATTT 5’ AAATTGGCAAGTTTCCGGTGGTTCAAGTCATCGCCG

S123G 5’ GGTGTTCACGGTTTACGGTGAGCACTGGCGGAAGATGC 5’ GCATCTTCCGCCAGTGCTCACCGTAAACCGTGAACACCL181M 5‘CGGCGGCTGCAGCTCATGATGTACAACAACATGTAC 5’ GTACATGTTGTTGTACATCATGAGCTGCAGCCGCCG V198F 5’ CGATAGGAGATTCGAGAGCGAAGACGATCCTTTGTTCAAC 5’ GTTGAACAAAGGATCGTCTTCGCTCTCGAATCTCCTATCG Q414E 5' GCTCACTGGAAAGACCCGGAAGAGTTCAGGCCGGAG 5' CTCCGGCCTGAACTCTTCCGGGTCTTTCCAGTGAGCQ414E/V415E 5’ GCTCACTGGAAAGACCCGGAAGAATTCAGGCCGGAG 5’ CTCCGGCCTGAATTCTTCCGGGTCTTTCCAGTGAGC I438L 5’ GGAAATGACTTCCGATACCTTCCTTTTGGTGTCGGG 5’ CCCGACACCAAAAGGAAGGTATCGGAAGTCATTTCC

F491H 5’ GGTGGGCAGTTCAGTTTGCACATTCTGAACCACTCCACG 5’ CGTGGAGTGGTTCAGAATGTGCAAACTGAACTGCCCACC V242C 5' GGTTATTTGAAGCTGTGCAAGGAAGTTAAGG 5' CCTTAACTTCCTTGCACAGCTTCAAATAACCR248K 5' GTGAAGGAAGTTAAGGAAAAAAGACTCAAGC 5' GCTTGAGTCTTTTTTCCTTAACTTCCTTCACL250I/K251Q 5' GTTAAGGAAAGAAGAATCCAGCTTTTCAAGGAC 5' GTCCTTGAAAAGCTGGATTCTTCTTTCCTTAAC


97

utilisant comme matrice l’ADNc sauvage de CYP73A32 cloné dans le vecteur pUC19

entre les sites de restriction BamHI et EcoRI. Cette technique nécessite l’utilisation de

deux amorces en 5’ (Amorce 1 : 5’TTTGGATCCATGGATCTCCTCTTACTG) et en

3’ (Amorce 2 : 5’TTGAATTCTTAGACAGAAGATCTAGG) de l’ADNc ainsi que de

deux amorces mutées superposant la séquence à modifier et complémentaires l’une de

l’autre. Les séquences des amorces utilisées sont décrites dans le tableau III-2. Dans un

premier temps, deux PCR (A et B) sont réalisées (Fig. III-3) : la première avec l’amorce

(1) en 5’ de la séquence et l’amorce mutée (4) anti-sens (A) et la seconde avec l’amorce

mutée sens (3) et l’amorce (2) en 3’ de la séquence(B). Ces deux PCR génèrent ainsi

deux fragments de l’ADNc, complémentaires sur une vingtaine de paires de bases. Ces

deux fragments sont purifiés sur gel d’agarose 1 % puis utilisés comme matrice pour

une troisième PCR avec les deux amorces 5’ et 3’ (1) et (2) (C). Cette étape génère la

totalité de l’ADNc muté qui sera cloné dans le vecteur d’expression pYeDP60 entre les

sites BamHI et EcoRI. La présence de la mutation désirée et l’absence d’autres

mutations parasites dans l’ADNc sont vérifiées par séquençage. La transformation des

levures WAT 11 par les plasmides, ainsi que les conditions d’expression hétérologue

1

2

3

4

PCR (B) Amorces 3 +2

PCR (A) Amorces 1 + 4

PCR (C) Amorces 1 + 2

Figure III-3 : Schéma de la stratégie d’obtention des mutants ponctuels de CYP73A32 Les amorces 1 et 2 permettent l’insertion respectivement des sites BamHI et EcoRI. Les amorces 3 et 4 sont décrites dans le tableau III-2.

Tableau III-3 : Tableau récapitulatif du niveau d’expression dans les levures, des constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène des mutants de CYP73A32 Le niveau d’expression des P450 est estimé d’après la mesure du spectre différentiel au CO à 450 nm. Les constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène ont été déterminées comme décrit dans le chapitre matériel et méthodes.

ClonesNiveau d'expression

(pmol P450/mg prot)

Km (µM) kcat (pkat/pmol P450) KI kinact kinact/KI

A32 Sauvage 30 ± 12 0,9 ± 0,2 298 ± 8 8 ± 1,4 0,066 ± 0,03 8

Q55H 38 ± 8 0,74 ± 0,1 214 ± 9 6 ± 2 0,06 ± 0,01 10

S123G 45 ± 1 0,9 ± 0,2 175 ± 28 5,7 ± 1,3 0,069 ± 0,01 12

L181M 28 0,9 192 7,8 ± 1 0,05 ± 0,02 7

V198E 31 0,8 ± 0,1 243 ± 6 6,4 ± 2,3 0,067 ± 0,04 10

Q414E 37 ± 15 1,3 ± 0,3 250 ± 12 6,9 0,089 13

Q414E/V415E 90 ± 13 0,9 ± 0,2 241 ± 21 7 ± 1 0,067 ± 0,01 10

I438L 37 ± 11 0,8 ± 0,1 257 ± 8 8 ± 5 0,08 ± 0,02 10

F491H 51 0,6 ± 0,1 163 ± 35 9 ± 1,7 0,08 ± 0,02 9

Octomutant 8 ± 5 0,9 ± 0,4 82 ± 9 N.D

Contantes d'inactivation par le psoralèneConstantes d'activité C4H


99

des protéines mutantes et la préparation des microsomes sont décrits dans le chapitre

matériel et méthodes.

Le niveau d’expression des C4H mutantes dans les microsomes de levure est

déterminé en mesurant le spectre différentiel à 450 nm après incubation en présence de

monoxyde de carbone (Omura et Sato, 1964 a et b). Le niveau d’expression des mutants

est en moyenne similaire à celui de CYP73A32 sauvage (Tab.III-3), à l’exception du

double mutant Q414E/V415E dont le niveau d’expression est augmenté d’un facteur

trois. Tous les mutants ont conservé une activité C4H. La comparaison de leurs

constantes catalytiques pour le cinnamate avec celles du CYP73A32 sauvage montre

qu’aucune des mutations n’affecte l’affinité de l’enzyme pour le substrat. En revanche,

l’activité spécifique de tous les mutants est réduite. Cette réduction est plus marquée

pour F491H, L181M et S123G où l’activité spécifique représente entre la moitié et deux

tiers de celle du CYP73A32 sauvage. La sensibilité des mutants à l’inactivation par le

psoralène a été mesurée comme décrit au début de ce chapitre. Tous sont inactivés par le

psoralène et possèdent une affinité (KI) et une vitesse d’inactivation (kinact) comparables

à celles du CYP73A32 sauvage.

La mutation simple des résidus identifiés sur la base de l’alignement des

séquences de C4H, n’a pas permis d’augmenter la sensibilité de l’enzyme à

l’inactivation autocatalytique par le psoralène. Ces résultats tendent à montrer que (i)

soit les acides aminés qui ont été identifiés n’interviennent pas dans la faible sensibilité

de CYP73A32 à l’inactivation par le psoralène, (ii) soit cette faible sensibilité est

conférée par la modification simultanée de plusieurs de ces résidus.

Pour vérifier cette dernière hypothèse, nous avons entrepris de créer un

« octomutant » de CYP73A32 combinant les huit mutations puis de tester sa sensibilité

au psoralène. L’expression de cet octomutant dans les levures WAT 11 est très faible en

comparaison des mutants simples et du CYP73A32 sauvage. Un pic à 450 nm de faible

amplitude est enregistré dans le microsomes contenant l’octomutant après bullage au

monoxyde de carbone, ce qui nous permet d’estimer la quantité de P450 autour de

8 pmol / mg de protéines microsomales. En dépit des huit mutations, cette enzyme

conserve une activité C4H bien que l’activité spécifique soit fortement altérée (Kcat 3,5

fois inférieure à celle de CYP73A32 sauvage). L’affinité pour le cinnamate n’est, par


100

contre, pas modifiée. L’octomutant est inhibé par le psoralène, cependant cette

inactivation est excessivement faible, ce qui n’a pas permis de déterminer les constantes

d’inactivation. Le comportement de l’enzyme mutée vis à vis de l’inactivation par le

psoralène a néanmoins été comparé avec celui de CYP73A32 et CYP73A1. Les

microsomes de levures exprimant CYP73A32, CYP73A1 et l’octomutant ont été pré-

incubés en présence de NADPH et de 50 µM de psoralène pendant 10 min. L’activité

C4H résiduelle a ensuite été mesurée sur une fraction des microsomes pré-incubés en la

diluant dix fois dans une mélange réactionnel contenant une forte concentration en

cinnamate (200 µM). L’inactivation de l’enzyme pendant l’incubation est considérée

comme négligeable en raison de la forte concentration en cinnamate et de la dilution de

l’inhibiteur. L’activité C4H mesurée après une pré-incubation en absence d’inhibiteur et

de NADPH définit le 100 % d’activité. Suite à la préincubation en présence de

psoralène et de NADPH l’activité résiduelle de CYP73A1 est réduite à seulement 10 %

de l’activité du témoin alors qu’elle n’est réduite qu’à 40 % dans le cas de CYP73A32

(Tab. III-4). L’octomutant, par contre, conserve 76 % d’activité.

La préincubation des enzymes uniquement en présence de NADPH (1 mM)

entraîne également une perte d’activité causée par un découplage entre la consommation

de NADPH et la métabolisation de substrat. En absence de substrat, le pouvoir

réducteur fourni par le NADPH entraîne la production d’espèces oxygénées réactives

(EOR) et l’inactivation d’une partie du pool d’enzymes. Les vitesses d’inactivation par

le NADPH de CYP73A32 et CYP73A1, mesurées dans le cadre de travaux précédents

sont similaires, ce qui est confirmé ici puisque les deux enzymes conservent entre 60 et

65 % d’activité après la pré-incubation en présence de NADPH. L’octomutant conserve,

Tableau III-4 : Mesure de la perte d’activité de CYP73A1, CYP73A32 et de l’octomutant après 10 min et 20 min en présence de psoralène

PréincubationCYP73A1 CYP73A32

10 min 20 minNADPH + Psoralène

10 ± 2 40 ± 3 76 57

NADPH seul 65 ± 10 62 ± 2 87 76

0 100 100 100 100

OctomutantClones


101

lui, 87 % d’activité. Cette faible inactivation par le NADPH ainsi que la diminution de

l’activité spécifique d’hydroxylation du cinnamate, indiquent que la combinaison des

mutations affecte vraisemblablement le mécanisme catalytique de l’enzyme. Suite à une

pré-incubation plus longue (20 min), l’octomutant conserve 76 % d’activité en présence

de NADPH seul et 57 % d’activité avec le psoralène. En dépit de l’altération de son

mécanisme catalytique, il apparaît néanmoins que le comportement de l’octomutant vis

à vis du psoralène, est très proche de celui de CYP73A32 non modifié. Par ailleurs, les

résultats partiels fournis par l’étude des trois mutants double Q55H / S123G ,

Q55H / F491H et S123G / F491H (correspondant aux résidus les plus intéressants

d’après l’alignement des séquences de C4H. Cf. § 2.2.1) n’ont pas non plus révélé une

augmentation de la résistance au psoralène (résultats non présentés).

2.2.2 Deuxième approche : étude de protéines chimères de CYP73A32 et CYP73A1

L’étude des mutants ponctuels de CYP73A32 a révélé que les acides aminés

identifiés d’après l’alignement de séquences protéiques ne sont vraisemblablement

pas impliqués dans l’inactivation différentielle des C4H par le psoralène. Le choix

des acides aminés était basé sur l’hypothèse que la faible sensibilité au psoralène des

3 C4H de plantes productrices de furocoumarines était contrôlée par un même

mécanisme évolutif (i.e. un ou plusieurs acides aminés communs aux trois C4H et

différents de celles de plantes non productrices seraient à l’origine de la sensibilité

différentielle au psoralène). Le comportement des mutants de CYP73A32 met à mal

cette hypothèse et semble indiquer au contraire que CYP73A32, CYP73A10 et

CYP73A41 ont évolué indépendamment.

Pour la suite de ce travail, nous nous sommes focalisés sur le comportement de

CYP73A1 et CYP73A32. Ces deux enzymes possèdent une homologie de séquences

de 83 %, ce qui correspond à 87 acides aminés divergents. Bien que nous en ayons

déjà testé 8, il en reste encore 79 qu’il n’est pas envisageable de tester un à un par

mutagenèse dirigée.

La génération de protéines chimères, combinant les domaines de deux

protéines proches possédant des propriétés catalytiques différentes, s’est déjà révélée

être une approche utile pour identifier des régions importantes pour la régio-spécificité


102

ADNc de CYP73A1

ADNc de CYP73A32

Amorce chimère

A

B

C

Produit de la PCR 1

Figure III-4 : Stratégie utilisée pour la construction des C4H chimères (A) Une première PCR (PCR 1) est réalisée pour amplifier la partie 5’ de la chimère. Cette PCR requiert l’utilisation d’une amorce chimère antisens (description dans le tableau III-5) et d’une amorce spécifique en 5’ de CYP73A1 5’ GGATCCATGGACCTCCTCCTCATAGA3’

(B) Le produit de la PCR 1 est utilisé comme amorce sens contre une amorce antisens spécifique de l’extrémité 3’ de CYP73A32 5’CTGTTGCCACTGTATGAGATGATT3’ (C) Le produit de la PCR 2 est une séquence chimèrique combinant le domaine 5’ de CYP73A1 et le domaine 3’ de CYP73A32.


103

d’une réaction ou pour la sensibilité à un inhibiteur (Ibeanu et al., 1996 ; Von

Weymarn et al., 2004). Cette approche a l’avantage de pouvoir restreindre le nombre

d’acides aminés candidats en vue d’un travail de mutagenèse dirigée et permet

également d’identifier des interactions potentielles entre plusieurs régions de la

protéine.

Afin de localiser « grossièrement » les sites potentiels déterminant la sensibilité

différentielle de CYP73A32 et CYP73A1 à l’inhibition par le psoralène, deux protéines

chimères combinant des domaines larges de chaque protéine ont été crées. La première

est constituée des 134 premiers acides aminés N-terminaux de CYP73A1 avec la partie

C-terminale de CYP73A32 (nommées A1 [1-134]) et la seconde des 379 premiers

acides aminés de CYP73A1 (A1 [1-379]). Les ADNc des protéines chimères ont été

générés par PCR. Pour ces deux constructions, une stratégie commune a été utilisée.

Elle est résumée par la Figure III-4. Dans un premier temps, la partie 5’ de la chimère

est amplifiée par PCR à l’aide d’une amorce 5’ spécifique de la séquence de CYP73A1,

insérant un site de restriction en amont de l’ATG initiateur et une amorce chimère

antisens capable de s’hybrider sur CYP73A1 par sa partie 3’ (Tab. III-5). Le produit

PCR obtenu est ensuite purifié sur gel d’agarose 1 %, puis est utilisé dans une deuxième

PCR comme amorce sens en utilisant comme matrice l’ADNc de CYP73A32. L’amorce

antisens utilisée est spécifique de CYP73A32 et insère un site de restriction EcoRI en

aval du codon stop. La produit de cette PCR correspond à la séquence entière de la

chimère avec le domaine de CYP73A1 en 5’ et le domaine de CYP73A32 en 3’. Après

purification sur gel d’agarose, le produit PCR est digéré par les enzymes de restriction

adéquates, puis est cloné dans le vecteur d’expression pYeDP60. Après avoir vérifié la

construction par séquençage, le plasmide est introduit dans les levures WAT 11.

Amorces SéquenceA1 1-31 5’ GAAGGGCCCCGGCGGGAGTTTGAATTTTTTACGCGGAGTTTGGA1 1-58 5’ GAATTTCTTGGATAAATTGGCTAAGTTCCGGTGGTTCAAATCATCA1 1-134 5' GGTCATGATCCTCCTCATCTTCCA1 1-229 5' CTCAAGAAAGGCCTCAAAATAGGGATGAAATCGCCATAGTTGTACA1 1-259 5' GCTTGTTAATTTCTTTCTCTCTTCAACGAAGTAATCCTTGAAGAGCTGAATCA1 1-288 5' GTTGTCCTCGTTGATTTCTCCCTTCTCTTTAGCTTCAAGAATGTGA1 1-379 5' GGTTCATGTGTGGGACTAGAAG

Tableau III- 5 : Amorces utilisées pour générer les protéines chimères CYP73A1/CYP73A32


104

3

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

4,6

0 2 4 6 8 10

Temps (min)

Ln

(% a

ctiv

ité

rési

duel

le)

0

2

4

6

8

10

-0,35 -0,15 0,05 0,25

1/ [ p s o ra l èn e ] ( µM- 1) B

3

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

4,6

0 2 4 6 8 10

Temps (min)

Ln

(% a

ctiv

ité

rési

duel

le)

0

4

8

12

16

20

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4

1/ [ p s o ra l èn e ] ( µM - 1 ) A

Tableau III- 6 : Niveau d’expression, métabolisme du cinnamate et inactivation par le psoralène des chimères A1 [1-134] et A1 [1-379] ainsi que de CYP73A32 et CYP73A1.

Clones

Km (µM)Vm (pkat/pmol

P450) KI kinact kinact/KI

A32 30 ± 12 0,9 ± 0,2 298 ± 8 8 ± 1,4 0,066 ± 0,03 8

A1-134 98 ± 13 0,7 ± 0,1 362 ± 5 3,8 ± 0,7 0,073 ± 0,01 19

A1-379 138 ± 17 0,9 ± 0,1 374 ± 12 3,5 ± 0,2 0,16 ± 0,02 44

A1 136 ± 24 1 ± 0,1 350 ± 10 4,6 ± 2 0,18 ± 0,02 41

InhibitionCinétiqueExpression levure (pmol P450/mg

prot)

Figure III-5 : Représentation de la perte d’activité des chimères A1 [1-134] et A1 [1-379] en fonction du temps et de la concentration en psoralène dans le milieu de préincubation La représentation de Kitz-Wilson en encart permet de déterminer le t1/2 et le KI

de cette inactivation. [Psoralène] : 4 µM ; 8 µM ;12 µM ; 50 µM


105

L’expression de A1 [1-134] et A1 [1-379] dans les levures WAT 11 a été réalisée

en suivant la méthode décrite dans le chapitre matériel et méthodes. Les niveaux

d’expression dans les microsomes des deux chimères, définis d’après le spectre

différentiel à 450 nm après bullage de monoxyde de carbone, sont tous deux comparables

à celui de CYP73A1 et correspondent à 3 à 4 fois celui de CYP73A32. A1 [1-134] et A1

[1-379] sont fonctionnels pour l’activité C4H et possèdent des constantes catalytiques

proches de celles des deux protéines apparentées (Tab. III-6). La sensibilité des chimères

à l’inactivation par le psoralène a été déterminée en suivant la perte d’activité en fonction

du temps et de la concentration en psoralène comme décrit au début de ce chapitre. Les

deux chimères répondent différemment à l’inactivation par le psoralène (Fig. III-5) . A1

[1-379] est fortement inhibé et présente une affinité pour l’inhibiteur et une vitesse

d’inactivation comparable à celle de CYP73A1. En revanche le comportement de A1 [1-

134] peut être qualifié d’intermédiaire entre CYP73A1 et CYP73A32. La vitesse

d’inactivation de A1 [1-134] est très proche de celle de CYP73A32, par contre il possède

une affinité pour le psoralène plus élevée qui s’approche de celle de CYP73A1. L’étude

de ces deux chimères semble montrer que l’affinité pour le psoralène et la vitesse

d’inactivation sont déterminées par deux régions distinctes, la première localisée dans la

partie N-terminale et l’autre dans la région médiane. Une localisation plus fine des

régions déterminant ces deux paramètres d’inactivation a été entreprise par la création et

l’étude de nouvelles protéines chimères. La région 1-134 recouvre 24 résidus différents

entre CYP73A1 et CYP73A32. Cette région a fait l’objet de la création de deux autres

chimères. Pour la première, A1 [1-31] seule l’ancre membranaire de CYP73A32 a été

substituée par celle de CYP73A1, alors que pour A1 [1-58] c’est la région s’étendant

jusqu’à l’hélice A qui est remplacée. D’après l’étude des premières chimères la région

134 – 379 doit contenir le ou les résidus déterminant les vitesses d’inactivation de

CYP73A1 et CYP73A32 par le psoralène. Cette région englobe les SRS2, 3, 4 et 5. Trois

nouvelles chimères ont été construites pour étudier cette région : les chimères A1 [1-229],

A1 [1-259] et A1 [1-288]. Ces trois chimères permettent d’analyser le rôle de quatre

régions divergentes entre CYP73A32 et CYP73A1 au niveau de l’hélice D et de la

boucle D-E, de l’hélice G (correspondant au SRS3), de l’hélice H et de la partie C-

terminale de l’hélice I. Tous les ADNc chimères ont été synthétisés de la même façon

que les deux premières. Le clonage, la transformation des levures WAT 11 et


106

Clones

Km (µM)Vm (pkat/pmol

P450)KI kinact kinact/KI

A32 30 ± 12 0,9 ± 0,2 298 ± 8 8 ± 1,4 0,066 ± 0,03 8

A1-31 103 ± 7 0,8 ± 0,1 276 ± 12 7,1 0,04 5

A1-58 94 ± 11 0,9 ± 0,1 314 ± 12 3,5 ± 0,3 0,065 ± 0,01 18

A1-134 98 ± 13 0,7 ± 0,1 362 ± 5 3,8 ± 0,7 0,073 ± 0,01 19

A1-229 87 ± 15 0,75 ± 0,2 324 ± 80 2,9 ± 0,3 0,088 ± 0,02 30

A1-259 96 ± 6 1,1 ± 0,2 353 ± 30 3,4 ± 1 0,11 ± 0,01 32

A1-288 101 ± 12 0,7 ± 0,1 349 ± 15 4,3 ± 1 0,11 ± 0,01 25

A1-379 138 ± 17 0,9 ± 0,1 374 ± 12 3,5 ± 0,2 0,16 ± 0,02 44

A1 136 ± 24 1 ± 0,1 350 ± 10 4,6 ± 2 0,18 ± 0,02 41

InhibitionCinétiqueExpression levure (pmol P450/mg

prot)

Tableau III-7 : Tableau récapitulatif du niveau d’expression dans les levures, des constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène des chimères de CYP73A32 et CYP73A1 Le niveau d’expression des P450 est estimé d’après la mesure du spectre différentiel au CO

à 450 nm. Les constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène ont été déterminées comme décrit dans le chapitre matériel et méthodes.


107

l’expression hétérologue sont décrits au début de ce chapitre. Le niveau d’expression

dans les microsomes de levure de toutes les chimères est en moyenne égal, variant de 90

à 130 pmol de P450 / mg de protéines microsomales (Tab. III-7). Ce niveau

d’expression est très proche de celui de CYP73A1. Comme dans le cas précédent, les

propriétés cinétiques des chimères pour le cinnamate ne sont pas altérées avec un Km

entre 0,7 à 1 µM et des activités spécifiques autour de 350 min-1. Les constantes

d’inactivation par le psoralène des chimères sont en revanche modifiées. Le

remplacement de l’ancre membranaire de CYP73A32 par celle de CYP73A1 ne modifie

pas la sensibilité de l’enzyme au psoralène. La chimère A1 [1-31] conserve en effet les

mêmes constantes d’inactivation que CYP73A32. Par contre, le remplacement d’une

partie N-terminale plus importante correspondant aux 58 premiers acides aminés,

génère une enzyme 2 à 3 fois plus affine pour le psoralène que CYP73A32, sans que la

vitesse d’inactivation ne soit vraiment modifiée. Le comportement de cette chimère vis

à vis du psoralène se rapproche de celui de la chimère A1 [1-134] étudié précédemment

et également de la chimère A1 [1-229]. La substitution de régions plus longues de

CYP73A32 par celle de CYP73A1 se traduit par un maintien du KI autour de 3 µM

comparable à celui de CYP73A1, et par une vitesse d’inactivation qui augmente avec la

longueur du fragment substitué. Les chimères A1 [1-259] et A1 [1-288] sont inactivées

avec un kinact de 0,11 min-1, intermédiaire entre celui de CYP73A32 et CYP73A1, alors

que A1 [1-379] est inactivé avec une kinact de 0,16min-1 très proche de CYP73A1.

2.2.3 Construction d’un modèle 3D de CYP73A32 et étude de l’orientation du psoralène dans le site actif

En parallèle de l’analyse des C4H chimères, une étude bioinformatique a été

entreprise afin d’étudier l’orientation du psoralène et d’identifier des résidus en contact

avec l’inactivateur. Le modèle 3D de CYP73A32 a été généré par homologie à l’aide du

logiciel MOE (Chemical Computing Group, Inc). La séquence protéique de CYP73A32

a été alignée avec les séquences protéiques de P450 dont la structure 3D a été résolue :

CYP2C5 (PDB : 1DT6), CYP2C9 (PDB : 1OG2), CYP2C8 (PDB : 1PQ2), CYP2B4

(PDB : 1PO5), P450 BM3 (PDB : 1BU7). Dix modèles ont été générés sur la base des

alignements et en utilisant comme matrice principale la structure 1OG2 qui présente la

plus forte homologie avec CYP73A32 (25%). Le modèle présentant le meilleur


108

Figure III-6 : Evolution des paramètres thermodynamiques et structuraux du modèle de CYP73A32 pendant une simulation de dynamique moléculaire de 200 ps (A) évolution de la température. (B) évolution de la RMSD relative à la structure initiale. (C)

évolution du rgyr.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 50 100 150 200

Temps (ps)

RM

SD (Å

)

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

0 50 100 150 200

Temps (ps)

Tem

péra

ture

(Kel

vin)

22,4

22,6

22,8

23

23,2

23,4

23,6

0 50 100 150 200

Temps (ps)

rgyr

(Å)

A

B

C


109

score d’après le programme d’évaluation de MOE, est conservé. L’hème de la structure

tridimensionnelle de CYP2C9 est ensuite fixée sur la cystéine 447 de CYP73A32. Le

modèle subit ensuite une minimisation d’énergie puis est soumis à des tests de

validation. Le premier est l’établissement du diagramme de Ramachandran permettant

d’évaluer la distribution des angles f et . Le test révèle la bonne distribution de 466

acides aminés sur 484 pour CYP73A32 soit 96,7 % des acides aminés. Ce résultat place

notre modèle au même niveau que ceux déjà publiés pour CYP119, CYP6B1,

CYP73A5, CYP98A3, CYP75B1 et CYP84A1 (Chang et Loew, 2000 ; Baudry et al.,

2003 ; Rupasinghe et al., 2003). La stabilité structurale et thermodynamique du modèle

a été estimée en le soumettant à une simulation de dynamique moléculaire pendant

200 ps. Au cours de la simulation, la température du système est maintenue à 300 ±

20 K (Fig. III-6). La stabilité de la structure est estimée en mesurant d’une part la

RMSD (Root Mean Square Deviation) des structures générées en fonction du temps au

cours de la dynamique moléculaire avec la structure de départ, et d’autre part en

déterminant l’évolution du rgyr (radius of gyration) de la structure au cours du temps

(Fig. III-6). Ces deux paramètres se stabilisent avant la fin de la dynamique moléculaire,

la RMSD atteignant un plateau après 100 ps, et le rgyr après 40 ps. La faible évolution

de ces paramètres au cours du temps montre que le modèle tridimensionnel de

CYP73A32 est thermodynamiquement stable et peut être utilisé pour la simulation

d’ancrage du psoralène dans le site actif.

La simulation d’ancrage du psoralène dans le site actif CYP73A32 a été réalisée

à l’aide de l’application Monte Carlo du logiciel MOE. 25 modèles d’ancrage ont été

générés et classés en fonction de la somme de l’énergie de Van der Waals, de l’énergie

électrostatique de l’interaction et de l’énergie propre du ligand. Le modèle le mieux

classé a été sélectionné, puis le complexe protéine-ligand a subi une étape de

minimisation d’énergie à l’aide du champ de force CHARMm22.

Dans la configuration la plus probable, le psoralène définit un angle de 58 ° avec

le plan de l’hème (Fig. III-7). Le carbone C2’ du cycle furane est le plus proche de

l’oxygène de l’intermédiaire ferroxo (4,68 Å). Cette configuration est très proche de

celle du 8-MOP cristallisé dans le site actif de CYP2A6 et est en accord avec la réaction

d’époxydation du carbone C2’ qui est supposée être à l’origine de l’inactivation


110

4,68 Å

Figure III-7 : Orientation du psoralène dans le site actif du modèle de CYP73A32 Le psoralène est représenté en rose et les résidus à moins de 5 Å sont indiqués en gris. La distance entre le carbone C2’ du psoralène et l’oxygène de l’intermédiaire ferroxo est indiquée en rouge. Une partie de l’hélice I est représentée en rouge.

4,68 Å


111

de l’enzyme (Koenigs et Trager, 1998 ; Yano et al., 2005). 13 acides aminés du site

actif, sont situés à moins de 5 Å du psoralène et sont susceptibles de participer au bon

positionnement de ce dernier. Tous sont localisés dans les régions SRS : V118 (SRS1) ;

R213, A217 et Y222 (SRS2) ; V305, A306, E309 et T310 (SRS4) ; I371 et L374

(SRS5) ; S489, L490 et F491 (SRS6). Excepté F491 qui est remplacé par une histidine

chez CYP73A1, les acides aminés composant le site actif de CYP73A32 sont conservés

chez CYP73A1. Le rôle de F491 dans la résistance au psoralène est néanmoins écarté

car le mutant F491H n’a pas présenté une sensibilité plus marquée à l’inactivation.


112

3 Discussion

3.1 Origine évolutive de la résistance de CYP73A32, A10 et A41 à l’inactivation par le psoralène

Le psoralène et le 8-MOP sont connus en tant qu’inactivateurs autocatalytiques

de P450 d’insectes, de mammifères, en particulier de CYP2A6 et CYP3A4, et plus

récemment des C4H de topinambour, de rue, de persil et d’Ammi majus (Zumwalt et

Neal, 1993 ; Koenigs et al., 1997 ; Ho et al., 2001 ; Gravot et al., 2004 ; Hubner et al.,

2003). Nos résultats montrent que le psoralène se comporte aussi comme un inactivateur

autocatalytique de la C4H d’Arabidopsis. Les constantes de cette inactivation

(KI = 3 µM ; kinact = 0,113 min-1) sont proches de celle de CYP73A1 et montrent que la

forte sensibilité de la C4H de topinambour à l’inactivation par le psoralène est

généralisable à d’autres C4H de plantes ne produisant pas de furocoumarines. Ce

résultat conforte l’hypothèse selon laquelle les C4H de plantes productrices de

furocoumarines ont évolué pour pouvoir fonctionner dans un environnement riche en

ces molécules. Cependant, l’étude des mutants de CYP73A32 pour lesquels les résidus

communs aux C4H de plantes productrices de furocoumarines ont été remplacés par

ceux de CYP73A1, laisse penser que le caractère « résistant » aux furocoumarines des

C4H de rue, de persil et d’Ammi majus ont été acquis par des processus évolutifs

différents. En effet, aucun des mutants simples testés, n’a présenté une augmentation

même partielle de la sensibilité à l’inactivation par le psoralène. La combinaison de

toutes les mutations dans la séquence de CYP73A32, bien qu’affectant la stabilité

et / ou le folding de la protéine ainsi que ces propriétés catalytiques, n’a pas non plus

augmenté la sensibilité au psoralène. Les familles des Rutacée et des Apiacées

auxquelles appartiennent respectivement Ruta graveolens d’un coté et le persil et Ammi

majus de l’autre, sont des familles phylogénétiquement éloignées et leur capacité à

produire des furocoumarines est supposée résulter d’un phénomène de convergence

évolutive. La production des furocoumarines dans ces deux familles présente plusieurs

divergences comme (i) l’élicitabilité de la voie chez les Apiacés alors que celle-ci est

constitutive chez Ruta graveolens, (ii) une divergence dans la voie de synthèse menant


113

aux dérivés méthoxylés du psoralène, avec une prépondérance pour l’hydroxylation de

la (+)-marmésine chez Ruta graveolens, alors que celle-ci se fait majoritairement sur le

psoralène chez les Apiacées (Innocenti et al., 1981 ; Hamerski et Matern, 1988 a et b). Il

est donc tout à fait possible que l’adaptation des C4H à l’inactivation par les

furocoumarines chez ces plantes soient acquise par des mutations différentes. Le cas du

résidu s’alignant avec F491 dans la séquence de CYP73A32 est en ce point tout à fait

intéressant. Le modèle 3D de CYP73A32 indique que ce résidu est présent dans le site

actif de l’enzyme et pourrait participer au positionnement du psoralène. La modification

de la phénylalanine par une histidine présente dans la séquence de CYP73A1 n’a pas

d’impact sur la sensibilité au psoralène, ce qui peut s’expliquer par le fait que ce sont

deux résidus aromatiques de même gabarit. En revanche dans la séquence de

CYP73A10 et CYP73A41, F491 est remplacé par une glutamine. Cette substitution non

conservative dans le site actif, pourrait avoir un impact sur le positionnement du

psoralène et pourrait être une des raisons de la résistance de ces deux C4H. Cette

hypothèse nécessitera une confirmation par mutagenèse dirigée.

3.2 Expression hétérologue dans les levures WAT 11

Les résultats présentés dans ce chapitre ainsi que les travaux précédents sur

CYP73A32 montrent que le niveau d’expression de cette enzyme dans les levures

WAT 11 est relativement faible en comparaison de celui de CYP73A1 (diminution d’un

facteur 3 à 4) (Gravot, 2002). Nous avons pu constater lors de l’étude des C4H chimères

que la substitution de l’ancre membranaire de CYP73A32 par celle de CYP73A1 suffit,

à elle seule, à retrouver un niveau d’expression comparable à celui de CYP73A1. Cette

amélioration de l’expression pourrait être liée à la présence dans la séquence de

CYP73A1 de codons utilisés plus fréquemment chez Saccharomyces cerevisiae. La

comparaison des séquences nucléotidiques codant la région protéique 1-31 de

CYP73A1 et CYP73A32 montre en effet la présence dans la séquence de CYP73A32

d’un plus grand nombre de codons rares chez Saccharomyces cerevisiae (Gravot, 2002).

Ce problème d’incompatibilité de codons a déjà été proposé pour expliquer la faible

expression de CYP73A17 dans les levures WAT 11. Dans ce cas, le remplacement de

l’ancre par celle de CYP73A1, ainsi que le recodage de la partie N-terminale de

CYP73A17 ont permis d’améliorer significativement le niveau d’expression


114

K57

G39

F40

F38C1

F-G

a B’

C2

a I

Figure III-8 : Représentation des canaux potentiels d’accès au substrat sur le modèle tridimensionnel de CYP73A32 Le canal C1 « hydrophobe » est délimité par la région 30-58 et la boucle F-G (en rouge). Le canal C2 « hydrophile » est composé de l’hélice B’ et de la partie N-terminale de l’hélice I (en vert). Les résidus potentiellement responsables de la faible affinité de CYP73A32 pour le psoralène sont représentés en noir. L’hème est en orange alors que le psoralène ancré dans le site actif est en rose.


115

de l’enzyme (Batard et al., 1998). Dans notre cas, cette hypothèse devra être confirmée

par northern blot ou RT-PCR quantitative pour mesurer le niveau de transcription des

différentes constructions dans WAT 11. Il est également possible que l’amélioration du

niveau d’expression résulte d’une plus grande stabilité de l’enzyme causée par le

changement de l’ancre membranaire. La portion de 31 acides aminés remplacée dans la

chimère contient 9 résidus différents entre CYP73A32 et CYP73A1. Le rôle et

l’importance des acides aminés composant l’ancre membranaire ont été relativement

peu étudiés en comparaison des résidus impliqués dans les propriétés catalytiques des

P450. On peut néanmoins penser que la modification des résidus composant l’ancre

peut perturber l’interaction du P450 avec la membrane ou avec la réductase et jouer sur

sa stabilité. Les travaux de Cabello-Hurtado sur CYP81B1 ont déjà montré que le

niveau d’expression de cette enzyme dans les levures dépend d’une part de la longueur

de l’ancre membranaire et de la réductase co-exprimée. L’interprétation la plus

plausible proposée par les auteurs est que ces deux facteurs jouent sur la stabilité de

l’enzyme (Cabello-Hurtado et al., 1998).

3.3 Impact de la modification de l’extrémité N-terminale sur l’affinité de CYP73A32 pour le psoralène

La chimère A1 [1-58] possède une affinité pour le psoralène plus importante que

CYP73A32 et comparable à celle de CYP73A1, bien que la vitesse d’inactivation ne

soit pas modifiée. En revanche, la chimère A1 [1-31] montre que le seul remplacement

de l’ancre membranaire de CYP73A32 ne modifie pas l’affinité de l’enzyme pour le

psoralène. Cette différence de KI entre les deux chimères suggère que la zone protéique

31-58 est importante et suffisante pour déterminer l’affinité de CYP73A32 pour le

psoralène. La région 31-58 s’étend de la fin du coude proline jusqu’au début de

l’hélice A. D’après le modèle 3D de CYP73A32, une partie de cette région est proche

de la boucle F/G dont le rôle dans l’interaction avec la membrane a été démontré

(Williams et al., 2000 b.), et pourrait constituer avec cette boucle, un canal d’accès au

substrats hydrophobes diffusant directement à partir de la membrane vers le site actif de

l’enzyme (Fig. III-8). Dans cette région protéique 31-58, six résidus sont différents entre

CYP73A32 et CYP73A1 et correspondent aux résidus F38, G39, F40, V42, Q55, K57

dans la séquence de CYP73A32. L’étude des mutants de CYP73A32 a permis de


116

montrer que la mutation de Q55 ne suffit pas à elle seule à augmenter l’affinité de

l’enzyme pour le psoralène. Les autres résidus n’ont pas été testés par mutagenèse

dirigée et nous ne pouvons qu’établir des hypothèses quant à leur importance dans la

détermination de l’affinité de la C4H pour le psoralène. Néanmoins, l’étude du modèle

3D de CYP73A32 laisse penser que K57 est un candidat intéressant. Ce résidu est

orienté en direction de la boucle F-G et se trouve à l’intérieur du canal d’accès de

l’enzyme. Ce résidu lysine est remplacé, chez CYP73A1, par une asparagine qui

présente un encombrement stérique moins important et qui pourrait faciliter l’accès du

psoralène au site actif. Par ailleurs, ces résidus en position 57 s’alignent avec une région

du CYP51 de Mycobacterium tuberculosis dans laquelle plusieurs mutations modifient

la sensibilité de cette enzyme à l’inhibition par l’azole (Podust et al., 2001). Il pourrait

également être intéressant d’étudier l’impact d’une mutation des trois résidus successifs

F38, G39, F40 (Fig. III-8). Ce motif présent chez CYP73A32 est atypique pour les C4H

de type I et caractéristique des C4H de type II. Il est remplacé par le motif IPV chez

CYP73A1 qui est plus classique pour les C4H de type I. Une modification dans cette

zone, correspondant à la fin du coude proline, est susceptible de modifier l’ancrage ou

l’orientation de l’enzyme par rapport à la membrane et pourrait modifier la

conformation du canal d’accès.

L’étude des deux chimères A1 [1-31] et A1 [1-58] oriente donc notre recherche

vers un résidu potentiellement impliqué dans un canal d’accès entre la région N-

terminale et la boucle F-G. Il est intéressant de constater que pour aucune des deux

chimères, ni même pour CYP73A32 et CYP73A1, l’affinité pour le cinnamate n’est

modifiée. Deux hypothèses se présentent :

- La cinnamate est une molécule plus petite que le psoralène et la

modification du canal d’accès par un résidu stériquement plus imposant

n’affecte pas son entrée dans le site actif.

- Le cinnamate est une molécule plus hydrophile que le psoralène. Il est

possible que cette molécule ait accès au site actif par un autre canal moins

exposé à la membrane. L’étude de la structure de CYP51 de Mycobacterium

tuberculosis a mis en évidence la présence d’un canal entre la boucle B-C et

l’hélice I (Podust et al., 2001). La présence des deux types de canaux (boucle


117

B-C / hélice I et boucle F-G) a été mise en évidence chez les P450

eucaryotes et il est supposé que pour un même P450, le canal d’accès peut

être différent suivant les substrats (Scott et al., 2002 ; Ibeanu et al., 1996 ;

Williams et al., 2000 b.). Bien qu’aucune structure 3D de P450 végétaux

n’ait encore été résolue, il est très probable que ces deux canaux existent

également chez ces enzymes.

3.4 Recherche des résidus contrôlant la vitesse d’inactivation par le psoralène

L’étude des C4H chimères montre que la sensibilité au psoralène augmente en

fonction de la taille de la région de CYP73A32 qui est substituée. Nous avons constaté

que le remplacement de la partie protéique 1-58 de CYP73A32 par celle de CYP73A1

augmente l’affinité de l’enzyme pour le psoralène, mais sans pour autant modifier la

vitesse d’inactivation. Celle-ci reste également très proche de celle de CYP73A32 dans

le cas des chimères A1 [1-134] et A1 [1-229]. En revanche, elle est significativement

augmentée dans les chimères A1 [1-259] et A1 [1-288]. La chimère A1 [1-379]

présente, elle, une vitesse d’inactivation comparable à celle de CYP73A1. Ces résultats

suggèrent qu’un ou vraisemblablement plusieurs résidus contrôlant la sensibilité au

psoralène sont localisés dans la région 229-379. Cette région comprend 30 acides

aminés différents entre les deux C4H. Six de ces résidus, en position 237, 242, 247, 248,

250 et 251, sont localisés dans l’hélice G dont l’extrémité C-terminale correspond au

SRS3. Le modèle de CYP73A32 indique que ces résidus sont assez éloignés du substrat

mais pourraient interagir avec des résidus constituant le site actif. Le résidu 242 a retenu

notre attention dans la mesure où il correspond chez CYP73A32 à une valine remplacée

dans la séquence de CYP73A1 par une cystéine, acide aminé nucléophile pouvant

constituer un site potentiel de fixation du psoralène activé. Le mutant de CYP73A32

V242C, n’a cependant pas présenté une plus grande sensibilité au psoralène (résultat

non présenté). L’étude de l’impact des 5 autres résidus de ce SRS sur la sensibilité au

psoralène, pourrait constituer une piste de recherche intéressante. Les propriétés

catalytiques des P450 ne sont cependant pas contrôlées uniquement par des acides

aminés localisés dans les SRS. Plusieurs travaux font état de l’importance de résidus de

l’hélice E, de la boucle F-G ainsi que de la région des hélice K’ et K’’ pour la

118

Figure III-9 : Bilan des travaux entrepris pour l’identification des résidus déterminant l’inactivation différentielle de CYP73A32 et CYP73A1 par le psoralène A- Positionnement sur la séquence de CYP73A32 des différents résidus testés par mutagenèse dirigée. B-

Représentation schématique des chimères de CYP73A1(trait bleu) et CYP73A32 (trait vert) testées. Le tableau résume les constantes d’inactivation par le psoralène des mutants ponctuels et des chimères de C4H. C- Représentation sur la séquence de CYP73A32 des zones identifiées comme importantes pour la résistance de CYP73A32 à l’inactivation par le psoralène (en bleu). Les résidus indiqués par un trait rose ont été identifiés d’après le modèle de CYP73A32. Sur les deux séquences de CYP73A32 les hélices et les régions SRS (en rose) ont été replacées.

Q55H S123G L181M V198EQ414E/V415E I438L F491H

F38G39

F40

K57 G237 E247

L250

K251

31

58

134

229

259

379

288

A-Mutants ponctuels de CYP73A32

B-Chimères

CYP73A32/CYP73A1

Mutant/chimère KI (µM) kinact (min-1)

A32 8 ± 1,4 0,066 ± 0,03

Q55H 6 ± 2 0,06 ± 0,01

S123G 5,7 ± 1,3 0,069 ± 0,001

L181M 7,8 ± 1 0,05 ± 0,02

V198E 6,4 ± 2,3 0,067 ± 0,04

Q414E 6,9 0,089

Q414E/V415E 7 ± 10,067 ± 0,007

I438L 8 ± 5 0,08 ± 0,02

F491H 9 ± 1,7 0,08 ± 0,02

A1[1-31] 7,1 0,04

A1[1-58] 3,5 ± 0,3 0,065 ± 0,01

A1 [1-134] 3,8 ± 0,7 0,073 ± 0,01

A1 [1-229] 2,9 ± 0,3 0,088 ± 0,02

A1 [1-259] 3,4 ± 1 0,11 ± 0,01

A1 [1-288] 4,3 ± 1 0,11 ± 0,01

A1 [1-379] 3,5 ± 0,2 0,16 ± 0,02

A1 4,6 ± 2 0,18 ± 0,02

C-Modèle CYP73A32

a A a

B’ a

C a D a

E a

F a G a

H a I a

J a

La K a K’a

K’’

a A a

B’ a

C a D a

E a

F a G a

H a I a

J a

La K a K’a

K’’

L174

régiospécificité de l’hydroxylation du substrat ou pour la résistance à un inhibiteur chez

CYP2C19, CYP2B4, CYP2B1 et CYP2C11 (Ibeanu et al., 1996 ; He et al., 1998 ;

Biagini et al., 1999 ; Von Weymarn et al., 2004). Plusieurs résidus de l’hélice E

diffèrent entre CYP73A1 et CYP73A32, et en particulier la leucine 174 de CYP73A32

qui est remplacée par une isoleucine chez CYP73A1. D’après le modèle L174 est située

assez près de la leucine 312 proche du site actif dans l’hélice I. La modification de L174

pourrait avoir un impact sur la configuration du site actif et modifier le positionnement

du psoralène.

Bien qu’à l’issue de ce travail, aucun résidu précis n’ait été identifié, la

combinaison des trois approches (mutagenèse dirigée, chiméragenèse et modélisation

3D) nous a permis (i) de localiser deux régions importantes pour le contrôle de

l’inactivation par le psoralène et (ii) de proposer plusieurs résidus candidats dans ces

régions (Fig. III-9). Un point troublant résulte néanmoins dans la différence de

sensibilité au psoralène observée entre les chimères A1 [1-288] et A1 [1-379] qui

semble indiquer que la région 288-379 contient des résidus importants. Or, tous les

résidus différents entre CYP73A32 et CYP73A1 et présents dans cette portion protéique

sont localisés très loin du site actif et des canaux d’accès potentiels d’après le modèle de

CYP73A32. Des travaux complémentaires de mutagenèse dirigée ou de chiméragenèse

en échangeant des domaines plus ciblés des deux C4H devraient permettre de fournir

des résultats plus précis quant à la nature des résidus contrôlant la sensibilité de ces

deux enzymes au psoralène.

La simulation d’ancrage du psoralène dans le site actif de la structure modélisée

de CYP73A32 place l’inactivateur dans une position en accord avec la réaction

d’époxydation du noyau furane décrite par Koenigs pour expliquer l’inactivation de

CYP2A6 par le 8-MOP (Koenigs et Trager, 1998). Très récemment la structure

tridimensionnelle de CYP2A6 complexé avec le 8-MOP a été résolue (Yano et al.,

2005). Notre modèle d’orientation du psoralène dans le site actif de CYP73A32 est très

similaire au positionnement du 8-MOP dans le site actif de CYP2A6 avec le carbone

C 2’ positionné le plus près de l’hème. Nous avons déjà pu montrer que le psoralène

inactive les C4H de rue et de topinambour par fixation covalente sur l’apoprotéine

(Gravot et al., 2004). Un bon nombre de travaux réalisés sur l’inactivation


120

autocatalytique de P450 par des molécules contenant une fonction acétylène ou un

noyau furane ont montré que les intermédiaires réactifs se fixent sur un acide aminé

nucléophile du site actif, souvent présent dans l’hélice I (pour revue, Kent et al., 2001).

Il s’agit bien souvent d’une sérine ou de la thréonine conservée et impliquée dans

l’activation de l’oxygène. L’étude de l’inactivation de CYP3A4 par le L-754 394, un

composé synthétique possédant un noyau furane, a montré que la fixation était

vraisemblablement réalisée sur le glutamate 307 dans l’hélice I (Lightning et al., 2000).

L’orientation du psoralène dans le site actif du modèle de CYP73A32 est compatible avec

une fixation de l’intermédiaire réactif sur l’hélice I. La région N-terminale de l’hélice qui

constitue une partie du site actif, est conservée entre CYP73A32 et CYP73A1, ce qui laisse

imaginer que le résidu sur lequel se fixe le psoralène pourrait être le même. L’identification

de l’acide aminé sur lequel se fixe le psoralène chez CYP73A1 et CYP73A32 devra être

déterminé pour confirmer cette hypothèse.

4 Conclusion

Les C4H de rue, de persil et d’Ammi majus, trois plantes productrices de

furocoumarines sont inactivées moins efficacement par le psoralène que ne l’est la C4H de

topinambour qui ne produit pas ce type de molécules. Nos travaux ont montré que la C4H

d’Arabidopsis est également inactivée par le psoralène avec une efficacité équivalente à

celle de topinambour, ce qui conforte l’hypothèse selon laquelle les C4H de plantes

productrices de furocoumarines ont évolué pour devenir plus résistantes à ces molécules.

Les travaux de mutagenèse dirigée sur CYP73A32 destinés à étudier le rôle des résidus

conservés dans les séquences des C4H de rue, de persil et d’Ammi majus n’ont pas permis

d’isoler un ou plusieurs acides aminés important pour la résistance au psoralène. Ceci

suggère que l’acquisition du caractère « résistant » des trois C4H de plantes productrices de

furocoumarines est probablement le fruit de processus évolutifs différents. La création de

C4H chimères combinant des domaines de la C4H de rue et de topinambour a permis

d’identifier deux zones importantes pour la sensibilité de ces enzymes vis à vis de

l’inactivation par le psoralène. La première, localisée entre les résidus protéiques 31 et 58

est importante pour déterminer l’affinité de l’enzyme pour le psoralène. Cette zone pourrait

définir une partie d’un canal d’accès. Une deuxième zone comprise entre les résidus 229 et

120


121

379 devrait également participer à la détermination de la sensibilité au psoralène. Un

modèle de la structure tridimensionnelle de CYP73A32 a été créé et a permis de pointer

plusieurs acides aminés dans ces deux zones dont l’implication dans la sensibilité au

psoralène devra être vérifiée par mutagenèse dirigée.

121

122

Chapitre IV

Recherche de P450 de la

voie de biosynthèse des

furocoumarines :

identification et

caractérisation fonctionnelle

de la psoralène synthase

d’Ammi majus

123

Chapitre IV : Recherche de P450 de la voie de biosynthèse des furocoumarines :

identification et caractérisation fonctionnelle de la psoralène synthase

d’Ammi majus

1 Introduction

La voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires a été révélée dans les années

70, grâce à des travaux de marquage isotopique réalisés sur plusieurs plantes dont

l’angélique, la rue, le figuier et Ammi majus (Brown et al., 1970; Innocenti et al., 1978 ;

Dall’Acqua et al., 1972). La voie menant de l’umbelliférone au psoralène est bien

conservée chez les plantes étudiées; elle fait intervenir comme intermédiaires la

déméthylsubérosine et la (+)-marmésine. La synthèse des dérivés hydroxylés du psoralène

pourrait quant à elle provenir soit de l’hydroxylation directe du psoralène, soit de

l’hydroxylation de la (+)-marmésine suivie par la conversion en hydroxypsoralène.

L’importance de chacune de ces deux voies varie selon les espèces. L’hydroxylation du

psoralène apparaît la voie principale chez Ammi majus, Apium graveolens et Petroselinum

crispum, alors que chez Ruta graveolens et Ficus carica l’hydroxylation de la (+)-

marmésine a été clairement montrée (Dall’Acqua et al., 1975; Dall’acqua et al. 1972,

Innocenti et al., 1981). Un degré supplémentaire dans la compréhension de la synthèse des

furocoumarines linéaires a été apporté par l’étude des activités et l’isolement des enzymes

de la voie dans les années 80 et 90. La majeure partie de ces travaux a été réalisée sur des

cultures cellulaires d’Apiacées en particulier de persil et d’Ammi majus. En effet, ces

cultures cellulaires voient leur production de furocoumarine et la synthèse des enzymes

associées fortement augmenter en réponse à l’élicitation par des extraits du champignon

Phytophtora megasperma (Tietjen et al., 1983; Hauffe et al., 1986; Hamerski et Matern,

1988 a et b). L’ensemble des étapes enzymatiques conduisant de l’umbelliférone au

bergaptène a pu être isolé. Quatre étapes sont catalysées par des P450 et permettent la

conversion séquentielle de la démétylsubérosine en (+)-marmésine, puis en psoralène et

enfin en bergaptol ou en xanthotoxol (Fig IV-1). Chez Ammi majus, à l’exception de la

81

98

38

5

Chapitre IV : Identification et caractérisation de la psoralène synthase d’Ammi majus

124

formation du xanthotoxol qui n’a pas été décrite, les trois autres étapes P450 dépendantes

ont été mesurées dans des fractions microsomales (Hamerski et Matern, 1988 a et b).

La suite logique dans l’étude de la biosynthèse des furocoumarines est de s’intéresser

aux gènes de cette voie et au contrôle de leur expression. A l’heure actuelle cependant, seuls

les gènes responsables des étapes terminales de méthylation du xanthotoxol et du bergaptol

ont été clonés chez Ammi majus et Petroselinum crispum (Hehmann et al., 2004, Ibrahim et

al., 1998). Les étapes catalysées par les P450 présentent un intérêt particulier dans la

compréhension de la régulation de cette voie de biosynthèse car (i) les vitesses de réaction

souvent faibles de cette famille d’enzymes en font généralement des étapes limitantes, (ii)

l’orientation vers la synthèse de bergaptène ou de xanthotoxine est contrôlée au niveau du

psoralène par le rapport de deux activités P450, les psoralène-5 et 8-monoxygénases (P5M et

P8M) et (iii) les furocoumarines étant connues comme des inhibiteurs de P450, ces étapes

pourraient correspondre à des points de rétro-contrôle de la voie.

Le clonage de P450 végétaux de fonction connue représente un travail difficile. La

méthode classique consistant à purifier la protéine, puis séquencer la partie N-terminale

pour cloner l’ADNc correspondant est rendue complexe par le caractère membranaire, la

faible quantité et l’extrême instabilité de ces enzymes. Le développement de méthodes de

génomique inverse a permis de contourner en partie ce problème. Le séquençage

systématique des génomes du riz et d'Arabidopsis notamment, le clonage par PCR et la

Figure IV-1 : Voie générale de biosynthèse des furocoumarines linéaires Les étapes P450 dépendantes sont marquées par des points bleus

O OO

OMe

O OO

OH

O OO

O OO

OH

O OHO O OHO O OO

HO

O OO

OMe

UPT PSMSP5M

P8M

XMT

BMT

(1) (2) (3) (4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(1): umbelliférone(2): déméthylsubérosine(3): (+)-marmésine(4): psoralène

(5): xanthotoxol(6): xanthotoxine (8MOP)(7): bergaptol(7): bergaptène (5MOP)

UPT: umbelliferone prenyl transferaseMS : (+)-marmésine synthase

PS : psoralène synthase

P5M : psoralène-5-monooxygenase

P8M : psoralène-8-monooxygenaseBMT : bergaptol-O-methyltransferaseXMT : xanthotoxol-O-methyltransferase

O OO

OMe

O OO

OH

O OO

O OO

OH

O OHO O OHO O OO

HO

O OO

OMe

UPT PSMSP5M

P8M

XMT

BMT

O OO

OMe

O OO

OH

O OO

O OO

OH

O OHO O OHO O OO

HO

O OO

OMe

UPT PSMSP5M

P8M

XMT

BMT

(1) (2) (3) (4)

(5)

(6)

(7)

(8)





UPT: umbelliferone prenyl transferaseMS : (+)-marmésine synthase

PS : psoralène synthase

P5M : psoralène-5-monooxygenase

P8M : psoralène-8-monooxygenaseBMT : bergaptol-O-methyltransferaseXMT : xanthotoxol-O-methyltransferase

(8)


125

construction de banque d’EST ont fourni un nombre important de séquences de P450,

cependant la grande majorité de ces P450 n’ont pas de fonction associée (En mars 2005, la

fonction de seulement 20 % des P450 a été identifiée chez la plante modèle Arabidopsis

(http://members.shaw.ca). La caractérisation fonctionnelle d’un P450 isolé par génomique

inverse nécessite de le faire exprimer dans un système hétérologue, puis de déterminer son

substrat préférentiel par criblage métabolique en présence d’une P450 réductase. Trois

systèmes d’expression sont couramment utilisés pour l’expression de P450 végétaux : les

cellules d’insectes, les levures S. cerevisiae et les bactéries E. coli. Ce dernier système

demande bien souvent, pour améliorer l’expression, une modification de l’ancre

transmembranaire, de plus, les activités sont mesurées dans des systèmes membranaires

reconstitués avec une P450 réductase purifiée (Haudenschild et al., 2000). Certains travaux

relatent l’expression chez E. coli de P450 fusionnés avec la réductase (Hotze et al., 1995).

Les cellules d’insecte et les levures présentent eux l’avantage d’être des systèmes

d’expression eucaryotes plus propices à d’éventuelles modifications post-traductionnelles.

Les souches de levure S. cerevisiae W(R), WAT 11 et WAT 21 ont été mises au point par

Pompon et al. (1996) spécialement pour l’expression de P450. En fonction de la souche

utilisée, le P450 est co-exprimé avec la réductase endogène de levure (W(R)) ou avec

l’isoforme 1 ou 2 de la réductase d’Arabidopsis (WAT 11 et WAT 21). Ces levures

modifiées constituent le système d’expression de P450 végétaux le plus utilisé à l’heure

actuelle. Elles permettent d’obtenir, dans la fraction microsomale, des quantités d’enzymes

souvent suffisantes pour leur caractérisation.

Un projet de clonage et d’identification de P450 spécifiques de la voie des

furocoumarines a été entrepris par notre laboratoire en collaboration avec le laboratoire du

Pr. Matern de l’université de Marburg et celui du Dr. Werck-Reichhart de l’IBMP de

Strasbourg. La première partie de ce projet, réalisée à l’université de Marburg, était destinée

à isoler des séquences codantes de P450 exprimés spécifiquement dans les cultures

cellulaires d’Ammi majus stimulées pour la production de furocoumarines, en utilisant la

technique de differential display. Les travaux de caractérisation fonctionnelle de plusieurs

P450 isolés ont été menés dans notre laboratoire. Les résultats présentés dans cette partie

décrivent tout d’abord la mise au point des conditions d’expression des P450 dans les

levures WAT 11, puis l’identification et la caractérisation enzymatique d’un nouveau P450

catalysant l’activité psoralène synthase.

http://members.shaw.ca


126

2 Résultats

2.1 Résumé de l’isolement des séquences réalisé par l’équipe du Pr. Matern

L’équipe du Pr. Matern possède une grande expérience dans la culture et

l’élicitation des cellules d’Ammi majus (Hamerski et Matern, 1988 a et b; Hamerski et

al., 1990 a et b). L’ensemble des travaux d’isolement des séquences de P450 a été

réalisé au sein de cette équipe par les deux doctorantes Sylvia Specker et Sandra

Kellner.

Les premiers travaux d’élicitation des cultures cellulaires d’Ammi majus par les

extraits de Phytophtora megasperma (Pmg) ont montré que les coumarines et les

furocoumarines s’accumulent dans le milieu dans un délai de 3 à 5 H pour atteindre un

maximum à 35 H (Hamerski et al., 1990 a). En parallèle, l’activité de la

dimethylallyldiphosphate:umbelliférone-6-C-diméthylallyltransférase atteint un pic

après 12 H d’élicitation (Hamerski et al., 1990 b). Pour l’isolement de séquences de

P450 par differential display, l’élicitation a été réalisée sur 40 ml de culture avec 5 mg

de Pmg pendant 8 H, temps auquel l’accumulation maximale de transcrits est attendue.

A l’issue des 8 H d’élicitation, les ARN totaux sont isolés puis utilisés comme matrice

pour la DD-RT-PCR en amplifiant sélectivement les séquences de P450 à l’aide des

amorces dégénérées spécifiques des régions PERF et PFG définies par Akashi et al.

(1997) et Schöpfer et Ebel (1998). Par cette méthode, 5 fragments d’ADNc de P450

spécifiquement exprimés dans les cellules élicitées ont été isolés. Les séquences entières

de ces 5 P450 ont été obtenues par des techniques de RACE PCR. Deux de ces P450

appartiennent aux familles des CYP73 et CYP98 (CYP73A41 et CYP98A21)

impliquées dans le métabolisme des phénylpropanoïdes et codent respectivement une

C4H et une C3’H (Hübner et al., 2003 ; Werck-Reichhart, communication personnelle).

La caractérisation fonctionnelle des trois P450 restants a été réalisée au cours de ma

thèse. Ce travail implique d’une part, l’expression des protéines codées par ces ADNc et

d’autre part, la recherche de leur activité.


127

2.2 Expression hétérologue des P450 d’Ammi majus et identification de la psoralène synthase

2.2.1 Séquences et classification des 3 P450 étudiés

Les trois séquences ont été classées et nommées d’après la nomenclature

internationale des P450 basée sur l’homologie de séquence protéique. Les trois P450

désignés CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 appartiennent à trois familles différentes.

CYP76B8 présente 61 % d’identité avec CYP76B7 de Pastinaca sativa, 57 % avec

CYP76B6 décrite comme une géraniol-hydroxylase (Collu et al., 2001) et 53 % avec

CYP76B1 qui métabolise efficacement des herbicides de la famille des phenylurés

(Robineau et al., 1998 ; Batard et al., 1998) (Tab. IV-1).

CYP71AJ1 et CYP82H1, qui possèdent moins de 60 % d’identité avec les

membres les plus proches, définissent chacun une nouvelle sous-famille chez les CYP71

et les CYP82. La famille des CYP71 est la plus grande famille de P450 décrite chez les

végétaux avec déjà plus de 300 membres identifiés à ce jour toutes plantes confondues.

Paradoxalement, peu de CYP71 ont une fonction connue. Ils interviennent dans les

voies de biosynthèse diverses (terpènes, alcaloïdes, flavonoïdes, DIMBOA…).

CYP71AJ1 possède 48 % d’identité avec CYP71A6 dont la fonction est inconnue et

46 % avec la menthofurane synthase (CYP71A n° acc.: AW255974) qui catalyse la

formation d’un noyau furane sur la pulégone via un mécanisme similaire à celui

Tableau IV-1 : Comparaison des séquences protéiques déduites des trois ADNc isolés d’Ammi majus avec les P450 les plus proches Les pourcentages d’identité et de similarité ont été déterminés à l’aide du programme blastx accessible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Clones de P450Séquence la plus proche / numéro

d'accession% d'identité % de similarité

CYP71AJ1 CYP71A6/ O04164 48 66

CYP76B8 CYP76B7/ AAQ05825 61 79

CYP82H1 CYP82C4/ NP_194922 51 69

http://www.ncbi.nlm.nih.gov


128

Figure IV-2 : Alignement des séquences protéiques de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 Les motifs consensus conservés chez les P450 végétaux sont représentés en gras. La cystéine liant l’hème est indiquée en rouge. L’alignement a été réalisé avec le logiciel ClustalX.

CYP71AJ1 1 ------MKML EQNPQYLYFS LFLVTIFLYK WLT---LKKT PLKNLPPSPP QYPIIGNLHQ 51

CYP76B8 1 ---------- -----MDVII IVLSVMLAYV LVKHLLLSRD RGKNLPPGPF QLPIIGNLTN 45

CYP82H1 1 MITCEMGIYL QMQDIILFSL VFFSTLILWR IFSTYVIRKK TCSGPPEPAG RWPLIGHLHL 60

CYP71AJ1 52 IGPD--PQAS LRDLAQKYGP LMFLKFGTVP VLVVSSADAA REALKTHDLV FADRPYSSVA 109

CYP76B8 46 LGKL--PHRS LAKLSQNYGP IMHLQLGRVT TIVISSSAIA QQVFQKKGRA FSRRFIPDSL 103

CYP82H1 61 LGGSKILHHI LGDMADEYGP IFSLNLGINK TVVITSWEVA KECFTTQDRV FATRPKSVVG 120

CYP71AJ1 110 NKIFYNGKDM VFARYTEYWR QVKSICVTQL LSNKRVNSFH YVREEEVDLL VQNLENSHSK 169

CYP76B8 104 CACDHSLYSF VWLPIGPQWR NLRKISNSNL FSANKLDANQ HLRGRKVNEL IAYVQKCSQT 163

CYP82H1 121 QVVGYNSRVM IFQQYGAYWR EMRKLAIIEL LSNRRLDMLK HVRESEVNLF IKELYEQWSA 180

CYP71AJ1 170 VANLTELLIE VTG------- NVVCRVSVGS --------GD KVDSYKILIL EIMDMLGYSR 214

CYP76B8 164 GDAVDIGRAA FRTSFNLLSN TVFSKDMVDP -------YQD SAQEFKDLAW NIMVEAG-SP 215

CYP82H1 181 NGNGSKVVVE MMKRFGDLTT NIVVRTVAGK KYSGTGVHGN EESRQFQKAM AEFMHLGGLL 240

CYP71AJ1 215 SIEDFFPLLG WVDWLTGLRG KVAEAAKGVD TFLEGVLKEH LSTTGSKYN- ----DFVSIL 269

CYP76B8 216 NLVDYFPVLK KMD-PQGVKR RMTGYFQKVI KMLDGLINER LALKGSGTT- VDKTDMLDEL 273

CYP82H1 241 MVSDALPLLG WIDTVKGCKG KMKKTAEEID HILGSCLKEH QQKRTNISNN HSEDDFIYVM 300

CYP71AJ1 270 LEIQEADAGS SMDN-ECIKS LIWDMLGAGT ETISTALEWT LAALIKNPDA MFKLQNEVRE 328

CYP76B8 274 INISQVN--P NEMDKILMEH LFVDIFVAGT DTTSNTVEWG MAEILRSTET MMKVKAELRH 331

CYP82H1 301 LSAMDGNQFP GIDTDTAIKG TCLSLILGGY DTTSATLMWA LSLLLNNRHV LKKAQDEMDQ 360

CYP71AJ1 329 IGKGKSKISE ADLVKMNYLQ AVMKESMRLY FTAPLLVPGE ARQDIKFMGY DISSGTQVLI 388

CYP76B8 332 LVGKGVILEE GDIYRLPFLQ CIVRETLRLH PPFPLLLPRQ TEEETELNGY TIPKNSQVLV 391

CYP82H1 361 YVGRDRQVKE SDVKNLTYLQ AIVKETLRLY PAAPLSVQHK AMADCTVAGF NIPAGTRLVV 420

CYP71AJ1 389 NAWAIARDPL LWDKPEEFRP ERFLN--SPI DYKGFHYEFL PFGAGRRGCP GIQFAMCINE 446

CYP76B8 392 NAWAIGRDPV SWKNPSSFRP ERFLD--SEV DVKGQDFELI PFGAGIRICP GLPLVMRMVP 449

CYP82H1 421 NLWKMHRDPK VWSDPLEFQP ERFLQKHINV DIWGQNFELL PFGSGRRSCP GITFAMQVLH 480

CYP71AJ1 447 LVVANLVHKF NFELPDGKRL EDLDMTAASG ITLRKKSPLL VVARPQV--- --- 493

CYP76B8 450 VMLGSLINCF DWELEGGIPL NELDMEEKCG LSVAKLHPLR VLATSQVV-- --- 497

CYP82H1 481 LTLAQLLHGF ELGTVLDS-- -SIDMTESSG ITDPRATPLE VTLTPRLPPA VYQ 530

Ancre transmembranaire Coude proline

Méandre

Fixation de l’hème


129

décrit pour la synthèse de la (+)-marmésine à partir de la déméthylsubérosine. Dans le

cas de CYP82H1, aucun membre de cette famille n’est associé à une fonction.

CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 codent des protéines respectivement de 493,

497 et 530 résidus (Fig IV-2). Les trois protéines ont une structure typique de P450

eucaryote avec la succession, à l’extrémité N-terminale, de l’ancre membranaire, du

cluster d’acides aminés basiques et du coude proline. On retrouve dans la partie C-

terminale, la région de fixation de l’hème avec les deux séquences consensus PFG et

CPG très conservées ainsi que la triade ERR supposée impliquée dans le positionnement

de l’hème et la stabilité de la protéine (Hasemann et al., 1995).

2.2.2 Clonage des ADNc dans le vecteur pYeDP60

Les ADNc des trois P450 clonés à l’origine dans le vecteur pCR4-TOPO, sont

amplifiés par PCR avec les amorces décrites dans le tableau IV-2.

L’amplification est réalisée en 30 cycles (95 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 2 min) à

l’aide de la Pfu DNA polymerase. A l’issue de la PCR, une étape d’élongation de

10 min est réalisée avec une Taq DNA polymerase standard pour ajouter une adénine

aux extrémités 3’ des amplifiats. Ces derniers sont purifiés sur gel d’agarose 1 %

(Fig. IV-3), puis ligués dans le vecteur pGEM-T afin d’être séquencés. Les ADNc de

CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 clonés dans le pGEM-T et ne possédant pas d’erreur

dans leur séquence, sont digérés par les enzymes de restrictions KpnI / EcoRI pour

CYP71AJ1 et CYP76B8 et BamHI / KpnI pour CYP82H1. Après élimination des enzymes

de restriction sur colonne, les ADNc coupés sont ligués dans le vecteur pYeDP60

préalablement digéré par les enzymes correspondantes. Les produits de ligation

Tableau IV-2 : Amorces utilisées pour l’amplification des séquences codantes de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 La localisation et l’identité du site de restriction ajouté sont

précisées pour chaque amorce.

Amorces Séquences Site de restriction71AJ1 dir 5' CGGTACCATGAAGATGCTGGAACAGAAT 3' Kpn I71AJ1 rev 5’ CGAATTCAAAGCAACTGCAAGTGAAA 3' Eco RI76B8 dir 5' GGGTACCATGGATGTGATTATCATTG 3' Kpn I76B8 rev 5' GGAATTCCTAGACAACTTGTGAAGTTGCCAA 3' Eco RI82H1 dir 5' CGGATCCATGATTACGTGTGAAATGGG 3' Bam HI82H1 rev 5' CGGTACCTTATTGGTAGACTGCAGGAG 3' Kpn I

5’ GGAATTCTCAAACATGTGGTCTGGCAACCACCAAGAGAGG 3’

EcoRI (1623)

BamHI (682)

BamHI

(10754)

KpnI (1) EcoRI

(1494)

Digestion BamHI/EcoRI

9260 pb 812 pb

687 pb

CYP76B8

EcoRI (695)

BamHI (1)

Digestion BamHI/EcoRI

9249 pb 928 pb

695 pb

KpnI (1607)

CYP 82H1

BamHI ((776)

KpnI (1) EcoRI (1482)

Digestion BamHI

9971 pb 781 pb

CYP71AJ1

9971

781

9260

812

687

9247

695

Figure IV-4 : Vérification de l’insertion des séquences codantes de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 dans le vecteur pYeDP60 La partie supérieure de la figure représente la taille des fragments attendus après digestion de pYe71AJ1 par BamHI et de pYe76B8 et pYe82H1 par EcoRI et BamHI. La partie inférieure représente pour chaque construction le profil obtenu après digestion par ces mêmes enzymes.

BamHI

(10742)

928


131

sont ensuite précipités à l’éthanol, repris dans 4 µl d’eau et utilisés pour transformer un

aliquot de bactéries XL1Blue par électroporation. Après amplification dans les

bactéries, les trois plasmides pYe71AJ1, pYe76B8 et pYe82H1 sont extraits par lyse

alcaline puis soumis à une digestion de contrôle (Fig. IV-4).

2.2.3 Introduction des plasmides pYe71AJ1, pYe76B8 et pYe82H1 dans les levures WAT 11

Les trois constructions plasmidiques sont introduites dans la souche de levure

WAT 11. Les transformations sont réalisées suivant la méthode dite à « l’acétate de

lithium » décrite dans le chapitre matériel et méthode. Pour chaque construction

plasmidique, quatre colonies de levures transformées sont isolées, mises en culture puis

stockées à – 80 °C dans un milieu SGI additionné de 15 % de glycérol.

2.2.4 Mise au point des conditions d’expression dans WAT 11

L’expression hétérologue de P450 végétaux en système levure, et en particulier

celle des C4H de topinambour et de rue, est une technique bien maîtrisée au laboratoire

et son principe est décrit dans le chapitre matériel et méthodes. Les conditions optimales

d’expression des C4H de rue et de topinambour ont été établies pour une période de

24 H de croissance à 28 °C et une durée d’induction de 15 H à la même température.

Figure IV-3: Electrophorèse sur gel d’agarose des ADNc de CYP71AJ1 (A), CYP76B8 (B) et CYP82H1 (C) amplifiés par PCR Les amorces utilisées pour l’amplification sont décrites dans le tableau IV-2. Les PCR

génèrent des fragments respectivement de 1496 pb, 1508 pb et 1607 pb pour CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1.

B C A

1,6 kb 1 kb

1,6 kb

1 kb


132

Tableau IV-3 : Résumé des conditions d’expression des P450 d’Ammi majus Les quantités de P450 sont estimées d’après le spectre différentiel au CO à 450 nm N.D : Non détecté ; N.T : Non testé

Croissance Induction 82 H1 76 B8 71 AJ124H-28°C 15H-28°C N.D N.D N.D72H-20°C 36H-20°C 35 N.D N.D72H-20°C 24H-20°C 55 N.D N.D

WAT 21 72H-20°C 24H-20°C N.T N.D N.D

W(R) 72H-20°C 24H-20°C N.T N.D N.D

WAT 11

Conditions (temps-température) Quantité de P450 (pmol/mg prot)Souche

Figure IV-5 : Spectres différentiels au CO enregistrés avec les microsomes de levures transformées avec pYe71AJ1, pYe76B8, pYe82H1 et pYe73A1 Les microsomes ont été préparés à partir de levures mises à pousser pendant 72 H à 20 °C et induites pour l’expression de P450 à 20 °C pendant 36 H.


133

L’expression hétérologue des 3 P450 d’Ammi majus a donc été réalisée dans un premier

temps, en utilisant ces mêmes conditions. L’expression du CYP73A1 de topinambour

dans les levures WAT 11 a été réalisée en parallèle en guise de témoin positif. A l’issue

des 15 H d’induction, les levures sont sacrifiées et les microsomes sont préparés. Le

dosage des P450 surexprimés dans les microsomes est réalisé par l’établissement de

spectres CO comme décrit par Omura et Sato (1964 a et b). Bien que les levures

possèdent 3 P450 endogènes, ceux-ci ne s’expriment qu’en condition de stress et on

peut considérer que le pic obtenu à 450 nm correspond uniquement aux P450

surexprimés. Avec les conditions de culture et d’induction utilisées, aucun pic à 450 nm

n’est détecté pour les 3 P450 d’Ammi majus (Tab. IV-3). Dans le cas du témoin

CYP73A1, au contraire, le spectre CO donne un pic de grande amplitude à 450 nm

correspondant après calcul à une concentration d’enzyme de l’ordre de 150 pmol.mg-1

de protéines microsomales, en accord avec les valeurs obtenues en routine pour cette

enzyme.

L’absence d’une expression détectable des P450 d’Ammi majus peut résulter

d’une synthèse inefficace (problème au niveau transcriptionnel ou traductionnel) ou

bien d’une dégradation importante des enzymes synthétisées. Pour essayer de limiter un

éventuel problème de dégradation, un nouvel essai d’expression en levure a été réalisé

en diminuant les températures de croissance et d’induction à 20 °C. Cette diminution de

la température est accompagnée d’un allongement des temps de croissance et

d’induction respectivement à 72 H et 36 H. Dans ces conditions, un petit pic à 450 nm

est détecté pour les microsomes de levure exprimant CYP82H1 (Fig. IV-5). Ce pic

correspond à une concentration en P450 de 35 pmole.mg-1 de protéines totales, ce qui

est nettement moins que le témoin CYP73A1 (200 pmole.mg-1 de protéines totales).

Pour CYP71AJ1 et CYP76B8, ces nouvelles conditions de culture n’ont pas permis de

détecter de signal (Tab. IV-3). La réduction de la durée d’induction à 24 H toujours à

20 °C, permet d’améliorer encore un peu l’expression de CYP82H1 (55 pmole.mg-1 de

protéines totales), cependant rien n’est encore détecté pour les deux autres P450.

L’expression de CYP71AJ1 et CYP76B8 a été testée dans les levures WAT 21 et

W(R). Ces deux souches sous adaptées à l’expression hétérologue de P450 tout comme

WAT 11, à la différénce près que WAT 21 surexprime l’AthR2 d’Arabidopsis thaliana et


134

W(R) surexprime la P450 réductase endogène. Ces deux souches ont été transformées

avec les vecteur pYe71AJ1 et pYe76B8. Pour l’expression, les levures sont mises à

pousser 72 H à 20 °C, puis l’expression est induite pendant 24 H à 20 °C. Quelle que soit

la souche de levure et le P450, les spectres CO réalisés sur les microsomes ne revèlent

aucun pic à 450 nm.

2.2.5 Modification de l’extrémité N-terminale de CYP71AJ1

Les conditions de culture et d’induction dans WAT 11 décrites dans le

paragraphe précédent ne nous ont pas permis d’exprimer correctement CYP71AJ1 et

CYP76B8 dans les microsomes. Les travaux réalisés dans le chapitre III sur les

chimères de C4H (CYP73A1/CYP73A32) ont montré que l’expression dans les levures

WAT 11 de CYP73A32 est nettement améliorée lorsqu’on substitue les 31 premiers

résidus de la protéine par ceux de CYP73A1. Les travaux de Batard et al. (2000) ont par

ailleurs déjà montré que le remplacement de l’ancre transmembranaire d’une C4H de

blé (CYP73A17) par celle de CYP73A1 est suffisant pour obtenir une expression

conséquente de l’enzyme dans les levures WAT 11. Cette région des P450 constitue un

des points principaux d’ancrage de l’enzyme à la membrane du réticulum

endoplasmique, mais elle n’intervient pas dans la reconnaissance du substrat (Sagara et

al., 1993; Sueyoshi et al., 1995). Afin d’obtenir un niveau d’expression détectable de

CYP71AJ1 dans les levures WAT 11, nous avons entrepris de remplacer la région N-

terminale transmembranaire initiale (36 résidus) par celle de CYP73A1 (33 résidus)

pour générer l’ADNc CYP71AJ1-NT (Fig. IV-6).

Figure IV-6 : Séquences des régions transmembranaires de CYP73A1 et CYP71AJ1 La région de CYP71AJ1 substituée par les 33 résidus de CYP73A1 est représentée entre crochets.

CYP73A1 MDLLLIEKTLVALFAAIIGAILISKLRGKKFKL...33

CYP71AJ1 [MKMLEQNPQYLYFSLFLVTIFLYKWLTLKKTPLKNL]PPSPPQYP...45


135

Synthèse de l’ADNc chimère CYP71AJ1-NT

La synthèse de l’ADNc chimère CYP71AJ1-NT a été réalisée de la même façon

que celle des chimères de C4H décrite dans le chapitre 3. Une première PCR réalisée

sur l’ADNc de CYP73A1 à l’aide de l’amorce sens

5’ GGATCCATGGACCTCCTCCTCATAGA 3’ et de l’amorce antisens

5’ GGGATATTGTGGTGGAGAAGGTGGGAGCTTGAATTTTTTACCGCGG 3’

(30 cycles composés de 30 s à 95 °C, 30 s à 50 °C et 30 s à 72 °C) permet d’amplifier

un produit de 123 nucléotides correspondant au 99 premiers nucléotides de CYP73A1

avec 24 nucléotides de CYP71AJ1 en 3’. Ce produit est purifié sur gel, puis utilisé

comme amorce sens dans une deuxième réaction de PCR sur l’ADNc de CYP71AJ1.

L’amorce antisens 5’ GGAATTCTCAAACATGTGGTCTGGCAACCACCAAGAGAGG 3’

s’hybride à l’extrémité 3’ de l’ADNc et permet l’addition d’un site de restriction EcoRI

en 5’. La PCR a été réalisée en touch-down avec de la Pfu DNA polymerase : après 10

min de dénaturation à 95 °C, 10 cycles d’amplification sont entrepris avec 30 s de

dénaturation à 95 °C, 45 s d’hybridation à 60 °C lors du premier cycle, la température

étant ensuite minorée d’un degré à chaque cycle, et 2 min d’élongation à 72 °C.

L’amplification est complétée par 20 cycles avec une température d’hybridation

maintenue à 50 °C. Le produit obtenu, de 1493 nucléotides, correspond à l’ADNc

chimère complet de CYP71AJ1-NT auquel ont été ajoutés les sites de restriction BamHI

et EcoRI aux extrémités 5’ et 3’. L’ADNc est purifié sur gel d’agarose, digéré par

BamHI et EcoRI, puis cloné dans le vecteur pYeDP60 préalablement digéré avec les

mêmes enzymes. L’identité du plasmide pYe71AJ1-NT est vérifiée par séquençage.

pYe71AJ1-NT est introduit dans les levures WAT 11 en utilisant le protocole de

transformation à l’acétate de lithium.

2.2.6 Expression de CYP71AJ1-NT dans WAT 11

L’expression de CYP71AJ1-NT dans WAT 11 a été menée en utilisant les

conditions optimisées pour CYP82H1. Les levures ont été cultivées pendant 72 H à 20 °C,

puis l’expression du P450 a été induite avec 20 g.l-1 de galactose pendant 24 H à 20 °C.

Après préparation des microsomes, les P450 sont dosés par spectre différentiel en présence

de CO (Fig IV-7).


136

Tableau IV-4 : Liste des substrats testés pour le criblage métabolique de CYP71AJ1-NT, CYP76B8 et CYP82H1

Furocoumarines

(+)-marmésine

psoralène

bergaptol

xanthotoxol

bergaptène

xanthotoxine

angélicine

isopimpinelline

Acide cinnamique et dérivés hydroxylés

cinnamate

p-coumarate

o -coumarate

férulate

Terpènes

pulégone menthofurane

Coumarines

umbelliférone

déméthylsuberosine

coumarine

herniarine

scopolétine

Herbicides

isoproturon chlortoluron

Substrats testés

O OO

HO

O OO

O OO

OH

O OO

OH

O OO

OMe

O OO

OMe

O OO

OMe

OMe

HOOC

O OHO

HOOC

OH

O

CH3

H3C

H3C

O

CH3

CH3

O O

O OHO

OH O

O-

O

HO

O

O-

O OO

H3C

O O

O

HO

H3C CH3

NH

N

O

H3C

CH3

Cl

H3C NH C N

O

CH3

CH3

O OO

Furocoumarines

(+)-marmésine

psoralène

bergaptol

xanthotoxol

bergaptène

xanthotoxine

angélicine

isopimpinelline

Acide cinnamique et dérivés hydroxylés

cinnamate

p-coumaratep-coumarate

o -coumarateo -coumarate

férulate

Terpènes

pulégone menthofurane

Coumarines

umbelliférone

déméthylsuberosine

coumarine

herniarine

scopolétine

Herbicides

isoproturon chlortoluron

Substrats testés

O OO

HO

O OO

O OO

OH

O OO

OH

O OO

OMe

O OO

OMe

O OO

OMe

OMe

HOOC

O OHO

HOOC

OH

O

CH3

H3C

H3C

O

CH3

CH3

O O

O OHO

OH O

O-

O

HO

O

O-

O OO

H3C

O O

O

HO

H3C CH3

NH

N

O

H3C

CH3

Cl

H3C NH C N

O

CH3

CH3

O OO


137

Le spectre obtenu présente deux pics : un pic majoritaire à 420 nm caractéristique de P450

dégradés, et un plus petit à 450 nm qui prouve la présence de P450 fonctionnel. La

quantité de P450 produit dans ces conditions oscille autour de 10 pmol.(mg de protéine

microsomale) -1.

2.2.7 Criblage fonctionnel de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1

Afin d’identifier la fonction des trois P450 d’Ammi majus, des tests de

métabolisation ont été réalisés sur un large panel de molécules incluant majoritairement

des intermédiaires de synthèse des furocoumarines linéaires, ainsi que des coumarines et

des dérivées du cinnamate (Tab. IV-4). Les deux herbicides isoproturon et chlortoluron

ont également été testés car ils sont métabolisés par le CYP76B1 proche du CYP76B8

ainsi que par deux P450 de la famille des 71 (CYP71A10 et A11) (Robineau et al.,

1998 ; Siminszky et al., 1999 ; Yamada et al., 2000). Par ailleurs, la forte homologie de

CYP71AJ1 avec la menthofurane synthase nous a amené à tester le substrat et le produit

de cette enzyme, à savoir la pulégone et la menthofurane (Bertea et al., 2001).

Les incubations ont été réalisées dans 150 µl de tampon phosphate de sodium

(NaPi) 0,1 M pH 7,5 contenant 1 mM de NADPH et chaque substrat à 100 µM. Les

réactions sont initiées par l’ajout des microsomes exprimant CYP82H1 ou CYP71AJ1-

NT. Les test ont également été réalisés avec les microsomes exprimant CYP76B8 bien

qu’aucun spectre CO n’ait été enregistré. Les réactions, incubées à 27 °C sous agitation

(600 rpm) pendant 1 H, sont stoppées par l’ajout de 50 µl d’acétonitrile/HCl (99/1). Le

Figure IV-7 : Spectre différentiel au CO de microsomes de levures surexprimant CYP71AJ1-NT


138

P

S

Figure IV-8: Détection en HPLC du produit de la conversion de la (+)-marmésine catalysée par CYP71AJ1-NT A: Incubation des microsomes exprimant CYP71AJ1-NT en présence de (+)-marmésine et NADPH; B: Même incubation que A mais sans NADPH; C: Incubation en présence de (+)-marmésine et NADPH avec des microsomes de levures contenant le vecteur vide pYeDP60. S, substrat; P, produit.

AU

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

AU

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

AU

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

AU

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Minutes2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

B

C

S

P

A


139

milieu d’incubation est ensuite centrifugé à 10000 g pendant 20 min, puis le surnageant

est prélevé avant d’être analysé en HPLC.

Dans le cas de CYP76B8 et CYP82H1, aucun nouveau métabolite n’est formé,

quel que soit le substrat testé. L’incubation de microsomes exprimant CYP71AJ1-NT en

présence de (+)-marmésine et de NADPH donne un produit détecté en HPLC (Fig IV-

8). La formation de ce produit est dépendante de la présence de NADPH. De plus, il

n’est pas détecté lorsqu’on incube des microsomes de levures transformées avec un

vecteur vide. La molécule formée possède le même temps de rétention que le psoralène

(20,5 min) ainsi que le même spectre d’absorbance (270 nm-370 nm) caractérisé par

deux

max à 295 nm et 330 nm (Fig IV-9).

Pour confirmer son identité, le produit est analysé en GC-MS. Pour ce faire, 20

fractions HPLC contenant la molécule d’intérêt sont collectées et lyophilisées. L’ensemble

est ensuite resuspendu dans du chloroforme et 1 µl est injecté en GC-MS. Une fois de plus,

le temps de rétention en GC est identique à celui du psoralène (Fig IV-10). Le spectre de

masse est lui aussi sans équivoque avec un pic principal de m/z = 186, et des pics

majoritaires de fragmentation à 102, 130 et 158 caractéristiques du psoralène. Les temps de

rétention en HPLC et GC ainsi que le spectre d’absorbance et le spectre de masse

permettent donc de confirmer que le produit formé est du psoralène. CYP71AJ1-NT

catalyse donc la conversion de la (+)-marmésine en psoralène communément définie

comme l’activité psoralène synthase.

B

nm

300 350 400

0

5

10 A

Figure IV-9 : Spectre d’absorbance du produit formé par CYP71AJ1-NT (A) et du psoralène (B)

nm

300 350 400

mAU

0

50

100B

50 100 150 200 250 300 350m/z

0%

25%

50%

75%

100%

50 76

102

130

158

186

205 233 269

Spect 112.568 min. Scan: 764 Chan: 1 Ion: 146 us RIC: 307127 BCBP 186 (77966=100%) psoralene002.sms

0%

25%

50%

75%

100%

47

83 102

130

158

186

221 236 269 283

Spect 212.479 min. Scan: 763 Chan: 1 Ion: 5171 us RIC: 11712 BCBP 186 (1550=100%) psoralenepoole2.sms

5 10 15 20 25minutes

0

50

100

150

200

250

300kCounts

0

1

2

3

4

5

kCounts

Ions: 186+158+130+102 all psoralene002.sms

Ions: 186+158+102+130 all psoralenepoole2.sms

Figure IV-10 : Spectre de masse et profil d’élution GC du produit formé par CYP71AJ1-NT (A et C) et du psoralène (B et D)

A

D

C

B


141

2.3 Caractérisation enzymatique de la psoralène synthase

Une caractérisation enzymatique de la psoralène synthase recombinante a été

entreprise afin de déterminer dans un premier temps les conditions de pH et de température

optimales pour l’activité. Une fois les conditions de réaction déterminées nous avons

mesuré les constantes cinétiques de l’enzyme par rapport à la (+)-marmésine. Pour conclure

ce travail de caractérisation, la sensibilité de la psoralène synthase vis à vis des

furocoumarines, décrits comme inhibiteurs de P450, a été mesurée.

2.3.1 Détermination du pH optimal d’activité

Le pH optimal d’activité a été déterminé pour une gamme de pH s’étendant de 2 à

10. Une activité psoralène synthase est mesurée dans la fourchette de pH 5 - 9, avec le

maximum pour pH 7 (Fig IV-11).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12

pH

Act

ivité

rel

ativ

e glycine HCl

Sodium acetate

Sodium Phosphate

Tris HCl

Sodium glycinate

Figure IV-11 : Détermination du pH optimum pour l’activité psoralène synthase

L’activité est mesurée dans 150 µl de tampon à 0,1 M contenant 1 mM de NADPH, 100 µM de (+)-marmésine et 0,45 pmol de P450. Après 9 min d’incubation à 27 °C sous agitation 600 rpm, les réactions sont arrêtées par l’addition de 75 µl d’acétonitrile / HCl (99 / 1). L’activité maximale obtenue à pH 7 est égale à 190 mol.min-1.mol-1P450.


142

Figure IV-12 : Détermination de la température maximale pour l’activité psoralène synthase L’activité est mesurée dans 150 µl de tampon Phosphate de sodium (pH 7) à 0,1 M contenant 1mM de NADPH, 100 µM de (+)-marmésine et 0,45 pmol de P450. Après 9 min d’incubation sous agitation 600 rpm, les réactions sont arrêtées par l’addition de 75 µl d’acétonitrile / HCl (99 / 1). L’activité maximale obtenue à 35 °C est égale à 180 mol.min-1.mol-1P450.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Température (°C)

Act

ivité

rela

tive


143

2.3.2 Détermination de la température optimale

L’activité psoralène synthase a été mesurée pour des températures comprises

entre 15 et 45 °C (Fig. IV-12). L’activité maximale est obtenue pour des températures

comprises entre 27 et 35 °C. CYP71AJ1 présente une faible thermo-spécificité, avec

40 % de l’activité qui est conservée à 15 °C et 50 % à 40 °C.

2.3.3 Linéarité de la réaction

La linéarité de la réaction a été déterminée sur une période de temps de 90 min.

La formation de psoralène est linéaire pendant les 20 premières minutes, puis celle-ci

décroît pour atteindre un plateau après 80 minutes de réaction (Fig. IV-13).

2.3.4 Constantes cinétiques de la psoralène synthase

La détermination des constantes cinétiques a été faite en utilisant les conditions

d’activité optimale définies précédemment. Les microsomes (contenant 0,30 pmol de

P450) sont incubés dans 200 µl de tampon phosphate de sodium pH 7 à 0,1 M,

contenant 1 mM de NADPH et une gamme de concentration de (+)-marmésine (1 µM à

Figure IV-13 : Accumulation de psoralène en fonction du temps

La réaction est réalisée dans 150 µl de tampon Phosphate de sodium (pH 7) à 0,1 M contenant 1mM de NADPH, 100 µM de (+)-marmésine et 0,45 pmol de P450. L’incubation est maintenue sous agitation à 600 rpm, à 27 °C, puis est stoppée par l’addition de 75 µl d’acétonitrile / HCl (99 / 1).

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60 80 100

Temps (min)

Qun

atité

de

psor

alèn

e fo

rmé

(pm

ol)


144

15 µM). L’incubation est maintenue à 27 °C sous agitation à 600 rpm pendant 6 min

avant d’être stoppée par 100 µl d’acétonitrile / HCl (99 / 1). La représentation en double

inverse de Lineweaver-Burk permet de définir la constante d’affinité (Km) de

CYP71AJ1 pour la (+)-marmésine ainsi que la vitesse de réaction (Vm) exprimée ici en

mole de produit par minute et par mole de P450 (Fig. IV-14). Chaque réaction a été

répétée 2 à 3 fois. Le Km pour la (+)-marmésine, défini graphiquement en considérant

tous les points expérimentaux, est de 2 ± 0,3 µM et le Vm est de 150 ± 4 mol.min-1.(mol

P450) -1.

2.3.5 Mesure de la sensibilité de CYP71AJ1-NT à l’inactivation autocatalytique par les furocoumarines

Les furocoumarines, notamment le psoralène et le 8-MOP, sont couramment

décrits comme des inhibiteurs autocatalytiques de P450 (Koenigs et al., 1997, Fouin-

Fortunet et al., 1986). Cette propriété des furocoumarines est paradoxale au regard du

nombre important de P450 impliqués dans leur voie de biosynthèse (Gravot et al.,

2004). Nous nous sommes intéressés au comportement de CYP71AJ1 vis à vis de

l’inactivation autocatalytique par trois furocoumarines linéaires (5-MOP, 8-MOP et

Figure IV-14 : Représentation de Lineweaver-Burk pour la psoralène synthase d’Ammi majus (CYP71AJ1)

y = 0,0134x + 0,0065

R2 = 0,9916

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

1/[(+)-marmésine] (µM-1)

1/A

ctiv

ité (m

ol.m

in-1

.mol

-1 P

450)


145

psoralène) et une furocoumarine angulaire, l’angélicine. Pour mesurer la sensibilité de

CYP71AJ1-NT à l’inactivation autocatalytique, les microsomes sont incubés pendant

10 minutes dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7 contenant 1 mM de

NADPH et 50 µM d’inhibiteur. A l’issue de la préincubation, l’activité psoralène

synthase résiduelle est mesurée en ajoutant un volume de préincubation dans neuf

volumes d’un mélange d’incubation composé de NADPH 1mM et de (+)-marmésine à

100 µM dans un tampon phosphate de sodium (0,1 M, pH 7). L’activité résiduelle

obtenue après une pré-incubation sans inhibiteur ni NADPH constitue le témoin auquel

on attribue la valeur d’activité relative 100 %. Les résultats sont présentés dans le

tableau IV-5. La présence du NADPH dans le milieu de pré-incubation provoque une

perte d’activité d’environ 20 % qui s’explique par un phénomène d’auto-inactivation.

Quels que soient les inhibiteurs testés, en absence ou en présence de NADPH, on

retrouve des valeurs similaires au témoin sans inhibiteur indiquant que l’enzyme n’est

inhibée par aucune de ces molécules.

2.3.6 Recherche d’une inhibition compétitive des furocoumarines sur CYP71AJ1-NT

La sensibilité de CYP71AJ1 à une inhibition « classique » par les furocoumarines a

été testée en incubant les microsomes exprimant CYP71AJ-NT pendant 6 minutes à 27 °C

en présence de 1 mM de NADPH, 5 µM de (+)-marmésine et une gamme de concentration

(15 µM, 50 µM et 100 µM) d’inhibiteur (psoralène, 5-MOP, 8-MOP et angélicine). Sur les

quatre molécules testées, seuls le 8-MOP et le psoralène démontrent une activité inhibitrice.

Celle-ci est néanmoins relativement faible pour le 8-MOP même à forte concentration

Inhibiteur Sans NADPH Avec NADPH

8MOP 87 ± 3 77 ± 7

5MOP 93 ± 3 79 ± 3

Psoralène 95 ± 2 76 ± 3

Angélicine 94 ± 11 78 ± 5

Sans inhibiteur 100 78 ± 8

% d'activité résiduelle

Tableau IV-5 : Test d’inactivation autocatalytique de CYP71AJ1-NT par différentes furocoumarines


146

Figure IV-15 : Représentation en double inverse de l’activité psoralène synthase en fonction de la concentration en (+)-marmésine en présence de concentrations croissantes en psoralène [Psoralène] : 0 µM ; 10 µM ; 30 µM ; 70 µM En encart : Détermination graphique du Ki du psoralène pour l’activité psoralène synthase

Figure IV-16 : Mise en évidence de l’activité psoralène synthase dans les levures exprimant CYP71AJ natif et CYP71AJ-NT Profil HPLC du milieu de culture YPGE contenant 1 mM de (+)-marmésine après 4 H d’incubation avec les levures WAT 11 exprimant CYP71AJ1 (A), CYP71AJ1-NT (B) ou WAT 11 transformées avec le vecteur vide pYeDP60 (C). M : (+)-marmésine ; P : psoralène

Minutes2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5

AU

-0 .0450

-0.0425

-0.0400

-0.0375

-0.0350

-0.0325

-0.0300

-0.0275

-0.0450

-0.0425

-0.0400

-0.0375

-0.0350

-0.0325

-0.0300

-0.0275

M inutes2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5

AU

-0 .0450

-0.0425

-0.0400

-0.0375

-0.0350

-0.0325

-0.0300

-0.0275

M inutes2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5

AU

-0 .0450

-0.0425

-0.0400

-0.0375

-0.0350

-0.0325

-0.0300

-0.0275

-0.0450

-0.0425

-0.0400

-0.0375

-0.0350

-0.0325

-0.0300

-0.0275

A

B

C

P

M

M

M

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

-0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,91/[marmesine] (µM-1)

1/ac

tivité

(pm

ol-1

.min

.pm

ol P

450) 0

5

10

-55 45

[Psoralène] (µM)

Km

(ap

p)

(µM

)


147

(24 % d’inhibition pour 100 µM). L’inhibition provoquée par le psoralène est la plus

marquée avec une perte d’activité de 60 % pour 100 µM d’inhibiteur. Afin de mieux

caractériser les paramètres de cette inhibition, les propriétés cinétiques de CYP71AJ1 ont

été mesurées sur une gamme de concentratuions de (+)-marmésine (1 µM à 10 µM) en

présence de différentes concentrations en inhibiteur (0, 10, 30 et 70 µM de psoralène). En

dépit du fait que la mesure n’a été réalisée qu’une seule fois sur seulement 3 à 4 points, il

apparaît que l’addition de concentrations croissantes de psoralène, modifie l’affinité de

l’enzyme pour la (+)-marmésine, mais sans changer la vitesse d’activité maximale (Fig. IV-

15). Ces propriétés sont caractéristiques d’une inhibition compétitive. D’après ces mesures,

le Ki est estimé à 35 µM.

2.3.7 Bioconversion de la (+)-marmésine en psoralène par les levures exprimant les formes natives et modifiées de CYP71AJ1

L’ensemble des travaux de détermination et de caractérisation de l’activité psoralène

synthase a été réalisé avec CYP71AJ1-NT modifié avec l’ancre membranaire de CYP73A1.

Afin de vérifier la fonctionnalité de la forme native de CYP71AJ1, nous avons testé la

métabolisation de la (+)-marmésine in vivo par les levures recombinantes. Des levures

transformées avec CYP71AJ1, CYP71AJ1-NT ou avec le vecteur vide ont été cultivées

24 H à 28 °C et induites pendant 24 H à 20 °C. A l’issue de l’induction, 750 µl de chaque

souche sont prélevés et centrifugés pour sédimenter les levures. Celles-ci sont resuspendues

dans 500 µl de milieu YPGE contenant 1 mM de (+)-marmésine et incubées 4 H à 24 °C.

La composition du milieu est ensuite analysée en HPLC (Fig. IV-16). Un pic de psoralène

est observé avec les levures exprimant CYP71AJ1 et CYP71AJ1-NT alors que rien n’est

observé pour les levures transformées avec le vecteur vide. Ce résultat prouve (i) que le

CYP71AJ1 natif est exprimé dans les levures mais à un niveau sans doute trop faible pour

le détecter dans les préparations de microsomes et (ii) que cette enzyme non modifiée est

fonctionnelle pour l’activité psoralène synthase.


148

O OO

Hs Hr

H3C

HO

H3C

P FeV

O

O OO

Hr

H3C

HO

H3C

P FeIV

O H

.

O OOH3C

HO

P FeIV

OH

CH3

H

. +

CH3H3C

O++ H2O P-FeIII

Figure IV-18 : Mécanisme réactionnel de la psoralène synthase proposé par Stanjek et al. (1997) Dans un premier temps, l’intermédiaire FeV=O de l’hème attaque l’hydrogène syn du carbone C3’ de la (+)-marmésine donnant un radical benzylique qui forme spontanément une molécule de psoralène et un radical propyloxy. Ce dernier attaque ensuite l’intermédiaire FeIV=OH de l’hème pour donner un acétone et une molécule d’eau.

Figure IV-17 : Représentation des voies de biosynthèse des furocoumarines linéaires et angulaires

Les étapes catalysées par la psoralène synthase et l’angélicine synthase sont représentées respectivement par des flèches rouges et bleues.

OHO OUmbelliferone

OHO Odemethylsuberosine

O OO(+)-marmésine

OH

O OOpsoralène

O OO5-MOP

OMe

OHO Oosthenol

O OO(+)-columbianetine

OH

O OO

angelicine

O OOsphondine

MeO

OMe

O OO

8-MOP


149

2.3.8 Test de la métabolisaton de la (+)-columbianetine par

CYP71AJ1-NT

Certaines Apiacées proches d’Ammi majus, comme Angelica archangelica ou

Heracleum mantegazzianum, produisent en plus des furocoumarines linéaires, plusieurs

formes angulaires. Ces furocoumarines angulaires sont distribuées chez les Apiacées et les

Fabacées, et uniquement dans des plantes synthétisant des furocoumarines linéaires. Elles

fourniraient un avantage évolutif aux plantes les synthétisant en augmentant le potentiel

toxique de leurs équivalents linéaires (Berenbaum et Zangerl, 1996). Il a été proposé que la

voie de synthèse menant aux furocoumarines angulaires puisse dériver de celle des

furocoumarines linéaires au niveau de l’étape de prénylation de l’umbelliférone, le prényl

étant ajouté sur le C6 dans le cas des linéaires et le C8 pour les angulaires (Fig. IV-17)

(Berenbaum et Zangerl, 1993 ; Stanjek et Boland, 1998). La machinerie enzymatique

responsable de la synthèse des furocoumarines angulaires en aval de l’étape de prénylation

pourrait ensuite avoir évolué à partir de celle des linéaires. Dans le cas de la psoralène

synthase, les travaux de Stanjek destinés à déterminer le mécanisme réactionnel de

l’enzyme, ont montré que la conversion de la (+)-marmésine en psoralène est réalisée par le

clivage oxydatif d’une liaison carbone-carbone et s’accompagne de la formation d’une

molécule d’acétone (Fig. IV-18) (Stanjek et al., 1997 ; Stanjek et al., 1999). C’est par ce

même mécanisme relativement atypique que, chez Heracleum mantegazzianum,

l’angélicine synthase catalyse la conversion de la (+)-columbianetine en angélicine,

furocoumarine angulaire équivalente du psoralène (Stanjek et Boland, 1998). En raison de

la similarité des réactions catalysées par ces deux enzymes et de l’origine évolutive

probable des furocoumarines angulaires, et bien qu’Ammi majus ne synthétise pas ce type

de molécule, nous avons testé la capacité de CYP71AJ1-NT à catalyser la conversion de la

(+)-columbianetine en angélicine. Le test de métabolisation a été réalisé dans 150 µl de

tampon Phosphate de sodium 0,1 M pH 7 contenant 1 mM de NADPH et la (+)-

columbianetine à 100 µM. La réaction est amorcée par l’ajout de microsomes contenant

CYP71AJ-NT et est menée à 27 °C sous agitation (600 rpm) pendant 1 H avant d’être

stoppée par l’addition de 75 µl d’acétonitrile / HCl (99 / 1). Le milieu d’incubation est

ensuite centrifugé 20 min à 10000 g, puis le surnageant est prélevé avant d’être analysé en

HPLC. L’analyse HPLC ne révèle aucune métabolisation de la (+)-columbianetine. De tous


150

Figure IV-19 : Evolution des paramètres thermodynamiques et structuraux au cours d’une dynamique moléculaire de 160 ps Évolution de la température (A), du RMSD des stuructures générées au cours de la dynamique moléculaire en comparaison de la structure initiale (B) et du rgyr (C).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 40 80 120 160

Temps (ps)

RM

SD (

angs

tröm

s)

B

270

280

290

300

310

320

330

0 40 80 120 160

Temps (ps)

Tem

péra

ture

(K

)

A

22,3

22,4

22,5

22,6

22,7

22,8

22,9

23

23,1

0 40 80 120 160

Temps (ps)

Rgy

r (A

ngst

röm

s)

C


151

les substrats testés, CYP71AJ1-NT présente une spécificité de substrat exclusive pour la

(+)-marmésine et ne possède donc pas d’activité angélicine synthase.

2.4 Etude in silico de la psoralène synthase

Dans le but de déterminer les résidus impliqués dans le mécanisme réactionnel

de la psoralène synthase et de comprendre la spécificité de l’enzyme pour la (+)-

marmésine, nous avons entrepris de créer un modèle 3D de CYP71AJ1, puis de simuler

le positionnement de la (+)-marmésine et de la (+)-columbianetine dans le site actif.

2.4.1 Création d’un modèle tridimensionnel de CYP71AJ1

La structure tridimensionnelle de CYP71AJ1 a été modélisée par homologie à

l’aide du logiciel MOE (Chemical Computing Group, Inc.) en suivant la méthode

décrite dans le chapitre III. La séquence protéique de CYP71AJ1 a tout d’abord été

soumise à un alignement multiple (matrice blosum62) avec les séquences de P450

récemment cristallisés : CYP2C5 (PDB : 1DT6), CYP2C9 (PDB : 1OG2), CYP2C8

(PDB : 1PQ2), CYP2B4 (PDB : 1PO5), P450 BM3 (PDB : 1BU7) et CYP2A6

complexé avec la coumarine (PDB : 1Z10) ou avec le 8-MOP (PDB : 1Z11). La

structure de base utilisée pour la création du modèle est celle de CYP2C8 qui présente

la plus forte homologie de séquence avec CYP71AJ1 (27,5 %). Le diagramme de

Ramachandran, qui permet d’évaluer la distribution des angles f et dans la protéine,

indique que sur les 454 résidus constituant le modèle, 11 seulement sont considérés hors

norme. Ce résultat est en accord avec ceux obtenus pour les structures de CYP119,

CYP6B1, CYP73A5, CYP98A3, CYP75B1 et CYP84A1 (Chang et Loew, 2000 ;

Baudry et al., 2003 ; Rupasinghe et al., 2003). La stabilité structurale et

thermodynamique du modèle a été estimée en le soumettant à une simulation de

dynamique moléculaire pendant 160 ps. Au cours de la simulation, la température du

système est maintenue à 300 ± 10 K (Fig. IV-19). Le suivi de la RMSD (root mean

sqare deviation) témoignant des réarrangements structuraux du modèle et du rayon de

rotation (rgyr) renseignant sur la taille de l’enzyme, montre que la structure

tridimensionnelle de la protéine se stabilise autour de 40 ps. A partir de ce temps, la

RMSD atteint un plateau, cependant le rgyr fluctue encore légèrement. L’évolution de


152

3,78 Å

Figure IV-20 : Positionnement de la (+)-marmésine (A) et de la (+)-columbianetine (B) dans le site actif de CYP71AJ1 La (+)-marmésine (en turquoise) et la (+)-columbianetine (en orange) sont représentées dans le site actif, ainsi que les résidus à moins de 4,5 Å des substrats. La distance entre le site d’attaque défini par Stanjek et l’oxygène de l’intermédiaire ferroxo est indiquée orange.

6,27 Å

B

A


153

ces paramètres est comparable à celle enregistrée pour les modèles de CYP6B1 et des 4

P450 d’Arabidopsis thaliana mentionnés plus haut (Baudry et al., 2003 ; Rupasinghe et

al., 2003). L’ensemble des outils de validation (Ramachandran et dynamique

moléculaire) permet d’attester que le modèle généré est thermodynamiquement stable et

est d’une qualité acceptable pour étudier l’ancrage de substrat.

2.4.2 Simulation d’ancrage de la (+)-marmésine et de la (+)-columbianetine

Les simulations d’ancrage de la (+)-marmésine et de la (+)-columbianetine dans

le site actif de CYP71AJ1 ont été réalisées après avoir lié un atome d’oxygène sur le fer

héminique pour représenter l’état ferroxo. L’ancrage a été effectué à l’aide de

l’application Monte Carlo du logiciel MOE. Pour chaque molécule, 25 modèles

d’ancrage ont été générés et classés en fonction de la somme de l’énergie de Van der

Waals, de l’énergie électrostatique de l’interaction et de l’énergie propre du ligand.

Dans le cas des deux ligands testés, le modèle le mieux classé a été sélectionné, puis le

complexe protéine-ligand a subi une étape de minimisation d’énergie à l’aide du champ

du force CHARMm22.

- Positionnement de la (+)-marmésine

Le modèle d’ancrage le plus probable généré par MOE, représente la (+)-

marmésine avec un axe principal définissant un angle de 45 ° avec l’hélice I (Fig. IV-20

A). Le noyau coumarine est orienté du coté de la région N-terminale de l’hélice I, tandis

que le furane et la fonction hydroxy-propyl sont proches de l’hème. L’hydrogène syn

par rapport au groupement hydroxy-propyl, lié au carbone C3’ du cycle furane a été

décrit par Stanjek comme le site d’attaque de la psoralène synthase pour déalkyler la

(+)-marmésine (Stanjek et al., 1997 ; Stanjek et al., 1999). Le modèle d’ancrage est en

accord avec les résultats de Stanjek, puisque l’hydrogène syn en C3’ est situé à 3,78 Å

de l’atome d’oxygène de l’intermédiaire ferroxo, soit suffisamment proche pour

permettre la réaction. Dix résidus (R103, M119, V120, A296, T300, T360, L364, V365,

P366 et T478) sont situés à moins de 4,5 Å de la (+)-marmésine et sont par conséquent,

susceptibles de participer à l’ancrage et / ou au mécanisme réactionnel. Le résidu T300,

en particulier, pourrait participer au positionnement de groupement hydroxy propyl en

établissant une liaison hydrogène avec l’hydroxyl.


154

- Ancrage de la (+)-columbianetine

La (+)-columbianetine possède une orientation globale assez similaire à celle de

la (+)-marmésine avec le noyau coumarine du côté N-terminal de l’hélice I et le cycle

furane vers la région C-terminale, mais l’angle défini par le plan du noyau coumarine et

celui de l’hème est cependant plus important (65 ° pour la (+)-columbianetine contre

45 ° pour la (+)-marmésine) (Fig. IV-20 B). De manière similaire à ses travaux sur le

mécanisme d’action de la psoralène synthase, Stanjek a montré que l’angélicine

synthase catalyse la formation de l’angélicine par une déalkylation de la (+)-

columbianetine initiée par une attaque de l’hydrogène syn situé sur le carbone C 9

(Stanjek et Boland, 1998). Dans le modèle d’ancrage cet atome est probablement situé

trop loin de l’hème (6,27 Å) pour permettre la métabolisation. Ce modèle concorde

parfaitement avec les tests d’activité de CYP71AJ1 en présence de (+)-columbianetine

qui ont révélé l’absence de métabolisation de ce substrat.


155

3 Discussion

3.1 Clonage de P450 de la voie des furocoumarines par differential display

Les cultures de cellules d’Ammi majus élicitables pour la synthèse des

furocoumarines se sont avérées être un matériel bien adapté à l’étude des enzymes, et en

particulier des P450 impliquées dans cette voie de biosynthèse, dès les années 80

(Hamerski et al., 1988 a et b). C’est encore le cas pour ce travail destiné à isoler des

séquences codantes de P450 de la voie des furocoumarines. Sur les cinq séquences de

P450 isolées par differential display à l’université de Marburg, deux codent des

enzymes impliquées de près ou de loin dans la synthèse des furocoumarines : une C4H

(CYP73A41) qui catalyse la formation du p-coumarate en amont de la voie (Hubner et

al., 2003) et une psoralène synthase (CYP71AJ1) dont l’identification et la

caractérisation sont présentées dans ce chapitre. Une troisième séquence isolée code une

C3’H (CYP98A21) impliquée dans la voie des phénylpropanoïdes (D. Werck-

Reichhart, communication personnelle,). Les deux dernières séquences que nous avons

été amenés à étudier (CYP82H1 et CYP76B8), n’ont pas pu être caractérisées d’un

point de vue fonctionnel pour le moment. Bien qu’il soit exprimé correctement dans la

levure, les tests de métabolisation réalisés avec CYP82H1 n’ont pas abouti à

l’identification d’une activité. Ce P450 ne semble pas impliqué dans la synthèse des

furocoumarines linéaires. Les tests de métabolisation permettent également d’exclure un

rôle dans la détoxification de l’isoproturon et du chlortoluron, deux herbicides

phenylurés. Le rôle de cette famille de P450 reste encore irrésolu. Malgré l’isolement de

plus d’une quarantaine de séquences de CYP82, aucune fonction ne lui a encore été

associée. A l’image de nombreux membres de cette famille (CYP82A1, A2, A3, E1…)

inductibles par un stress, CYP82H1 voit son expression augmentée en réponse à

l’élicitation par des extraits de champignon, ce qui laisse penser qu’il est impliqué dans

un mécanisme de résistance aux pathogènes. Cependant, il est difficile d’être plus précis

quant à la fonction de ce P450, d’autant plus que l’élicitation des cellules d’Ammi majus

par les extraits de Phytophtora n’est pas spécifique : l’accumulation de furocoumarines


156

par les cellules élicitées s’accompagne d’une forte production de phtalides ainsi que de

la synthèse d’une dizaine de molécules encore non identifiées (S. Kellner,

communication personnelle). Les tests de métabolisation réalisés sur les microsomes

exprimant CYP76B8 n’ont pas permis de statuer sur la fonction de cette enzyme. Ce

résultat est néanmoins à relativiser car comme le démontrent les spectres différentiels au

CO, cette enzyme n’est pas ou très peu exprimée dans les microsomes. La

caractérisation de CYP76B8 nécessitera donc dans un premier temps, d’améliorer les

conditions d’expression de cette enzyme en système hétérologue.

3.2 Expression hétérologue des CYP d’Ammi majus dans WAT 11

L’expression hétérologue des ADNc de P450 isolés par PCR ou differential

display, est une étape nécessaire pour l'étude fonctionnelle des enzymes pour lesquelles

ils codent. Dans le cas des CYP d’Ammi majus, l’expression dans WAT 11 s’est révélée

étonnament faible, voire indétectable. Seul CYP82H1 s’exprime à un niveau correct à

condition de diminuer la température d’induction à 20 °C. Les différentes tentatives

destinées à faire exprimer les formes natives de CYP71AJ1 et CYP76B8 n’ont pas

permis d’obtenir des quantités d’enzymes détectables par spectre différentiel au CO

dans les microsomes. La bioconversion de la (+)-marmésine par les levures

transformées avec le CYP71AJ1 natif prouve néanmoins que cette enzyme est présente

à un faible niveau et est fonctionnelle. Il semble peu probable que le problème

d’expression soit d’origine transcriptionnelle car tout les ADNc testés (CYP82H1,

CYP71AJ1 et CYP76B8) y compris le témoin CYP73A1, sont placés sous le contrôle

du même promoteur GAL10-CYC1 et du terminateur PGK. Le problème pourrait alors

provenir soit d’une traduction peu efficace, soit d’une dégradation importante de la

protéine. Pour CYP76B8, nos données ne permettent pas de statuer sur l’une ou l’autre

de ces possibilités. Par contre, certaines observations réalisées lors de la caractérisation

fonctionnelle de CYP71AJ1 indiquent que cette enzyme est particulièrement instable :

en effet, malgré plusieurs tentatives, il nous a été impossible de mesurer l’activité

psoralène synthase dans les microsomes de levures exprimant la forme native de

CYP71AJ1, alors que l’activité est détéctable dans les levures entières. D’autre part,

l’activité psoralène synthase que nous avons pu mesurer dans les microsomes contenant


157

CYP71AJ1-NT, s’est avérée assez instable et n’était plus détectable après congélation

des microsomes pendant 72 H à – 20 °C. L’instabilité de l’activité ne semble pas liée à

l’expression hétérologue de l’enzyme puisqu’elle est également constatée dans les

microsomes purifiés de cellules d’Ammi majus (U. Matern, communication

personnelle). La forte dégradabilité d’une enzyme est d’autant plus préjudiciable sur le

niveau d’expression que la traduction est peu efficace. L’hypothèse d’un problème

traductionnel a déjà été avancée pour expliquer la faible expression dans WAT 11 des

C4H de Triticum aestivum (CYP73A17) et de Ruta graveolens (CYP73A32) (Batard et

al., 2000; Gravot, 2002). Les auteurs de ces travaux ont mis en évidence la présence, à

l’extrémité 5’ de chacun de ces ADNc, d’un nombre important de codons rares chez la

levure, ce qui pourrait altérer l’efficacité de la traduction. Les résultats obtenus dans le

chapitre III pour l’expression des chimères CYP73A1/73A32 vont dans ce sens puisque

le remplacement de seulement 93 nucléotides de CYP73A32 par ceux de CYP73A1

suffit pour augmenter largement l’expression de l’enzyme dans WAT 11. Ici, le

remplacement de l’ancre membranaire de CYP71AJ1 par celle de CYP73A1 nous a

permis d’obtenir un niveau d’expression dans les microsomes certes faible mais

suffisant pour identifier et caractériser la fonction de l’enzyme. La comparaison des

séquences nucléotidiques codant l’ancre membranaire de CYP73A1 et CYP71AJ1

révèle cependant assez peu de différences dans l’usage de codons rares chez la levure en

comparaison de l’effet observé sur l’expression de l’enzyme (Cf. tableau d’usage des

codons de Nakamura http://www.kazusa.or.jp/codon/). Sur les 108 nucléotides codant

l’ancre membranaire de CYP71AJ1, 11 codons sont représentés avec une fréquence de

moins de 1 % chez la levure, alors qu’il n’y en a que 8 pour CYP73A1 (Fig. IV-21).

L’utilisation de l’ancre membranaire de CYP73A1 a déjà été rapportée avec plus ou

moins de succès pour améliorer l’expression d’autres CYP73 dans WAT 11 (Batard et

al., 2000, Ralston et al., 2001, Nedelkina et al., 1999). CYP71AJ1-NT constitue à notre

connaissance le premier P450 de plante dont l’expression hétérologue est améliorée par

substitution avec l’ancre membranaire d’un P450 de famille différente. Une

construction similaire est actuellement en cours de réalisation pour tenter d’améliorer

l’expression de CYP76B8.

http://www.kazusa.or.jp/codon/


158

3.3 Identification et caractérisation de la psoralène synthase

Le criblage métabolique réalisé sur CYP71AJ1-NT exprimé dans les

microsomes de levures nous a permis de détecter la conversion de la (+)-marmésine en

psoralène dont l’identité a été confirmée sur la base de son spectre d’absorbance et de

son spectre de masse. Cette activité psoralène synthase a pu être mesurée non seulement

avec la forme modifiée CYP71AJ1-NT mais également dans les levures exprimant la

forme native de CYP71AJ1. CYP71AJ1 constitue donc le premier gène de P450 cloné

codant une psoralène synthase et plus généralement le premier gène de P450 de fonction

identifiée, impliqué directement dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. La

caractérisation de l’activité réalisée sur la forme modifiée CYP71AJ1-NT nous a fourni

des conditions optimales à pH 7 et à une température entre 27 °C et 35 °C. Ces

conditions sont relativement proches de celles mesurées pour la C4H d’Ammi majus

(pH 6,5-7, température 25 °C) (Hubner et al ., 2002) mais différentes de celles de la

bergaptol-O-méthyl-transférase (BMT) (pH 8 – température 42 °C) impliquée dans une

étape terminale de la synthèse des furocoumarines et dont la séquence codante a été

isolée récemment chez Ammi majus (Hehmann et al., 2004). Les constantes catalytiques

définies dans les conditions d’activité optimales donnent un Km de 2 ± 0,3 µM et un kcat

Figure IV-21. Codons rares chez la levure dans la région 5’ codant l’ancre membranaire de CYP71AJ1 et CYP73A1 Les codons présents à moins de 1 % chez Saccharomyces cerevisiae sont en caractère gras et soulignés.

CYP71AJ1 atgaagatgctggaacagaatccccagtacctgtatttttcattgtttcttgtc 54 M K M L E Q N P Q Y L Y F S L F L V

CYP73A1 atggacctcctcctcatagaaaaaaccctcgtcgccttattcgccgccattatc 54 M D L L L I E K T L V A L F A A I I

CYP71AJ1 acaatatttctctacaaatggttaacacttaagaaaacacccttgaaaaatctg 108 T I F L Y K W L T L K K T P L K N L

CYP73A1 ggcgcaatactaatctccaaactccgcggtaaaaaattcaagctc 99 G A I L I S K L R G K K F K L


159

de 150 ± 4 mol.min-1.mol-1 P450. Bien que l’activité psoralène synthase ait déjà été

mesurée dans les cultures cellulaires de persil et d’Ammi majus (Wendorff et Matern,

1986 ; Hamerski et Matern, 1988 a ), aucune donnée concernant les constantes

catalytiques n’avait été publiée. L’affinité de notre enzyme pour son substrat (2µM) est

néanmoins en accord avec celles mesurées pour la (+)-marmésine synthase (10 µM) et

la psoralène-5-monooxygénase (12 µM), les deux autres activités P450 dépendantes

identifiées dans les microsomes de cellules d’Ammi majus élicitées (Hamerski et

Matern, 1988 a et b). Le kcat mesuré, indicateur de la vitesse de la réaction, est du même

ordre de grandeur que ceux déterminés pour les C4H de topinambour (CYP73A1) et de

rue (CYP73A32) et représente une vitesse relativement élevée pour un P450. Il convient

cependant d’être prudent avec les constantes catalytiques que nous avons mesurées dans

la mesure où celles-ci ont été déterminées avec la forme modifiée (CYP71AJ1-NT) de

la psoralène synthase. De précédents travaux ont montré que bien que l’ancre N-

terminale n’intervienne pas dans la spécificité du substrat (Sagara et al., 1993 ;

Sueyoshi et al., 1995), la modification de cette dernière peut néanmoins jouer sur le Km

et le kcat de l’enzyme (Schoch et al., 2004, Wester et al., 2004). Les modifications les

plus importantes ont été rapportées dans les travaux de Schoch et al. (2004), avec la

construction PD73A1 (kcat divisé par 3 comparé à CYP73A1) et par Nedelkina et al.

(1999) avec la chimère CYP73A15/A1 (Km divisé par 3 comparé à CYP73A15),

cependant dans ces deux cas, l’ancre membranaire d’origine a été remplacée par une

séquence de nature radicalement différente (ancre moins hydrophobe pour PD73A1, et

ancre plus courte pour CYP73A15/A1) ce qui pourrait expliquer ces effets prononcés.

Pour CYP71AJ1-NT, l’ancre de substitution présente une hydrophobicité et une

longueur comparables à l’ancre d’origine. Notre construction s’apparente plus à celles

réalisées pour l’expression des CYP2 chez E. Coli dont les ancres ont été remplacées

par celle de CYP17A (Richardson et al., 1995). Or pour toutes ces constructions les

auteurs ont rapporté des modifications mineures des constantes catalytiques. De plus,

dans le cadre de l’étude des C4H chimères présentée dans le chapitre III, nous avons pu

montré que le remplacement de l’ancre membranaire de CYP73A32 par celle de

CYP73A1 ne modifie ni les propriétés catalytiques de l’enzyme pour le cinnamate, ni sa

sensibilité à l’inactivation par le psoralène.


160

Figure IV-22 : Alignement de la séquence protéique de CYP71AJ1 avec CYP73A1 d’Helianthus tuberosus, CYP73A5, CYP98A3, CYP84A1 et CYP75B1 d’Arabidopsis

thaliana tous impliqués dans la synthèse de phénylpropanoïdes, CYP6B1 de Papilio

polyxenes responsable de la dégradation du 8-MOP, CYP2A6 de Homo sapiens

capable de métaboliser la coumarine et inactivé par le 8-MOP et CYP2A1 de Ratus norvegicus

qui métabolise la testostérone. L’alignement a été réalisé à l’aide du logiciel Clustal X. Les résidus prédits au contact de la (+)-marmésine d’après le modèle sont en vert et gras dans la séquence de CYP71AJ1. Les résidus dont l’implication dans la reconnaissance du substrat a été démontrée par mutagenèse dirigée ou par l’étude d’un modèle cristallisé, sont en rouge dans les séquences de CYP73A1, CYP6B1 et CYP2A6 (Schalk et al., 1999 ; Schoch et al., 2003 a. ; Baudry et al., 2003 ; Yano et al., 2005). Les résidus supposés au contact du substrat après modélisation de la structure par homologie et simulation d’ancrage du substrat, sont en vert dans les séquences de CYP73A5, CYP98A3, CYP84A1 et CYP75B1 (Rupasinghe et al., 2003). Les résidus surlignés en jaune représentent les régions SRS déterminées sur les modèles pré-cités, alors que les résidus surlignés en rose représentent les SRS définis par Gotoh pour la famille des CYP 2 (Gotoh, 1992).

71AJ1 100 FADRPYSSVANKIFYNGKDMVFARYTEYWR

73A1 98 FGSRTRNVVFDIFTGKGQDMVFTVYGEHWR 73A5 98 FGSRTRNVVFDIFTGKGQDMVFTVYGEHWR 98A3 91 LADRHRNRSTEAFSRNGQDLIWADYGPHYV 84A1 104 FSNRPATIAISYLTYDRADMAFAHYGPFWR 75B1 99 FASRPPNSGAKHMAYNYQDLVFAPYGHRWR 6B1 99 FADRGVEFSLDGLG----ANIFHADGDRWR 2A6 98 FSGRGEQATFDWVFKGYG—-VVFSNGERAK 2A1 98 FSGRGEQATYNTLFKGYG--VAFSSGERAK

---283 NECIKSLIWDMLGAGTETISTALEWT ---293 EDNVLYIVENINVAAIETTLWSIEWG

---293 EDNVLYIVENINVAAIETTLWSIEWG

---286 EDTIIGLLWDMITAGMDTTAITAEWA

---306 RDNIKAIIMDVMFGGTETVASAIEWA

---289 DTEIKALLLNMFTAGTDTSASTVDWA ---290 DGVISAQMFIFYMAGYETSATTMTYL ---288 LKNLVMTTLNLFIGGTETVSTTLRYG

---286 MKNLVMTTLSLFFAGSETVSSTLRYG

SRS1 SRS4

71AJ1 353 ESMRLYFTAPLLVPGEARQ 73A1 363 ETLRLRMAIPLLVPHMNLH 73A5 363 ETLRLRMAIPLLVPHMNLH 98A3 356 ESFRLHPPTPLMLPHRSNA 84A1 376 ETLRMHPPIPL-LLHETAE 75B1 359 ENFRLHPPTPLSLPHIASE 6B1 361 ETLRKYPVADFTQRNAKTD 2A6 358 EIQRFGDVIPMSLARRVKK 2A1 356 EIQRFSNLAPLGIPRRIIK

---470 DMTAASG-ITLRKKS ---480 DTDEKGGQFSLHILK ---480 DTSEKGGQFSLHILN ---473 DMSENPG-LVTYMRT ---493 DMNDVFG-LTAPKAT ---480 NMEESYG-LTLQRAV ---476 FKFDPMRLFALPKGG ---472 DVSPKHVGFATIPRN ---470 NESPKPLGFTRIIPK

SRS5 SRS6


161

Le développement d’un modèle tridimensionnel de la psoralène synthase fournit

de nouvelles données sur le mécanisme réactionnel de l’enzyme. Les travaux de Stanjek

sur la psoralène synthase d’Ammi majus ont déjà permis de montrer que l’élimination du

groupement 2-hydroxy-2-propyl de la (+)-marmésine est initiée par une attaque de

l’hydrogène syn lié au carbone C3’ du cycle furane (Stanjek et al., 1997 ; Stanjek et al.,

1999). Par ce mécanisme atypique, la formation du psoralène s’accompagne de celle

d’une molécule d’acétone. La simulation d’ancrage de la (+)-marmésine dans le site

actif de CYP71AJ1 est parfaitement en accord avec les conclusions de Stanjek puisqu’il

place le site d’attaque à moins de 4 Å de l’hème. Le modèle met également en avant une

dizaine de résidus du site actif susceptibles d’entrer en interaction avec la (+)-

marmésine. Un alignement de la séquence protéique de CYP71AJ1 avec celles de P450

métabolisant des furocoumarines ou impliqués dans la synthèse de phénylpropanoïdes

permet de vérifier que tous ces résidus sont situés dans les régions SRS définies par

Gotoh pour la famille des CYP2 (Fig IV-22). L’alignement de séquences montre

notamment que, dans le SRS1, R103 s’aligne avec R101 de CYP73A1 dont la mutation

provoque une perte de la stabilité et de l’activité de la protéine (Schoch et al., 2003).

Les résidus A296 et T300 sont des résidus très conservés chez les P450. A306

correspondante dans la séquence de CYP73A1, est importante pour la stabilité de la

protéine ainsi que le positionnement du substrat (Schalk et al., 1999). Les résidus

Thréonine s’alignant avec la T300 de CYP71AJ1 sont impliqués dans l’activation de

l’oxygène. Il est important de noter que d’après notre modèle la T300 pourrait participer

au positionnement de la (+)-marmésine en établissant un liaison hydrogène avec

l’hydroxyl du groupement hydroxy-propyl. Les autres résidus que nous avons mis en

évidence au voisinage de la (+)-marmésine (M119, V120, T360, L364, V365, P366 et

T478) s’alignent tous avec des résidus proposés au contact du substrat d’après les

modèles de CYP73A5, CYP98A3, CYP75B1 et CYP84A1, quatre P450 métabolisant

des phénylpropanoïdes. L’importance réelle de ces 10 résidus pour l’activité psoralène

synthase pourra être confirmée par un travail de mutagenèse dirigée.


162

3.4 Comportement de la psoralène synthase vis à vis de l’inhibition par les furocoumarines

Les tests d’inhibition de l’activité psoralène synthase ont révélé une très faible

sensibilité de l’enzyme vis à vis des furocoumarines linéaires et angulaires les plus

courantes. Bien que les furocoumarines aient été décrites comme des inactivateurs

autocatalytiques très efficaces de certains P450 de mammifères, d’insectes et de plantes

(Fouin-Fortunet et al., 1984 ; Koenigs et al., 1997 ; Ho et al., 2001 ; Neal et Wu, 1994 ;

Gravot et al., 2004), nos résultats indiquent que CYP71AJ1 n’est pas soumis à ce type

d’inactivation. Ce résultat peut paraître logique car, par son caractère irréversible,

l’inactivation autocatalytique s’inscrit mal dans un mécanisme de régulation fin de

l’activité par les produits en aval. CYP71AJ1 est le deuxième exemple avec les C4H de

rue, de persil et d’Ammi majus, d’un P450 de plantes à furocoumarines résistant

fortement ou totalement à l’inactivation autocatalytique de ces dernières (Gravot et al.,

2004, Hubner et al., 2003). En dépit de la résistance à l’inactivation autocatalytique,

nous avons pu mettre en évidence un processus plus classique de régulation de l’activité

psoralène synthase par inhibition compétitive avec le psoralène. On peut s’interroger

quant à la signification physiologique de cette inhibition déterminée in vitro. La

sensibilité de l’enzyme au psoralène paraît en effet assez faible (Ki estimé à 35 µM) en

comparaison de son affinité pour la (+)-marmésine (2 µM). Par ailleurs, bien que les

concentrations en furocoumarines intracellulaires soient difficiles à évaluer, il paraît peu

probable que celles-ci soient de l’ordre de la dizaine de micromolaire. Chez Ammi

majus, la synthèse des furocoumarines est inductible, et paraît essentiellement contrôlée

au niveau transcriptionnel, de plus certains P450 de cette voie comme la psoralène

synthase et la (+)-marmésine synthase ont la particularité d’être extrêmement labiles (U.

Matern, communication personnelle). Dans ces conditions, une régulation fine de la

synthèse des furocoumarines par feed back pourrait ne pas être essentielle. Il serait par

contre intéressant d’étudier le comportement vis à vis des furocoumarines, d’une

psoralène synthase issue d’une plante comme Ruta graveolens qui synthétise ces

molécules de façon constitutive.


163

3.5 Spécificité de CYP71AJ1 dans la voie de synthèse des furocoumarines linéaires

Les furocoumarines angulaires sont des molécules moins courantes et ont fait

l’objet de moins d’attention que leurs homologues linéaires à partir desquels elles sont

supposées avoir évolué (Berenbaum et Zangerl, 1998). La divergence entre formes

linéaires et angulaires aurait lieu lors de l’étape de prénylation de l’umbelliférone, le

prényl étant ajouté respectivement sur le C6 ou le C8. La voie de synthèse des

furocoumarines angulaires serait alors prise en charge par des enzymes dérivant (et donc

très fortement homologues) de celles menant aux formes linéaires. Bien que le

mécanisme réactionnel de l’angélicine synthase ait été démontré comme identique à

celui de la psoralène synthase (Stanjek et al., 1998), nos tests de métabolisation de la

(+)-columbianetine par CYP71AJ1 montrent que cette enzyme ne possède pas d’activité

angélicine synthase. Nos mesures in vitro sont confirmées par l’étude in silico de

l’ancrage de la (+)-columbianetine dans le site actif de CYP71AJ1. La comparaison du

positionnement de la (+)-marmésine et de la (+)-columbianetine montre que le noyau

coumarine est sensiblement orienté de la même façon dans les deux cas. Cette

orientation place le site d’attaque de la (+)-marmésine proche de l’hème, alors que dans

le cas de la (+)-columbianetine, à cause de l’angle du noyau furane, ce site se trouve

éloigné de l’hème. Il est courant dans l’étude des P450 de modifier la spécificité ou la

régio-sélectivité d’une enzyme en substituant seulement un ou deux acides aminés

(Lindberg et Negishi, 1989). La similarité des mécanismes réactionnels ainsi que

l’origine évolutive de l’angélicine synthase font supposer que les deux enzymes

diffèrent par seulement quelques résidus sans doute au niveau du site actif. Au vu des

modèles d’ancrage ces modifications pourraient se localiser dans la zone au contact du

noyau coumarine (R103, M119, V120, V365, P366) et permettre de suffisamment

réorienter la (+)-columbianetine pour favoriser sa métabolisation. Il reste cependant

difficile de cibler un résidu précis avec le modèle.

4 Conclusion

En dépit de leur importance dans les processus de défense des plantes vis à vis

des prédateurs, les connaissances sur la voie de synthèse des furocoumarines linéaires


164

restent encore incomplètes, en particulier au niveau moléculaire. Les résultats présentés

dans ce chapitre décrivent l’identification et la caractérisation fonctionnelle de la

psoralène synthase (CYP71AJ1) d’Ammi majus, le premier P450 cloné et caractérisé,

spécifique de la voie des furocoumarines. L’expression et la caractérisation de cette

enzyme extrêmement instable n’ont pu être réalisées qu’après remplacement de l’ancre

membranaire originale par celle de CYP73A1. CYP71AJ1 présente une spécificité pour

la (+)-marmésine (Km = 2 ± 0,3 µM) qu’il convertit efficacement (kcat = 150 ± 4 min-1)

en psoralène. Il est supposé que la voie de synthèse menant aux furocoumarines

angulaires ait dérivé de celle des furocoumarines linéaires et qu’en particulier la

psoralène synthase et l’angélicine synthase soient des enzymes très proches. Les tests de

métabolisation réalisés avec la (+)-columbianetine, montrent que CYP71AJ1 ne possède

pas d’activité angélicine synthase. La construction d’un modèle 3D de CYP71AJ1 nous

a permis d’une part, d’identifier des résidus potentiellement responsables de la

métabolisation de la (+)-marmésine et d’autre part, de fournir des informations

expliquant l’absence de métabolisation de la (+)-columbianetine. Par ailleurs les tests

d’inhibition suicide et compétitive avec différentes furocoumarines montrent que

CYP71AJ1 n’est pas ou très peu sensible à ces molécules au même titre que les C4H de

rue, de persil et d’Ammi majus.

Chapitre V

Recherche de P450 de la

voie de biosynthèse des

furocoumarines : clonage de

P450 candidats à partir de

tissus élicités de Ruta

graveolens

165

Chapitre V : Recherche de P450 de la voie de biosynthèse des furocoumarines :

clonage de P450 candidats à partir de tissus élicités de Ruta graveolens

1 Introduction

Au cours de la synthèse des phénylpropanoïdes, les acides cinnamiques

subissent des hydroxylations en différentes positions du noyau phénol. En plus de

l’hydroxylation en position 4 du cinnamate, celles en position 3’ et 5 du p-coumarate et

du férulate ont été démontrées comme étant P450 dépendantes (Teutsch et al. ,1993 ;

Schoch et al., 2001 ; Meyer et al., 1996). L’hydroxylation en position 2 du cinnamate,

du p-coumarate ainsi que du férulate permet de s’orienter respectivement vers la voie

des coumarines et des furocoumarines (Fig. V-1). En dépit de son importance dans les

mécanismes de défense d’une grande variété de plantes (Fabacées, Lamiacées,

Lauracées, Apiacées et Rutacées notamment), cette réaction a été relativement peu

étudiée. Les premiers travaux relatant une activité 2-hydroxylase ont été publiés par

Kindl en 1971 chez Hydrangea macrophylla (Kindl, 1971). L’auteur a mis en évidence

une enzyme dans la fraction chloroplastique catalysant la conversion du p-coumarate

en umbelliférone et du férulate en scopolétine. Ces travaux furent rapidement suivis par

ceux de l’équipe de Pr. Conn qui rapporta l’activité de 2-hydroxylation du cinnamate

également dans les chloroplastes chez Melilotus alba (Gestetner et Conn, 1974). Cette

dernière étude reste cependant sujette à débat d’une part, car les auteurs n’ont jamais pu

renouveler leurs observations et d’autres part, car les techniques analytiques de l’époque

ne permettaient vraisemblablement pas de séparer les différents acides cinnamiques

(Conn, 1984 ; U. Matern, communication personnelle). Bien que ces deux travaux

n’aient pas permis de statuer sur la nature exacte des enzymes catalysant cette étape de

2-hydroxylation, on peut supposer, au regard des hydroxylations du noyau phénolique

réalisées par la C4H (CYP73), la C3’H (CYP98) et la F5H (CYP84), qu’elle est

également contrôlée par un P450. Partant de ce postulat, une question importante est de

Chapitre V : Recherche de P450 de la voie des furocoumarines chez Ruta graveolens

166

Figure V-2 : Arbre phylogénétique des P450 végétaux de type A (Schoch et al. 2001) Pour des raisons pratiques, l’arbre a été construit en utilisant les séquences consensus représentatives de chaque famille, à l’exception de CYP98 pour laquelle tous les membres disponibles lors de la construction de l'arbre sont représentés. Les familles métabolisant des acides phénoliques ou des acides aminés sont surlignés.

Figure V-1 : Représentation des hydroxylations des acides cinnamiques catalysées par la C4H, la C3’H ainsi que des activités d’ortho-hydroxylation catalysées par la C2H et la F2H

Coumarines

OH

O-OO-O

CoumarinesFurocoumarines etcoumarines hydroxylées

OH

O

HO

OH

OOShik

C3’H

C2H

Cinnamate p-coumarate

o-coumarate 2-4 dihydroxycinnamate

p-coumaroylshikimate

Caffeoylshikimate

OH

O-O

HO

O-O

HO

O

OCH3

OH

O

O

OCH3

OH

O

HO

C4H

OShik

F2H

Férulate

2’-hydroxyférulate


167

savoir à quelle famille de P450 pourrait appartenir la C2H. La découverte récente de o-

coumarate et de scopoline (une coumarine glycosylée) chez Arabidopsis, plante dont

tous les P450 sont référencés, montre que la C2H appartiendrait à une famille déjà

répertoriée (Walker et al., 2003 ; Rohde et al., 2004 ; Bednarek et al., 2005 ; Kai et al.,

2006). En se basant sur la similarité des substrats, il est raisonnable d’imaginer que la

C2H puisse être un CYP73 ou un CYP98. Plusieurs exemples montrent que, chez les

P450, la modification d’un à deux acides aminés peut modifier la régio-spécificité d’une

réaction (Hsu et al., 1993 ; Schalk et Croteau, 2000 ; Domanski et Halpert, 2001). Les

travaux de Schalk et Croteau ont ainsi montré que la substitution "F363I" chez la

limonène-6-hydroxylase (CYP71D18) modifie la régio-spécificité de l’enzyme qui

devient alors une C3 hydroxylase. Par ailleurs, l’étude fonctionnelle de CYP98 issus de

diverses plantes a mis en évidence que tous catalysent l’hydroxylation en 3’ avec

comme substrat préférentiel le p-coumaroyl shikimate mais qu’il existe une certaine

plasticité dans la métabolisation de substrats alternatifs spécifiques à chaque plante

(Morant, 2004). CYP98A13, par exemple, issu du basilic producteur d’acide

rosmarinique, est capable d’hydroxyler le p-coumaroyl 4’-hydroxyphellylactate

spécifique de la voie de l’acide rosmarinique (Gang et al., 2002).

Un des objectifs du laboratoire est d’isoler les séquences codantes des P450

impliqués dans la voie de biosynthèse des furocoumarines chez Ruta graveolens.

L’étape catalysée par la C2H est un objectif majeur, dans la mesure où c’est elle qui

oriente vers la voie des furocoumarines. Une première campagne de travaux à permis

d’isoler un CYP73 (CYP73A32), codant une C4H particulièrement résistante à

l’inactivation par les furocoumarines, mais ne catalysant pas l’étape d’ortho-

hydroxylation (Gravot et al., 2004). Dans le cadre d’une étude débutée tardivement en

cours de thèse, nous nous sommes intéressés à l’isolement de séquences de CYP98 et

également de CYP78, une famille de P450 phylogénétiquement proche des CYP73 et

CYP98 (Fig. V-2) et dont la fonction physiologique n’est pas encore déterminée. Les

résultats présentés dans ce chapitre décrivent d’une part la recherche de séquences

partielles de CYP78 et CYP98 chez Ruta graveolens en utilisant la méthode CODEHOP

(Rose et al., 1998 ; Morant et al., 2002) et d’autre part la construction et le criblage

d’une banque de feuilles de rue élicitée pour la production de furocoumarines.


168

Figure V-3 : Exemple d’une amorce CODEHOP définie dans une région consensus de la méthyl transférase MET1 d’Arabidopsis thaliana La dégénérescence en 3’ est réalisée dans la région protéique la plus conservée. L’ancre (clamp) en 5’ représente la séquence nucléotidique la plus probable basée sur le biais de codons. D’après Rose et al.( 2003)

Figure V-4 : Amplification PCR avec des amorces CODEHOP A) Lors des premiers cycles de la PCR « touch-down », les amorces hautement

spécifiques dans la région 3’ vont s’hybrider. B) Après quelques cycles d’amplifications, l’ancre 5’ permet une hybridation

maximale entre les amplifiats et les amorces encore présentes dans le mélange réactionnel. D’après Rose et al. (2003)

A

B


169

2 Résultats

2.1 Recherche de fragments de gènes codant des P450 chez Ruta graveolens à l’aide de la stratégie CODEHOP

Face à la difficulté de purifier les P450 à partir des tissus végétaux, de

nombreuses méthodes de clonage se sont développées pour l’isolement de nouvelles

séquences. La méthode la plus courante fait appel à l’utilisation d’amorces dégénérées

dans les régions consensus (région du méandre , site de fixation de l’hème…), ce qui a

permis d’isoler de nombreux P450 et d’identifier de nouvelles familles (Meijer et al.,

1993 ; Akashi et al., 1997 ; Ralston et al., 2001). Bien qu’efficace dans certains cas,

cette approche s’est avérée assez limitée pour l’amplification de gènes faiblement

exprimés car (i) dans le mélange d’amorces dégénérées, chaque amorce spécifique est

présente à faible concentration, ce qui limite le nombre de cycles d’amplification de la

séquence ciblée, (ii) la présence de nombreuses amorces non spécifiques dans le

mélange peut aboutir à des amplifications artéfactuelles et (iii) la petite taille des

amorces utilisées génère de nombreux faux positifs. La méthode dite de CODEHOP

(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers) a été établie pour augmenter

la spécificité des amplifications et par conséquent favoriser l’amplification de séquences

faiblement exprimées (Rose et al., 1998 ; Rose et al., 2003). La particularité de cette

méthode tient à la détermination des amorces. Celles-ci sont définies dans les régions

conservées d’une famille de protéines (Fig. V-3). Les 3 à 4 codons en 3’ de l’amorce

sont dégénérés tandis que le reste en 5’ correspond à la séquence nucléotidique la plus

probable (basée sur l’usage du biais de codons) correspondant à la séquence protéique

conservée. La partie 5’ non dégénérée permet d’avoir des amorces plus longues, donc

plus spécifiques et par conséquent autorise des températures d’hybridation plus hautes.

L’utilisation d’amorces CODEHOP est combinée à une PCR dite en « touch-down » :

dans un premier temps la température d’hybridation est diminuée d’un degré à chaque

cycle entre 70 °C et 50 °C. Ces premiers cycles permettent d’amplifier les séquences

présentant la plus forte spécificité avec la partie 3’ de l’amorce (Fig. V-4). En raison de

la séquence conservée en 5’, toutes les amorces du mélange peuvent participer aux


170

78-1 dir

78-2 dir

CYP78A1 341-EMVFRGT DTTALLTEWC MAELVRHPAV QARVRAEVDA AVGA--G-GC PTDADVARMP YLQAVVKETL RAHPPGPLLS WARL CYP78A2 226-EMIFRGT DTVAILLEWT LARMVLHPDI QSKAQVEIDS VV-DS--SRP VLDSDIQRLP YLQSIVKETL RMHPPGPLLS WARL CYP78A3 319-EMIFRGT DTVAVLIEWI LARMALHPHV QSKVQEELDA VVGKA---RA VAEDDVAVMT YLPAVVKEVL RLHPPGPLLS WARL CYP78A4 342-EMIFRGT DTTALLTEWT MAELVLHPEA QKKAQAELDA VVGH--D-RS VKDSDIPKLP YIQAVVKEAL RMHPPGPLLS WARL CYP78A5 314-EMIFRGT DTVAILVEWV LARMVLHQDI QDKLYREIAS ATSNN--IRS LSDSDIPKLP YLQAIVKETL RLHPPGPLLS WARL CYP78A6 325-EMIFRGT DTVAVLIEWI LARMVLHPDM QSTVQNELDQ VVGKS---RA LDESDLASLP YLTAVVKEVL RLHPPGPLLS WARL CYP78A7 333-EMIFRGT DTTALLTEWT MAELVLNPNV QTKLRDEILT AVGDGAD-GD VADADLAKLP YLNAVVKETL RLHPPGPLLS WARL CYP78A8 328-EMIFRGT DTVAVLVEWV LARIVMHPKV QLTVHDELDR VVGRS---RT VDESDLPSLT YLTAMIKEVL RLHPPGPLLS WARL CYP78A9 326-EMIFRGT DTVAVLIEWI LARMVLHPDI QSTVHNELDQ IVGRS---RA VEESDVVSLV YLTAVVKEVL RLHPPGPLLS WARL CYP78A10335-EMIFRGT DTVAILLEWI LARMVLHPDI QAKAQAEIDC IVGDS--GRQ VTDSDLPKLP YVRAIVKETL RMHPPGPLLS WARL CYP78A11346-EMIFRGT DTTALVTEWC MAEVVRNPAV QARLRAEVDA AVGG--D-GC PSDGDVARMP YLQAVVKETL RAHPPGPLLS WARL CYP98A1 298-DMITAGM DTTVISVEWA MAELVRNPRV QKKLQEELDR VVGRD---RV MLETDFQNLP YLQAVVKESL RLHPPTPLML PHKA CYP98A2 296-DMITAGM DTTAISVEWA MAELIRNPRV QQKVQEELDR VIGLE---RV MTEADFSNLP YLQCVTKEAM RLHPPTPLML PHRA CYP98A3 295-DMITAGM DTTAITAEWA MAEMIKNPRV QQKVQEEFDR VVGLD---RI LTEADFSRLP YLQCVVKESF RLHPPTPLML PHRS CYP98A6 292-DMIAAGM DTATISTEWA MAELVRNPRV QRKAQEELDR VVGPD---RI MTEADVP--- --KSI--------------- ----- CYP98A7 293-DMITAGT DTTVISVEWA MAELLRNPRV QEKLQEELDR VVGRD---RV LSETDFPNLP YLQAVVKESL RLHPPTPLML PHRA CYP98A8 288-NMLTAGA DTTAVVIEWA MAEMIKCPTV QEKAQQELDS VVGSE---RL MTESDIPILP YLQCVVKEAL RLHPSTPLML PHKA CYP98A9 282-NMLTAGA DTTAITIEWA MAEMIRCPTV KEKVQDELDS VVGSG---RL MSDADIPKLP FLQCVLKEAL RLHPPTPLML PHKA CYP98A13 ---DMITAGM DTTAISVEWA MAELIKNPRV QQKAQEELDR VIGYE---RV MTELDFSNLP YLQCVAKEAL RLHPPTPLML PHRS CYP98A19299-DMITAGM DTTAITVEWA MAELVRNPRI QQKAQEEIDR VVGRD---RV MNETDFPHLP YLQCITKEAL RLHPPTPLML PHKA CYP98A20296-DMISAGM VTTTITVEWA MAELVRNPRV QQKVQEELDR VVGSD---RV MTEADIPNLP YLQCVTKECF RMHPPTPLML PHKA

98-1 dir 98-78 rev

CYP78A1 ATADVPLCNGMVVPAG TTAMVNMWAI THDAAVWADP DAFAPERFLP SEGGADVDVR GVDLRLAPFG AGRRVCPGKN-494 CYP78A2 AIHDVPVD-GHMIPAG TTAMVNMWAI THDECNWAEP NKFNPDRFID EDVN----IL GSDLRLAPFG SGKRVCPGKT-364 CYP78A3 SINDTTID-GYHVPAG TTAMVNTWAI CRDPHVWKDP LEFMPERFVT AGGDAEFSIL GSDPRLAPFG SGRRACPGKT-471 CYP78A4 STEDVNMGDGMCVPAG TTAMVNMWSI THDPNIWESP YEFRPERFVV FEGGEEVDVR GNDLRLAPFG AGRRVCPGKA-495 CYP78A5 AIHDVHVG-PNLVPAG TIAMVNMWSI THNAKIWTDP EAFMPERFIS EDVS----IM GSDLRLAPFG SGRRVCPGKA-463 CYP78A6 AITDTIVD-GRLVPAG TTAMVNMWAV SHDPHVWVDP LEFKPERFVA KEGEVEFSVL GSDLRLAPFG SGRRICPGKN-478 CYP78A7 STSDVQLSNGMVIPKG TTAMVNMWAI THDQTVWSDP LKFDPERFT- --GNADMDIR GGDLRLAPFG AGRRVCPGKN-485 CYP78A8 SITDTSVD-GYHVPAG TTAMVNMWAI ARDPHVWEDP LEFKPERFVA KEGEAEFSVF GSDLRLAPFG SGKRVCPGKN-480 CYP78A9 AITDTIID-GRRVPAG TTAMVNMWAI AHDPHVWENP LEFKPERFVA KEGEVEFSVL GSDLRLAPFG SGRRVCPGKN-478 CYP78A10 SIHDTQIG-THFIPAG TTAMVNMWAI THDEKVWPEA HEYKPERFLG AQESNNFPIM GSDLRLAPFG AGRRVCPGKS-487 CYP78A11 ATADVGLANGMVVPAG TTAMVNMWAI THDGEVWADP EAFAPERFIP SEGGADVDVR GGDLRLAPFG AGRRVCPGKN-499 CYP98A1 STNVKIGG--YDIPKG ANVMVNVWAV ARDPKVWSNP LEYRPERFL- ---EENIDIK GSDFRVLPFG AGRRVCPGAQ-445 CYP98A2 NANVKVGG--YDIPKG SNVHVNVWAV ARDPAVWKDP LEFRPERFL- ---EEDVDMK GHDFRLLPFG SGRRVCPGAQ-443 CYP98A3 NADVKIGG--YDIPKG SNVHVNVWAV ARDPAVWKNP FEFRPERFL- ---EEDVDMK GHDFRLLPFG AGRRVCPGAQ-442 CYP98A6 ------------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- CYP98A7 SASVKIAG--YDIPKG ANVVVNVWAV ARDPKVWDSP LEFRPERFL- ---RENIDIK GADFRVLPFG AGRRVCPGAQ-440 CYP98A8 SETVWVGG--YKVPKG ATVYVNVQAI GRDPANWINP YEFRPERFL- ---QEETDVK GRDFRVLPFG SGRRMCPAAQ-435 CYP98A9 SESVQVGG--YKVPKG ATVYVNVQAI ARDPANWSNP DEFRPERFL- ---VEETDVK GQDFRVLPFG SGRRVCPAAQ-429 CYP98A13 NSNVKIGG--YDIPKG SNVHVNVWAV ARDPAVWKNP CEFRPERFL- ---EEDVDMK GHDFRLLPFG AGRRVCPGAQ CYP98A19 TQNVKIGG--YDIPKG SNVHVNVWAI ARDPAVWKDP VTFRPERFL- ---EEDVDIK GHDYRLLPFG AGRRICPGAQ-447 CYP98A20 STNVKIGG--YDIPKG ATVSVNVWAL ARDPAVWKNP LEFRPERFQ- ---EEDIDMK GTDYRLLPFG SGRRICPGAQ-442

Figure V-5 : Alignement des séquences protéiques des CYP78 et 98 disponibles pour la détermination des amorces CODEHOP Seule une partie de la région C-terminale est représentée. Les zones surlignées correspondent à des régions identiques ou très fortement homologues, à partir desquelles vont être définies les amorces CODEHOP.

200 pb

500 pb

A

B C

Figure V-6 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR obtenus avec les amorces CODEHOP sur de l'ADN génomique de rue Les PCR ont été réalisées avec les couples d’amorces 98-1 dir/98-78 rev (A) ; 78-1 dir/98-78 rev (B) et 78-2 dir/98-78 rev (C)


171

cycles d’amplification suivants. Il en résulte une amplification plus spécifique et plus

importante des séquences faiblement exprimées. En contrepartie, cette technique

nécessite de cibler la famille de P450 que l’on désire amplifier. Cette méthode a déjà été

utilisée avec succès pour cloner des orthologues de l’ADN méthyltranférase MET1

d’Arabidopsis thaliana chez le brocoli, le rhododendron, l’orpin et le chêne (Rose et al.,

1998) ainsi que des orthologues de CYP98 chez le blé et plusieurs plantes vasculaires

(Morant et al., 2002). La recherche d’orthologues de CYP78 et CYP98 chez la rue a

donc été conduite en utilisant cette approche.

2.1.1 Choix des amorces CODEHOP

Pour définir les amorces CODEHOP, les séquences protéiques des CYP78 et

CYP98 disponibles au début de ce travail ont été alignées à l’aide du programme

ClustalX (Fig V-5). L’alignement met en évidence dans la partie C-terminale, deux

blocs de 8 résidus conservés chez CYP78 et un bloc de 7 résidus pour les CYP98. Une

amorce sens a été créée pour chacune de ces régions alors qu’une amorce antisens est

définie dans la région consensus PFG présente chez tous les P450. La partie 3’ de

chaque amorce est dégénérée de façon à représenter l’ensemble des combinaisons

possibles codant trois à quatre résidus conservés. La partie 5’ des amorces est, elle,

définie en se basant sur le biais de codons de Citrus sinensis, phylogénétiquement

proche de Ruta graveolens, et pour lequel suffisamment de gènes ont été décrits pour

avoir une représentation statistique de l’emploi des différents codons

(http://www.kazusa.or.jp/codon/). Les quatre amorces CODEHOP sont représentées

dans le tableau V-1 ci-dessous :

Amorces78-1 dir78-2 dir98-1 dir

98-78 rev

Séquences5'-ATG ATT TTT AGG GGN ACN GAY ACN-3'5'-CCT GGC CCT CTT CTT WSN TGG GCN-3'5'-GAG TGG GCT ATG GCT GAR HTN RT-3'

5'-CCT CCT GCC NGC NCC RAA NGG-3'

Tableau V-1 : Amorces CODEHOP définies à partir des familles CYP78 et CYP98 R = G ou A ; Y = T ou C ;W = A ou T ; H =A, T ou C ; N = A, T, G ou C

http://www.kazusa.or.jp/codon/


172

2.1.2 PCR CODEHOP sur ADN génomique

La recherche de séquences partielles de P450 est réalisée par PCR à l’aide des

amorces CODEHOP sur de l’ADN génomique de Ruta graveolens préalablement extrait à

l’aide du kit Dneasy (Qiagen). L’utilisation de cette matrice nous permet d’avoir accès à

toutes les séquences de P450 de la plante indépendamment de leurs conditions

d’expression. Les couples d’amorces utilisés sont 98-1 dir / 98-78 rev, 78-1 dir / 98-78 rev

et 78-2 dir / 98-78 rev qui devraient générer respectivement des fragments de 420 pb,

460 pb et 255 pb. La PCR est réalisée sur l’ADN génomique à l’aide de la « Expand High

Fidelity Polymerase » (Roche) possédant une activité correctrice (proof-reading), dans

25 µl de milieu réactionnel contenant 0,4 µM de chaque amorce et 2,5 mM de dNTP.

Afin d’améliorer la spécificité de l’amplification, la PCR est conduite en touch-down avec

une étape de dénaturation de 3 min à 94 °C, suivie de 20 cycles composés d’1 min de

dénaturation à 94 °C, 2 min d’hybridation à 70 °C lors du premier cycle, minorée ensuite

d’un degré à chaque cycle et 1 min d’élongation à 72 °C. La PCR est complétée par 20

autres cycles avec une température d’hybridation maintenue à 58 °C puis est terminée par

5 min à 72 °C. Les produits sont séparés sur gel d’agarose 2 % (Fig. V-6). Pour chaque

couple d’amorces utilisé, un produit PCR correspondant à la taille attendue est obtenu.

Après purification sur gel, ces produits sont clonés dans le vecteur pGEM-T (Promega).

Quatre plasmides issus de chaque clonage sont ensuite séquencés et les séquences

obtenues sont comparées avec les P450 déjà identifiés dans les bases de données à l’aide

du programme Blastx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Le tableau V-2 indique le poucentage d’homologie de chaque clone séquencé avec

le P450 le plus proche. Les PCR réalisées sur l’ADN génomique de Ruta graveolens à

l’aide des trois couples d’amorces définis précédemment nous a permis d’identifier 7

séquences partielles de P450 (cf. Annexes). Deux de ces séquences correspondent aux

familles CYP78 et CYP98 recherchées initialement (dénommées ici 78-1 et 98-1 pour la

suite du travail). L’utilisation des amorces dégénérées engendre tout de même une

aspécificité qui se traduit ici par l’isolement de 5 séquences correspondant à 3 autres

familles : deux CYP71 (71-1 et 71-2), un CYP75 (75-1) et deux CYP89 (89-1 et 89-2). La

taille des séquences isolées est relativement faible et correspond suivant les cas à 1/4 ou

1/5 des séquences entières.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/


173

2.2 Elicitation de la production de furocoumarines dans les feuilles de Ruta graveolens

Contrairement au clonage des fragments de P450 qui a été mené à partir de

d’ADN génomique de rue, la recherche des séquences entières doit être réalisée à partir

d’une préparation d’ARNm ou d’une banque d’ADNc pour s’affranchir de la présence

d’introns et surtout pour cibler les P450 impliqués dans une voie de biosynthèse donnée.

Or devant le nombre de gènes de P450 estimé dans le génome d’une plante (272 gènes

pour un petit génome de 125 Mb comme celui d'Arabidopsis), il est souvent fastidieux

de trouver ceux impliqués dans une voie de biosynthèse d’autant plus s’ils sont

faiblement exprimés. Il est donc essentiel de disposer d’un matériel élicité pour la voie

recherchée, afin d’augmenter la représentativité des transcrits spécifiques. Afin de

bénéficier d’un tel matériel, un travail préliminaire d’élicitation de la production des

furocoumarines par des plantes de rue a été réalisé. Cette plante présente l’inconvénient

de réaliser une synthèse de furocoumarine constitutive, et très faiblement élicitable,

contrairement à des plantes comme le persil ou Ammi majus. Les travaux de Zobel

Tableau V-2 : Informations sur les séquences de P450 clonées chez Ruta graveolens Ce tableau renseigne sur la taille des séquences nucléotidiques et le pourcentage d’homologie avec le P450 le plus proche (basée sur la séquence protéique déduite). Le détail des séquences des clones de Ruta graveolens est disponible dans la partie annexes.

Produit PCR Clone Dénomination Homologie (%) Longueur

1 89-1 CYP89A2 (65 %) 456 pb

2 78-1 CYP78A10(75 %) 225 pb

3 89-2 CYP89A5 (62 %) 458 pb

4 71-1 CYP71A9 (57 %) 431 pb

1 89-1 CYP89 A2 (65 %) 225 pb

2 78-1 CYP78A10 (75 %) 229 pb

3 78-1 CYP78A10 (75 %) 227 pb

1 75-1 CYP75A1 (86 %) 394 pb

2 98-1 CYP98A2 (89 %) 384 pb

3 71-2 CYP71A10 (66 %) 384 pb

4 89-1 CYP98A2 (89 %) 389 pb

78-1/98-78

78-2/98-78

98-1/98_78


174

Figure V-7 : Photographie du système d’irradiation de Ruta graveolens

pour éliciter la synthèse de furocoumarines La plante, placée à l’obscurité, est irradiée par une lampe UV ( = 312 nm)

distante de 30 cm pendant 24 H.

0

5 000 000

10 000 000

15 000 000

20 000 000

25 000 000

30 000 000

35 000 000

40 000 000

C0 C7 C24 UV 0 UV 7 UV 24

Plantes traitées

Ten

eur

en fu

roco

umar

ines

(uni

tés

arbi

trai

res)

Bergaptène/mg MS

Xanthotoxine/mg MS

Psoralène/mg MS

Don

nées

man

quan

tes

Figure V-8 : Effet du stress UV sur la quantité en furocoumarines dans les feuilles de Ruta graveolens C = plantes contrôles ; UV = plantes exposées aux UV

Figure V-9 : Effet de l’exposition aux UV sur l’expression des P450 clonés Electrophorèse sur gel d’agarose des produits PCR réalisés sur des ADNc de feuilles de plantes traités aux UV à t 0 (A) et à t 24 H (B).

89-1 78-1 71-1 71-1 75-1 75-1 78-1 89-1 98-1 98-1

A B


175

et Brown en 1993, ont cependant montré une augmentation notable de la concentration

en furocoumarines (d’un facteur 2 à 7) dans des plantes de rue soumises à un

rayonnement UV ( =

366 nm) (Zobel et Brown, 1993). Dans ces conditions, les

furocoumarines s’accumulent à la surface des feuilles. En tant que molécules

aromatiques, elles constitueraient, au même titre que les flavonoïdes et les sinapoyl

esters, un filtre de protection efficace pour limiter les dégâts engendrés par les UV. La

réponse des plantes à un stress UV implique une activation transcriptionnelle des gènes

de la voie des phénylpropanoïdes déjà bien décrite chez Arabidopsis (Jin et al., 2000).

Dans notre démarche de clonage et d’identification de gènes de P450 de la voie des

furocoumarines, la disponibilité d’un tissu élicité s’avère intéressante. C’est pourquoi,

nous avons défini un protocole d’exposition de plantes de rue aux UV, puis nous avons

suivi les effets sur la teneur en furocoumarines et l’expression des P450 isolés

précédemment.

2.2.1 Impact des UV sur la quantité en furocoumarines

Le stress UV a été réalisé en plaçant une plante sous exposition ( =

312 nm) pendant

24 H (Fig. V-7). Une à deux feuilles sont prélevées sur la plante stressée ainsi que sur

une plante contrôle non soumise aux UV aux temps t 0, t 7 H et t 24 H. Une partie des

feuilles prélevées est utilisée pour doser les furocoumarines. Pour cela, les feuilles sont

lyophylisées, puis broyées dans 1,5 ml d’éthanol 50 % (v / v). Le broyat est centrifugé à

10000 g pendant 20 min puis le surnageant est filtré à 0,25 µm (Filtre Minisart). Les

quantités en psoralène, 8-MOP et 5-MOP sont dosées par HPLC sur 50 µl de

surnageant. L’évolution des teneurs en chacune des furocoumarines rapportées à la

masse en matière sèche est représentée sur la figure V-8. Dans le cadre d'expérience

préliminaires et pour des raisons de manque de temps et de quantité de matériel végétal

limitante, le dosage n’a été réalisé qu’une seule fois. De plus, les données pour les

plantes traitées aux UV au temps t 0 sont indisponibles. Malgré tout, les résultats à

disposition montrent que la quantité en furocoumarines augmente en fonction du temps

chez la plante traitée aux UV et, de façon plus surprenante, également chez la plante

témoin non exposée. L’évolution est cependant plus marquée dans le cas de l’exposition

aux UV avec une augmentation de 50 % entre les points 7 H et 24 H, alors que dans le

même temps la quantité de furocoumarines n’augmente que de 35 % pour le contrôle. A


176

l’issue des 24 H d’exposition, la quantité de furocoumarines retrouvée dans les feuilles

de la plante traitée représente environ 1,7 fois celle de la plante témoin. La plante traitée

présente, par ailleurs, une proportion en 5-MOP plus importante que la plante témoin

(22 % contre 13 % à 24 H).

2.2.2 Impact des UV sur l’expression des P450 isolés

L’ARN total des feuilles prélevées sur la plante traitée aux UV aux temps t 0 et

t 24 H, est extrait à l’aide du kit « Rneasy » (Qiagen). Après avoir vérifié la qualité de

l’extraction et dosé les ARN sur gel, ces derniers sont utilisés dans une réaction de reverse

transcription suivie d'une PCR. Cette PCR (5 min à 95 °C suivies de 20 cycles de 30 s à

95 °C, 15 s à 68 °C et 30 s à 72 °C, puis 10 min à 72 °C) est réalisée sur les deux

échantillons d’ADNc pour amplifier les séquences partielles de 71-1, 75-1, 78-1, 89-1 et 98-

1 à l’aide d’amorces spécifiques décrites dans le tableau V-3. Les produits PCR sont

analysés sur gel d’agarose 2 % (Fig. V-9). 71-1 et 98-1 sont amplifiés dans les deux

échantillons. Au contraire, 75-1, 78-1 et 89-1 sont présents uniquement dans l’échantillon

traité 24 H aux UV.

Bien que ces résultats soient issus d’expériences préliminaires, nous avons pu

montrer (i) une tendance de l’exposition UV à induire la synthèse de furocoumarines et

(ii) que cette accumulation de furocoumarines dans la plante s’accompagne visiblement

d’une induction de l’expression de trois des P450 partiellement clonés. Ce dernier

résultat n’a été obtenu que par une approche de RT-PCR classique. Il devra être être

confirmé par RT-PCR quantitative. Ces résultats préliminaires nous encouragent

Tableau V-3 : Amorces spécifiques utilisées pour l’amplification des séquences partielles de 71-1, 75-1, 78-1, 89-1 et 98-1

Clones Amorces sens Amorces antisens71-1 5' GGGATCAGTTCAAAATTTGTTCC 3' 5' TTGGAAAAGGCACAAGCAGA 3'71-2 5' AGCACCCAACGGTATAAGATTCA 3' 5' GACGTTGGTTTGGACGATGA 3'75-1 5' CGAACGGAATCAGCTCGA 3' 5' GGCTCACGAAGAAATGGATC 3'78-1 5' TTCTTTGTTGGGCAAGGCT 3' 5' TTAGACCCCATGATGTTCACATC 3'89-1 5' ACGGATACGACGTCGTCAGC 3' 5' CCCTGCTCCCCGTTAAGTC 3'89-2 5' GGAACTGATACGACGTCGTCAG 3' 5' TCCCTACTCCCCGTTAAGTCC 3'98-1 5' CCTGCCAGCACCGAAC 3' 5' TGCAACACAAAGCACAGGAG 3'


177

néanmoins à rechercher les séquences entières de ces P450 à partir d’une banque de

feuilles de rue soumise aux UV.

2.3 Recherche des ADNc complets des P450 isolés à partir d’une banque de feuilles de Ruta graveolens traitée aux UV

Une banque d’ADNc de feuilles de rue traitée aux UV a été construite à l’aide

du kit SMART cDNA Construction (Clontech). Le détail de la construction de cette

banque est décrit dans le chapitre matériel et méthodes.

2.3.1 Marquage des sondes

Des sondes spécifiques des séquences 71-1, 71-2, 75-1, 78-1, 89-1 et 89-2,

marquées à la digoxygénine (Roche) sont synthétisées par PCR à l’aide d’une Taq DNA

polymérase et des amorces décrites dans le tableau V-3. Les sondes sont ensuite

purifiées sur gel d’agarose et resuspendues dans 10 µl d’eau.

2.3.2 Criblage de la banque

- Criblage primaire :

Le criblage est réalisé sur 600 000 clones étalés à hauteur de 60 000 par boîtes de

Pétri de 15 cm de diamètre. Après transfert et fixation des colonies sur filtre, l’hybridation

est conduite avec le mélange des 6 sondes dans des conditions moyennement stringentes

(température d’hybridation à 58 °C). En raison de la petite taille des plages de lyse, la

révélation a été conduite par une méthode de chimioluminescence plus sensible que les

réactions colorimétriques généralement utilisées. Avec ce système de révélation, 22 plages

de lyses s’avèrent positives.

- Criblage secondaire :

Afin de limiter le risque d'avoir des faux positifs issus d'un « carottage grossier », les

plages de lyses positives après le criblage primaire sont isolées et les phages extraits sont

ré-étalés sur boîtes de Pétri de 8 cm de diamètre, à hauteur d’une trentaine de clones par

boîtes. Suite à cet étalement, une nouvelle hybridation est entreprise dans les mêmes

conditions que lors du criblage primaire. Dans ce cas, les plages de lyses sont de diamètre

RL13 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL 1 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL11 ---------------------------------------------------------------------RKKMIEERLLNSKENQDQDHVLSYVDTLFDLQLPGENRK-LNEEEIYT

RL14 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL15 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL 8 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL12 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- RL10 ----------------------------------------------------------------------------------------HVLCYVDTLFDLQLPGENRK-LNEEEIYT

RL16 VLMCFGDKLDHDQIRLVEKVQRCRILSLRRFSILNIFPMVTKIVFRKKWDEFLQSLKDQENTLFPLIRARKKMIEERLLNSKENQDQDHVLCYVDTLFDLQLPGENRK-LNEEEIYT

RL17 -------------------------------------------VFRKKWEQFFRLLKDQQNVVVPLIRARKMQAKEDRLLNKGNGD-ECVVSYVDTLLDLQLPEEKRK-LNEEEIAA RL 3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------RK-LNEEEIAA

RL 7 --------------------------GRGRFQILNFWPKFTRIVLRKRWEQFLQVRRNQVNVLTPLIRARKKMNDE----SGVQENE-HVLSYVDTLLDLHLPEEDKRNLTEYETFS

RL13 --------------SALQFLMANLVKYPRIQEKLYMEIKGVVAGNR~~~EVKEEDLNRIPYLRAVILEGLRRHPPGNFAVPRAVTEDFAMDGYMIPTHANVNFLVGQMGRDPRVWED RL 1 ------------------------------------EIKGVVAGNR~~~EVKEEDLNRIPYLRAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFAMDGYMIPTHANVNFLVGQMGRDPRVWED RL11 LCSEFLTGGTDTTSSALQFLMANLVKYPRIQEKLYMEIKGVVAGNR~~~EVKEEDLNRIPYLRAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPTNANVNFLVGQMGRDPRVWED

RL14 ------------------------------------EIKGVVEGNR~~~EVKEEDLNKIPYLKAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVWED RL15 ------------------------------------EIKGVVEGNR~~~EVKEEDLNKIPYLKAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVWED RL 8 ----------------------------------------------~~~------------------------------------------GYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVWED RL12 ----------DTTSSALQFIMANLVKYPRIQEKLYMEIKGVVEGNR~~~EVKEEDLNKIPYLKAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVWED RL10 LCSEFLTGGTDTTSSALQFIMANLVKYPRIQEKLYMEIKGVVEGNR~~~EVKEEDLNKIPYLKAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVRED

RL16 LCSEFLNAGTDTTSTALQFITANLVKYPRIQEKLYMEIKGVVEGNR~~~EVKEEDLNKIPYLKAVILEGLRRHPPGNFVVPHAVTEDFTLDGYMIPKNANVNFLVGQMGRDPRVWED

RL17 LCSEFLTGGTDTTSSALQWIMANLVKFPHVQEKLYIEIKGVV~GERADEEVKEEELNKMPYLKAVVLEGLRRHPPGHFVLPHAVTEDFSLDGYVIPKNASVNFMVAELGHDPRVWES RL 3 LCSEFLNAGTDTTSTAPQWIMANLVKYPHVQEKLYIEIKGVVG-------------------------------------------------------------------------

RL 7 LCSDFLNGETDTTSTALQRITANLDKYPGLQDKLCMEIK-~---------------------------------------------------------------------------

RL13 PMEFKPERFMKVSDESGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLGLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVHVSPRNGSSV-- RL 1 PMEFKPERFMKVSDESGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLGLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVHVSPRNGSSV-- RL11 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLGLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVHVSPRNGSSV—

RL14 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLSLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAVEVDLSEKQEFSILLKNPLLVNVSPRNGSSV-- RL15 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLSLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAVEVDLSEKQEFSILLKNPLLVNVSPRNGSSV-- RL 8 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLSLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVNVSPRNGSSV-- RL12 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRRICPGLSLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVNVSPRNGSSV-- RL10 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGAGRGICPGLSLAMLHLEYFVANLVWGFEWKAAAEVDLSEKQEFSILLKNPLLVNVSPRNGSSV--

RL16 PLEFKPERFIATSDENGRVLVEDFDITGSREIKMMPFGAGRRICPGLSLAMLHLEYFVANLGLGFRVKAAAEVDLSEKQSSHL--------------------

RL17 PMEFKPERFMKVSDGSGRRMLEDLDLTGSREIKMMPFGVGRRICPGLGLAMLHLEYFVANLVWRFEWKAVDGDEVDLAEMQEFTIVMKTPLRAHIFPRIT--- RL 3 -------------------------------------------------------------------------------------------------------

RL 7 -------------------------------------------------------------------------------------------------------

Figure V-10 : Alignement des séquences protéiques partielles des CYP89 clonés à partir de la banque de feuilles de rue traitée aux UV

Les résidus en gras correspondent aux résidus conservés chez les P450. Les résidus surlignés dans les séquences du groupe RL13, 1, et 11 correspondent aux résidus divergents avec le groupe RL14, 15, 8, 12 et 10.


179

plus élevé et peuvent être révélées par une réaction de colorimétrie. Sur les 22 plages de

lyse criblées, 18 sont à nouveau positives. Ces plages de lyses (RL1 à RL18) sont isolées et

les phages sont resuspendus dans un tampon MS additionné de chloroforme.

- Excision des plasmides :

Les plasmides contenant les séquences RL1 à RL18 sont excisés des phagemides

par le systèmes Cre-lox. Ces plasmides sont ensuite purifiés et séquencés.

2.3.3 Nature des séquences isolées par criblage de la banque

Les séquences RL1 à RL18 sont identifiées à l’aide du programme blastx

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Bien qu'ayant fait un criblage secondaire, il s'avère

que sur 18 séquences, 5 correspondent à des gènes totalement différents de ce que nous

attendions. Ces séquences codent deux peroxydases, deux protéines ELIP de réponse à la

lumière et une protéine de réponse au stress. Le clonage de ces séquences démontre la

difficulté à isoler des gènes spécifiques. Les 13 séquences restantes, par contre,

correspondent bien à des P450 et présentent tous une forte homologie (de 60 à 65 %) avec

la famille des CYP89 (Fig. V-10). Ce résultat est surprenant dans le sens où lorsqu'on

observe la figure V-9, la famille CYP89 est faiblement représentée dans le tissu élicité aux

UV. On se serait plutôt attendu à avoir une majorité de P450 issus de la famille CYP71, ou

éventuellement CYP75. Ces différentes séquences de CYP89 codent pour des fragments

peptidiques partiels de 53 (RL3) et 313 acides aminés (RL16). En se basant sur l’homologie

des séquences protéiques, les 13 séquences se distribuent en 5 groupes. Les 3 séquences du

premier groupe (RL1, 13 et 11) sont quasiment identiques à l’exception de divergences sur

4 acides aminés. Ces différences peuvent s’expliquer soit par des variants allèliques, soit par

des mutations introduites par la polymérase pendant la construction de la banque lors de la

synthèse des ADNc. Dans ce groupe, toutes les séquences possèdent leur partie C-terminale

intacte. La séquence la plus longue (RL11) représente tout juste 260 a.a, c’est à dire la

moitié d’une séquence complète de P450. Le deuxième groupe comprend les séquences

RL8, 9, 10, 12, 14 et 15. Ils possèdent une forte homologie avec le premier groupe avec des

divergences sur seulement une douzaine d’acides aminés. Le troisième groupe est

représenté par RL16. Cette séquence est quasiment identique aux séquences du premier et

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/


180

deuxième groupe à l’exception de la région C-terminale délétée d’une quinzaine d’acides

aminés et divergente sur les dix derniers. Le quatrième groupe comprend RL3 et RL17. Ce

groupe est le plus divergent des 5. RL17 ne possède pas plus de 65 à 70 % d’homologie

avec les autres séquences. Outre deux petites insertions de 1 et 3 acides aminés, la

différence la plus notable est encore une fois à l’extrémité C-terminale. Le cinquième

groupe est représenté par RL7. Cette séquence est courte (126 a..a.) et ne contient pas la

région C-terminale. Le travail de criblage de la banque nous a donc permis d’isoler les

séquences partielles d’au moins 5 P450 appartenant à la famille des CYP89.

2.3.4 Tentative d’isolement des séquences entières

La recherche de l’extrémité 5’ des deux ADNc les plus longs (RL16 et RL17) a été

entreprise par une méthode de PCR sur la banque assimilable à de la 5’ RACE (Rapid

Amplification of c-DNA Ends). Des amorces antisens s’hybridant aux extrémités 5’ des

ADNc ont été définies (Tab. V-4). Une PCR est réalisée sur 5 µl de la banque UV

amplifiée, à l’aide de la Pfu DNA polymerase (Promega), en présence de l’amorce antisens

16RL rev ou 17RL rev et de l’amorce sens 5’LD fournie dans le kit de construction de la

banque (Clontech) Cette amorce s’hybride sur le vecteur phagique TriplEx2 en amont des

ADNc insérés. En présence d’un ADNc complet correspondant à 16RL ou 17RL, la PCR

devrait amplifier la séquence 5’ manquante estimée respectivement à 600 pb et 730 pb

(basée sur des séquences de CYP89 déjà caractérisés). A l’heure actuelle et en dépit de

plusieurs tentatives en modifiant les paramètres d’amplification (modifications des

concentrations en amorces, de la quantité de matrice, des températures d’hybridation et

d’élongation…), nous n’avons pu amplifier l’extrémité 5’ de ces ADNc.

Amorces

16 RL rev

17 RL rev

5' LD

Séquences

5' GAG CTT GTC CCC GAA ACA CAT CAG CAC 3'

5' GAA CTG CTC CCA CTT TTT ACG GAA AAC 3'

5' AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT 3'

Tableau V-4 : Amorces utilisées pour la tentative d’amplification de l’extrémité 5’ des ADNc partiels 16RL et 17RL


181

3 Discussion

Les résultats présentés dans ce chapitre sont issus d’un travail initié tardivement,

destiné, à terme, à cloner des P450 issus de familles qui pourraient être impliquées dans

la voie des furocoumarines chez Ruta graveolens. Pour ce travail, deux aspects ont été

abordés : l’élicitation de plantes de rue pour la synthèse de furocoumarines et le clonage

de séquences de P450 candidats.

3.1 Tentative d’élicitation de plantes de rue par les UV

L’élicitation des tissus végétaux pour la synthèse de métabolites secondaires

fournit un matériel particulièrement adapté à l’étude enzymatique et moléculaire des

voies de synthèse des phytoalexines en général et des furocoumarines en particulier (cf.

chapitre IV, Hamerski et Matern, 1988 a et b ; Schoendorf et al., 2001, Schopfer et

Ebel, 1998). Contrairement à Ammi majus ou au persil, il s’avère que chez Ruta

graveolens, la production de furocoumarines est faiblement élicitable aussi bien dans la

plante entière que dans les tissus in vitro (Staniszewska et al. 2003, Tietjen et al., 1983 ;

Milési, 2001 ; Massot, 2001). L’exposition aux rayonnements UV ( =

366 nm) et

l’irradiation artificielle à 900 lux sont les facteurs favorisant le plus la production de

furocoumarines (augmentation d’un facteur 2 à 7) chez les plantes entières et les tiges

feuillées de rue (Zobel et Brown, 1993 ; Ekiert et al., 1999). Les données concernant

notre premier essai d’exposition des plantes aux UV ( =

312 nm), bien qu’incomplètes,

tendent à montrer un effet inducteur de l’exposition sur les teneurs en furocoumarines

dans les feuilles (augmentation des teneurs en fonction de la durée d’exposition,

accumulation de furocoumarines 1,7 fois plus importante dans les plantes traitées 24 H

que dans les plantes contrôle). Contrairement aux travaux de Zobel et Brown,

l’exposition à 312 nm a également un impact sur la composition en furocoumarines,

avec un effet inducteur principalement observé pour le 5-MOP. Nous avons par ailleurs

observé une augmentation des teneurs en furocoumarines au cours du temps dans la

plante contrôle (augmentation d’un facteur 9 entre le t 0 et le t 24 H). Ce résultat,

étonnant à première vue, pourrait s’expliquer par le fait que l’essai d’exposition a été

réalisé sur des plantes initialement cultivées en conditions artificielles dans un phytotron

et sorties quelques jours en conditions naturelles pour les besoins de l’expérience. La


182

transition phytotron-extérieur, et en particulier, l’exposition de ces plantes à un

rayonnement naturel pourrait avoir provoqué une accumulation de furocoumarines

indépendamment de l’exposition aux UV. Ce phénomène inattendu devra être confirmé

par des expériences complémentaires mais il pourrait constituer un système d’élicitation

efficace (augmentation de la quantité de furocoumarine d’un facteur 9) et très simple.

En parallèle, le réel impact d’une exposition des plantes aux UV ( =

312 nm), devra

être étudié sur des plantes maintenues dans le phytotron pour s’affranchir de cette

induction parallèle.

3.2 Clonage de P450 candidats pour la synthèse des furocoumarines chez Ruta graveolens

La stratégie CODEHOP utilisée pour la recherche de CYP78 et CYP98 à partir

de l’ADN génomique de Ruta graveolens, nous a permis d’isoler seulement un membre

de ces deux familles mais également 5 séquences appartenant aux familles CYP71,

CYP75 et CYP89. Il est intéressant de constater que tous ces P450 sont exprimés dans

les feuilles de rue soumise aux UV. L’expression du CYP78, du CYP75 et d’un CYP 89

(89-1) semble, en particulier, induit par l’exposition UV (sous réserve d’une

confirmation par RT-PCR quantitative). Dans la mesure où nous ne disposons pas des

séquences entières et qu’il n’est donc pas possible de tester leur activité, nous ne

pouvons qu’être spéculatifs sur le rôle et l’implication possible de ces P450 dans la voie

de biosynthèse des furocoumarines. Il est très probable que le CYP75 cloné chez Ruta

graveolens soit une flavonoïde-3’-5’-hydroxylase. En effet, la partie de séquence dont

nous disposons présente une forte homologie (86 %) avec le CYP75A1 et tous les

membres de cette sous-famille identifiés jusqu’à présent se sont révélés être des F3’5’H

(Brugliera et al., 1999 ; Shimada et al., 1999). Par ailleurs, l’induction de ce P450 en

réponse aux UV pourrait correspondre avec l’accumulation des flavonoïdes

généralement observée chez les plantes pour les protéger de ces rayonnements (Beggs et

al., 1986 ; Li et al., 1993). Le clonage de deux séquences de CYP71 est intéressant dans

la mesure où nous avons montré chez Ammi majus que CYP71AJ1 est une psoralène

synthase (cf. Chapitre IV). Les deux séquences partielles dont nous disposons

présentent une assez faible homologie avec CYP71AJ1 (48% et 44% d’identité

protéique respectivement pour 71-1 et 71-2) et se rapprochent plus des sous-familles


183

71A et 71D. Les CYP71 correspondent à la plus large famille de P450 végétaux. 54

séquences de CYP71 sont notamment répertoriées dans le génome d’Arabidopsis

(Werck-Reichhart et al., 2002) et plus largement plus de 300 séquences réparties en une

cinquantaine de sous familles ont été déposées au comité de nomenclature des P450

(http://drnelson.utmem.edu/BiblioD.html). Cette famille est impliquée tardivement dans

la biosynthèse de divers métabolites secondaires. Il convient donc d’être prudent avant

d’imaginer que les deux séquences clonées chez la rue codent des P450 de la voie des

furocoumarines d'autant plus que le niveau d’expression de 71-1 notamment, ne semble

pas modifié suite à l’exposition aux UV (figure V-9). Il est toutefois fortement

envisageable, à l’image de la voie de synthèse du DIMBOA où quatre étapes

successives sont catalysées par 4 CYP71 organisés en cluster, que la (+)-marmésine

synthase, la psoralène synthase et les psoralène-5 et 8-monooxygénases appartiennent à

la même famille des CYP71 (Frey et al.,1997 ; Glawischnig et al., 1999). Un effort

particulier devra donc être entrepris pour permettre le clonage des séquences entières et

l’identification fonctionnelle de ces deux P450. La stratégie CODEHOP a permis

d’isoler deux fragments de CYP89. Il nous a ensuite été possible, après criblage de la

banque d’ADNc de feuilles soumises aux UV, d’isoler des séquences partielles d’au

moins 5 CYP89. Bien que 27 séquences de CYP89A aient déjà été rapportées

(principalement grâce aux campagnes de séquençage d’Arabidopsis, du riz et du

peuplier), aucune fonction n’a été identifiée. La recherche de l’extrémité 5’ manquante

devrait nous permettre d’isoler prochainement les séquences entières.

Concernant les séquences de CYP78 et CYP98, les deux familles recherchées

initialement avec la stratégie CODEHOP, les résultats sont également partiels. Nous

avons manqué de temps pour isoler un clone complet de CYP78. Cependant, un travail

de clonage du CYP98 entrepris en parallèle au laboratoire à partir d’une banque

d’ADNc de feuilles de rue non traitées aux UV, a abouti à l’isolement d’une séquence

codante entière (CYP98A22). Cette séquence présente la particularité d’avoir deux sites

d’initiation de la traduction avec le même cadre de lecture et distants de 15 codons. La

forme la plus courte de CYP98A22 (issue du deuxième site ATG) correspond aux

CYP98 retrouvés chez les autres plantes, tandis que la forme la plus longue possède une

addition de 15 résidus à l’extrémité N-terminale, rendant cette dernière relativement

atypique. En se basant sur une analyse in silico, il est possible que cette modification de

http://drnelson.utmem.edu/BiblioD.html


184

l’ancre transmembranaire influe sur la localisation cellulaire des deux formes de

CYP98A22, cependant rien n’a encore été démontré. L’expression dans les levures

WAT 11 et les tests de métabolisation ont montré que les deux formes possèdent une

activité C3’H et n’acceptent que le p-coumaroyl shikimate contrairement à une grande

partie des CYP98 qui métabolisent aussi les p-coumaroyl quinate (Schoch et al., 2001 ;

Morant, 2004). D'autre part aucune des deux formes n’a présenté d’activité C2H en

dépit de nombreux substrats testés (cinnamate, p-coumarate, p-coumaroylCoA, p-

coumaroyl shikimate, p-coumaroyl quinate, cinnamoyl shikimate).

4 Conclusion

Dans le cadre de la recherche de séquences codantes de P450 impliqués dans la

synthèse des furocoumarines (cf. Chapitre IV), nous nous sommes intéressés à l’étape

d’ortho-hydroxylation du p-coumarate supposée être catalysée par un P450. Partant de

l’hypothèse que ce P450 dérive de familles déjà connues et impliquées dans des étapes

d’hydroxylation d’acides cinnamiques, nous nous sommes intéressés au clonage

d’orthologues chez Ruta graveolens, de CYP98 responsables de l’activité C3’H et de

CYP78 phylogénétiquement proches des CYP73 et CYP98. Ce travail de clonage à

partir de l’ADN génomique de rue, nous a amené à isoler 7 séquences partielles de

P450. En parallèle de ce travail, un protocole d’élicitation de la production de

furocoumarines dans la plante entière par exposition aux UV a été entrepris, ce qui nous

a ensuite permis de construire une banque d’ADNc de feuilles de rue élicitée pour la

synthèse de furocoumarines. Mis à part pour CYP98A22 dont la séquence entière a pu

être clonée, les autres séquences isolées correspondent à des fragments partiels, parfois

très courts. En attendant de pouvoir caractériser l’ensemble de ces clones, la suite de ce

travail passera par l’isolement des séquences entières. Dans cette entreprise, la banque

d’ADNc construite à partir de feuilles de rue traitées aux UV devrait s’avérer être un

outil utile. Nous avons en effet montré que toutes les séquences isolées sont exprimées

dans les feuilles traitées. Le criblage de la banque avec les sondes correspondant aux

séquences des deux CYP89 a déjà permis d’isoler les séquences partielles d’au moins 5

CYP89. Le criblage avec les autres sondes n’a encore rien donné mais l’optimisation

des conditions d’hybridation devrait à court terme fournir des résultats positifs.

Conclusion générale et

perspectives

185

Conclusion générale et perspectives

Ce travail de thèse avait pour objectif d’améliorer les connaissances sur la voie

de biosynthèse des furocoumarines, voie encore mal caractérisée concernant des

molécules dont l’intérêt pharmaceutique est prouvé. Ce travail s’est partagée en deux

grands axes : d’une part, identifier les déterminants moléculaires conférant à la C4H de

rue (CYP73A32) une faible sensibilité à l’inactivation autocatalytique par les

furocoumarines, et d’autre part, isoler et caractériser de nouveaux P450 impliqués dans

la voie de biosynthèse de ces molécules.

Recherche des déterminants de la faible sensibilité de CYP73A32 au

psoralène

La première partie des travaux présentés dans cette thèse avait pour objectif de

déterminer les facteurs favorisant la forte résistance des C4H de plantes à

furocoumarines vis à vis de l’inactivation autocatalytique par le psoralène. Les résultats

obtenus n’ont pas permis d’isoler d’acides aminés clés dans les séquences protéiques

des C4H de rue, de persil et d’Ammi majus expliquant ce phénomène. Nos résultats, en

particulier ceux issus de l’étude des mutants ponctuels de CYP73A32, suggèrent

néanmoins que les mécanismes évolutifs qui ont abouti au caractère « résistant » de ces

enzymes, sont survenus indépendamment, au moins entre les C4H de rue et celles de

persil et d’Ammi majus. Ceci semble cohérent avec l’évolution phylogénétique des

Rutacées et des Apiacées qui présentent par ailleurs d’autres points de divergence dans

la biosynthèse des furocoumarines (élicitabilité de la voie chez les Apiacées,

prépondérance de voies alternatives de synthèse de furocoumarines hydroxylées chez

les Rutacées).

Nos travaux se sont par la suite focalisés sur l’inactivation différentielle par le

psoralène de CYP73A32 et de CYP73A1 par l’étude de protéines chimères et d’un

modèle tridimensionnel de CYP73A32. Cette étude a permis de délimiter deux régions

importantes. La première, située entre les acides aminés 31 et 58 semble expliquer la

différence d’affinité des deux enzymes pour le psoralène. En se basant sur l’étude du


186

modèle et sur les données de la littérature, cette région pourrait participer à un canal

d’accès favorisant le transfert de molécules hydrophobes de la membrane vers le site

actif. Dans cette région, 4 résidus spécifiques à CYP73A32 (F38 ; G39 ; F40 ; K57)

pourraient constituer des candidats intéressants pour expliquer la faible affinité de

l’enzyme pour le psoralène en comparaison de celle de CYP73A1. L’étude des

protéines chimères a, par ailleurs, permis de délimiter une deuxième région entre les

acides aminés 229 et 379 permettant d’expliquer la faible vitesse d’inactivation de

CYP73A32. Un groupe de 5 résidus différents entre CYP73A1 et CYP73A32 (G237,

E247, R248, L250 et K251 dans la séquence de CYP73A32) et localisés près du SRS3

constitue également une piste de recherche intéressante. Ces hypothèses devront être

confirmées par mutagenèse dirigée en remplaçant ces résidus par ceux présents à la

même position dans la séquence de CYP73A1.

Les outils de bioinformatique nous ont, par ailleurs, permis de modéliser

l’orientation du psoralène au sein du site actif de CYP73A32. L’inhibiteur est dans une

position compatible avec la formation d’un furane époxyde qui pourrait se lier sur un

acide aminé nucléophile. Ce mécanisme d’inactivation pourrait être très similaire à

l’inactivation de CYP2A6 par le 8-MOP. La nature de l’acide aminé sur lequel se fixe le

psoralène chez CYP73A32 et CYP73A1 devrait fournir des informations importantes,

d’une part pour la compréhension globale de l’inactivation d’un P450 par une

furocoumarine, et d’autre part, en imaginant qu’il se fixe sur des acides aminés

différents, pour la compréhension de l’inactivation différentielle des deux enzymes. Nos

précédents travaux ont pu mettre en évidence que le psoralène se fixe sur la partie

apoprotéique de la C4H en formant une liaison covalente (Gravot et al., 2004). En

raison de la stabilité de cette liaison, il est donc possible d’identifier le peptide ou

idéalement l’acide aminé adduit par spectrométrie de masse en comparant les profils de

digestion peptidique des protéines inactivées ou non avec le psoralène. L’acide aminé

ou le peptide adduit sera ainsi identifié en raison de l’incrément de masse correspondant

à l’addition d’une molécule de psoralène époxydé (+ 202). Ces travaux sont actuellemnt

en cours au laboratoire.


187

Clonage de P450 de la voie de synthèse des furocoumarines :

identification de la psoralène synthase chez Ammi majus

Une collaboration réunissant les laboratoires du Pr. Matern, du Dr. Werck-

Reichhart et le nôtre a été initiée dans le but d’isoler et d’identifier des P450 impliqués

dans la biosynthèse des furocoumarines. Cinq ADNc exprimés spécifiquement dans les

cultures cellulaires d’Ammi majus élicitées ont été isolés. L’identification fonctionnelle de

trois de ces ADNc (CYP82H1, CYP76B8 et CYP71AJ1) a été entreprise durant ce travail

de thèse. L’expression hétérologue de ces enzymes dans les microsomes de levures

WAT 11 s’est avérée correcte pour CYP82H1 mais indétectable pour CYP76B8 et

CYP71AJ1 en dépit de nombreuses tentatives d’optimisation du protocole d’expression

initialement décrit par Pompon (Pompon et al., 1996). Une expression conséquente de

CYP71AJ1 n’a été obtenue qu’après remplacement de l’ancre membranaire par celle de

CYP73A1. Un criblage métabolique fut entrepris sur les enzymes exprimées afin

d’identifier leur fonction. Aucun des substrats testés n’est métabolisé par CYP82H1. En

revanche, CYP71AJ1 métabolise la conversion de la (+)-marmésine en un produit

identifié comme du psoralène. CYP71AJ1 est donc le premier P450 cloné codant une

psoralène synthase, et plus largement le premier P450 cloné et de fonction identifiée dans

la voie de synthèse des furocoumarines. Dans les conditions d’activité optimale

préalablement définies, CYP71AJ1 présente une forte affinité pour la (+)-marmésine (2

µM) et une activité spécifique élevée pour un P450 (kcat = 150 min-1) dans le même ordre

de grandeur que ceux des C4H de rue et de topinambour.

Les tests réalisés avec la déméthylsubérosine et le psoralène ont montré que

CYP71AJ1 ne catalyse pas les autres étapes P450 dépendante de la voie de synthèse des

furocoumarines (i.e (+)-marmésine synthase, psoralène-5 et 8-monooxygénase). Dans

ces tests nous n’avons pas inclu les dérivées hydroxylés de la (+)-marmésine (5- et 8-

Hydroxy-marmésine). Les travaux d’Innocenti ont montré l’existence chez Ammi majus,

Petroselinum crispum et Apium graveolens, d’une voie alternative de synthèse du

bergaptène passant par l’hydroxylation en position 5 de la (+)-marmésine, suivi de la

conversion de cette 5-Hydroxy-marmésine en 5-Hydroxy-psoralène finalement

méthoxylé pour donner du bergaptène (Innocenti et al., 1981). La voie parallèle

aboutissant à la synthèse de xanthotoxine n’existe pas chez ces plantes alors qu’elle a


188

été décrite chez Ruta graveolens et Ficus carica. Chez Ruta graveolens et Ficus carica

ces deux voies alternatives pourraient prédominer sur la voie classique passant par la

conversion de la (+)-marmésine en psoralène. Ces observations suggèrent que (i)

CYP71AJ1 pourrait catalyser la conversion de substrats proches de la (+)-marmésine

comme la 5-Hydroxy-marmésine et que (ii) les orthologues de CYP71AJ1 chez Ruta

graveolens et Ficus carica pourraient présenter une spécificité de substrat différente de

CYP71AJ1 en raison de la prépondérance des voies de synthèse des furocoumarines

hydroxylées chez ces plantes.

Le clonage et l’identification de la première psoralène synthase devrait permettre

d’améliorer nos connaissances quant à l’évolution des voies de biosynthèse menant aux

furocoumarines linéaires et angulaires. En raison du fait que les furocoumarines

angulaires ne sont distribuées que dans des plantes synthétisant des formes linéaires et

qu’elles accentuent le potentiel toxique des ces dernieres, il a été proposé qu’elles aient

divergé à partir de leurs homologues linéaires (Gray et Waterman, 1977). Cette

divergence est supposée avoir eu lieu lors de l’étape de prénylation de l’umbelliférone.

Les étapes suivantes faisant intervenir le même type d’intermédiaires que les linéaires,

pourrait être catalysées par les mêmes enzymes intervenant dans la synthèse des

furocoumarines linéaires, ou par des isoformes proches ayant évoluées pour se

spécialiser dans la synthèse des formes angulaires. Les résultats de ce travail de thèse

ont permis de montrer que CYP71AJ1, issu d’Ammi majus qui ne produit pas de

furocoumarines angulaires, n’est pas capable de métaboliser la (+)-columbianetine,

analogue angulaire de la (+)-marmésine, en angélicine. L’étude in silico de l’ancrage de

la (+)-columbianetine dans le site actif de CYP71AJ1 soutient les résultats

expérimentaux en montrant que le site de métabolisation est trop éloigné du fer

héminique. L’apparition des furocoumarines angulaires ne semble donc pas uniquement

liée à une divergence de l’étape de prénylation de l’umbelliférone, mais fait également

intervenir une évolution des enzymes en aval. Le clonage d’orthologues de CYP71AJ1

chez des plantes productrices de furocoumarines angulaires comme Apium graveolens

ou Heracleum mantegazzianum devrait permettre de déterminer si, dans ce type de

plante, la psoralène synthase a évolué pour accepter les formes linéaires et angulaires ou

si les deux voies de synthèse sont prises en charge par des enzymes différentes.


189

Clonage de P450 de la voie de synthèse des furocoumarines :

Recherche chez Ruta graveolens

En parallèle à la caractérisation de la psoralène synthase d’Ammi majus, ce

travail de thèse a permis d’aborder la perspective du clonage de P450 impliqués dans la

voie des furocoumarines chez Ruta graveolens. La synthèse constitutive et la faible

élicitation de la production de furocoumarines par les plantes mais aussi les cultures

cellulaires de Ruta graveolens peut constituer un frein dans la recherche de ces P450,

dans la mesure où l’approche en differential display, comme dans le cas des cultures

cellulaires d’Ammi majus, n’est pas réellement envisageable. L’approche CODEHOP

développée dans le chapitre V est susceptible de fournir des résultats intéressants,

encore faut-il avoir une idée des familles de P450 à prendre en considération. La mise

en évidence que l’activité psoralène synthase est catalysée par un CYP71, fournit en ce

sens une information importante et permettra d’orienter la stratégie CODEHOP sur cette

famille. Il est, en effet, possible qu’à l’image de ce qui se passe pour la voie de synthèse

du DIMBOA, les quatre étapes successives P450 dépendantes menant de la

déméthylsubérosine (DMS) aux dérivés hydroxylés du psoralène soient toutes codées

par des CYP71. Cette supposition est d’autant plus forte dans le cas de la (+)-marmésine

synthase, que la menthofurane synthase catalysant la conversion de la pulégone en

menthofurane, par le biais d’un mécanisme réactionnel identique à celui de la

conversion de la DMS en (+)-marmésine, a été identifié comme appartenant aux CYP71

(Bertea et al. 2001). En se référant au nombre de CYP71 présent dans un organisme

diploïde comme Arabidopsis, cette approche devrait limiter la recherche de P450

spécifique de la voie des furocoumarines à une cinquantaine de membres. Les deux

séquences partielles de CYP71 qui ont déjà été clonées chez la rue constituent déjà une

bonne base de départ.

Ce travail de thèse a également permis de construire deux banques d’ADNc de

tissus riches en furocoumarines :

Une banque d’ADNc de feuilles de rue traitée aux UV : le traitement UV a un

impact sur la production de furocoumarines dont l’ampleur devra encore être confirmée.

L’augmentation de la teneur en furocoumarines observée est vraisemblablement causée


190

par une induction de l’expression des gènes spécifiques de la voie (Jin et al., 2000). La

représentativité des ADNc correspondant doit donc être augmentée.

Une banque d’ADNc de fruits de rue : les fruits constituent les organes les plus

riches en furocoumarines chez la rue (Milési, 2001). Il n’est cependant pas encore établi

si cette forte concentration est la résultante d’un transfert vers cet organe, ou d’une

activité de synthèse soutenue in situ. Dans ce deuxième cas, l’expression des gènes

spécifiques doit être importante, ce qui entraînerait une forte représentativité des ADNc

correspondants. En raison de contraintes de temps, cette banque n’a pas encore été

utilisée.

A l’issue de ce travail de thèse, nous disposons d’informations importantes pour

orienter la stratégie de clonage ainsi que d’un matériel adéquat pour l’isolement et

l’identification de P450 de la voie des furocoumarines chez Ruta graveolens.

A la recherche d’un P450 hypothétique : la C2H

L’activité d’ortho-hydroxylation du noyau phénolique des acides cinnamiques

constitue l’un des chaînons majeurs manquant dans le métabolisme des

phénylpropanoïdes. Cette réaction peut intervenir à différents niveaux de la voie, sur le

cinnamate, le p-coumarate, le cafféate ou le férulate pour ouvrir la voie des coumarines

et furocoumarines (pour revue, Bourgaud et al. , 2006). La nature de cette enzyme n’est

pas encore établie, mais plusieurs observations laissent penser qu’elle pourrait être un

P450. L’approche que nous avons développée dans le chapitre V est basée sur l’idée que

cette enzyme est un P450 appartenant à la même famille ou à une famille proche de

celles catalysant les autres hydroxylations des acides cinnamiques i.e CYP73, CYP98 et

CYP84. Cette approche nous a permis d’isoler les séquences partielles d’un CYP78

relativement proche des CYP73 et CYP98, ainsi que d’autres P450 de familles plus

éloignées, dont la fonction chez Ruta graveolens devra être établie. Ce travail est par

ailleurs, à l’origine de l’isolement et de l’identification fonctionnelle d’une C3’H

(CYP98A22). La stratégie CODEHOP que nous avons utilisée peut se révéler

intéressante si la C2H est relativement proche des familles que nous avons privilégiées.

La découverte récente de coumarines chez Arabidopsis thaliana offre de

nouvelles perspectives pour le clonage du gène codant la C2H. Il devient en effet


191

envisageable de cribler l’ensemble des P450 de cette plante pour cette activité. La

difficulté de cette approche réside cependant dans l’utilisation du bon substrat. L’ortho-

hydroxylation se fait-elle sur un acide cinnamique libre comme c’est le cas pour la C4H

(CYP73) et la F5H (CYP84), ou sur une forme estérifiée (ester de quinate ou shikimate

comme pour la C3’H, ou ester de coA ou de glucose) ?

L’étude de mutants d’insertion d’Arabidopsis dont le profil en coumarines est

altéré représente une autre alternative intéressante qui pourrait aboutir à l’identification

du gène codant la C2H mais également d’autres gènes important dans la voie des

coumarines.

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Liste des figures et tableaux


211

Listes des figures

Figure I-1 : Structure chimique des principales furocoumarines linéaires et angulaires..11

Figure I-2 : Photoaddition du psoralène sur la thymine………………………………...14

Figure I-3 : Photoaddition du psoralène avec le méthyl ester d’acide linolénique……...14

Figure I-4 : Mécanisme proposé d’activation de la mélanogenèse par P-UVA thérapie.16

Figure I-5 : Voie générale simplifiée des phénylpropanoïdes et représentation de ses principaux dérivés………………………………………………………………………..18

Figure I-6 : Voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires…………………………20

Figure I-7 : (A) Représentation de Ruta graveolens ; (B) Buisson de Ruta graveolens………..24

Figure I-8 : (A) Représentation de Ammi majus ; (B) Ammi majus à la floraison………24

Figure I-9 : Exemples de réactions oxydatives catalysées par les P450…………..…….28

Figure I-10 : Schéma du cycle catalytique d’un P450…………………………………..31

Figure I-11 : Représentation schématique de la structure primaire d’un P450 eucaryote40

Figure I-12 : Représentation de la structure tridimensionnelle de CYP2C5 complexé avec la progestérone………………………………….…………………………………..40

Figure I-13 : Représentation de la cinétique d’inactivation de CYP73A1 par le psoralène …….…...…………………………………………………………………………………46

Figure II-1 : Cartes de restriction des plasmides pGEM-T (A) et pYeDP60 (B)…….…60

Figure II-2 : Cartes de restriction et détail du site multiple de clonage des vecteurs pUC19 (A) et pTriplEx2 (B)……………………………………………………………..62

Figure II-3 : Electrophorèse de l'ARN total extrait de feuilles de Ruta graveolens exposées aux UV pendant 24 H………………………………………………………….70

Figure II-4 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la RT-PCR sur l’ARN total extrait de feuilles de Ruta graveolens ……………………………...………………70

Figure II-5 : Comparaison des sites de restriction de Sfi I……………………………...73

Figure II-6 : Electrophorèse sur gel d’agarose des fractions collectées après passage des ADNc sur colonne Chroma 400 lors de la construction de la banque d’ADNc de feuilles de rue traitées aux UV……………………………………………………………………74

Figure III-1 : Représentation de la perte d’activité de CYP73A5 en fonction du temps et de la concentration en psoralène dans le milieu de préincubation ………………………92

Figure III-2 : Alignement des séquences protéiques de C4H réalisé à l’aide du logiciel ClustalX………………………………………………………………………………….94

Figure III-3 : Schéma de la stratégie d’obtention des mutants ponctuels de CYP73A32.97

Figure III-4 : Stratégie utilisée pour la construction des C4H chimères………………102


212

Figure III-5 : Représentation de la perte d’activité des chimères A1 [1-134] et A1 [1-379] en fonction du temps et de la concentration en psoralène dans le milieu de préincubation ……………….…………………………………………………………..104

Figure III-6 : Evolution des paramètres thermodynamiques et structuraux de la structure 3D de CYP73A32 pendant une simulation de dynamique moléculaire de 200 ps……..108

Figure III-7 : Orientation du psoralène dans le site actif du modèle de CYP73A32.…110

Figure III-8 : Représentation des canaux potentiels d’accès au substrat sur le modèle tridimensionnel de CYP73A32…………………………………………………………114

Figure III-9 : Bilan des travaux entrepris pour l’identification des résidus déterminant l’inactivation différentielle de CYP73A32 et CYP73A1 par le psoralène……………..118

Figure IV-1 : Voie générale de biosynthèse des furocoumarines linéaires……………124

Figure IV-2 : Alignement des séquences protéiques de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1……………………………………………………………………………….128

Figure IV-3 : Électrophorèse sur gel d’agarose des ADNc de CYP71AJ1 (A), CYP76B8 (B) et CYP82H1 (C) amplifiés par PCR………………………………………………..131

Figure IV-4 : Vérification de l’insertion des séquences codantes de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1 dans le vecteur pYeDP60………………………………….….130

Figure IV-5 : Spectres différentiels au CO enregistrés avec les microsomes de levures transformées avec pYe71AJ1, pYe76B8, pYe82H1 et pYe73A1……………………...132

Figure IV-6 : Séquences des régions transmembranaires de CYP73A1 et CYP71AJ1.134

Figure IV-7 : Spectre différentiel au CO de microsomes de levures surexprimant CYP71AJ1-NT…………………………………………………………………………137

Figure IV-8 : Détection en HPLC du produit de la conversion de la (+)-marmésine catalysée par CYP71AJ1-NT…………………………………………………….……..138

Figure IV-9 : Spectre d’absorbance du produit formé par CYP71AJ1-NT (A) et du psoralène (B)……………………………………………………………………………139

Figure IV-10 : Spectre de masse et profil d’élution GC du produit formé par CYP71AJ1-NT (A et C) et du psoralène (B et D)……………………………………………...……140

Figure IV-11 : Détermination du pH optimum pour l’activité psoralène synthase……141

Figure IV-12 : Détermination de la température maximale pour l’activité psoralène synthase…………………………………………………………………………………142

Figure IV-13 : Accumulation de psoralène en fonction du temps……………………..143

Figure IV-14 : Représentation de Lineweaver-Burk pour la psoralène synthase d’Ammi majus (CYP71AJ1)……………………………………………………………………..144

Figure IV-15 : Représentation en double inverse de l’activité en fonction de la concentration en (+)-marmésine en présence de concentrations croissantes en psoralène………………………………………………………………………………..146

Figure IV-16 : Mise en évidence de l’activité psoralène synthase dans les levures exprimant CYP71AJ natif et CYP71AJ-NT……………………………………………146

Listes des figures et tableaux

213

Figure IV-17 : Représentation des voies de biosynthèse des furocoumarines linéaires et angulaires……………………………………………………………………………….148

Figure IV-18 : Mécanisme réactionnel de la psoralène synthase proposé par Stanjek et al. (1997)………………………………………………………………………………..148

Figure IV-19 : Evolution des paramètres thermodynamiques et structuraux au cours d’une dynamique moléculaire de 160 ps………………………………………………..150

Figure IV-20 : Positionnement de la (+)-marmésine (A) et de la (+)-columbianetine (B) dans le site actif de 71AJ1………………………………………………………………152

Figure IV-21 : Codons rares chez la levure dans la région 5’ codant l’ancre membranaire de CYP71AJ1 et CYP73A1…………………………………………………………….158

Figure IV-22 : Alignement de la séquence protéique de CYP71AJ1 avec CYP73A1 d’Helianthus tuberosus, CYP73A5, CYP98A3, CYP84A1 et CYP75B1 d’Arabidopsis thaliana tous impliqués dans la synthèse de phénylpropanoïdes, CYP6B1 de Papilio polyxenes responsable de la dégradation du 8 MOP, CYP 2A6 de Homo sapiens capable de métaboliser la coumarine et inactivé par le 8 MOP et CYP2A1 de Ratus norvegicus qui métabolise la testostérone…………………………………………………………..160

Figure V-1 : Représentation des hydroxylations des acides cinnamiques catalysées par la C4H, la C3’H ainsi que des activités d’ortho-hydroxylation catalysées par la C2H et la F2H……………………………………………………………………………………..166

Figure V-2 : Arbre phylogénétique des P450 végétaux de type A ……………………166

Figure V-3 : Exemple d’une amorce CODEHOP définie dans une région consensus de méthyl transférase d’Arabidopsis thaliana……………………………………………..168

Figure V-4 : Amplification PCR avec des amorces CODEHOP………………………168

Figure V-5 : Alignement des séquences protéiques des CYP78 et 98 disponibles pour la détermination des amorces CODEHOP………………………………………………...170

Figure V-6 : Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR obtenus avec les amorces CODEHOP sur de l'ADN génomique de rue………………………………….170

Figure V-7 : Photographie du système d’irradiation de Ruta graveolens pour éliciter la synthèse de furocoumarines…………………………………………………………….174

Figure V-8 : Effet du stress UV sur la quantité en furocoumarines dans les feuilles de Ruta graveolens…………………………………………………………………………174

Figure V-9 : Effet de l’exposition aux UV sur l’expression des P450 clonés…………174

Figure V-10 : Alignement des séquences protéiques partielles des CYP89 clonés à partir de la banque de feuilles de rue traitée aux UV…………………………………………178


214

Liste des tableaux

Tableau I-1 : Liste des fonctions de P450 identifiés chez Arabidopsis thaliana .………...34 Tableau I-2 : Résumé des constantes d’activité C4H des différents CYP73………….……52

Tableau I-3 : Constantes d’inhibition des principaux inhibiteurs de C4H…………………52

Tableau II-1 : Antibiotiques utilisés…………………………………………………….…65

Tableau II-2 : Composition des milieux de culture pour levures…………………………..66

Tableau II-3 : Composition des tampons utilisés pour le criblage des banques……………78

Tableau II-4 : Composition des tampons pour la préparation des microsomes de levures…83

Tableau III-1 : Constantes d’inactivation autocatalytique des C4H de topinambour (CYP73A1), d’Arabidopsis (CYP73A5), de persil (CYP73A10) et de rue (CYP73A32)..…92

Tableau III- 2 : Amorces utilisées pour la création des mutants ponctuels de CYP73A32...96

Tableau III-3 : Tableau récapitulatif du niveau d’expression dans les levures, des constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène des mutants de CYP73A32………………………………………..…………………………………...98

Tableau III-4 : Mesure de la perte d’activité de CYP73A1, CYP73A32 et de l’octomutant après 10 min et 20 min en présence de psoralène …..…………………….100

Tableau III- 5 : Amorces utilisées pour générer les protéines chimères CYP73A1/CYP73A32……………………………………………………………………103

Tableau III- 6 : Niveau d’expression, métabolisme du cinnamate et inactivation par le psoralène des chimères A1 [1-134] et A1 [1-379] ainsi que de CYP73A32 et CYP73A1...104

Tableau III-7 : Tableau récapitulatif du niveau d’expression dans les levures, des constantes de métabolisation du cinnamate et d’inactivation par le psoralène des chimères de CYP73A32 et CYP73A1…………………………………………….....................…...106

Tableau IV-1 : Comparaison des séquences protéiques déduites des trois ADNc isolés d’Ammi majus avec les P450 les plus proches…………………………………………….127

Tableau IV-2 : Amorces utilisées pour l’amplification des séquences codantes de CYP71AJ1, CYP76B8 et CYP82H1……………………………………………………...129

Tableau IV-3 : Résumé des conditions d’expression des P450 d’Ammi majus…..……….132

Tableau IV-4 : Liste des substrats testés pour le criblage métabolique de CYP71AJ1-NT, CYP76B8 et CYP82H1…………………………………………………………………...136

Tableau IV-5 : Test d’inactivation autocatalytique de CYP71AJ1-NT par différentes furocoumarines……………………………………………………………………………145

Tableau V-1 : Amorces CODEHOP définies à partir des familles CYP78 et CYP98……171

Tableau V-2 : Informations sur les séquences de P450 de Ruta graveolens……………...172

Tableau V-3 : Amorces spécifiques utilisées pour l’amplification des séquences partielles de 71-1, 75-1, 78-1, 89-1 et 98-1……………………………………………………………..176


215

Tableau V-4 : Amorces utilisées pour la tentative d’amplification de l’extrémité 5’ des ADNc partiels 16RL et 17RL……………………………………………………………..180

Annexes

Annexe 1 : Liste des structures tridimensionnelles de P450 eucaryotes

résolues en janvier 2006

PDB ID Title Resolution

[Å]Authors Journal

NamePublication Year

1DT6 STRUCTURE OF MAMMALIAN CYTOCHROME P450 2C5

3.000 P.A.Williams, J.Cosme, V.Sridhar, E.F.Johnson, D.E.Mcree

Mol.Cell 2000

1N6B MICROSOMAL CYTOCHROME P450 2C5/3LVDH COMPLEX WITH A DIMETHYL DERIVATIVE OF

SULFAPHENAZOLE

2.300 M.R.Wester, E.F.Johnson, C.Marques-Soares, P.M.Dansette, D.Mansuy, C.D.Stout

Biochemistry 2003

1NR6 MICROSOMAL CYTOCHROME P450 2C5/3LVDH COMPLEX WITH DICLOFENAC

2.100 M.R.Wester, E.F.Johnson, C.Marques-Soares, S.Dijols, P.M.Dansette, D.Mansuy, C.D.Stout

Biochemistry 2003

1OG2 STRUCTURE OF HUMAN CYTOCHROME P450 CYP2C9

2.600 P.A.Williams, J.Cosme, A.Ward, H.C.Angove, D.Matak Vinkovic, H.Jhoti

Nature 2003

1OG5 STRUCTURE OF HUMAN CYTOCHROME P450 CYP2C9

2.550 P.A.Williams, J.Cosme, A.Ward, H.C.Angove, D.Matak Vinkovic, H.Jhoti

Nature 2003

1PO5 STRUCTURE OF MAMMALIAN CYTOCHROME P450 2B4

1.600 E.E.Scot t , Y.A.He, M.R.Wester, M.A.White, C.C.Chin, J.R.Halpert , E.F.Johnson, C.D.Stout

Proc.Nat .Acad.Sci.USA

2003

1PQ2 CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN DRUG METABOLIZING CYTOCHROME P450 2C8

2.700 G.A.Schoch, J.K.Yano, M.R.Wester, K.J.Griffin, C.D.Stout, E.F.Johnson

J.Biol.Chem. 2004

1SUO STRUCTURE OF MAMMALIAN CYTOCHROME P450 2B4 WIT H BOUND 4-(4-

CHLOROPHENYL)IMIDAZOLE

1.900 E.E.Scott , M.A.White, Y.A.He, E.F.Johnson, C.D.Stout , J.R.Halpert

J.Biol.Chem. 2004

1TQN CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN MICROSOMAL P450 3A4

2.050 J.K.Yano, M.R.Wester, G.A.Schoch, K.J.Griffin, C.D.Stout, E.F.Johnson

J.Biol.Chem. 2004

1W0E CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN CYTOCHROME P450 3A4

2.800 P.A.Williams, J.Cosme, D.M.Vinkovic, A.Ward, H.C.Angove, P.J.Day, C.Vonrhein, I.J.Tickle,

H.Jhoti

Science 2004

1W0F CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN CYTOCHROME P450 3A4


H.Jhoti

Science 2004

1W0G CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN CYTOCHROME P450 3A4


H.Jhoti

Science 2004

1Z10 CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN MICROSOMAL P450 2A6 WITH COUMARIN BOUND

1.900 J.K.Yano, M.H.Hsu, K.J.Griffin, C.D.Stout, E.F.Johnson

Nat.Struct.Mol.Biol.

2005

1Z11 CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN MICROSOMAL P450 2A6 WITH METHOXSALEN BOUND

2.050 J.K.Yano, M.H.Hsu, K.J.Griffin, C.D.Stout, E.F.Johnson

Nat.Struct.Mol.Biol.

2005

Annexes

218

Annexe 2 : Extraction d’ADN à partir d’un

gel d’agarose

Protocole d’extraction QIAEX (Qiagen)

1- Exciser la bande d’ADN à partir du gel d’agarose à l’aide d’une lame de

scalpel propre et la placer dans un tube de 1,5 ml propre.

2- Peser le morceau de gel. Pour un fragment d’ADN compris entre 100 pb et

4 kb, ajouter 3 volumes de tampon QX1 par volume de gel.

3- Resuspendre le gel QIAEX II en le vortexant pendant 30 s. Ajouter le gel

QIAEX II à l’échantillon :

10 µl de QIAEX II pour moins de 2 µg d’ADN

30 µl de QIAEX II entre 2 et 10 µg d’ADN

4- Incuber l’échantillon pendant 10 min à 50 °C pour solubiliser l’agarose et

fixer l’ADN sur le QIAEX II.

5- Centrifuger l’échantillon pendant 30 s et éliminer le surnageant.

6- Laver le culot avec 500 µl de tampon QX1. Centrifuger pendant 30 s et

éliminer le surnageant.

7- Laver le culot deux fois avec 500 µl de tampon PE. Centrifuger pendant 30 s

et éliminer le surnageant.

8- Sécher le culot à l’air pendant 15 min jusqu’à ce qu’il devienne blanc.

9- Pour éluer l’ADN, ajouter 20 µl d’eau et resuspendre le culot en vortexant.

Incuber le culot pendant :

- 5 min à température ambiante pour des fragments < 4 kb

- 5 min à 50 °C pour des fragments de 4 à 10 kb

- 10 min à 50 °C pour des fragments > 10 kb

10- Centrifuger pendant 30 s et récupérer le surnageant dans un tube propre.

Annexes

219

Annexe 3 : Protocole de préparation de

plasmides

Protocole plasmid miniprep kit (Sigma)

1- Centrifuger 1 à 5 ml de culture de bactérie E. coli pendant 1 min à 12000 g.

Eliminer le surnageant.

2- Resuspendre les bactéries à l’aide de 200 µl de tampon de resuspension

additionné de RNAse A.

3- Lyser les bactéries en ajoutant 200 µl de tampon de lyse et mélanger

doucement par inversion.

4- Neutraliser le tampon de lyse en ajoutant 350 µl de tampon de neutralisation.

Mélanger par inversion. Sédimenter les débris cellulaire en centrifugeant

pendant 10 min à 12000 g.

5- Insérer les colonnes Genelute Miniprep dans un tube collecteur de 2 ml et

déposer 500 µl de tampon de préparation. Centrifuger pendant 30 s à

12000 g. Eliminer le tampon à l’issue de la centrifugation.

6- Charger le lysat sur la colonne et centrifuger pendant 30 s à 12000 g.

Eliminer le tampon passé au travers de la colonne.

7- Laver la colonne est ajoutant 750 µL de tampon de lavage suivi de 30 s de

centrifugation à 12000 g. Eliminer le tampon et recentrifuger pendant 2

minutes pour éliminer le maximum de tampon. A l’issue de la centrifugation,

changer le tube collecteur de 2 ml.

8- Éluer l’ADN en ajoutant 50 µl d’eau en haut de la colonne. Centrifuger 30 s

à 12000 g. L’ADN est récupéré dans le tube collecteur.

Annexes

220

Annexe 4 : Code génétique universel

Disponible sur :

http://www.ac-versailles.fr/etabliss/herblay/genetiqu/fiches/codegene.htm

http://www.ac-versailles.fr/etabliss/herblay/genetiqu/fiches/codegene.htm

Annexes

221

Annexe 5 : Liste et composition des acides

aminés

Disponible sur : www.callisto.si.usherb.ca/ ~bcm514/1a.html

http://www.callisto.si.usherb.ca/

Annexes

222

Annexe 6 : Séquences partielles des P450 de Ruta graveolens isolées par stratégie

CODEHOP

Séquences 89-1: homologue de CYP89A2

ATGATTTTTA GGGGNACGGA TACGACGTCG TCAGCACTAC AGTTTATCAT GGCCAATTTG GTGAAGTACC CACGTATTCA GGAGAAGCTT TACATGGAAA TCAAAGGAGT CGTCGAGGGA AACAGAGAAG TGAAAGAAGA AGACTTGAAC AAGATTCCTT ATCTGAAAGC TGTGATTTTG GAGGGGCTCC GGAGGCACCC ACCGGGGAAT TTCGTAGTGC CACATGCAGT GACAGAGGAC TTCACATTGG ACGGATACAT GATACCCAAG AACGCTAATG TCAACTTCTT GGTGGGCCAG ATGGGTCGGG ACCCGAGAGT GTGGGAGGAT CCGATGGAGT TCAAGCCCGA GAGGTTCATG AAGGTCAGTG ATGGAAGTGG AAGGAGAATG CTTGAAGATT TGGACTTAAC GGGGAGCAGG GAGATTAAGA TGATGCCCTT TGGTGCCGGC AGGAGG

Séquences 78-1: homologue de CYP78A10

CCTGGCCCTC TTCTTTGTTG GGCAAGGCTT GCCATCCACG ACACTCAAGT GGGCAACCAC GTGGTCCCTG CCGGCACCAC CGCTATGGTG AACATGTGGG CCATAACACA CGACGAGGGT GTCTGGCCTG AGGCCAATCA GTTCAAGCCT GAGAGGTTTT TGGAAGAAGA TGTGAACATC ATGGGGTCTA ATCTTAAGTT GGCTCCTTTC GGAGCTGGCA GGAGG

Séquence 89-2 : homologue de CYP89A5

ATGATTTTTA GGGGGAACTG ATACGACGTC GTCAGCACTA CAGTTTCTCA TGGCCAATTT GGTAAAGTAC CCACGTATTC AGGAGAAGCT TTACATGGAA ATCAAAGGAG TCGTCGCGGG AAACAGAGAA GTGAAGGAAG AAGACTTGAA CAGGATTCCT TATCTGAGAG CTGTGATTTT GGAGGGGCTC CGGAGGCACC CACCGGGGAA TTTCGTAGTG CCACACGCAG TGACAGAAGA CTTCACATTG GACGGATACA TGATACCCAC GAACGCTAAT GTCAACTTCT TGGTGGGCCA GATGGGTCGG GACCCGAGAG TGTGGGAGGA TCCGATGGAG TTCAAGCCCG AGAGGTTCAT GAAGGTCAGT GATGGAAGTG GAAGGAGAAT GCTTGAAGAT TTGGACTTAA CGGGGAGTAG GGAGATTAAG ATGATGCCGT TCGGTGCCGG CAGGAGGA

Séquence 71-1: homologue de CYP71A9

CCTCCTGCCA GCACCCAACG GTATAAGATT CAAAATCCTG TCCCCTGNAA ATCAACAGGA GCCTATTCAA GAACCTTTCC GGCTGAAACC CAGTTGGATT CTCCCAGTAC TCAGGATCCG TAGCTATGGC TTTTGCATTG ATAATCACCC TTGCTCCGCG AGGAATTCTG TATTCTCCGA CGGTGCAGTC CTCGGTCGTT TCTCTGGGGA CAAGCAACGG CGTTGGTGGG TGAAGTCTCA GTGCTTCCTT GAGAACTAAT TTTAGAAACA CCAGTCCCGC CAGATCCTCT TCTTCAACCC TCTTTTTCTC TCCCTTCACA ATTTTTCTTA CTTCATTCTG TGCTCTTTTA AGCACTGATG GATTCCTAAT CAGCTCCGTC ATCGTCCAAA CCAACGTCGC TGAAGATGTA TCCGTCCCCC TAAAAATCAT A


CCTCCTGCCT GCGCCGAACG GAATCAGCTC GAAGTCGTTC CCCCGGGGAT CGATTTTGGC GTTTTCCTTG CTCAGAAACC TCTCCGGGTT GAACTCTAAT GGGTCTTTCC ACACATCCGG GTCACGCCCG ATTGCCCAAA TGTTGACACT CAATCTGGTG TTCTTCGGAA TGTAGTAGCC GTTCACGACG CAGGCTTCGG TGGAGACCCG CGGCAGATTT AGCGGCGTTG ATGGGTGTTT CCGAAACGTT TCTTTGCATA TGGCTTGTAA GTATGGGAGT TTCTCCAAGT CTGATTCTTC AAGCCTTCTG TTTCTGCCGA TTACTCGATC CATTTCTTCG TGAGCCTTTT TCATTATTCT AGGGTTTTTC ACGATCTCAG CCATAGCCCA CTCA

Annexes

223


CCTCCTGCCA GCACCGAACG GCAGTAACCT AAAATCATGT CCTTTCATGT CCACATCCTC CTCGAAATAC CTCTCTGGCC GGAACTCCAA GGGGTTCTTC CAGACAGCCG GGTCCCTAGC TACTGCCCAC ACGTTAACGT GAACGTTTGA TCCTTTTGGA ATGTCGTAGC CACCTATTTT GACATTGGTG TTGGCGCGGT GAGGGAGCAT CAGGGGAGTT GGCGGGTGCA ACCTCAGAGC CTCCTTGGCC ACAGCTTGCA AGTATGGAAG GTTTGAGAAA TCGGGTTCTG TCAACACACG TTGAAGACCC ACCACACGGT CTAGTTCCTC CTGTGCTTTG TGTTGCACTC TAGGGTTTTT TATGAATTCA GCCATAGCCC ACTC

Séquence 71-2: homologue de CYP71A10

CCTCCTGCCG GCGCCAAAGG GGATCAGTTC AAAATTTGTT CCTTTGTAAT CGATTGATCT ATCGATGAAT CTCTCCGGAA AAAATCTTTC TGCTTCACTC CAATACTCAG GATCCCTTCC AATGGCCCAA GCATTAACAA TGACTCTAGA CCCCTCAGGA ATGTCGTATC CGAGAATTTG ACAGGCTTGC CTACATTCTC TTGGGAACAA CATTGCAAGC GGAGGGTGCA ATCTCAGAGT TTCTTTAATG ACTAGCTTCA AGTAGTCTAA TTCCTGAAGG TCTTCTTCAT TAACATTTCC CTTATCCTGA CAAACTCTTC TTACCTCTGC TTGTGCCTTT TCCAAAACTC TTGGGTTTTT AACCAATTCA GCCATAGCCC ACTC

224

225

Listes de publications

Articles dans des revues internationales à comité de lecture

R. Larbat, S. Kellner, S. Specker, A. Hehn, E. Gontier, F. Bourgaud and U. Matern. Molecular cloning and functional characterization of psoralen synthase, the first committed monoxygenase of furanocoumarin biosynthesis (soumis dans JBC)

A.Gravot, R. Larbat, A. Hehn, K. Lièvre, E. Gontier, J-L. Goergen, F. Bourgaud (2004). Cinnamic Acid 4-Hydroxylase Mechanism-Based Inactivation by Psoralen Derivatives: Cloning and Characterization of a C4H from a Psoralen Producing Plant -Ruta Graveolens - Exhibiting Low Sensitivity to Psoralen Inactivation. ABB, 422-1, 71-80

F. Bourgaud, A. Hehn, R. Larbat, S. Doerper, E. Gontier and U. Matern. Biosynthesis of coumarins in plants: a major pathway still to be unravelled for cytochrome P450 enzymes (Accepté dans Phytochemistry reviews)

C. Comino, S. Lanteri, E. Portis, A. Acquadro, A. Romani, A. Hehn, R. Larbat, F. Bourgaud. Isolation and functionnal characterization of a cDNA coding an hydroxycinnamoyltransferase involved in phenylpropanoid biosynthesis in Cynara cardunculus L. (soumis dans MGG)

Communications internationales par voie d’affiche

R. Larbat,

S. Kellner, A. Hehn, E. Gontier, J. Hans, U. Matern and F. Bourgaud. Heterologous expression and functional characterization of psoralen synthase, the first P450 monooxygenase involved in furanocoumarin biosynthesis. Poster présenté lors du 8ème congrès international de biodiversité et biotechnologie des P450 de Swansea en Juillet 2006

C. Comino, E. Portis, A. Acquadro, S. Lanteri, A. Hehn, R. Larbat, F. Bourgaud. Cloning and functional characterization of two hydroxycinnamoyltransferases involved in phenylpropanoid biosynthesis in C. cardunculus L.

Communications nationales par voie d’affiche

R. Larbat, A. Gravot, A. Hehn, V.C. Nguyen, C. Comino, J.L. Goergen, F. Bourgaud. Étude du mécanisme d’inhibition d’un cytochrome P450 par les furocoumarine ; utilisation d’une approche de mutagenèse dirigée sur la cinnamate-4-hydroxylase (CYP73A32) de Ruta graveolens L. Poster présenté lors du séminaire de l’école doctorale RP2E du 15 Janvier 2004

Contribution à l’étude des P450 impliqués dans la biosynthèse des furocoumarines

Les furocoumarines sont des métabolites secondaires végétaux jouant un rôle de phytoalexines chez les plantes et présentant un potentiel thérapeutique important, notamment en dermatologie. Les travaux présentés dans ce document se sont focalisés sur l’étude des cytochromes P450 participant à leur voie de biosynthèse.

Une étude des relations structure-fonction de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H) a été réalisée. Les C4H de Ruta graveolens (CYP73A32), Petroselinum crispum (CYP73A10) et Ammi majus (CYP73A41), trois plantes productrices de furocoumarines, sont moins sensibles à l’inactivation autocatalytique par le psoralène que celle d’Helianthus tuberosus (CYP73A1) qui n’en produit pas. L’étude de mutants et de protéines chimères entre CYP73A1 et CYP73A32 a montré (i) que la « résistance » au psoralène des C4H de plantes productrices de furocoumarines est sans doute issue de processus évolutifs distincts et (ii) que deux régions protéiques sont impliquées dans l’inactivation différentielle entre CYP73A32 et CYP73A1. L’une, située entre les acides aminés 31 et 58, détermine la différence d’affinité pour le psoralène. L’autre, entre les résidus 229 et 379, contrôle la vitesse d’inactivation. L’étude d’un modèle 3D de CYP73A32 a permis d’étayer plusieurs hypothèses sur le rôle de résidus précis dans ces deux régions.

Un travail de clonage et d’identification de nouveaux P450 impliqués dans la biosynthèse des furocoumarines a été entrepris. D’une part, plusieurs ADNc partiels ont été clonés par PCR à partir de tissus de Ruta graveolens enrichis en furocoumarines. D’autre part, la fonction de CYP71AJ1 isolé à partir de cultures cellulaires d’Ammi majus, a été identifiée. Il catalyse la conversion de la (+)-marmésine en psoralène correspondant à l’activité psoralène synthase et constitue le 1er P450 cloné et de fonction connue dans la voie des furocoumarines. La spécificité de CYP71AJ1 pour la (+)-marmésine a été approchée par l’étude d’un modèle 3D.

Mots clés : cytochrome P450, psoralène synthase, cinnamate-4-Hydroxylase, C4H, métabolite secondaire, Ruta graveolens, Ammi majus, inactivation autocatalytique, furocoumarines, psoralène, (+)-marmésine, Modélisation 3D, (+)-columbianetine

Study of P450 involved in furocoumarin biosynthesis

Furocoumarins are plant natural products acting as phytoalexins in plants and also known as therapeutic agents especially in dermatology. The work reported here focused on cytochromes P450 involved in their biosynthesis pathway.

The first part of this work was dedicated to the study of Cinnamate-4-hydroxylase (C4H) structure-function relationships. C4H from Ruta graveolens (CYP73A32), Petroselinum crispum (CYP73A10) and Ammi majus (CYP73A41), three furocoumarin-producing plants, are less susceptible to mechanism-based inactivation by psoralen than C4H from Helianthus tuberosus (CYP73A1) which doesn’t produce furocoumarins. Study of site-directed mutants and chimera between CYP73A1 and CYP73A32 showed that (i) C4H from furocoumarin producing plant adapted to psoralen inactivation probably by different evolution process and (ii) two parts of the protein are involved in the differential susceptibility of CYP73A32 and CYP73A1 to psoralen. The first, between amino acids 31 and 58, defines differential affinity to psoralen. The second between residues 229 and 379 controls inactivation kinetic. Study of a CYP73A32 model allowed us to make some predictions on the role of specific amino acids in this regions.

The second part of this work was devoted to cloning and identification of new P450 involved in furocoumarin biosynthesis. On the one hand, several partial cDNA were cloned by a PCR approach from a Ruta graveolens furocoumarin enriched tissue. On the other hand, the function of CYP71AJ1 cloned from Ammi majus cells cultures, was identified. This clone catalyse the conversion of (+)-marmesin to psoralen refereed as the psoralen synthase activity. Thus, CYP71AJ1 is the first furocoumarin-producing-P450 that as been cloned and identified. The specificity of CYP71AJ1 for (+)-marmesin was approached by the study of a 3D model.

Key words : cytochrome P450, psoralen synthase, cinnamate-4-Hydroxylase, C4H, secondary metabolite, site directed mutagenesis, Ruta graveolens, Ammi majus, mechanism-based inactivation, furocoumarins, psoralen, (+)-marmesin, homology models, (+)-columbianetin.

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LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4docnum.univ-lorraine.fr/public/INPL/2006_LARBAT_R.pdf · 2016-12-13 · Catherine Larrière mes deux secrétaires préférées