L'immunodiagnostic: principes et développement actuel

ANALYSES PROSPECTIVES - REVUES GENERALES

L'immunodiagnostic • principes et d( veloppemeni actuel

S. A v r a m e a s

Unit(~ d'Immunocytochimie - Institut Pasteur Paris

La d~tection ou le dosage dans un milieu complexe comme le s~rum d'un constituant d'int~r~t biologique ou clinique, comme une prot~ine, une hormone ou un m~dicament, est difficile ~ r~aNser par des pro- c~d~s conventionnels d'analyse. En effet, il faut proc~- der en g~n~ral (~ toute une s~rie de fractionnements n~cessitant beaucoup de temps, souvent fastidieux

r~aliser. Par contre ces analyses deviennent beaucoup plus aisles, si on emploie la r~action immunologique, Ainsi, si I'on poss~de un anticorps sp~cifiquement dirig~ contre un constituant, il est possible, en suivant un certain nombre de proc~d~s immunologiques, de d~tecter ou de doser ce constituant directement darts le s~rum, c'est-6-dire proc~der 6 un immunodiagnostic,

L'immunodiagnostic est donc bas~ sur la r~action d'un anticorps qui reconnaTt avec une grande sp~cificit~ un constituant ou en d'autres termes son antigone correspondant. L'immunodiagnostic est extr~mement sp~cifique du fait de la nature m~me de la r~action immuno- Iogique et peut atteindre une tr~s grande sensibilit~ si des proc~d~s appropri~s sont utilis~s pour mettre en ~vidence la r~action antig~ne-anticorps,

Au d~but, les techniques d' immunodiagnostic qui ~taient simples ~ r~aliser, ont ~t~ appliqu~es dans le domaine biomedical comme par exemple dans le typage des groupes sanguins, et dans la classification des bact~ries. Au fur et (~ mesure, ces techniques se sont cependant de plus en plus diversifi~es et d~velopp~es. Elles sont actuellement employees dans plusieurs domaines allant du diagnostic clinique ~ I'agro-alimentaire, en passant par le contr61e des m~dicaments et de la fraude.

Ces techniques qui initialement ~taient effectu~es de fa?on manuelle ont ~t~ remplac~es par des syst~mes automatiques adapt~s pour I'analyse en grande s~rie. En m~me temps, le progr~s apport~ par l '~lectronique a permis le traitement de I'information et par consequent une interpretation plus objective des r~sultats obtenus,

Parmi les techniques d'immunodiagnostic, on peut dis- tinguer les trois suivantes :

4 - celles qui utilisent les antig~nes ou anticorps natifs sans aucune modification,

2 - celles qui utilisent des particules, telles que les globules rouges ou les billes de plastique pour la visualisa- tion de la r6action immunologique,

3 - celles qui utilisent des antig6nes ou des anticoprs marqu~s avec un traceur appropri~,

En r~gle g~n6rale, les premi6res sont les moins sensibles, les derni~res les plus sensibles, tandis que les techniques qui utilisent les particutes se situent 6 un niveau interm6- diaire. Dans ce qui suit, nous d6crirons les premieres et secondes assez bri6vement, tandis que nous examine- rons plus en d6tail les troisi~mes qui sont celles qui ont ~t6 le plus intensivement d~velopp6es au cours des vingt derni~res ann6es.

Des ouvrages et des revues g6n~rales sur ces diverses techniques ont 6t6 publi~s et sont mentionn~s 6 la fin de cet article [voir r~f~rences].

Techniques utilisant des antig(~nes ou des anticorps non-marqu(~s

Ces techniques sont bas6es sur la formation d'un pr~cipit~ qui est obtenu apr~s r~action d'un antigone s.olu- ble avec un anticorps 6galement soluble. La quantit6 du pr~cipit~ form6 est 6valu~e visuellement ou mesu- r~e par turbidom6trie. L'introduction r6cente de n6phe- Iom~tres; ~ base de laser, capables de mesurer la dif- fraction de la lumi6re, a contribu6 6 rendre ces proc6- d6s plus precis et plus performants, Mais ta precipita- tion antig~ne-anticorps ne devint couramment utilis~e pour I' immunodiagnostic qu'apr~s I'introduction par Oudin en 4946 [4] du principe de la r~v~lation du pr~- cipit~ antig~ne-anticorps dans un milieu g61ifi6 [gel d 'agar agar]. Ce proc~d~ est (~ la base de I'immuno- 61ectrophor~se de Grabar [2], de I'~lectrosyn~r~se de Bussard [3], de I'immunodiffusion radiale de Mancini [4] et de la technique dite << des rockets >> de Laurell [5], qui ont permis I'analyse qualitative et quantitative d'un grand nombre de milieux biologiques.

Les techniques de pr6cipitation sont pr~cises, simples et ne n6cessitent pas d'6quipement sophistiqu6. N~an- moins, leur sensibilit~ n'est pas ~lev6e [de I'ordre de 40/~g/ml pour les immunoglobulines] et elles deman- dent en moyenne 24 heures pour leur r6alisation. Cepen-

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dant, elles restent actuellement d'usage courant, par exemple pour la d@tection d'une prot@ine my@loma- teuse ou le dosage des constituants s~riques presents en grande quantitY.

Techniques utilisant des particules

Ces techniques sont bas~es sur la formation d'un agglu- tinat entre particules ; on distingue deux types de pro- c~d~s : I'agglutination directe et I'agglutination indirecte ou passive.

bans le proc@d@ de I'agglutination directe, I'addition d'un s~rum ou d'un autre l iquide biotogique dans une suspension de globules rouges, peut, au bout d'un temps relativement court [de I'ordre de quelques dizaines de minutes] aboutir ~ I'agglutination de ces globules rouges. Avec ce type de proc~d@, on peut conclure que le s~rum examin@ contient des anticorps dirig@s contre des antig@nes de la surface de ces erythrocytes, et si I'on conna~t ie groupe de ces erythrocytes, il est possible ensuite d'utiliser ce s~rum dans le typage des groupes sanguins. De la m~me fa?on, I'emptoi d'antis@rum sp@cifiques provoquant I'agglutination de certaines sou- ches de bact@ries permet la classification des bact~ries,

bans le test de I'agglutination passive, on utilise des globules rouges ~ la surface desquels on a attach@ un anti- g@ne [6]. L'agglutination de ces globules rouges << sensibilis~s >> par un s@rum permet d'~tablir la pr@sence des anticorps dirig~s contre cet antig@ne. Inversement, I'inhibition de cette agglutination, par I'addition d'un milieu, permet d'~tablir la presence de cet antig@ne dans ce milieu. Alternativement, I'agglutination de globules rouges sensibilis~s par un anticorps permet la d@tection de I'antig~ne correspondant dans un milieu.

En g@n~ral, I'~tendue de I'agglutination d'une suspension d'erythrocytes est ~valu~e visuellement et par cons@quent les r~sultats obtenus ne peuvent @tre que partiellement objectifs. Ainsi, I'h~magglutination directe ou indirecte ne permet qu'une @valuation approxima- tive de la quantit@ d'un antig@ne ou d'un anticorps pr~- sent dans un liquide biologique. D'autre part, la pr@paration de globules rouges sensibilis@s de qualit~ ainsi que leur stockage, n'est pas une t~che toujours ais le. Cependant, malgr@ ces inconv~nients, I'h@magglutination reste ~ I'heure actuelle une technique majeure dans le diagnostic m~dical, surtout dans les domaines de I'infection virale et bact@rienne et les maladies auto- immunes. Ceci est dO au fait que I'h~magglutination est une technique extr@mement simple, suffisamment sensible, ne n@cessitant qu'un temps relativement court pour sa r~alisation.

Ces considerations, associ~es au fait que tr~s souvent darts un diagnostic m~dical une r@ponse affirmative ou n~gative est suffisante, font que I'h@magglutination est encore une technique largement utilis~e, comme par exemple dans le diagnostic de la grossesse. D'autre part, le proc@d@ d'h@magglutination peut actuellement @tre compl@tement automatis@ gr(~ce ~ des apparei l- lages commercialement disponibles permettant ia dis- tribution, la dilution et le mixage de plusieurs @chantil- Ions ~ la fois.

Pour la r~alisation de I'agglutination, des particules autres que les globules rouges ont @t~ essay@es comme supDort pour I'immobilisation des antig~nes ou des anticorps. Parmi ces particules, des suspensions de billes de polystyr@ne d'une tr@s grande homog@n~it@ de dimen- sions [latex] furent celles ayant donn~ les r~sultats tes plus satisfaisants [7]. Avec ces billes et ~ I 'aide d'un appa- reil lage @lectronique de comptage de particules, il est possible actuellement de mesurer I'agglutination et d'exprimer les r@sultats obtenus en termes quantitatifs. Cependant, le prix ~lev~ de cet apparei l sophistiqu~, con?u pour le diagnostic en grande s~rie ne permet pas d'envisager son emploi ~ grande @chelle.

Techniques utilisant des anticorps ou des antig(~nes marquis

L'emploi des anticorps marqu6s date de 4944, quand A. Coons a pr@par@ pour la premi@re fois un anticorps marqu6 avec un fluorochrome et I'a utilis6 pour mettre en 6vidence, (~ I 'aide d'un microscope 6 fluorescence, des constituants tissulaires [8]. Cette technique, nomm6e immunofluorescence, peut @tre consid~r6e comme pr6- curseur de toutes m6thodes bas~es sur I'emploi d'anticorps [ou antig@nes] marqu6s,

Depuis I'av@nement de I'immunofluorescence, les techniques bas6es sur I'emploi des anticorps marqu6s ont connu un grand d~veloppement. Elte se sont consid6- rablement diversifi~es dans leurs principes et sont employ6es actuellement dans des domaines extr@mement vari6s. Leur point commun est I'utilisation d'un anticorps [ou d'un antigone] marqu~ avec un traceur pou- vant @tre d6tect~ en quantit6s tr~s faibles. Ainsi, la sp@- cificit@ immunologique se trouve associ@e 6 un syst6me sensible de d6tection. Ces techniques sont employees pour d@tecter les constituants cellulaires 6 I 'aide d'un microscope ou pour doser les substances vari@es en milieu l iquide par des proc6d6s ad~quats. Diff~rents traceurs ont ~t6 utilis~s : fluorochromes, m~taux Iourds, bac- teriophages, radicaux libres, radio-61@ments, enzymes, substances denses aux 61ectrons. Actuellement, les traceurs les plus largement utilis6s sont les fluorochromes, les enzymes et les radio-@l~ments.

• D~tect ion des constituants cellulaires : techniques immunocytochimiques

Les proc~d~s utilis~s pour mettre en ~vidence des constituants cellulaires, ~ I'aide d'un anticorps marqu@, sont appel@s techniques immunocytochimiques. Les deux proc~d@s sur lesquels elles reposent, technique directe ou indirecte, ont ~t~ ~tablis par Coons pour I'immunofluorescence.

Pour d@tecter un antigone par la technique directe, la preparation cellulaire est incub6e avec un exc~s d'anticorps marqu6, ce qui permet 6 cet anticorps de r6agir avec le constituant cellulaire. L'exc~s de I'anticorps marqu~ est alors ~limin6 par lavages et le traceur associ6 avec la pr@paration cellulaire est d@tect6 6 I'aide d'un proc@d~ appropri~ [Figure 4].

Pour d6tecter un antig@ne ~ I'aide de la technique indirecte, la pr6paration cellulaire est incub@e avec un anticorps non-marqu6 sp6cifique de I'antig@ne que I'on cherche (~ d@tecter. Apr~s r6action de cet anticorps



-b -b

Figure

Principe de la technique directe pour la d~tection d'un antigone cellulaire.

: antigone cellulaire

', ~ : anticorps marque, /

avec I'antig@ne, I'exc~s de r~actif est @limin~ et un anticorps marqu@, sp~cif iquement dir ig~ centre le premier anticorps, est ajout~. Ce second anticorps est pr~par@ dans une esp~ce diff@rente de cel le qui a fourni le premier anticorps, La suite des operations se d@roule comme pour la technique directe [Figure 2], Le grand avantage de cette technique indirecte est qu'un m~me anticorps peut ~tre utilis@ dans des cas tr~s diff~rents.

Les traceurs les plus utilis@s dans les techniques immunocytochimiques sent les fiuorochromes. Les fluorochromes, quand ils sent illumines par un rayonnement de courte Iongueur d'onde, ~mettent de ta lumi~re d'une Iongueur d 'onde plus grande, visible avec un microscope 6quip~ d'un appare i l lage appropri6. L'apparei l lage comprend une source de lumi@re d'excitation UV, des filtres d'excitation laissant passer uniquement les Iongueurs d 'onde n6cessaires pour I'excitation des fluorochromes, ainsi que des filtres de protection pour I'oeil. La fluoresc6ine et la rhodamine sent les deux fluorochromes les plus utilis@s, La fluoresc@ine ~met dans ie jaune-vert et la rhodamine dans le rouge des Iongueurs d 'onde du spec- tre visible,

L'immunofiuorescence est une technique simple, rapide et sensible. Elle a ~t~ particuli@rement utile pour les diagnostics biom~dicaux. Plus g@n~ralement, elle a contribu~ {3 nos connaissances actuelles dans divers domaines de la Biologie.

Malgr~ le grand nombre de divers autres proc~d@s d~velopp@s depuis, I ' immunofiuorescence reste un des proc~d@s majeurs dans le diagnostic m@dical. L'identi- f ication des virus dans les crachats des enfants atteints de maladies respiratoires ou la d@tection des immun- complexes dans les glom~rules des patients atteints de maladies r~nales en sent des exemples typiques.

L'emploi des enzymes comme traceurs dans les techniques immunocytochimiques est plus r6cent. II remonte {3 1966, quand, pour faciliter les 6tudes entreprises au laboratoire sur la diversit6 des anticorps synth~tis6s par les lymphocytes, nous avons 6t6 amends, comme d'ail-

Figure 2

Principe de la technique indirecte pour la d~tection d'un antigone cellulaire.

: antigone cellulaire

: anticorps non marqu@ sp6cifique de I'antig@ne

-, : anticorps marqu@ dirig@ centre I'anticorps sp~cifique de I'antig~ne,

leurs Nakane et Pierce {3 la m6me ~poque aux Etats-Unis, {3 substituer les fluorochromes par des enzymes [9, t0].

Les principes de base sent les m6mes que ceux qui g6rent I ' immunofluorescence, mais les enzymes sent mises en @vidence par des precedes cytochimiques qui font appe l {3 des substrats, sp6cifiques de chaque enzyme, dent le produit final est insoluble et color6. La peroxydase est I'enzyme de premier choix la plus utili- s~e, mais la phosphatase alcaline et la glucose-oxydase le sent aussi. Ces trois enzymes peuvent 6tre mises en 6vidence par des proc@d6s cytochimiques donnant des colorations diff~rentes,

La comparaison entre les anticorps marqu6s aux enzymes ou la fluoresc@ine a montr6 que la sensibilit~ de ces deux types de traceurs ~tait similaire. Le principal avantage des enzymes sur les fluorochromes est qu'un microscope opt ique ordinaire est suffisant et que les colorations restent permanentes. Le principal avantage de I ' immunofluorescence est sa g rande rapidi t6 et le fait qu'el le peut @tre prat iqu6e sur des cellules vivantes. L' immuno-enzymologie est app l iqu~e dans les m~nnes domaines que I' immunofiuorescence, quoique sur une moins g rande ~chelle, sauf dans I ' immunodiagnostic des cellules sanguines.

En utilisant des anticorps marqu6s avec la peroxydase et un proc~d~ cytochimique appropr i~, il est possible de d6tecter des antig~nes au niveau du microscope 61ectronique, Cependant, compte tenu du prix et de la Iourdeur de manipulat ion, on effectue rarement un immunediagnost ic avec le microscope 61ectronique,

L'emploi des anticorps marqu6s aux radio-isotopes dans les techniques immunocytochimiques a ~t6 d6crit pour la premi@re fois en 1959 par Berenbaum [I 1]. De fagon similaire {3 I ' immunofluorescence, un anticorps marqu@ avec un radio-@16ment tel que le tritium 3H ou I' iode t251 peut ~tre utilis6 pour la d@tection des constituants cellulaires. Dans ce cas cependant, le radio-616ment associ@ 6 I'antig@ne est r6v61~ en recouvrant la pr6paration cellulaire avec une 6mulsion photographique et en pro- c6dant, apr6s un certain temps d'exposition, au d6ve-

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- ,,. A N A L Y S E S P R O S P E C T I V E S - R E V U E S G E N E R A L E S

~ ÷

Figure 3 Principe du proc~d~ comp~t~tif pour le dosage d'antig~ne

~ anticorps immobilis~

¢ = antigone marqu~

• antigCne (~ doser present dans I'~chantillon,

ioppement de I 'autoradiogramme. Cependant, la faible resolution du microscope optique, associee 6 une resolution 0 peine satisfaisante inherente ~ I 'autoradio- graph•e, ainsi que la Iourdeur de manipulation de cette technique, la rend inapte ~ son emploi dans le diagnostic immunocytochimique,

• Dosage des constituants en milieu l iquide

En 4959, Yalow et Berson decrivent la radio-immunologie quantitative, premiere technique immunologique qui utilise des reactifs marqu6s avec un traceur [en I'occu- rence les radio-isotopes],.et qui permet un dosage precis et sensible de constituant se trouvant dons une solution [42]. Depuis cette date, un grand nombre de pro- c6des, bases sur I'emploi de traceurs isotopiques ou non isotopiques, ant ete developpes, qui permettent le dosage de prat iquement tout ant igene ou ant•corps souhaite.

Sur le plan operationnel, ces procedes peuvent Ctre divi- s6s en deux categories : dosage en phase h6terogCne et dosage en phase homog6ne, Dans les dosages en phase heterog¢ne, une e tape de separation entre le complexe antigene-anticorps forme et les r6actifs restant libres est necessaire, Ces procedes ant et6 initiale~ ment developpes pour les traceurs isotopiques et ant 6te adaptes et appl iques par la suite aux traceurs non- isotopiques. Dans les dosages en phase homog~ne, qui ne necessitent pas une e tape de separation, le traceur couple avec I 'antigene poss~de une activite differente selon que I'antig~ne est associ~ avec I'anticorps pour former un complexe immunoiogique ou non. Ces procedes ant ete developpes pour les traceurs fluorescents et enzymatiques et •Is ne sont pas appl icab les aux traceurs isotopiques.

II existe trois proced6s principaux pour le dosage en phase hetCrog~ne, (in du type competi t i f et deux du type non competit if.

>-.

Figure 4 Principe du proc6d6 immunom6trique pour le dosage

d'antigCne

• : antig6ne 6 doser present dans 1'6chant•lion

\ / • : ant•corps marqu6

~--~ : antigCne immobilis6.

Le proc6d6 du type comp6tit i f est represente dans la figure 3, Un echanti i lon contenant I 'antigene (3 doser et une quantite determinee du meme ant igene marque avec un traceur est laisse en incubation avec une quantite fixe et limitee d'ant icorps immobilises sur une phase sonde, Dans ces conditions, il y a competition entre I'antigene (~ doser et I 'antigene marque pour le nombre res- treint d'anticorps disponible, Apres equilibre, I 'antigene marque restant libre est separe de celui qui a reagi avec I'anticorps immobilise, Le traceur present dons la solution ou associ6 avec la phase sonde est alors mesure. La quantite de I'antig6ne presente dans 1'6chant•lion est calculee par le degre d'inhibition de la fixation de I'anti- gCne marque sur l'anticorps, et ceci en se ref6rant a une courbe etalon etabl ie en utilisant des quantites fixes et connues d 'ant igene non-marque.

Le proc6de appe le immunometrique, I'un des deux pro- c6des non competitifs, est represente dans .la figure 4, Une quantite determinee d'anticorps marqu6s est ajoutee 0 I'echantillon contenant I 'antigene ~ doser. Apres reaction arlt igene-anticorps, une quanti te fixe d'anti- gCne immobilise sur une phase sol•de est ajoutee. L'anticorps marque libre qui n'a pas r~agi avec I'antig~ne soluble, se fixe ainsi sur I'antigene immobilise. Par la suite, comme dans le proced6 comp¢titif, le traceur est mesure apr~s s6paration de la phase sol•de de la phase tiquide.

Un procede largement utilise, appe le <, sandwich >, [ou parfois proc6de immunometrique ~ deux sites], est represente dans la figure 5. L'echantillon contenant I'antigene

doser est incube avec une quanti te en excCs et fixe d'anticorps immobilises. La phase sol•de est lavee pour el•miner I 'antig¢ne n'ayant pas reagi avec I'anticorps immobilise et ensuite une quanti te fixe d'ant icorps marque est ajout6e. Apr@s fixation de I'anticorps marqu6 sur I'antigCne complexe avec I'anticorps immobilise, la phase sonde est lavee et le traceur est mesure.

Le procede de dosage base sur la comp6ti t ion est par- ticuliCrement bien adap te pour la mesure de constituants de faible poids mol6culaire, comme par exem- pie une hormone st~rofde ou une drogue. Cependant, ce procede necessite de I'antigCne tres pur, ce qui n'est pas toujours facile ~ preparer. Dans ce cas, les deux pro- cCd6s immunometriques et << sandwich ,, qui utilisent des ant•corps marques sont plus appropries, Le procede non-competitif du type << sandwich ,. semble etre le plus sensible de tous les proc6des, et sa g a m m e utile de

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dosages est la plus Ctendue. Cependant, ce proc~d¢ exige que I'antig~ne que I'on cherche poss~de au moins deux sites antig~niques [ce qui est le cas surtout des poly- pept ides de poids mol~culaire ~lev~].

* Les t raceurs radio- isotopiques

L'introduction par Yalow et Berson de la radio-immuno- nologie, basCe sur les traceurs isotopiques, a boulevers~ le diagnostic m~dical. Elle s'est averse un outil pr¢cieux dans la recherche biomCdicale e t a Ct~ particuli~rement utile en physiologie, endocr inologie et pharma- cologie.

Avec la radio- immunologie, dont la limite de d~tection est approximat ivement de 40 -45 M, il a ~t~ possible, pour la premi¢re fois, de mesurer d 'une fa?on sp~cifique et sensible un grand nombre de substances natu- relies ou synthCtiques. A I'heure actuelle, les dosages radio-immunologiques sont largement utilis¢s. Toute une industrie a ¢t¢ construite autour de la fourniture des r~actifs n¢cessaires ou de trousses de diagnostic pr¢tes (~ I 'emploi, appel~es << Kit ,,. C'est ainsi que des prot~ines associ~es aux tumeurs, des antigCnes ou des anticorps apparaissant dans certaines maladies infectieuses et plusieurs hormones, m~diateurs et m~dicaments, peuvent ¢tre doses gr(~ce ~ ces Kits.

Quoique la g rande majorit~ des dosages radio- immunologiques soient performants et de rCalisation relativement facile, I 'emploi de radio-~l~ments comme traceurs prCsente plusieurs inconv~nients. En effet, le temps de demi-vie des r~actifs est court, le prix de revient de I'analyse ainsi que de I 'apparei l lage n~cessaire pour I'effectuer est ~lev~, I '~vacuation de d¢chets radioac- tifs pose des prob¢mes, ainsi que les diff~rentes I¢gisla- tions nationales concernant la fourniture et la manipulation des radio-~l~ments. C'est pourquoi un certain nombre de traceurs non-isotopiques ont ¢t¢ proposes

la p lace des radio-isotopes. Parmi ces traceurs, les fluorochromes mais surtout les enzymes connaissent actuel lement un grand d~veloppement.

• Les t raceurs f luorescents

Bien que tes anticorps marqu is aux fluorochromes aient ~t~ les premiers traceurs 6 ¢tre utilis~s et qu'ils soient m¢me encore largement employCs dans le diagnost ic au niveau cellulaire, leur utilisation dans des procCdCs quantitatifs du type radio- immunologique n'a dCbut~ que tr~s r~cemment. Ceci est d~ au fait que les appa- reil lages disponibles pour la lecture de la f luorescence Ctaient non-performants, ou performants mais de manipulation fastidieuse, et aussi parce qu'il existe un r~el et difficile probl~me de fluorescence parasite rencon- tree dans presque tousles liquides biologiques. Cepen- dant, les progr~s apportCs au cours des derniCres annCes dans I'instrumentation de la mesure de la fluorescence permettent le dCveloppement d'un certain nombre de proc¢d~s bas¢s sur oes traceurs.

Les dosages f luoro-immunologiques en phase h~tCro- gCne sont bases sur les mCmes principes que les dosages radio-immunologiques, mais la mesure de la fluorescence remplace la mesure de la radioactivit¢.

Cependant, c'est surtout dans le dCveloppement d'un certain nombre de procCd~s en phase homogCne que les fluorochromes ont ~t¢ utilis~s. IIs permettent surtout le dosage des haptCnes, c'est-~-dire des constituants de faible poids mol~culaire comme les drogues, les stCro'i'-

des et les m~diateurs. Le premier procCd¢ de oe type a ¢t6 r6alis¢ par Dandliker en 4964 [43], mais il avait 6t¢ abandonn¢ par manque de sensibilit6.

Dans ce proc6d~, I 'addit ion d'un anticorps anti- p6nicilline dans une solution contenant de la p6nicilline marquee (~ la fluoresc6ine change le pouvoir de polarisation de fluorescence de cette solution. Cet effet est bas6 sur le principe que Iorsqu'un rayon de lumiCre pola- ris6 est transmis ~ travers une solution contenant un constituant fluorescent, le degr6 de polarisation de la lumi¢re est affect6 par I'~tat physique du constiiuant fluorescent en solution (dans ce cas pr6cis, si la pCnicilline fluores- cente est complex6e avec I'anticorps ou non]. Un certain nombre de procCdCs bas¢s sur ce pr incipe ont ¢t6 d6velopp6s au cours des derniCres ann6es.

Le signal fluorescent Cmis par certains conjugu6s haptCne-fluoresc6ine est diminu¢ ou Cteint apr~s interaction avec un anticorps anti-haptCne. Ce degr~ d'extinction de la f luorescence est inversement propor- tionnel ~ la concentration de I'hapt~ne libre ajout6 dans le syst~me. Des proc~d6s bas~s sur cette approche ont 6t¢ utilis6s pour la mesure d'un certain nombre de m~dicaments. Une variante de cette approche consiste ~ utiliser un antigCne marqu~ avec la fluoresc¢ine et son anticorps marqu6 avec la rhodamine. Dans oe cas, la fluoresc6ine joue le r61e de donneur et la rhodamine le r61e de I 'accepteur de la fluorescence Cmise par la fluoresc~ine apr¢s son excitation ~ une Iongueur d 'onde appropr i~e.

Quand il y a interaction antig~ne-anticorps, le donneur et I 'accepteur se trouvent suffisamment pr¢s t'un de I'autre pour que la f luorescence 6mise par la fiuores- c6ine soit capt6e et ~teinte par I 'accepteur. Le degr6 de cette extinction de la fluorescence permet la mesure de la r6action antigCne-anticorps. Enfin, dans des cas plut6t rares, il arr ive qu'un con jugu~ hapt¢ne- fluoresc~ine montre une extinction intramol~culaire de la f luorescence qui est enlev~e par I 'addit ion de I'anticorps anti-hapt~ne. II est ainsi possible de mesurer le degr¢ d'augmentat ion de la fluorescence et par consequent de I '¢tendue de la reaction antigCne-anticorps.

Les procCdCs de marquage avec les fluorochromes sont simples, les produits marqu is poss¢dent une Iongue dur~e de vie et ne pr¢sentent pas de risques de conta-

Figure 5 Principe du proc6d6 ,< Sandwich >> pour le dosage d'antig~ne

anticorps immobilis6

• antigone ~ doser present dans 1'6chantillon

~- anticorps marqu6.

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I = * ~ l l l . ~ l * a

Figure 6

Dosage d'antig@ne en phase homog~ne par le procGd~ EMIT

: enzyme [ ~ - - ] marqu~ avee un antigone [ • ]

: anticorps specifique de I'antigGne,

S-C : substrat de I'enzyme,

S + C : substrat de I'enzyme apr~s action catalytique,

mination. Les techniques de dosage bas~es sur ces traceurs sont pr~cises et rapides mais, (~ I'heure actuelle, elles sont moins sensibles que les proc~d~s qui utilisent les radio-isotopes ou les enzymes comme traceurs.

• Les t raceurs enzymat iques

Parmi les diff~rents traceurs non-isotopiques propos6s, les enzymes connaissent actuel lement un intense d6ve- Ioppement.

Les premiers dosages immuno-enzymatiques d~crits en 1971 par Engvall et Perlmann en Suede, par Van Wee- men et Schuurs en Hollande, et par notre laboratoire sont en phase h@t~rog~ne et sont donc bas6s sur des principes simitaires ~ la radio- immunologie quantitat ive ['14, 17]. Dans ces proc~d~s, I'enzyme utilis6e comme traceur est r6v61@e ~ I 'aide d'un substrat chromog~nique, c'est-6-dire donnant lieu ~ un produit color~. L'intensit@ de la coloration d@velopp~e peut alors ~tre @valu~e a I'ceil nu ou mesur~e de fagon pr@cise avec des apparei ls appropri@s.

Le premier dosage immuno-enzymatique en phase homog~ne, connu maintenant sous le sigle EMIT [Enzyme Multiplied Immunoassay Technique], a ~t~ d@crit en t 972 par Rubenstein et col laborateurs [18]. II est bas~ sur I 'emploi d'une enzyme conjugu~e a un hapt@ne poss@- dant une activit~ enzymatique peu ou pas modifi@e par rapport ~ I'enzyme sous sa forme native.

L'addition d'un anticorps anti-hapt~ne a ce conjuguG a comme cons@quence une modif icat ion de sa struc- ture se traduisant par une diminution ou une inhibition complete de son activit~ catalytique. Si, dans ce syst~me, on ajoute un hapt~ne non-marquG, ce dernier d@place I'anticorps associ~ a I'hapt@ne du conjugu~, augmenfanf ainsi I'activit~ enzymatique [Figure 6]. Le degr@ de cette augmentation de I'activitG enzymatique permet, par r~f@rence (~ une courbe @talon, de mesurer la quantit@ de I'hapt@ne ajout@. Par la suite, d'autres proc@d@s de dosages immuno-enzymatiques en phase homog(~ne ont @t@ d@velopp~s, IIs sont tous bas~s sur le m@me principe fondamental , c'est-~-dire que I'activit@ catalyt ique du conjugu~ enzymatique est modul~e selon la quantit(~ de I 'hapt~ne ~ doser,

Figure 7

Titration d'un antigone par erythro-immunoessai. Les puits apparaissant comme exempts de globules rouges

correspondent ~ des echantillons qui contiennent I'antig~ne, tandis que les puits contenant des globules rouges sous forme d'un point noir correspondent ~ des ~chantillons sans antig6ne,

Les dosages immuno-enzymatiques en phase homo- g~ne sont precis, simples et rapides, mais sont nettement moins sensibies que les dosages en phase h6t6rog6ne. Pour cette raison, ils sont uniquement appl iquables au cas des hapt~nes. Le seul proc~d~ en phase homog~ne actuel lement utilis6 sur une grande 6chel le pour le dosage des drogues, est la technique EMIT, d6velopp~e et commercial is~e par la firme am6r icaine SYVA, Etant donn6 1'6tat actuel de d6ve loppement des techniques immuno-enzymatiques en phase homog~ne, nous consi- d6rons uniquement dans ce qui suit les proc6d6s immuno-enzymatiques en phase h6t~rog~ne,

La sensibilitY, la reproductibilit6 et la precision des dosages immuno-enzymatiques en phase h6t6rog6ne d6pendent des diff6rents r~actifs utilis6s, mais surtout de la phase solide, du conjugu6 anticorps-enzyme et de I'enzyme choisi comme traceur,

- II existe de nombreux supports capables de fixer des anti- g~nes et des anticorps. La fixation peut avoir lieu soit par des liaisons chimiques, soit par simple adsorption passive. Ainsi, les particules d 'agarose, de polyacrylamide ou de cellulose trait6es par diff6rents agents chimiques sont utilis~es pour I'immobilisation covalente des anticorps ou des antig6nes.

La s~paration entre phase solide et phase l iquide est g6r/6ralement r~alis~e par centrifugation, par d~can- tation ou, comme il a ~t~ d~velopp~ au laboratoire, (~ I 'aide d'un champ magn~t ique en utilisant comme phase solide des spheres de polyacrylamide contenant un oxyde ferro-magn~tique. Cependant, I' immobilisation par simple adsorption passive est le proc6d6 le plus couramment utilis6. Le polystyrene, le polycarbonate, le polypropyl~ne sous forme de tubes, de disques, de billes ou de plaques sont employ~s, L'utilisation en par- ticutier de microplaques de polystyrene a abouti au d~veloppement de syst~mes enti~rement automatiques, commerc iatement disponibles, qui permettent actuellement le dosage en routine d'un grand nombre d'6chantil lons.

En g6n6ral, les conjugu6s anticorps-enzymes sont pr6- par~s a I 'aide de r6actifs chimiques, comme le glu-

Trait d'Union n ° 6 - p a g e t5


%FLUO 1 0 3

Ir

B.G 100 000 200 000 400 000 600 0 0 0

Molecules d'lgE/puits

Figure 8

Dosage immuno-enzymatique de I'lgE humaine en utilisant comme enzyme traceur la ~-galactosidase et un substrat

fiuorog6nique lie 4-methyl-umbelliferyl-b-D-galactopyranoside], En ordonn6e le pourcentage Ix 103] de la fluorescence

produit apr~s action enzymatique, en abcisse le nombre de molecules d'lgE par pulis B.G. : bruit de fond,

tarald~hyde ou le periodate de sodium, qui permettent de lier d'une fagon covalente I'anticorps (~ I'enzyme, Cependant, il est aussi possible de tier I'anticorps I'enzyme de fagon non-convalente en tirant profit des interactions sp~cifiques existantes dans certains syst~- mes comme I'interaction avidine-biotine, lectines- glycoconjugu~s, antig~ne-anticorps. L'emploi de tels syst~mes a abouti ~ la r~alisation dans notre laboratoire d'un nouveau type de proc~d~, I'erytho-immunoessai, dans lequel le traceur enzymatique est remplac~ par des erythrocytes [t9]. Dans ce proc~d~, la lecture de r~sultat ne n~cessite aucun apparei l et le dosage est aussi sensible que le dosage immuno-enzymatique ou radio-immunologique [Figure 7],

Un certain nombre d'enzymes comme la peroxydase de raifort, la glucose oxydase d'Aspergillus niger, la phosphatase alcal ine d'Escherichia coil ou de la muqueuse intestinale de veau et la/~-galactosidase d'Escherichia coli, sont utilis~es en dosage immuno-enzymatique. Le choix de I'enzyme d~pend de la rapidit~ avec laquelle les r~sultats doivent ~tre obtenus et du nombre d'~chantillons ~ titrer. Pour un grand nombre d'~chantillons, il est preferable d'utiliser les enzymes hydrolytiques comme la phosphatase ou la/~-galactosidase, qui permettent une r~action enzymatique de Iongue dur~e et par

consequent une meilleure programmation, tandis que pour un dosage rapide il faut utiliser des enzymes d'oxydo-r~duction, en particulier la peroxydase.

En utilisant les substrats chromog~niques de ces enzymes et des proc~d6s exp~rimentaux bien choisis, on atteint une sensibilit6 6quivalente ~ celle de la radio- immunologie. Cependant, la sensibilit~ des dosages immuno-enzymatiques peut ~tre substantieliement aug- ment~e si, 6 la place des substrats chromog~niques on utilise des substrats fluorog6niques, c'est-(~-dire des substrats donnant lieu ~ un produit fluorescent.

Au laboratoire, nous nous sommes plus sp~cialement int~ress6s 6 I'emploi comme enzyme traceur de la/3- ga!actosidase et de son substrat f iuorog~nique lie 4-methyl-umbetliferyl-b-D-galactopyranoside] qui, apr~s action de I'enzyme, Iib6re un produit particuli~rement fluorescent et stable lie 4-methyl-umbelliferone]. Nous avons d6velopp~ un apparei l assist6 par un micro- ordinateur qui nous a permis d'effectuer le dosage de la fluoescence directement dans les puits [2 ~ 10 t~l] de plaques de plastique, de fagon continue et automati- que. Avec cet apparei l et avec des produits courants et commercialement disponibles, nous avons mis au point une technologie immuno-enzymatique qui permet le dosage en routine de tr~s petites quantit~s de pro- t~ines. Ainsi, nous avons pu mesurer avec une variabi- lit6 moyenne de 10 % jusqu'~ 100 000 molecules [33 femtogrammes d'lgE humaine [Figure 8] ou t 000 000 mol6cules [250 femtogrammes] d'lgG humaine ou murine [20].

Les techniques immuno-enzymatiques offrent un certain nombre d'avantages qui expliquent leur impact actuel dans le domaine du diagnostic. Ainsi, ces proc~d~s ne n~cessitant pas d 'appare i l lage Iourd, peuvent ©tre uti- Iis~s dans tout laboratoire moyennement et m~me som- mairement 6quipS. Cependant, il est aussi possible, en utilisant des apparei l lages appropri~s, de rendre ces proc~d6s compl~tement automatiques et adapt~s pour le diagnostic de routine en grande s6rie, puisque les r~sultats obtenus peuvent ~tre trait6s et analys~s par des micro-ordinateurs. Les anticorps et antig~nes marquis aux enzymes sont d'une grande stabilitY, ils peuvent ~tre utilis6s pendant des ann6es sans perte notable de leurs propri~t6s immunologiques ou enzymatiques. Les r~actifs immuno-enzymatiques sont moins on~reux que les r~'actifs radio-immunologiques, et n'impliquent qu'un risque minime de contamination ou de pollution. Enfin, du fait de leurs propri~t6s catalytiques, les enzymes peuvent ~tre mesur~es a de tr~s faibles quantit~s, et si besoin (~ des concentrations infinit~simales (~ I'aide des substrats fluorog6niques.

Au cours de ces derni~res ann~es, plusieurs proc~d~s immuno-enzymatiques ont ~t~ d~velopp~s et appliques avec succ~s dans le domaine des maladies infectieuses et surtout en virologie, parasitologie, bact~riologie et mycologie. Ainsi, par exemple, dans les abattoirs on d~tecte la trichinose chez les porcs par des proc~d~s immuno-enzymatiques et en Suisse, uniquement pour le contr61e virologique des semences de pomme de terre, plus de 500 000 dosages par an sont effectu~s. Actuel- lement, une bio-industrie est en train de se d~velopper autour des r~actifs immuno-enzymatiques et plusieurs trousses de diagnostic pour t'h~patite, la rougeote, la toxoplasmose et le cytom~galovirus et beaucoup d'autres, sont commercialement disponibles.



Conclusion et perspectives

II est int@ressant d e cons ta te r q u e les cliff@rents proc@- d@s d ' i m m u n o d i a g n o s t i c a c t u e l l e m e n t en a p p l i c a t i o n dans divers d o m a i n e s ont tous pour or ig ine, sauf un, des t r a v a u x d o n t I ' ob jec t i f p r i nc ipa l ~ ta i t la c o m p r 6 h e n s i o n d 'un m@can isme b i o l o g i q u e donn@. Dans c e sens, il est d i f f ic i le d e pr6vo i r dans que l le d i rec t ion vont @voluer les t e c h n i q u e s d ' i m m u n o d i a g n o s t i c . II est for t p r o b a b l e qu 'un proc@d~, i n i m a g i n a b l e au jou rd 'hu i , appa raT t ra d e m a i n et b o u l e v e r s e r a I ' i m m u n o d i a g n o s t i c .

C e p e n d a n t , il f au t s ' a t t end re a c e q u e le p rog r~s d e I ' immunod iagnos t i c suive d e u x voles, D'un c o t 6 le d6ve- I o p p e m e n t d e proc@d~s sophistiqu@s en t i~ rement au to - mat is6s d ' u n e e x t r 6 m e sensibi l i t6, e t d e I 'au t re c6t@ le d @ v e l o p p e m e n t d e p r o c 6 d 6 s pa r t i cu l i ~ remen t simples, r ap ides et peu co0 teux . II f au t s 'a t tendre aussi ~ c e q u e d a n s les a n n 6 e s ~ ven i r le d 6 v e l o p p e m e n t des p roc6 - d6s d e I 'hybr ida t ion m o l 6 c u l a i r e des a c i d e s nuc l6 iques v i enne c o m p l 6 t e r e t am~ l i o re r I ' i m m u n o d i a g n o s t i c a c t u e l l e m e n t existant.

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Documents

L'immunodiagnostic: principes et développement actuel