Lina Valeria Ariza Tapias Dayanna Katherine …repository.udistrital.edu.co/bitstream/11349/23432/1/Ari...Dayanna Katherine Vásquez Escobar Docente Jesús Álvaro Jiménez Montoya

Diseño experimental para la determinación del mecanismo de acción de los ácidos

húmicos extraídos de carbón colombiano sobre colonias Helicobacter pylori in vitro

para establecer su uso como tratamiento alternativo frente a enfermedades

gastrointestinales asociadas

Lina Valeria Ariza Tapias

Dayanna Katherine Vásquez Escobar

Universidad Distrital Francisco José de Caldas

Facultad de Ciencias y Educación

Proyecto Curricular de Licenciatura en Química

Bogotá

2018

Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas

2

Diseño experimental para la determinación del mecanismo de acción de los ácidos

húmicos extraídos de carbón colombiano sobre colonias Helicobacter pylori in vitro

para establecer su uso como tratamiento alternativo frente a enfermedades

gastrointestinales asociadas

Lina Valeria Ariza Tapias

Dayanna Katherine Vásquez Escobar

Docente

Jesús Álvaro Jiménez Montoya

Universidad Distrital Francisco José de Caldas

Facultad de Ciencias y Educación

Proyecto Curricular de Licenciatura en Química

Bogotá

2018


3

Tabla de contenido

1. Antecedentes .............................................................................................................................. 8

2. Justificación ............................................................................................................................... 12

3. Descripción del problema ......................................................................................................... 14

4. Objetivos ................................................................................................................................... 16

4.1. Objetivo general ................................................................................................................ 16

4.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 16

5. Marco teórico conceptual ......................................................................................................... 17

5.1. Generalidades del carbón ................................................................................................. 17

5.1.1. Historia de la formación del carbón .......................................................................... 17

5.1.2. Clasificación del carbón ............................................................................................. 18

5.2. Sustancias húmicas............................................................................................................ 20

5.2.1. Ácidos húmicos .......................................................................................................... 21

5.3. Helicobacter pylori ............................................................................................................ 27

5.3.1. Características generales y morfología de H. pylori .................................................. 27

5.3.2. Colonización bacteriana y factores de virulencia ...................................................... 28

5.3.3. Métodos de diagnostico ............................................................................................ 31

5.3.4. Tratamientos de erradicación ................................................................................... 34

5.3.5. Resistencia bacteriana ............................................................................................... 36

6. Metodología .............................................................................................................................. 39

6.1. Revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la determinación del

mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H. pylori ....................................................... 40

6.1.1. Microscopía de barrido electrónico .......................................................................... 41

6.1.1.2. Microscopio de barrido electrónico ...................................................................... 42

6.1.2. Citometría de flujo .................................................................................................... 44

6.1.2.2. Citómetro de flujo ................................................................................................. 45

6.1.3. Secuenciación de ácidos nucleicos ............................................................................ 49

6.1.4. Análisis proteómico ................................................................................................... 53

6.2. Análisis de los parámetros de estudio con los métodos descritos ................................... 55

6.3. Selección del método para el desarrollo de la propuesta metodológica ......................... 57

7. Desarrollo de la propuesta ........................................................................................................ 59

7.1. Toma y preparación de las muestras de carbón ........................................................... 59

7.2. Análisis próximo ............................................................................................................ 60


4

7.3. Análisis último: .............................................................................................................. 62

7.4. Extracción de Ácidos húmicos: ...................................................................................... 63

7.5. Caracterización de los ácidos húmicos .......................................................................... 64

7.6. Tratamiento microbiológico de Helicobacter pylori ...................................................... 64

8. Conclusiones.............................................................................................................................. 78

9. Bibliografía ................................................................................................................................ 79


5

Índice de figuras

Figura 1. Etapas de la carbogénesis. (“NEV,” n.d.) .......................................................... 18

Figura 2. Clasificación del carbón por rangos .................................................................. 18

Figura 3. Rutas de formación de las sustancias húmicas. ( Rodríguez Neave, s.f.) ......... 21

Figura 4. Modelo estructural de los ácidos húmicos ((Mirza et al., 2011) ......................... 24

Figura 5. División de sustancias húmicas de acuerdo con su solubilidad (Peña-Méndez,

Havel, & Patočka, 2005). ................................................................................................. 25

Figura 6. Helicobacter pylori. (Valdés, 2016) ................................................................... 27

Figura 7. Acción de la ureasa para la supervivencia de H. pylori ..................................... 30

Figura 8. Factores de virulencia de Helicobacter pylori (“FACTORES DE VIRULENCIA,”

n.d.) ................................................................................................................................. 31

Figura 9. Esquema metodológico general ........................................................................ 40

Figura 10. Estructura interna del microscopio electrónico (Universidad Andrés Bello) ..... 42

Figura 11. Tipos de muestra MEB y método de preparación (De Lozano, V et al., 2014) 43

Figura 12. Esquema general de un citómetro de flujo (Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A,

2014) ............................................................................................................................... 46

Figura 13. Pirosecuenciación de DNA (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN). .................... 51

Figura 14. Metodología para la tinción de Gram .............................................................. 70


6

Índice de tablas

Tabla 1. Clasificación de los carbones según sus propiedades físicas y químicas ........... 20

Tabla 2. Porcentaje de los elementos presentes en los ácidos húmicos (Gasset, 1968) .. 23

Tabla 3. Longitud de onda de absorción y emisión de algunos fluorocromos utilizados en

la técnica (Shapiro, 2003; McCarthy, 2010). .................................................................... 47

Tabla 4. Parámetros de análisis con los métodos descritos ............................................. 57

Tabla 5. Composición de diferentes medios de cultivo empleados en el aislamiento de

Helicobacter pylori. Adaptado de: Bayona, 2013 .............................................................. 68

Tabla 6. Medios de cultivo útiles para el cultivo de Helicobacter pylori (Majalca-Martínez,

Rivera-Cabrera, Ochoa-Pérez, & Giono-Cerezo, 2001) ................................................... 69


7

Índice de diagramas

Diagrama 1. Metodología del muestreo y la preparación de las muestras de carbón ....... 59

Diagrama 2. Metodología para el análisis próximo de las muestras de carbón. ............... 60

Diagrama 3. Metodología para la determinación del porcentaje de humedad .................. 60

Diagrama 4. Metodología para la determinación del porcentaje de cenizas. .................... 61

Diagrama 5. Metodología para la determinación del porcentaje de materia volátil. .......... 61

Diagrama 6. Metodología para la determinación de la densidad. ..................................... 62

Diagrama 7. Metodología para la determinación del poder calorífico. .............................. 62

Diagrama 8. Metodología para análisis último de las muestras de carbón. ...................... 63

Diagrama 9. Metodología para la extracción de los ácidos húmicos. ............................... 63

Diagrama 10. Caracterización experimental de los ácidos húmicos. ................................ 64


8

1. Antecedentes

En diferentes estudios se han reportado las propiedades beneficiosas de los ácidos

húmicos en áreas como la agricultura y la medicina. Generalmente a nivel industrial los

ácidos húmicos son empleados en la elaboración de abonos ya que se ha encontrado que

incrementan la capacidad de intercambio iónico y la capacidad de retención de agua

evitando así la pérdida de nutrientes por lixiviación (“Ácidos Húmicos | ACIDOS HUMICOS:

Fertilizantes agrícolas Jisa,” n.d.) , sin embargo, los conocimientos científicos en el área de

la medicina acerca de los mecanismos de acción para el tratamiento de algunas afecciones

son bastante escasos, poniendo en evidencia la necesidad de realizar investigaciones más

amplias y encaminadas a su elucidación, por lo cual en este trabajo se ha planteado el

objetivo de elaborar un diseño experimental para determinar el mecanismo a través del cual

estas sustancias naturales inhiben la bacteria Helicobacter pylori.

A través del tiempo se ha tenido evidencia de cómo diferentes civilizaciones hacían uso de

los humatos para tratar diferentes afecciones de la salud. Desde hace más de 2700 años

A. C. hay evidencia del uso de los ácidos húmicos por parte de los romanos para el

tratamiento de infecciones. Para el año 1.500 el médico chino Li Shi Zan documentó los

usos de los ácidos fúlvicos que junto a los ácidos húmicos hacen parte de la medicina

tradicional china, generando resultados óptimos en tratamientos clínicos, toxicología y

patologías severas.

Por otro lado, hace cerca de 7000 años se conoce un sistema de medicina alternativa hindú

denominada Ayurveda en la cual se prescribe el Shilajit como un elemento

extraordinariamente útil para tratar casi cualquier enfermedad atribuyéndole a su vez

propiedades divinas. Este corresponde a la exudación proveniente de las capas de rocas

en muchas cadenas montañosas del mundo, especialmente en el Himalaya, Tíbet, Norway

y Rusia. Se ha encontrado que el mayor efecto fisiológico del Shilajit se debe a la presencia

de ácidos húmicos y fúlvicos los cuales aparentemente actuaban portando los ingredientes

activos (Suraj P. Agarwal, Rajesh Khanna1 *, R, 2007) Entre los principales usos del Shilajit

está el tratamiento de desórdenes digestivos, distensión abdominal, hemorroides, fístula

rectal y disuria, así como aplicaciones sobre el tracto urinario, vías respiratorias, sistema

nervioso e inmunológico (tratamiento de cáncer) (Suraj P. Agarwal, Rajesh Khanna1 *, R,

2007)

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9

En el año 1914 el investigador Dr. Hanamel lo utilizó como antiséptico en las heridas de los

soldados de la primera guerra mundial. Algunos microorganismos pueden verse afectados

por la acción de estas sustancias naturales, ya que, por un lado, la catálisis de sus

reacciones metabólicas se alteran y por otro, es posible bloquear directamente un virus y

bacteria, por la interacción de los humatos con los sitios químicamente positivos de los

microorganismos (GmbH, 2015). El Dr. Gramsh (1961) y el Dr. Reichert (1966) los usaron

como tratamiento para la acidez y otros trastornos gastrointestinales, pues en caso de una

acidez excesiva, los ácidos húmicos ayudan a disminuirla, en cambio si hay una

disminución, se logra aumentar la producción de ácido gástrico. El Dr. Zimmerman (1971)

y el Dr. Adamek (1976) los usaban como antitumorales, consiguiendo un decremento

significativo de este tipo de células (Montesinos, 2017).

Los ácidos húmicos, son sustancias orgánicas, presentes en el suelo, la turba y zonas de

alta humedad, como lagos, pantanos y/o riachuelos. Son una mezcla de macromoléculas

complejas que tienen estructuras fenólicas poliméricas con la capacidad de quelar metales.

Se les han atribuido diversas propiedades que le permiten luchar contra pesticidas,

herbicidas, compuestos volátiles, tóxicos y metales en el cuerpo humano (Torres, s.f.). Esto

último se debe a que los ácidos húmicos, a través de su efecto quelante, pueden enlazarse

fácilmente a los iones cargados positivamente, tales como manganeso, hierro, cobre y zinc,

lo que favorece desintoxicación de metales a través de su excreción vía urinaria,

contribuyendo así a una correcta función celular y a la disminución del riesgo de desarrollo

de enfermedades causadas a partir de estos metales (DC, 2015).

Empíricamente, hay evidencia de cómo su consumo puede generar efectos positivos para

la salud, desarrollo y crecimiento de los seres vivos. Los ácidos húmicos manifestaron

capacidad de bloqueo sobre virus tales como simplex herpes, Coxsackie A9, Influenza A,

rinovirus 1B, citomegalovirus, VIH-1, VIH-2, gracias a la interacción de los humatos con los

sitios positivos de la cubierta proteica de un virus, así, el complejo virus-humato no es

absorbido en los tejidos (GmbH, 2015). Por ejemplo, se cree que estas sustancias naturales

ejercen una protección contra el VIH, el virus causante del SIDA. En el año 1995 el Dr.

Shneider hizo uso de los ácidos húmicos como tratamiento en el VIH, al inhibir la infección

VIH 1 en las células MT2, posteriormente en 1995 el Dr. Bernacchi logro la estimulación de

Linfocitos TH1 y 2 para tratar enfermedades infecciosas virales y bacterianas, incluyendo

infección de VIH y cáncer (Montesinos, 2017). Para el año 2002, se publicó un estudio en

& quot, La quimioterapia & quot, donde se indica que las células blancas al ser tratadas con


10

oxihumate (una forma de ácido húmico) disminuyó su susceptibilidad a la infección con el

VIH (Sandra, s.f.).

Con base en las diferentes propiedades que se les han atribuido a los ácidos húmicos, en

el mercado existen medicamentos naturales desarrollados a partir de esta sustancia, tales

como el F70, Ácido Fúlvico & Húmico y el HM80, Ácido Fúlvico, Húmico, Minerales y Vit C.

estos productos actúan de la siguiente forma (Montesinos, 2017):

I. Permiten crear un macrófago más fuerte, el cual mantiene encapsulado el virus por

más tiempo hasta que el sistema inmune genere una respuesta adecuada.

II. Ayudan al tracto gastro intestinal, pues facilita la eliminación de bacterias dañinas,

como Helicobacter pylori, y fortalece la presencia de bacterias benéficas, las cuales

liberan nutrientes inmuno defensores.

III. Los Ácidos Húmicos son muy solubles en agua. La interacción de estas dos

sustancias cambia la estructura molecular del agua haciéndola una sustancia activa

más penetrante, facilitando el transporte de vitaminas, minerales, proteínas, etc.

También existe otro medicamento llamado Cytosan, este es un concentrado de humatos de

potasio, enriquecido con silymarin (grupo de alcaloides) y ácido de ámbar. Tiene influencia

positiva sobre el retraso del desarrollo de algunos tumores cancerígenos, previene infartos

de miocardio, embolias cerebrales, coágulos y hematomas. Una de sus funciones más

destacadas es su protección sobre la mucosa intestinal; generan una película protectora,

impidiendo la penetración de sustancias tóxicas y metales pesados hacia el riego

sanguíneo. (ENERGY, 2005)

Tradicionalmente los ácidos húmicos han funcionado como la materia prima para la síntesis

de productos industrializados especializados y servir de sustratos para preparaciones

médicas, pues se han usado durante mucho tiempo como remedio popular en diversas

enfermedades. Por ejemplo, en Babilonia se utilizaron los baños de turba como tratamiento

terapéutico sobre la coagulación de la sangre, la fibrinólisis, la actividad estrogénica, y en

forma de bebida se han utilizado en el tratamiento de enfermedades de tipo gástrico,

intestinal y hepáticas.

Hasta el momento no se han encontrado estudios que especifiquen el mecanismo de acción

a través del cual los ácidos húmicos son capaces de inhibir la bacteria Helicobacter pylori,

tan solo las investigaciones realizadas en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas,


11

han logrado corroborar la inhibición y delimitar el rango de concentraciones mínimas

inhibitorias de ácidos húmicos que favorecen este proceso.


12

2. Justificación

Desde hace casi siete décadas la humanidad ha venido haciendo uso de los antibióticos

para combatir ciertas enfermedades infecciosas. El uso indiscriminado de dichos

compuestos ha generado un grave problema de salud pública mundial a causa del

desarrollo de cepas bacterianas resistentes. La situación tiene tal gravedad que la OMS ha

calificado este suceso como emergencia mundial, por lo cual se ha llamado a sus estados

miembros a tomar medidas para mitigar y estimular la búsqueda y diseño de nuevas

moléculas antimicrobianas así como para realizar tareas de vigilancia, prevención y control

de las infecciones intrahospitalarias y resistencia (Cabrera Cao, Fadragas Fernández, &

Guerrero Guerrero, 2005). Por otro lado es preocupante el elevado costo que significa el

cuidado médico de infecciones causadas por microorganismos resistentes el cual gira

alrededor de 4-7 billones por año en promedio (Asadi A & Razavi S & Talebi M, et al. 2018)

Una de las alternativas para hacer frente este problema consiste en el aprovechamiento de

las propiedades de algunos productos naturales usados en la antigüedad como parte de la

medicina tradicional. Recientemente en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas

se han llevado a cabo investigaciones que ponen en evidencia la capacidad que tienen los

ácidos húmicos presentes en el carbón leonardítico colombiano para inhibir el crecimiento

de Helicobacter pylori en cultivos in vitro, así como las concentraciones óptimas para tal

efecto.

Una de las razones más importantes para utilizar los ácidos húmicos en el tratamiento de

diferentes enfermedades, es que este tipo de sustancias no provocan reacciones alérgicas

o inesperadas y además se considera un apirógeno (no produce fiebre). Estudios actuales

realizados por Lab BioChem ponen en evidencia la seguridad total de este sustrato en

niveles de hasta 50 mg/Kg de peso corporal. Hay evidencia de que las sustancias húmicas

tienen propiedades antimicrobianas, pues al parecer estimulan los microbios que son

benéficos y suprimen los que generan daño. Teniendo en cuenta lo anterior y para

avanzar en esta misma línea, se pretende proponer la metodología experimental para

realizar un estudio en la bacteria Helicobacter pylori a nivel transcriptómico, buscando

establecer el cambio en su RNA, al ser inhibidas por la acción de los ácidos húmicos en

ensayos in vitro, contribuyendo a los referentes teóricos que permitan hacer un uso

adecuado de este sustrato natural, como un tratamiento totalmente eficaz contra la

erradicación de esta bacteria, tan ampliamente distribuida en el mundo.

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13


14

3. Descripción del problema

Uno de los principales problemas de salud pública mundial se relaciona con la resistencia

bacteriana a ciertos antibióticos generando consecuencias de mortalidad y morbilidad en la

población. Una de las razones asociadas a este fenómeno es el uso indiscriminado de los

antibióticos en la práctica médica y en la medicina veterinaria, lo cual ha conllevado al

surgimiento y diseminación de mecanismos de resistencia en diversas poblaciones

bacterianas. (García, 2001)

Entre la población mundial, cerca del 50% ha presentado manifestaciones gástricas

asociadas a la presencia de Helicobacter pylori (Hp) y más del 80% pertenece a la población

de países en vía de desarrollo. Dicha bacteria ha sido identificada como el agente causal

de patologías como úlcera péptica y gastritis, lo cual corresponde a un proceso dinámico

que evoluciona hacia la atrofia que afecta al antro, adenocarcinoma y linfoma estomacal,

además ha sido clasificada como carcinógeno tipo I por parte de la Agencia Internacional

de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC) y la OMS, (Organización Mundial de la Salud)

con base en evidencias epidemiológicas. (Sánchez, 2006)

El tratamiento de erradicación actual se basa en monoterapias y terapias duales con

antibióticos combinados con un inhibidor de la bomba de protones (IBP), pero además del

elevado costo que esto significa, dicha opción puede resultar inefectiva y contraproducente

debido a que puede generar cepas de bacterias resistentes a dichos antibióticos o

reacciones adversas en los pacientes. Una de las causas de fracaso de los tratamientos

más comunes es la resistencia del microorganismo y por otro lado las características

particulares de la cepa (Alarcón, 1999)

Un estudio realizado por la Universidad del Valle en Colombia, reportó una prevalencia de

más del 69% de infección a causa de Helicobacter pylori en hospitales ubicados en 16

departamentos de Colombia diagnosticadas a partir de muestras de biopsias tomadas de

endoscopias. En nuestro país, el estudio de este microorganismo se inició a finales del año

2010, por lo cual existen pocos informes de laboratorios que especifiquen las condiciones

microbiológicas ideales para su aislamiento y cultivo, haciéndose necesario generar

trabajos que contribuyan al enriquecimiento teórico-práctico referente al trabajo con

Helicobacter pylori. (Bayona, M. A., 2013)


15

Recientemente y tras la búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento y

erradicación de Hp, se ha optado por el estudio de los productos naturales, de este modo,

se ha encontrado que los ácidos húmicos, extraídos del carbón de bajo rango colombiano,

han sido empleados históricamente en el control de diversas enfermedades y afecciones,

presentando la capacidad de inhibir la bacteria en mención. Se ha establecido que este

sustrato, recurso invaluable de la medicina tradicional (MT), ejerce una función bactericida

y antibiótica, aunque se desconoce el mecanismo de acción correspondiente, debido en

cierto modo a que según algunas investigaciones realizadas con anterioridad los ácidos

húmicos no presentan una estructura única y por el contrario se caracterizan por la

presencia de grupos funcionales variados asociados a propiedades físicas, químicas y

biológicas que los hacen ser útiles para el hombre, por tal razón se pretende indagar en

este ámbito y establecer la acción de dicha macromolécula a partir de estudios

transcriptómicos para establecer los cambios que se generan en el RNA bacteriano como

resultado de la inhibición del microorganismo, partiendo de los resultados obtenidos con

anterioridad referentes a la concentración mínima inhibitoria producto de las investigaciones

más recientes realizadas en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.


16

4. Objetivos

4.1. Objetivo general

Diseñar una metodología experimental para la determinación del mecanismo de acción

inhibitorio de los ácidos húmicos, extraídos del carbón de bajo rango colombiano, frente a

la bacteria Helicobacter pylori mediante ensayos in vitro con el fin de definir su uso como

tratamiento alternativo de las enfermedades gastrointestinales asociadas.

4.2. Objetivos específicos

● Elaborar una revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la

determinación del mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H. pylori.

● Analizar las variables de estudio y alcances de cada uno de los métodos descritos

● Seleccionar y adaptar un proceso metodológico como propuesta para la

determinación del mecanismo de acción.


17

5. Marco teórico conceptual

5.1. Generalidades del carbón

De acuerdo con Cortés (s.f) el carbón es un sólido oscuro que se forma como resultado de

la acumulación y enterramiento de la materia vegetal, la cual se convierte en carbón al

atravesar por una serie de cambios de temperatura y presión. El carbón también se puede

definir como el combustible fósil más abundante en la Tierra y mantiene un importante papel

en la generación de energía (Smith, Foley, & Lobo, 2004).

La utilización del carbón se remonta a 1000 años AC en China, época en la cual era

empleado para tratar diferentes afecciones y como fuente de energía. Los primeros usos

del carbón fueron de tipo doméstico, donde su extracción sólo se hacía a través de

instrumentos como pica y pala. Actualmente, representa el 25 % de energía que se

consume en todo el mundo. Los mayores depósitos de carbón están en América del Norte,

Rusia, Colombia y China.

El carbón se ha postulado como el sucesor del petróleo, cada vez más costoso y escaso.

La consolidación mundial que ha tenido su uso en diferentes sectores de la industria está

permitiendo tener alternativas a los incrementos abruptos en los precios del petróleo. Por

ejemplo, en el sector eléctrico, carbones como la hulla funcionan como combustible para la

obtención de la energía eléctrica. En el sector siderúrgico, el coque (un carbón con

características especiales que se obtiene por la destilación del carbón) es un combustible

y reductor de hierro para la obtención de acero. En el sector químico, la carboquímica

desarrolla procesos para obtener productos como los alquitranes y el petróleo artificial.

5.1.1. Historia de la formación del carbón

La formación del carbón mineral se remonta a más de 300 millones de años, en el

Paleozoico superior, durante el periodo Carbonífero principalmente. Todo inicia con la

descomposición de la materia orgánica de plantas superiores terrestres, por la acción de

bacterias anaeróbicas. Poco a poco esta materia orgánica se fue haciendo cada vez más

rica en carbono mientras iba perdiendo oxígeno e hidrógeno; así se formaron las turberas.

Todo este proceso de transformación, junto con las altas presiones y temperaturas,

comprimieron los depósitos hasta formar los diferentes tipos de carbón. (TONDA, s.f.) En

la figura 1 se muestran las diferentes etapas en la formación del carbón.

https://paperpile.com/c/3MxZs7/pcA7g


18

Figura 1. Etapas de la carbogénesis. (“NEV,” n.d.)

5.1.2. Clasificación del carbón

Con base en su grado de carbonificación se pueden distinguir varios tipos de carbón (Figura

2)

Figura 2. Clasificación del carbón por rangos

5.1.2.1. Turba: se cataloga como carbón joven, pues fue el primero que se

formó, contiene mayor cantidad de impurezas y humedad (hasta


19

un 90 % de agua), tiene un menor poder caloríf ico y su contenido

de carbono es de solo un 55%. Es preciso que se someta a un

proceso de secado, para poder ser utilizado como combustible de

baja calidad, sin embargo, en los jardines es muy utilizado por su

capacidad de retener agua (El carbón, 2014).

5.1.2.2. Lignito: se forma por compresión de la turba. Es un carbono de

bajo rango, con aspecto leñoso, terroso o compacto y un color que

varía de pardo a negro brillante (Evangelista, 2007). Tiene un

contenido de azufre de aproximadamente 10%. Se clasifica como

combustible de calidad media, por lo que se destina a la

producción termoeléctrica (Monroy).

5.1.2.3. Hulla: se forma cuando se comprimen las capas de lignito. Es un

carbón bituminoso, lo que implica que es el carbón con poder

caloríf ico más alto, por ende el de mayor importancia económica,

seguido del sub-bituminoso, la antracita y finalmente el lignito

(TONDA, s.f.). Es utilizado en la siderurgia, centrales

termoeléctricas, y en algunos otros sectores industriales. También

se usa para producir carbón de coque usado en los altos hornos.

5.1.2.4. Antracita: es un carbón de alto rango, negro, duro y brillante, es

el último que se formó, es decir, el más antiguo. La presión y el

calor adicionales pueden transformar el carbón en grafito, que es

prácticamente carbono puro. Su combustión al ser tan limpia

permitió que inicialmente se usará con fines domésticos,

actualmente, su mayor aplicación es en las centrales

termoeléctricas.

Teniendo en cuenta lo anterior se evidencia como el origen de los diferentes tipos de carbón

determinan muchas de sus características físicas y químicas. Son varias las clasificaciones

que se pueden realizar, a partir de su grado de carbonificación, por su contenido en materias

volátiles, por la composición elemental de carbono y otros elementos, por su poder


20

calorífico, entre otras. La clasificación más usual es la ASTM, que hace uso del contenido

de carbón y materia volátil. Todas estas características se encuentran resumidas en la

tabla 1.

Tipo

Análisis elemental Poder calorífico (Kcal/Kg)

%Volátiles %C %H %O Superior Inferior

Turba 59,3 5,7 35,0 5.700 5.400 67

Lignito 70,0 5,5 24,5 6.750 6.450 54

Hullas

Grasas

Semigrasas

Secas

88,2

92,4

93,5

5,3

4,4

3,8

6,5

3,2

2,7

8.600

8.700

8.650

8.400

8.500

8.450

30

17

9

Antracitas 95,5 2,5 2,0 8.400 8.300 3

Tabla 1. Clasificación de los carbones según sus propiedades físicas y químicas

5.2. Sustancias húmicas

El suelo está formado por diferentes sustancias húmicas: ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y

huminas. Son moléculas heterogéneas de elevado peso molecular, donde su estructura y

conformación está fuertemente ligada a la composición del suelo, el pH, las condiciones

ambientales a las que se encuentre sometido y la acción microbiana, por lo cual tanto su

química y efecto fisiológico puede variar (Lodhi, y otros, 2013). Producto de su

transformación bioquímica, presentan diferentes grupos funcionales en su estructura

generados a partir de procesos de descomposición, reacciones de polimerización y

condensación (Martínez, Bravo, & Martín, 2013).


21

5.2.1. Ácidos húmicos

Los ácidos húmicos, son moléculas complejas generadas a partir de

la descomposición de la materia orgánica. Es posible localizarlas en

los suelos, turbas, océanos y aguas frescas. Tanto su estructura y

composición está sujeta a las características del suelo, razón por la

cual no es posible encontrar dos moléculas de ácidos húmicos

idénticas (Mosquera, Bravo, & Hansen, 2007).

5.2.1.1. Rutas de formación: Hay varias teorías que explican la formación

de las sustancias húmicas, sin embargo, son difíciles de establecer

teniendo en cuenta la alta velocidad de reacción y la inestabilidad

de los productos intermedios (Gasset, 1968). En la figura 3 se

exponen las cuatro vías principales, por las que se cree se

sintetizan.

Figura 3. Rutas de formación de las sustancias húmicas. ( Rodríguez Neave, s.f.)


22

5.2.1.2. Ruta de la lignina: La lignina y otros compuestos fenólicos se

degradan mediante oxidación, perdiendo sus cadenas laterales

con lo que la molécula aumenta su carácter aromático. A medida

que van dándose procesos de oxidación y deshidrogenación de los

productos intermedios, se van generando reacciones de

condensación con amoniaco, aminoácidos y péptidos, que

conducen a la formación de sustancias húmicas. Las reacciones

esenciales comprenden las etapas de descomposición de la

cadena lateral, demetilación, oxidación a quinonas, dimerización y

polimerización, apertura del núcleo, y adición de compuestos

conteniendo nitrógeno. Esta hipótesis impone a la lignina vegetal

como fuente de los grupos que forman las principales unidades

estructurales del ácido húmico (Gasset, 1968). Esta teoría se vio

reforzada por hechos tales como la naturaleza similar de los ácidos

húmicos y la lignina, en cuanto a la resistencia a agentes

microbianos, su solubilidad en medios básicos y su precipitación

en medios ácidos.

5.2.1.2.1. Rutas polifenólicas: se consideran a las quinonas, sintetizadas

por un lado a partir de microorganismos y por el otro a partir de la

lignina, las materias primas a partir de las cuales se sintetizan las

sustancias húmicas. Se inicia con la ruptura de todos los polímeros

de la planta a sus monómeros, derivados del fenilpropano, y como

en la ruta de la lignina sus cadenas son oxidadas y desmetiladas,

obteniéndose quinonas, las cuales reaccionan con compuestos

nitrogenados formando polímeros de aspecto semejante a las

sustancias húmicas (Tortosa, 2008).

5.2.1.3. Composición elemental:

Elementos como el C, H, O, N y S, siempre estarán presentes en los ácidos húmicos,

independientemente de su origen.

Carbono 45 – 65 %


23

Oxígeno 30 – 48 %

Nitrógeno 2 - 6 %

Hidrógeno 5 %

Tabla 2. Porcentaje de los elementos presentes en los ácidos húmicos (Gasset, 1968)

5.2.1.4. Naturaleza química:

La naturaleza química y composición de los ácidos húmicos ha sido de gran interés para

muchos científicos, razón por la cual se ha hecho uso de diversas técnicas analíticas

para la elucidación de su estructura. Varios autores como Stevenson (1982), Buffle et

al. (1977), Shulten (2002, 2003), Kujawinski et al. (2002a, 2002b) y Stenson et al. (2002,

2003), han realizado propuestas de las estructuras moleculares que presentan los

ácidos húmicos. De forma general, se les ha reconocido como macromoléculas

aromáticas, con presencia de grupos amino, ácidos, azúcares y compuestos alifáticos.

Sus pesos moleculares están en el rango de 2.0 a 1300 kDa, teóricamente se presume

que cuenta con grupos fenólicos libres y enlazados, grupos metoxi, grupos CH2OH,

nitrógeno, oxígeno y ácidos carboxílicos en los anillos aromáticos. El carbono presente

no hace solamente parte de grupos altamente conjugados, sino que además hace parte

de residuos alifáticos que influyen en la estructura que adquieren los ácidos húmicos

(Mosquera , Bravo, & Hansen, 2007). Según el estudio realizado por (Martínez, Bravo,

& Martin, 2013) en suelos altoandinos colombianos, a través de las técnicas de Pirólisis

- GC/MS y THM, se encontraron 252 compuestos que se lograron clasificar en los

siguientes grupos según la familia a la que pertenecen o su precursor: compuestos

aromáticos y poliaromáticos, ácidos grasos, terpenos, esteroles, hidrocarburos, fenoles,

compuestos derivados de polisacáridos, ligninas, compuestos de nitrógeno,

compuestos de azufre y derivados del ácido fosfórico.

Según Cepeda (1992) los ácidos húmicos son polímeros coloidales, donde sus

monómeros se forman a partir de micro unidades, cada una de las cuales contiene

núcleo, cadena puente y grupo reactivo (grupo carboxílico y alcohol). Los polímeros de

los ácidos húmicos son compuestos aromáticos de tipo fenólico y nitrogenados, tanto

cíclicos como aminoácidos alifáticos. Los compuestos fenólicos son la plantilla de


24

carbono de la molécula de ácido húmico, unidas mediante puentes de oxígeno, carbono

o nitrógeno (Estévez Estévez, 2006).

La estructura y composición de los ácidos húmicos puede variar de acuerdo con el

origen geográfico, el clima y las condiciones biológicas, lo cual dificulta la

caracterización precisa de dichas sustancias (“Humic acids: Structural properties and

multiple functionalities for novel technological developments,” 2016).

Aunque no existe una estructura única definida, existen algunos modelos de los mismos

(Figura 2), en los cuales se observan grupos funcionales como los mencionados

anteriormente.

Figura 4. Modelo estructural de los ácidos húmicos ((Mirza et al., 2011)

5.2.1.5. Propiedades de los ácidos húmicos: los ácidos húmicos son sólidos

amorfos de color marrón oscuro, generalmente insolubles en agua y en casi

todos los disolventes no polares, pero muy soluble en soluciones de sales

básicas de metales alcalinos. Los ácidos húmicos provenientes de fuentes

como suelos, turberas, restos vegetales conservan unos principios

estructurales muy semejantes (Estévez Estévez, 2006).

Los ácidos húmicos y fúlvicos, comparten características estructurales, pero

su separación se hace a través de condiciones diferentes. Tanto los ácidos

húmicos como fúlvicos con solubles en álcalis, mientras que las huminas son

insolubles. Su extracción se realiza usualmente con un álcali diluido y su

precipitación se consigue a través de un ácido fuerte (Figura 5), con lo cual

se logra su separación de los ácidos fúlvicos que presentan más grupos

funcionales de naturaleza ácida (Peña-Méndez, Havel, & Patočka, 2005).

https://paperpile.com/c/3MxZs7/vmZFJ

https://paperpile.com/c/3MxZs7/vmZFJ


25

Figura 5. División de sustancias húmicas de acuerdo con su solubilidad (Peña-Méndez, Havel, & Patočka, 2005).

Según Kononova, los fenoles o quinonas, compuestos con contenido de nitrógeno y los

hidratos de carbono hacen parte de las moléculas de ácidos húmicos. Relaciona la

insolubilidad en álcalis de las huminas con la firmeza con que esta fracción de une a la parte

mineral del suelo y no con una diferencia marcada a nivel estructural con los ácidos

húmicos. También, considera que el ácido fúlvico posee unidades estructurales similares,

pero con menor aromaticidad y mayor presencia de cadenas alifáticas, lo que podría

relacionarse con su solubilidad en medios ácidos.

5.2.1.6. Aplicaciones de los ácidos húmicos: es posible dividirlas en cuatro

categorías: agricultura, industria, medio ambiente y medicina (Peña-Méndez,

Havel, & Patočka, 2005).

5.2.1.6.1. Aplicaciones en agricultura: los ácidos húmicos influyen de forma

significativa en la calidad del suelo, pues mejora tanto las propiedades físicas

como las condiciones de humedad. Actualmente, los materiales húmicos se

incluyen en los abonos, con el propósito de aumentar la fertilidad del suelo,


26

el crecimiento de las plantas y la disponibilidad de hierro, pues estos tienen

la capacidad de quelarlo.

5.2.1.6.2. Aplicaciones industriales: los materiales húmicos han sido utilizados en la

preparación del cuero, como agente de curtido de este y como ingrediente

para terminarlo. También tienen aplicaciones para colorear plásticos de

Nylon 6 o PVC, endurecedores de espumas de poliuretano y como

plastificante. Su gran capacidad para retener la transición de metales, les

permite formar complejos metalorgánicos, lo que aumenta la disponibilidad

de estos metales para las plantas.

5.2.1.6.3. Aplicaciones ambientales: tienen la capacidad de formar complejos

hidrosolubles con muchos metales incluyendo radioisótopos, convirtiéndose

en un agente de transporte con capacidad de eliminar metales tóxicos y otros

contaminantes del agua, lodos del suelo y aguas residuales. Por otra parte,

la fermentación de las bacterias puede reducir las sustancias húmicas, la

producción de acetato durante este proceso es energéticamente ventajoso

para las bacterias.

5.2.1.6.4. Aplicaciones biomédicas: se caracterizan por actuar como antivirales y

antiinflamatorios. Su capacidad para formar quelatos permite la eliminación

de metales pesados de organismos vivos. Se ha encontrado que los ácidos

húmicos administrados a ratas profilácticamente disminuyó el daño a nivel

gástrico inducido por etanol. La administración a ratas con úlceras gástricas

y duodenales aceleró significativamente el proceso de curación.

Por otro lado, se ha observado actividad antiviral de las HA contra muchos

virus, como el citomegalovirus (CMV), los virus de la vacuna y el virus de la

inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2) (“Humic acids:

Structural properties and multiple functionalities for novel technological

developments,” 2016). Se cree que esto se debe a la carga negativa que

asumen dichas moléculas en medios neutros y básicos pudiendo inhibir la

replicación del virus al unirse a los dominios catiónicos del virus, que son

necesarios para la unión del virus a la superficie celular


27

5.3. Helicobacter pylori

Helicobacter pylori es responsable de las enfermedades gastrointestinales que se

evidencian en más del 50% de la población a nivel mundial, siendo estas en su mayoría

patologías tales como ulceración duodenal, úlcera péptica, enfermedades cardiovasculares

e incluso cáncer gástrico.

5.3.1. Características generales y morfología de H. pylori

Helicobacter pylori (Hp) es una bacteria Gram negativa de forma espiral o helicoidal que

mide de 0,5 a 3 micras (Figura 6), presenta de dos a seis flagelos unipolares (lofótricos) por

lo cual se le atribuye una gran movilidad (García, 2016). Se caracteriza por colonizar y

sobrevivir a uno de los medios más inhóspitos de nuestro organismo; inicialmente reside en

el antro gástrico pero emigra a otras áreas del estómago y el duodeno. Se encuentra en la

porción profunda del moco entre él y el epitelio (Gonzáles & Quino, 2008), se dice que es

una bacteria microaerofílica debido a que requiere condiciones especiales para su

crecimiento: su atmósfera debe contener 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 85%

de nitrógeno, además su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C (Herrera &

Jiménez)

Figura 6. Helicobacter pylori. (Valdés, 2016)

Existen 3 vías principales de transmisión; la transmisión oro-oral está basada en el hallazgo

de la bacteria y su genoma en la saliva; la transmisión oro-gástrica se asocia con el manejo

y desinfección inadecuada de los equipos médicos como gastroscopios; la transmisión feco-

oral corresponde con los datos que representan la prevalencia de infección por Helicobacter


28

pylori en países en vía de desarrollo debido a las regulares condiciones de higiene (Rivas-

Traverso & Hernández, 2000)

5.3.2. Colonización bacteriana y factores de virulencia

Una vez Hp llega a la mucosa gástrica, inicia un proceso de colonización en el cual las

proteínas de membrana externa (OMPs) desempeñan funciones de transporte de nutrientes

y transducción de señales procedentes del medio externo, se han identificado más de 21

OMPs en Hp y entre las funciones generales está la adhesión a la célula hospedadora y

estimulación de la producción de citoquinas pro inflamatorias. (Heras, 2017)

En el proceso de colonización y como factores de virulencia y patogenicidad, intervienen

mecanismos y características propias de la bacteria tales como las adhesinas, estructuras

celulares que le impiden a la bacteria ser arrastrada por el peristaltismo o el recambio

epitelial; enzimas como la ureasa que la protege del medio fuertemente ácido; lipasas y

proteasas que propician la desintegración del moco gástrico y disminuyen la capacidad de

las células para secretar mucosa. (Posse, Toledo, & Cabral, 2006)

La adherencia de Hp a la mucosa gástrica es de gran importancia para la colonización

inicial, así como para la persistencia de la bacteria en el estómago humano. La adhesión le

confiere a la bacteria mecanismos de protección frente a la acidez gástrica, dicho

mecanismo se debe a la presencia de las proteínas de membrana externa (PME). Existen

5 familias de PME (Cervantes-García, 2016):

Bab-A (Blood antigen binding adhesion): Esta adhesina interactúa con las células

epiteliales a través de los antígenos de Lewis B fucosilados de los grupos

sanguíneos ABO del ser humano, se han identificado 3 alelos (babA1, babA2, y

babB) de los cuales solo el gen babA2 es funcionalmente activo. Esta proteína está

involucrada en la glicosilación de la mucosa del hospedero que le permite a Hp

adaptarse y persistir.

Hop-: Es la proteína más larga de la familia e incluye la adhesina BabA (HopS),

SabA (HopP), OipA (HopH) y HopQ, esta juega un papel importante en la intensidad

de la respuesta inflamatoria y persistencia.


29

HpaA: Esta proteína media la unión a glicoconjugados con ácido siálico presentes

en la superficie de células epiteliales gástricas y de los neutrófilos. Es un antígeno

de membrana que es reconocido por los anticuerpos humanos.

SabA (Sialic acid binding adhesion): Estas proteínas estimulan a los neutrófilos para

inducir la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que causa daño oxidativo

en el epitelio gástrico.

OipA: Todas las cepas de Hp contienen el gen oipA que codifica para esta adhesina,

pero solo algunas la expresan, su expresión se asocia al desarrollo de inflamación

gástrica y una mayor producción de IL-8

Uno de los mecanismos de sobrevivencia al medio (pH<4) consiste en la elaboración de

una atmósfera alcalina de la cual se rodea y que sintetiza por acción de la enzima ureasa

a partir de la urea gástrica, liberando así amoníaco que modifica el pH gástrico (figura 7).

La ureasa es acumulada en el espacio periplásmico e hidroliza la urea presente en el

estómago, generando amonio y dióxido de carbono. El amonio eleva el pH hasta 6 o 7 y

ocasiona de manera transitoria aclorhidria, obteniendo así un ambiente óptimo para

sobrevivir mientras se traslada al epitelio gástrico (GARCÍA, 2016). (Gonzáles & Quino,

2008). El hidróxido de amonio generado durante la hidrólisis provoca un daño histológico

asociado en gran medida a esta infección debido al equilibrio del amonio con el agua que

genera el desdoblamiento del moco gástrico haciéndolo más fluido y permitiéndole a la

bacteria desplazarse para llegar a los espacios intercelulares. La gastritis se desarrolla en

el momento en que las células G de la mucosa detectan un pH neutro que promueve

enseguida la liberación de gastrina para estimular la producción de ácido. (Rivas-Traverso

& Hernández, 2000)


30

Figura 7. Acción de la ureasa para la supervivencia de H. pylori

De acuerdo con (Herrera & Jiménez), entre los factores de virulencia de la bacteria (Figura

8), en todas las cepas identificadas, se encuentra la citotoxina vacuolizante (VacA) que

propicia la formación de vacuolas intracelulares generando cambios en el metabolismo de

la célula hospedera y la muerte celular. La presencia de vacA puede inducir la expresión

del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y provocar el desarrollo de procesos

tumorgénicos. Todas las cepas de Hp tienen el gen vacA que codifica para esta toxina, esta

tiene un peso molecular aproximado de 87 KDa. Induce la vacuolización y múltiples

actividades celulares incluyendo la formación de canales en la membrana, liberación del

citocromo C que induce a la apoptosis y además se une a las células de la membrana

generando inflamación. Su actividad vacuolizante solo se presenta en el 50 a 60% de las

cepas a pesar de que todas contienen dicho gen.

Por otro lado está el lipopolisacárido (LPS) bacteriano el cual posee residuos de

carbohidratos en secuencias similares a las que presentan los antígenos sanguíneos,

pasando desapercibida por el sistema inmune, además el LPS estimula la apoptosis de las

células epiteliales. Su papel fundamental en la patogénesis es evadir la respuesta inmune

durante la colonización del epitelio gástrico, favoreciendo la persistencia bacteriana en el

microambiente (Cervantes-García, 2016).

Otro factor de virulencia es la proteína denominada “Proteína Activadora de Neutrófilo”

(NapA), esta actúa como un agente quelante del hierro y representa un factor quimiotáctico

para neutrófilos y monocitos.


31

Sin embargo, el principal factor de virulencia de Helicobacter pylori corresponde a la isla de

patogenicidad cagPAI, este es un segmento de 40 kb con un contenido de G + C de 35%

(Cervantes-García, 2016). Esta isla presenta 27 marcos de lectura abiertos entre los que

se encuentra en gen cagA que codifica para la proteína CagA, esta es una citotoxina que

activa diferentes señales en la célula hospedadora, provocando efectos tales como la

ruptura de uniones intercelulares, estimulación de linfocitos, desregulación del ciclo celular,

apoptosis celular y producción de interleucinas inflamatorias que generan inflamación

crónica, aspecto que se ve estrechamente relacionado con la aparición del cáncer gástrico

(Heras, 2017). Los genes de la isla se expresan y responden a determinadas condiciones

ambientales como el nivel de oxígeno, la fase del crecimiento bacteriano y el pH, entre

otros. Esta isla codifica un sistema de secreción de proteínas tipo IV que inyecta la proteína

CagA y peptidoglicanos en las células epiteliales del hospedero. Las cepas cagPAI se

encuentran con mayor frecuencia en pacientes con úlcera péptica y cáncer gástrico

(Cervantes-García, 2016).

Figura 8. Factores de virulencia de Helicobacter pylori (“FACTORES DE VIRULENCIA,” n.d.)

5.3.3. Métodos de diagnostico

Al hablar de los métodos de diagnóstico de la bacteria, se pueden destacar los métodos

invasivos que implican la realización de una endoscopia y toma de biopsia; entre estos se

encuentran: Prueba rápida de la ureasa, análisis histológico, cultivo y PCR.


32

5.3.3.1. Prueba rápida de la ureasa: es una técnica cualitativa que

determina la actividad de la enzima ureasa en una biopsia de

mucosa gástrica, es una prueba universal para detectar la

presencia de dicho microorganismo. Consiste en colocar la biopsia

en medio de urea y un indicador de pH que dejaría en evidencia la

formación de los iones de amonio tras la hidrólisis de la urea, lo

cual elevaría el pH. Cabe destacar la alta especificidad de la

prueba debido a la escasez de bacterias diferentes de H. pylori en

la cavidad gástrica, sin embargo se ve afectada en pacientes que

han recibido tratamiento con antibióticos o con fármacos

inhibidores de la bomba de protones. (Díaz, Domínguez, &

González, 2008)

5.3.3.2. Cultivo: Es posible aislar e identif icar de forma sencilla a H. pylori.

Generalmente se toma una biopsia macerada en un tubo de

16x100mm; se trabaja con un medio de cultivo que contiene agar

sangre sin antimicrobianos y las placas se incuban en

microaerobiosis por 5 días a 35°C. Después de este tiempo, se

obtendrán colonias brillantes y grisáceas de cerca de 1 mm de

diámetro, a los cuales se aplica la tinción de Gram mostrando

bacilos curvos Gram negativos, además este método permite

realizar una tinción a los flagelos. Posterior al cultivo es posible

hacer pruebas de sensibilidad a los agentes antimicrobianos,

estudios de genómica y proteómica dado que permite obtener y

conservar cepas. La sensibilidad de este método de detección

puede variar debido a las condiciones estrictas que requiere la

bacteria (Díaz, Domínguez, & González, 2008) (Rivas-Traverso &

Hernández, 2000).

5.3.3.3. Histología: Esta método incluye técnicas de tinción en cortes

histológicos que permite observar los microorganismos, por lo

general se emplea hematoxilina-eosina y la tinción con azul de

metileno, además permite conocer las lesiones de la mucosa y la

confirmación de la inflamación permite ident if icar zonas de

metaplasia intestinal. La visión al microscopio presenta una


33

sensibilidad menor a la del cultivo por lo que no es muy

aconsejable (Peña, 2010).

5.3.3.4. Reacción en cadena de la polimerasa: Esta técnica permite

analizar el DNA bacteriano a partir de biopsias gástricas, se

requieren diferentes cebadores como el urea que codifica para la

subunidad A de la enzima ureasa o el gen glmM que codifica para

la fosfoglucosamina mutasa, este último presenta alta sensibilidad

y especificidad. Este método permite detectar genes asociados a

la patogenicidad como CagA y VacA (Díaz, Domínguez, &

González, 2008).Paralelo es lo anterior, es posible ejecutar

métodos no invasivos como: Prueba del aliento urea C13 – C14;

pruebas serológicas y detección de antígenos en heces fecales.

5.3.3.5. Prueba del aliento urea C13 – C14: Esta técnica cualitativa se

realiza con urea marcada con C13 o C14 que es ingerida en forma

de suspensión, esta se hidroliza, se forma anhídrido carbónico que

es absorbido y exhalado a través del aliento. Dicha concentración

de CO2 se encuentra estrechamente relacionado con la presencia

de H. pylori. La especificidad y sensibilidad de esta prueba es muy

alta pero presenta elevados costos (Díaz, Domínguez, & González,

2008).

5.3.3.6. Serología: Consiste en la detección de anticuerpos séricos de

clase IgG o IgA contra antígenos específicos de la bacteria, sin

embargo, esta técnica presenta el problema de no poder

diferenciar la infección activa de la exposición previa al

microorganismo.

5.3.3.7. Test de sangre completa: Es una técnica poco recomendada que

consiste en un inmunoensayo a partir de una muestra de sangre

para identif icar el anticuerpo IgG frente a H. pylori; así mismo se

puede realizar este ensayo en orina y saliva.

5.3.3.8. Antígeno en heces fecales: Este ensayo cualitativo emplea

anticuerpos policlonales o monoclonales que identif ican al

antígeno en las heces, esto se realiza mediante técnicas


34

inmunoenzimáticas. Este método aporta información importante

debido a la fácil obtención y conservación de las muestras y se

realiza para el diagnóstico inicial de la bacteria y para confirmar la

erradicación de la misma después del tratamiento.

5.3.4. Tratamientos de erradicación

La erradicación de H. pylori es la principal indicación para el tratamiento de la úlcera péptica

y se recomienda en los casos con úlcera hemorrágica o perforación. Los tratamientos de

erradicación, además son útiles para aquellos pacientes que presentan linfoma gástrico

MALT, siendo efectivos en las fases iniciales del tumor. (Buitrago, Rodríguez, & Alejandre,

2010). El tratamiento para erradicar esta bacteria implican combinar dos o tres

antimicrobianos y un compuesto anti-ulceroso, que al modificar el pH facilita la acción de

los antibióticos. La duración de la terapia usualmente es de siete a diez días.

5.3.4.1. Compuestos de bismuto: algunos de los más conocidos con

citrato de bismuto coloidal y salicilato de bismuto. Son

citoprotectores, con capacidad de proteger la mucosa del tracto

gastro - intestinal de la acción del entorno ácido, aumentando la

producción de moco y prostaglandinas evitando así la unión de

Helicobacter pylori a la superficie destruyendo la pared bacteriana

a la mucosa gástrica.

5.3.4.2. Inhibidores de la bomba de protones: el omeprazol, lansoprazol,

pantoprazol, esomeprazol y rabeprazol son medicamentos que

funcionan al reducir la cantidad de ácido gástrico producido por

glándulas en el revestimiento del estómago, al inhibir de forma

reversible la enzima H-K ATPasa. (Agudo, 2010)

5.3.4.3. Antimicrobianos utilizados para erradicar H. pylori: Esta

bacteria es sensible a un gran número de antibióticos en

condiciones in vitro pero no todos presentan eficacia in vivo. Los

antimicrobianos que son eficientes desde el punto de vista clínico

para erradicar la infección son los siguientes:

5.3.4.3.1. Amoxicilina: Pertenece al grupo de los betalactámicos, siendo el

único que bajo condiciones in vitro ha demostrado tener eficacia


35

en la infección por Helicobacter pylori, al ser el más estable en

condiciones ácidas. En ocasiones se usa en terapias duales o

triples, combinadas con metronidazol, tetraciclina o claritromicina.

De forma general los betalactámicos inhiben la formación de la

pared bacteriana de las microrganismos. (Agudo, 2010)

5.3.4.3.2. Claritromicina: Dentro de los macrólidos es el más utilizado, al

tener una excelente actividad in vitro frente a Helicobacter pylori y

una excelente actividad en medios ácidos. Su mecanismo de

acción se basa en inhibir la síntesis de proteínas de los ribosomas

bacterianos al unirse reversiblemente a la subunidad 50 S del

ribosoma.

5.3.4.3.3. Metronidazol: Los nitroimidazoles son compuestos, que se

activan tras la reducción del grupo nitro unido al anillo imidazólico,

generando compuestos intermediarios y de vida corta. Ingresa a

la célula por difusión pasiva y es químicamente reducido por

proteínas del metabolismo anaerobio característica de algunos

parásitos y de bacterias anaerobias y algunas microaerófilas. La

reducción del metronidazol causa la pérdida de la estructura

helicoidal del DNA, rotura de la cadena e inhibición de la síntesis

de ácidos nucleicos. En Helicobacter pylori, se considera que la

piruvato flavodoxina oxidorreductasa es la proteína capaz de

reducir el metronidazol. (Agudo, 2010)

5.3.4.3.4. Tetraciclina: Ha demostrado buena actividad in vitro. Esta se una

reversiblemente a la subunidad 30 S produciendo una inhibic ión

de la sintesis de proteinas.

5.3.4.3.5. Furazolidona: Hay una reducción del profármaco, con lo que se

forman radicales nitro aniónicos, dañando el DNA. (Agudo, 2010).

En este sentido, la efectividad de un tratamiento aumenta cuanto mayor sean

las tasas de erradicación (superiores al 80%). Las principales opciones de

elección las constituyen las terapias triples las cuales combinan un

antisecretor o inhibidor de la bomba de protones (IBP), generalmente

omeprazol o lanzoprazol con dos antibióticos (claritromicina, amoxicilina o


36

metronidazol). La terapia OCA (omeprazol+claritromicina (500

mg)+amoxicilina (1g)) requiere de una duración del tratamiento en pacientes

con úlcera por 7 días, aunque las pautas de 10 días permiten una mayor

efectividad. Otra de las terapias triples recomendadas hacen referencia a la

combinación de 400 mg de ranitidina-citrato de bismuto cada 12 horas junto

con dos antibióticos (amoxicilina y claritromicina); de acuerdo con los datos

reportados, esta última pauta tendría un 85% de eficacia con 0% de

resistencia a claritromicina, 78,5% de eficacia en caso de un 10% de

resistencia y un 65,5% en caso de que la resistencia alcance el 30%

(Buitrago, Rodríguez, & Alejandre, 2010). Paralelo a esto, es posible

encontrar terapias dobles combinando un IBP con un antibiótico (IBP/12h+

amoxicilina 1g/12h) (Puigdengolas, Cuberas, & Mascort, 2011) .

5.3.5. Resistencia bacteriana

La resistencia bacteriana a los antibióticos está íntimamente relacionada con la susceptibilidad

in vitro y se encuentra definida por la concentración mínima inhibitoria (MIC) del crecimiento

del cultivo de un inóculo estándar.

El fenómeno de la resistencia tiene un sustrato genético intrínseco o adquirido que se expresa

fenotípicamente por mecanismos bioquímicos. Es posible encontrar 2 tipos de resistencias

principalmente: natural y adquirida. La resistencia natural se refiere a los mecanismos

genéticos permanentes no influenciados por la dosis de los antibióticos; la resistencia

adquirida se desarrolla como consecuencia de mutaciones en el DNA o por la adquisición de

elementos genéticos móviles donde se transportan los genes de resistencia (plásmidos,

trasposones, integrones).

Las bacterias Gram negativas presentan diversos mecanismos de resistencia ante los

antibióticos, estos pueden ubicarse en las siguientes categorías (Tafur, Torres, & Villegas,

2008):

a. Modificación enzimática del antibiótico: Mecanismo en el cual las bacterias

expresan enzimas capaces de modificar la estructura del antibiótico anulando su

funcionalidad; es el caso de las beta-lactamasas las cuales hidrolizan y modifican el

anillo beta-lactámico mediante reacciones de acetilación, adenilación y fosforilación.


37

b. Bombas de salida: Este mecanismo consiste en la expulsión del antibiótico tras su

captación en el espacio periplásmico de las bacterias, evitando así que el antibiótico

llegue al sitio de acción. Estas bombas se encuentran en la membrana externa de

la célula y utilizan la hidrólisis de ATP o un mecanismo de contra-transporte iónico

como sustrato energético. Las bombas de salida pueden ser específicas para un

tipo de fármaco (codificadas en el plásmido) o inespecíficas. Asociadas a las

bombas de salida se encuentran el cierre de porinas, las mutaciones en los sitios de

acción y la presencia de enzimas hidrolíticas.

c. Cambios en la permeabilidad de la membrana externa: Este mecanismo se

refiere a los cambios que generan las bacterias en la bicapa lipídica y modificaciones

en las porinas alterando la permeabilidad dado que estas porinas son canales

proteínicos que regulan la entrada de elementos como las proteínas.

d. Alteraciones del sitio de acción: Consiste en la alteración del sitio de acción donde

se une el antibiótico a la bacteria. Las alteraciones estructurales pueden disminuir

la afinidad de los beta-lactámicos por las proteínas unidoras de penicilinas cuya

función principal consiste en la lisis de la pared celular.

5.3.5.1. Resistencia de Helicobacter pylori a antibióticos

En los estudios in vitro realizados con Hp se evidenció susceptibilidad a una amplia gama

de antibióticos, sin embargo, muchos de ellos pierden su actividad in vivo. Las terapias de

erradicación se basan en el uso de antibióticos combinados con IBP. Los diagnósticos

errados y la administración de dosis elevadas han conllevado al desarrollo de resistencia

frente a los antibióticos más empleados, tales como (Power, Zamora, & Rodríguez, 2008):

a. Resistencia a metronidazol: El metronidazol es un antibiótico bactericida que

pertenece al grupo de los nitroimidazoles. Cuando la molécula de este medicamento

entra a la célula diana, se activa por un proceso de transferencia de electrones

debido a la acción de la enzima NADPH nitrorreductasa que da lugar a

intermediarios imidazoles, responsables de los daños letales a las estructuras

celulares y fragmentación del DNA. En H. pylori se han encontrado mutaciones en

el gen rdxA el cual codifica para una NADPH nitrorreductasa. Dichas mutaciones se

deben a inserciones de pares de bases y a sustituciones originan codones de

parada, dicha mutación impide la activación del metronidazol y por lo tanto

disminuye su acción bactericida.


38

b. Resistencia a amoxicilina: La amoxicilina corresponde a una penicilina

semisintética susceptible a la acción de las beta-lactamasas. Su acción está

orientada hacia la inhibición de la biosíntesis y reparación de la pared bacteriana,

esto se debe a la estructura cíclica y anillo beta-lactámico, además de la presencia

y acción de las proteínas de unión a penicilina PBPs (Penicilin Binding Proteins). El

mecanismo de resistencia de H. pylori consiste en mutaciones en la PBP1A,

proteína que presenta mayor afinidad por la amoxicilina lo cual afecta la efectividad

del antibiótico

c. Resistencia a Tetraciclina: La tetraciclina es un antibiótico bacteriostático, cuyo

mecanismo de acción consiste en bloquear la síntesis de proteínas en las bacterias

mediante la unión a la unidad ribosomal 30S impidiendo así la unión del RNA de

transferencia a su sitio de unión. En este sentido, bloquea el proceso de elongación

y se detiene la síntesis de proteínas generando como consecuencia la no

multiplicación bacteriana. El mecanismo de resistencia se presenta debido a la

mutación del gen rrn 16S en las posiciones 926 a 928, en la denominada caja C a

causa de la sustitución de las bases adenina-guanina-adenina por timina-timina-

citosina respectivamente. Esta mutación de permite a la bacteria tolerar

concentraciones de hasta 8 mg/L del antibiótico.

d. Resistencia a claritromicina: La claritromicina es un antibiótico bacteriostático

derivado de la eritromicina; afecta la síntesis de proteínas principalmente debido a

la interferencia que genera en la etapa de elongación como resultado de la unión a

la subunidad ribosomal 23S. La resistencia a claritromicina en H. pylori presenta

como resultado de mutaciones en el gen rrn 23S que codifica para el RNAr 23S.

Como consecuencia de la sustitución de bases en las posiciones 2142 y 2143, se

produce una modificación en la estructura ribosomal afectando la unión al antibiótico

además de generar resistencia a concentraciones de antibiótico entre 1mg/L hasta

64mg/L.


39

6. Metodología

Este trabajo de grado se realizó bajo las características de una monografía teórica de

investigación en la cual se abordó, de manera circunscrita, un tema poco explorado,

generando un referente conceptual y procedimental para el desarrollo de una tesis, a partir

de la propuesta planteada a lo largo del documento.

Se realizó una revisión selectiva de la literatura, a partir de diferentes fuentes, tales como

tesis, artículos científicos y libros, mediante una revisión, detección, consulta, extracción,

recopilación e integración de la información teórica referente al tema, con base en una

metodología de la investigación documental, al fundamentarse principalmente en la

información de diferentes documentos y exploratoria, pues el problema de investigación que

se examinó ha sido poco estudiado. Según Hernández, et al, 2014, una investigación de

tipo exploratoria, es el primer paso para desarrollar investigaciones de tipo descriptiva,

correlacional o explicativa.

De acuerdo con los objetivos de la investigación, se hace necesario abordar una

metodología que consta de tres etapas principales, ilustradas en la figura _. En la primera

etapa de revisión bibliográfica se recopila información acerca de diferentes métodos que

podrían contribuir a la interpretación y determinación del mecanismo de acción de los ácidos

húmicos sobre la bacteria Hp. En segundo lugar, la fase de análisis de los parámetros de

estudio constituye una etapa determinante en la posterior selección del método, en esta se

relaciona el fundamento del mismo con algunos factores de virulencia que cobran gran

importancia al tratarse del establecimiento del mecanismo de acción, y por último, la etapa

de selección del método establece la forma más adecuada de lograr el objetivo.


40

Figura 9. Esquema metodológico general

6.1. Revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la

determinación del mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H.

pylori

La elucidación del mecanismo por el cual los ácidos húmicos inhiben el crecimiento de H.

pylori se puede establecer a través de diferentes métodos, algunos de estos son la

microscopía de barrido electrónico y la citometría de flujo, los cuales permiten observar

cambios en la morfología bacteriana; análisis a nivel transcriptómico y proteómico, a través

de los cuales se evalúan cambios a nivel de expresión génica. El desarrollo de uno o varios

de estos métodos permitirá, en diferente medida, determinar adecuadamente la interacción

entre este patógeno y los ácidos húmicos, pudiendo incluso llegar a establecerse como un

tratamiento alternativo para inhibir el crecimiento de esta bacteria.

A continuación, se expondrán los fundamentos, metodología y alcance de las técnicas

anteriormente nombradas.


41

6.1.1. Microscopía de barrido electrónico

6.1.1.1. Generalidades de la técnica

Es una técnica de análisis superficial, que provee información de tipo morfológico,

topográfico y composicional sobre la muestra de estudio. Para ello un fino haz de

electrones, con energías de excitación desde 0.1kV hasta 30kV, incide y se desplaza sobre

la superficie de la muestra, siguiendo una trayectoria de líneas paralelas. Este bombardeo

de electrones provoca la aparición de diferentes señales, que captadas con detectores

adecuados proporcionan, información acerca de la naturaleza de la muestra (Universidad

de los Andes).

La interacción del haz de electrones con la muestra genera diferentes señales que se

relacionan entre sí y con la topografía, el número atómico y el estado químico de la muestra:

Electrones secundarios: Uno de los electrones del haz incidente, pasa cerca

de alguno de los núcleos atómicos de la muestra, transmitiendo energía a

uno o varios electrones internos para saltar fuera de la muestra, los cuales

son de baja energía (< 5 eV) por estar muy cerca de la superficie, haciéndose

sencillo escapar y generar así una información a nivel topográfica de la

muestra.

Electrones retrodispersados: Algunos de los electrones del haz colisiona de

forma frontal con el núcleo de un átomo de la muestra, siendo redireccionado

fuera de la muestra, la intensidad con que lo haga va a depender

directamente del número atómico medio de la muestra de estudio, por lo

tanto, los átomos más grandes, generan mayor cantidad de electrones

retrodispersados, lo que finalmente permitirá elucidar la composición

superficial de la muestra.

Absorción de electrones: La muestra de estudio absorbe electrones de

acuerdo a su espesor y la composición; por lo cual se identifican diferentes

contrastes de la imagen.

Electrones Auger: Al ser expulsado un electrón secundario fuera del átomo,

un electrón ubicado en una capa más externa tiene la posibilidad de llenar

este hueco, resultando así un exceso de energía, la cual es emitida al emitir

un nuevo electrón desde la capa más externa. Esta clase de electrones, dan


42

información acerca de la composición de pequeñísimas partes de la

superficie de la muestra.

Rayos X: El exceso de energía puede ser balanceado bien sea por

electrones de Auger o a través de la emisión de rayos X, los cuales son

característicos de cada elemento, lo que también genera información acerca

de la composición de la muestra.

6.1.1.2. Microscopio de barrido electrónico

El microscopio electrónico de barrido (figura 10) está compuesto por: a) Un haz de

electrones, producido por un cañón termoiónico con un filamento de tungsteno o de

hexaboruro de lantano, o un cañón de emisión de campo FEG, los cuales actúan como

emisor; b) Un sistema de lentes electromagnéticas, encargado de focalizar y reducir el

diámetro del haz de electrones producidos por el cañón; c) Un sistema de barrido que hace

recorrer el haz de electrones por la superficie de la muestra; d) Uno o varios sistemas de

detección que captan el resultado de la interacción del haz con la muestra y lo transforman

en una señal eléctrica (Marrero Alberto & Alberto, 2018).

Figura 10. Estructura interna del microscopio electrónico (Universidad Andrés Bello)

6.1.1.3. Protocolo general de aplicación

Para seleccionar el método a usar se deberá tener en cuenta la naturaleza de la muestra, tal como

se muestra en la figura 11.


43

Figura 11. Tipos de muestra MEB y método de preparación (De Lozano, V et al., 2014)

Con el fin de analizar el mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre la bacteria, se

propone trabajar sobre un cultivo de H. pylori en condiciones normales de crecimiento y un

cultivo de la misma bacteria tratada con ácidos húmicos en concentraciones específicas.

Los medios sólidos son muy utilizados ya sea agar o metil celulosa, lo importante es que

debe tener una viscosidad de 1500 a 6000 centipoise.

Con base en la información consignada en la figura 11, es posible realizar una preparación

de las muestras biológicas de dos maneras diferentes:

Bajo vacío:

No es necesario procesar la muestra.

Las muestras pueden estar hidratadas, no requieren fijación, ni

recubrimientos conductores.

Controlar los niveles de humedad y vacío.

Las muestras pueden sumergirse en nitrógeno líquido antes de introducirse

en la cámara.

Con la platina de enfriamiento es posible montar las muestras en agua y

congelarlas en la plataforma.


44

Alto vacío: Las muestras se secan y estabilizan químicamente teniendo en cuenta:

Cortar agar con colonia.

Colocar en una caja de Petri pequeña.

Fijar: Permite que la estructura morfológica y química del organismo se

mantenga de la misma forma que cuando estaba vivo. Hay fijadores de

carácter físico, tales como el calor, la congelación y la eliminación de agua;

hay fijadores de carácter químico, los cuales implican el uso de una o más

sustancias. Es necesario utilizar soluciones buffer para mantener el pH

dentro de los rangos permitidos a nivel fisiológico.

De Lozano, V et al (2014) proponen realizar una primera fijación en el medio de cultivo,

luego se filtra y se prosigue como si el filtro fuera la muestra. Además, con el fin de no

alterar la morfología de la colonia se realiza la fijación con vapores de OSO4 al 2% por 10

minutos. Un procedimiento específico desarrollado por (Postek, 1980) para la observación

de Bordetella pertussis, consiste en los siguientes pasos:

Seleccionar los especímenes adheridos al agar

Sumergir en FAA (Formol-ácido acético-alcohol) por 24 horas a temperatura

ambiente

Lavar con agua destilada

Deshidratar por 24 horas en 2,2-dimetoxi-propano (DMP) acidificado con 1 gota de

HCl

Transferir la muestra a acetona, dejar 48 horas y secar por punto crítico

La muestra seca se debe recubrir con una capa de metal (oro o platino)

6.1.2. Citometría de flujo


La citometría es un término que se utiliza para la medición, recuento, comparación y

caracterización de células. La citometría de flujo es una tecnología que permite examinar

diversas propiedades en un gran número de células en poco tiempo. Shapiro, H. (2003)

define la citometría de flujo como una tecnología analítica que permite la medición

simultánea de varias características de muestras biológicas.


45

En contraste con métodos de biología molecular, no se obtiene un resultado promedio de

la muestra de estudio, sino que a través de esta técnica se obtienen resultados

cuantitativos, sobre cada célula estudiada, identificándose aquellas que sean diferentes,

así estén presentes en menor proporción.

La citometría de flujo presenta algunas aplicaciones tales como las que presentan

Hartmann H, Stender H, SchÃ¤fer A, Autenrieth IB, and Kempf VA (2005), entre ellas se

encuentran: identificación rápida de microorganismos de interés clínico, estudios de

susceptibilidad o resistencia a medicamentos, análisis y toma de decisiones terapéuticas.

El principio de la citometría de flujo se basa en que las células suspendidas alineadas en

un líquido son pasadas a través de una fuente de luz intensa de una en una y los datos de

la luz reflejada y en la mayoría de los casos de la fluorescencia, relacionada con los

fluorocromos presentes en la célula, son detectados. Las señales luminosas, al ser

detectadas se transforman en impulsos eléctricos, que se amplifican y pasan a ser señales

digitales, las cuales son recogidos y organizados en un archivo de computadora.

En términos generales, es posible reconocer e identificar diferentes moléculas, siempre y

cuando se logre detectar el acoplamiento entre un anticuerpo y un fluorocromo. Es posible

realizar diversas combinaciones de anticuerpos y fluorocromos permitiendo detectar

diferentes antígenos en una misma célula, sin embargo, si la célula no posee el antígeno

correcto, el anticuerpo no podrá unirse, por lo cual la célula no emitirá fluorescencia de ese

color (Barrera y cols., 2004).

Hay moléculas capaces de absorber energía en forma de luz, logrando que uno de sus

electrones alcanzan una órbita mayor de energía y pase de un un estado basal a uno de

excitación. Cuando el electrón excitado regresa a su estado inicial, emite un cuanto de luz

o fotón y desprende energía. Esta transición se llama fluorescencia y los compuestos que

sufren este tipo de fenómeno se conocen como fluorocromos.

6.1.2.2. Citómetro de flujo

Un citómetro de flujo consta de tres sistemas principales, los cuales se ilustran en la figura

12:

a) El sistema de fluidos que transporta las células en suspensión al punto de análisis


46

b) El sistema óptico que incluye una o más fuentes de luz dotadas de lentes de enfoque

para iluminar las células, así como un sistema de lentes y filtros ópticos que recogen,

separan y seleccionan la luz de longitudes de onda específicas que emerge de las células

y la dirigen a los fotodetectores. La información lumínica y fluorescente que ofrece la célula

es recogida por los receptores.

El receptor Forward Scatter, recoge la penumbra celular (que es proporcional al tamaño de

la célula), generado al atravesar el láser; el receptor side scatter recoge la cantidad de luz

del láser desviada, proporcional a la complejidad del citoplasma, es decir, a las

desviaciones que producen los orgánulos intracelulares; la fluorescencia emitida por los

fluorocromos es recogida por diferentes receptores, tras ser filtrada por diferentes cristales

dicroicos, los cuales son capaces de reflejar longitudes de onda determinadas, permitiendo

que las demás lo atraviesen sin sufrir modificaciones. Los diferentes receptores transforman

la luz en señales eléctricas, que son enviadas a un registro informático

c) El sistema electrónico que procesa las señales ópticas al transformarlas en pulsos

eléctricos proporcionales a la intensidad de estas.

Figura 12. Esquema general de un citómetro de flujo (Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A, 2014)

La capacidad de medir simultáneamente múltiples parámetros celulares se debe a la

detección de la desviación de la luz, permitiendo así obtener el tamaño y complejidad, así

como la fluorescencia proveniente de cualquier componente celular o función marcada con


47

un colorante fluorescente o fluorocromo sensible a la fuente de luz (Barrera y cols., 2004;

Ortiz y cols., 2006).

Los fluorocromos tienen la característica de presentar en su estructura dobles enlaces

conjugados. Cada fluorocromo absorbe en una longitud de onda específica de luz y emite

en otra longitud también característica tal como se muestra a continuación:

Fluorocromo Absorción (nm) Emisión (nm)

DAPI 345 455

Cascade Blue 395 420

FITC 495 519

PE 480, 565 578

PerCP 490 675

Yoduro de Propidio 493 617

APC 650 660

Tabla 3. Longitud de onda de absorción y emisión de algunos fluorocromos utilizados en la técnica (Shapiro, 2003; McCarthy, 2010).

Los citómetros de flujos están conformados por diversos elementos integrados en el módulo

sensor. El equipo se encuentra asociado a una computadora que tiene diferentes

programas para almacenar la información en forma de archivos, los datos pueden ser

representados gráficamente para su posterior análisis. Para el análisis se puede elegir el

exámen total de los datos (dot plot o diagrama de puntos) o el análisis de solo una parte de

ellos (histograma).



48

La mayoría de las aplicaciones de la citometría de flujo se basan en la medición de la

fluorescencia. Algunas de las aplicaciones más comunes utilizando fluorocromos son el

análisis de la viabilidad celular y el estado fisiológico.

La determinación de la viabilidad celular consiste en un conteo de las células vivas (sanas)

o muertas en una muestra. Generalmente esta determinación se basa en el análisis de dos

parámetros: actividad metabólica de la célula o integridad de la membrana plasmática.

Una de las formas de evaluar la integridad de la membrana, es el uso de colorantes de

exclusión o colorantes de retención. Los colorantes de exclusión tiñen los ácidos nucleicos

de las células con membranas deterioradas y los de inclusión generalmente utilizan

sustratos fluorescentes que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan

productos fluorescentes (Riesberg, 2001).

Las células vivas con membranas intactas se caracterizan por su habilidad para excluir

colorantes que fácilmente penetran la membrana plasmática de células muertas o dañadas.

Al adaptar un procedimiento de Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A (2014), es posible

establecer el siguiente protocolo para el análisis de la viabilidad de bacterias:

a. Método o desarrollo

● Tomar 60 micro Litros del cultivo de bacterias

● Centrifugar a 500 xg por 5 minutos

● Retirar el sobrenadante

● Resuspender en 1mL de PBS

b. Tinción con yoduro de propidio

● Preparar una cama de hielo

● Colocar en un tubo de poliestireno aproximadamente 106 células lavadas y

suspendidas en 1 ml de PBS

● Agregar 1 μL de IP (concentración final: 2 μg/ml)

● En otro tubo colocar un millón de células en 1 ml de PBS

● Incubar durante 5 minutos en obscuridad en una cama de hielo.


49

● En el programa Cell Quest, construya la hoja de adquisición

● Abrir los controladores de los detectores

● Adquirir 20,000 eventos celulares de los tubos sin marca y con IP y analizar

en el citómetro de flujo a 488 nm de excitación

c. Análisis de viabilidad

Mediante el programa de adquisición y análisis CellQuest se obtendrán los histogramas

correspondientes al control positivo y a las células inviables es decir aquellas que

incorporaron IP (Yoduro de Propidio).

6.1.3. Secuenciación de ácidos nucleicos


Al conjunto de las moléculas funcionales de RNAs (RNA mensajero y RNA no codificante)

producto de la expresión de los genes en una célula se conoce como transcriptoma, su

importancia radica en que representa la cuantificación de material transcrito y su relación

con la expresión de genes (Muñoz & de Biología Celular, 2011). Por un lado, el RNA

mensajero es el producto de la transcripción de genes que finalmente son traducidos en

proteínas y por otro lado, el RNAs no codificante presenta diversas funciones como la

síntesis de ribonucleoproteínas, adaptación de aminoácidos en la traducción y regulación

de la expresión génica.

El análisis del transcriptoma es una herramienta que requiere investigación experimental

(in vitro) y computacional (in silico), por su rigurosidad, es posible obtener importante

información acerca de la activación o desactivación del gen de estudio. Dependiendo de la

técnica utilizada es posible conocer el número de transcritos para determinar la actividad

de los genes, también llamada expresión génica en un tipo específico de células o tejidos

(“Transcriptoma,” n.d.). Recientemente ha surgido una tecnología llamada secuenciación

de nueva generación (NGS) la cual permite inicialmente la secuenciación del DNA y en

segundo lugar, gracias a su versatilidad, la secuenciación masiva de todas las moléculas

de RNA presentes en una muestra y por lo tanto del transcriptoma completo mediante la

técnica RNA-Seq.

El estudio de transcriptomas bacterianos no ha progresado tan rápidamente como el estudio

de transcriptomas eucariotas debido a la naturaleza del RNA bacteriano. El análisis


50

exhaustivo de la expresión génica global en bacterias se ha visto obstaculizado debido a la

abundancia de RNA ribosómico (RNAr) y la inestabilidad del RNA (Filiatrault, 2011).

La estrategia básica de secuenciación de ácidos nucleicos consta de 3 etapas

principalmente: a) La degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos de

interés a fragmentos suficientemente pequeños para ser secuenciados; b) la secuenciación

de los fragmentos pequeños y d) el ordenamiento de los fragmentos a través de la repetición

de los pasos anteriores.

Entre las nuevas técnicas de secuenciación masiva se encuentra la pirosecuenciación e

illumina (Greif, n.d.).

6.1.3.2. Técnicas

6.1.3.2.1. Pirosecuenciación

Este es un método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS) que se

caracteriza por su alto rendimiento, significativamente mayor a los que implican

electroforesis capilar. Es una técnica enzimática, en la cual se mide la separación de

pirofosfato, tras una reacción de polimerización mediante diferentes reacciones enzimáticas

acopladas que generan una señal de luminosa cada vez que se incorpora un nucleótido

(n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN):

El cebador híbrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro enzimas, los

sustratos APS y luciferina.

A la mezcla anterior, se añade uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, si

es el complementario a la hebra molde, se integrará a la cadena de DNA creciente

generando una molécula de PPi, sino es el complementario se utilizará otro

desoxirribonucleótido trifosfato.

La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP, el cual genera la oxidación de la

luciferina (oxiluciferina), catalizada por la enzima luciferasa. Este proceso da como

resultado una cantidad de luz visible, acorde a la cantidad de ATP utilizado. Al ser

captada por un fotodetector, se genera un pico relacionado directamente con el

número de nucleótidos que se han integrado.

Antes de iniciar una nueva reacción, la apirasa degrada todos los

desoxirribonucleótidos trifosfato que no se han integradora la cadena naciente, así

como el exceso de ATP (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN).


51

Todo este proceso permite construir flujogramas, que al ser interpretados por un

computador, da como resultado las secuencias de nucleótidos. También se considera un

método de síntesis, y que la secuencia que se va construyendo depende de la hebra

complementaria. Este aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 99% de

precisión en una corrida de 4 horas.

Figura 13. Pirosecuenciación de DNA (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN).

6.1.3.2.2. Illumina

En esta tecnología se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas

fluorescentes. Además de la paralelización previa, es decir, la capacidad de realizar

millones de secuencias en cada corrida, se diferencia con el método convencional en la

posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen y desbloquear el

carbono 3’ de manera que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de

secuenciación.


6.1.3.3.1. Pirosecuenciación

En términos generales, la pirosecuenciación se lleva a cabo en cinco pasos esenciales los

cuales se describen a continuación (Pirosecuenciación del ADN, 2016 ):

Inicialmente se debe fragmentar el DNA a secuenciar mediante un proceso conocido

como nebulización el cual es un procedimiento físico en el que el material genético

se rompe en fragmentos de 200 a 800 pares de bases.


52

En segundo lugar, mediante una emulsión de aceite se generarán microesferas en

las que se encapsularán los fragmentos únicos de DNA.

En cada microrreactor se encuentran los fragmentos necesarios para llevar a cabo

la reacción de PCR tales como oligonucleótidos, dNTPS, polimerasa y un único

fragmento de DNA molde.

A continuación se realiza la PCR con el fin de generar muchas copias del mismo

fragmento de DNA original.

Finalmente se liberan las esferas de la emulsión y se colocan en placas donde se

secuenciarán. Para tal fin se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas

en cada una de las cuales se realizará la pirosecuenciación. La secuenciación

completa se lleva a cabo añadiendo uno de los cuatro nucleótidos y observando qué

celdilla se ilumina.

Después de cada adición de nucleótidos se lava y se añade el siguiente nucleótido

hasta completar la secuencia

6.1.3.3.2. Illumina

Los primeros pasos de esta técnica consisten en fragmentar el DNA y ligar los adaptadores;

posteriormente se debe realizar el paso de amplificación sobre una superficie sólida (“flow

cell”) sobre la cual se dará la reacción de secuenciación.(Greif, n.d.). A continuación se

mencionan los pasos generales para desarrollar esta técnica de secuenciación (Travisany,

2018):

Inicialmente se debe fragmentar el DNA, reparar los extremos y agregar los

adaptadores

A continuación se agrega el DNA a la placa en donde se realizará la hibridación y la

cual presenta el equipo, esto se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que

están en la placa

Seguido de esto, se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa, de esta manera

inicia la amplificación.

Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente, en este momento

se habrán generado millones de clústers en la placa, es decir, copias de genes.

Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular: G -

Amarillo; C – Azul; A – Rojo; T - Verde.

Esto se excita con láser y se genera una imágen la cual es captada. La imagen

capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.


53

Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado.

Una base a la vez.

Es importante resaltar que por lo general estos procedimientos los realizan las personas

encargadas del manejo del equipo y pueden variar con las características del mismo.

6.1.4. Análisis proteómico

Las técnicas de proteoma son utilizadas en gran escala en la investigación microbiana para

analizar la síntesis global de proteínas como un indicador de la expresión genética de la

bacteria. El término proteoma se refiere al producto de la traducción del RNAm y las

diferentes variantes o modificaciones generadas por la célula después de este proceso. La

combinación del proteoma con genética, biología molecular, bioquímica y biofísica de

proteínas han generado una completa técnica de gran alcance que, en particular para el

desarrollo del presente proyecto permitiría indagar acerca del estado fisiológico de las

células bacterianas en circunstancias particulares.

Entre las aplicaciones de la proteómica está en primer lugar el estudio de la patogenicidad

bacteriana, es decir, el mecanismo mediante el cual los microorganismos interactúan con

el hospedero para generar ciertos procesos clínicos; por otro lado esta técnica permite el

estudio de la expresión de factores de virulencia en microorganismos. La habilidad de los

microorganismos patógenos para causar enfermedades en hospederos susceptibles se

debe a múltiples factores que actúan individualmente o en grupo durante diferentes etapas

de la infección. En el caso de Helicobacter pylori, se presentan entre otros, dos factores de

virulencia: vacA y cagA los cuales ya han sido identificados y se ha encontrado que se

encuentran involucrados en distintos aspectos de la patogénesis de la bacteria; por un lado

el cagA corresponde a un marcador de una isla de patogenicidad que contiene 29 genes

(Cervantes-García 2012). En este sentido, el proteoma podría proporcionar información

acerca de la expresión de dichos genes y constituye una poderosa herramienta para

comparar proteínas sintetizadas por cepas bacterianas virulentas y avirulentas, con

respecto a esto, la electroforesis en geles de doble dimensión puede ser catalogada como

un método para la identificación de factores de virulencia a nivel de síntesis de proteínas



54

En términos generales, el protocolo a seguir para el estudio con las cepas Helicobacter

pylori, puede constar de las siguientes etapas:

● Cultivo de la bacteria: Es necesario partir de un control positivo el cual será objeto

de comparación con otras cepas bacterianas que crecerán en condiciones distintas

bajo la acción de los ácidos húmicos. Es esencial realizar el cultivo con medios libres

de proteínas, en un estudio realizado por (Bumann et al., 2002) se sugiere que el

medio de cultivo contenga BHI suplementado con ciclodextrina al 1%. Se

recomienda incubar a una temperatura de 37°C en placas de agar sérico con

vancomicina, nistatina y trimetoprim en una atmósfera microaerobia. Se procede a

resuspender las bacterias y a lavarlas con BHI. Las bacterias se recuperan por

centrifugación, se lavan con BHI y se inoculan en un segundo cultivo líquido hasta

alcanzar 20 cultivos de 60 mL cada uno.

● Precipitación de proteínas extracelulares: Los cultivos con crecimiento exponencial

se centrifugan durante 15 minutos a 4°C y se filtra el sobrenadante para eliminar las

bacterias residuales. Las proteínas extracelulares se precipitan mediante la adición

de TCA (ácido tricloroacético), se centrifuga por 10 minutos y se resuspende el

sedimento en 10mL de acetona, se disuelve usando un baño de agua ultrasónico.

Se repite este paso dos veces y el sedimento final se seca al aire (Bumann et al.,

2002).

● Electroforesis en gel bidimensional: Se solubilizan las proteínas por 30 minutos a

temperatura ambiente en urea 9 M-1% 3 - [(3-colamidopropil) -dimetilamonio] -1-

propanosulfonato (CHAPS) -ditiotreitol 70 mM (DTT) Servalyto al -2%. El el trabajo

realizado por Brumann (2002) se utilizó un sistema de electroforesis en gel

bidimensional (23 por 30 cm). Para la identificación de proteínas se aplicaron 50 a

70 µg de proteínas extracelulares en el lado anódico del gel de enfoque isoeléctrico.

Los puntos se identificaron y cuantificaron mediante el programa de análisis de gel

TOPSPOT (Bumann et al., 2002)

● Toma de huellas dactilares de péptidos: La mezcla de péptidos se mezcló con una

solución saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% de acetonitrilo-0,3%

de ácido trifluoroacético (TFA), y se aplicaron 2 µl a la plantilla de muestra de un

https://paperpile.com/c/3MxZs7/743E





55

láser asistido por matriz Espectrómetro de masas de ionización por desorción. Las

huellas dactilares de masa de péptidos se buscaron con el programa MS-FIT.

6.2. Análisis de los parámetros de estudio con los métodos descritos

De acuerdo con los factores de virulencia asociados a Helicobacter pylori, es posible

relacionarlos con los métodos anteriormente descritos (tabla 4), con el fin de seleccionar

posteriormente el más adecuado para la determinación del mecanismo de acción de los

ácidos húmicos sobre dicha bacteria.

Método Alcance del método Laboratorios para el

desarrollo del

análisis

Microscopía de

barrido

electrónico

Este método permite hacer un análisis de la

bacteria a nivel morfológico, siendo posible

examinar algunos factores asociados a la

colonización y virulencia. En primer lugar es

posible detectar cambios en la membrana

celular asociados a alteraciones en el LPS

bacteriano el cual posee residuos de

carbohidratos que pasan desapercibidos en

el proceso de reconocimiento por los

anticuerpos. La membrana celular es un

factor de supervivencia de la bacteria

importante a estudiar ya que corresponde al

límite entre el espacio intracelular y el espacio

extracelular y que presenta condiciones

extremas de pH. Las adhesinas son otras

estructuras celulares que pueden ser

estudiadas con este método, estas le impiden

a la bacteria ser arrastrada por el

peristaltismo o el recambio epitelial, así

Universidad

de los Andes

Universidad

Nacional

Universidad

ECCI.


56

mismo pueden ser objeto de estudio otras

estructuras externas como los flagelos o la

pilis bacteriana.

Citometría de

flujo

Este método hace posible medir múltiples

parámetros que permitirían el posterior

análisis con el mecanismo de acción de los

ácidos húmicos sobre Hp. La viabilidad

celular que se relaciona con la integridad de

membrana es uno de los parámetros de

interés pues los compuestos en mención

(AH) pueden incidir directamente sobre la

misma afectando el potencial de membrana.

Dichos aspectos se pueden estudiar

mediante el uso de fluorocromos y la

interpretación de los histogramas que se

obtengan de los ensayos realizados.

Pontificia

Universidad

Javeriana.

Universidad

Nacional.

Secuenciación

de ácidos

nucleicos

Entre los genes asociados a Hp como

factores de virulencia está el gen cagA el cual

codifica la proteína CagA, este gen

desencadena efectos tales como la ruptura

de uniones intercelulares, estimulación de

linfocitos, desregulación del ciclo celular,

apoptosis celular y producción de

interleucinas inflamatorias que generan

inflamación crónica. Así mismo el gen vacA

induce la expresión del factor de crecimiento

vascular endotelial (VEGF) y puede llegar a

provocar el desarrollo de procesos

tumorgénicos. Dichos genes pueden ser

secuenciados y comparados con bacterias

que han sido expuestas al tratamiento con

ácidos húmicos.

Alianza

Unandes-

Corpogen.

ISLA S.A.S.

Servicios

Médicos

Yunis Turbay

y Cía.


57

Análisis

proteómico

Entre los factores de virulencia que se

podrían estudiar con este método se

encuentran por un lado las proteínas de

membrana OMPs las cuales desempeñan

funciones de transporte de nutrientes y

transducción de señales, en HP se han

identificado más de 21 OMPs y entre las

principales funciones está la adhesión a la

célula hospedera y estimulación de

citoquinas pro inflamatorias.

Por otro lado para efectos comparativos entre

células desarrolladas normalmente y bajo la

acción de los ácidos húmicos, sería posible

comparar la manifestación de la proteína

NapA (Proteína Activadora de Neutrófilo) y la

cual actúa como un agente quelante del

hierro. La proteína cagA es otro de los objetos

de estudio mediante esta técnica, es una

citotoxina que activa diferentes señales en la

célula hospedadora provocando diferentes

efectos asociados a la inflamación, aspecto

relacionado con la aparición de cáncer

gástrico.

Alianza

Unandes-

Corpogen.

ISLA S.A.S.

Servicios

Médicos

Yunis Turbay

y Cía.

Tabla 4. Parámetros de análisis con los métodos descritos

6.3. Selección del método para el desarrollo de la propuesta metodológica

La secuenciación del transcriptoma bacteriano de Helicobacter pylori, mediante las técnicas

de nueva generación (NGS, Next-generation sequencing), permitirá secuenciar todos los

transcritos de RNA expresados por estas células, después de que sean sometidas a la

acción inhibitoria de los ácidos húmicos. A través de esto se puede obtener mayor


58

información de los genes que están activados y de los genes que están reprimidos,

independientemente de que estos estuvieran o no anteriormente identificados.

La calidad y confiabilidad de estos resultados dependen del correcto desarrollo

metodológico y experimental, a partir del cual se obtienen las muestras que serán

secuenciadas, cualquier error en este punto, implica empezar de nuevo, lo que conlleva

una mayor inversión en tiempo y recursos. Por otro lado, la rigurosidad de trabajo se hace

necesaria, para poder evitar la generación de variaciones técnicas, que conlleven a

conclusiones erradas, para lo cual se trabajará con un mínimo de tres muestras de

Helicobacter pylori cada una expuesta al tratamiento inhibitorio que ejercen los ácidos

húmicos, esto facilita evaluar la variabilidad biológica en cada tratamiento y compararlo con

el otro, para finalmente generalizar los resultados a la población bacteriana. (RODRÍGUEZ

CUBILLOS et al, 2014)


59

7. Desarrollo de la propuesta

El desarrollo de esta propuesta tiene tres vertientes, la primera se relaciona con la

caracterización de las muestras de carbón y una posterior extracción de los ácidos húmicos,

que serán sometidos a diversas pruebas para caracterizarlos física y químicamente; la

segunda, está enmarcada al tratamiento microbiológico que se le hará a las diferentes

cepas de Helicobacter pylori. Finalmente, una tercera fase implica unificar los anteriores

desarrollos experimentales, para evaluar la eficiencia inhibitoria de los ácidos húmicos en

las diferentes muestras bacterianas, a partir de las cuales se obtendrán muestras de sus

transcritos de RNA, que permitan conocer la información de los genes que están siendo

activados y reprimidos, cuando la célula se somete a una condición específica.

7.1. Toma y preparación de las muestras de carbón

Se plantea la recolección de seis muestras de carbón, siguiendo lo estipulado en la norma

ASTM D 2234-98. Posteriormente, se debe realizar una disminución de tamaño a través de

un proceso de molienda y tamizado, hasta que cada muestra alcance un tamaño de

partícula cercana a los 0,25 mm, separada mediante un tamiz Malla No. 60. El

procedimiento se ilustra en el diagrama 1.

Diagrama 1. Metodología del muestreo y la preparación de las muestras de carbón


60

7.2. Análisis próximo

En el diagrama 2, se ilustra la metodología usada para caracterizar las diferentes muestras

de carbón y establecer así la más óptima para la posterior extracción de los ácidos húmicos

que se emplearán posteriormente en la inhibición de la bacteria Hp.

Diagrama 2. Metodología para el análisis próximo de las muestras de carbón.

7.2.1. La metodología para la determinación del porcentaje de humedad de

cada una de las muestras de carbón se muestra en el diagrama 3.

Diagrama 3. Metodología para la determinación del porcentaje de humedad

7.2.2. Determinación del porcentaje de cenizas: La metodología para la

determinación del porcentaje de ceniza para cada una de las muestras

de carbón se muestra en el diagrama 4.


61

Diagrama 4. Metodología para la determinación del porcentaje de cenizas.

7.2.3. Determinación de materia volátil: La metodología para la

determinación del porcentaje de materia volátil para cada una de las

muestras de carbón se muestra en el diagrama 5.

Diagrama 5. Metodología para la determinación del porcentaje de materia volátil.

7.2.4. Determinación de densidad: La metodología para la determinación

de la densidad para cada una de las muestras de carbón se muestra

en el diagrama 6.


62

Diagrama 6. Metodología para la determinación de la densidad.

7.2.5. Determinación de poder calorífico: La metodología para la

determinación del poder caloríf ico para cada una de las muestras de

carbón se muestra en el diagrama 7.

Diagrama 7. Metodología para la determinación del poder calorífico.

7.3. Análisis último:

En el diagrama 8, se ilustra la metodología usada para realizar el análisis último de las

diferentes muestras de carbón, a través del cual se determina la composición porcentual de

nitrógeno, carbono, hidrógeno y azufre, por medio del equipo THERMO FLASH 2000

CHNS-O ubicado en las instalaciones de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.


63

Diagrama 8. Metodología para análisis último de las muestras de carbón.

7.4. Extracción de Ácidos húmicos:

La extracción de los A.H. se hace a partir de carbón de bajo rango, determinado por el

análisis próximo y último de las diferentes muestras de carbón, pues se considera como

una de las principales fuentes de estos ácidos. Con base en los trabajos en la Universidad

Distrital Francisco José de Caldas se ha logrado optimizar los procesos de extracción de

los A. H., por lo cual se continúa con la misma metodología de extracción el cual se describe

en el diagrama 9.

Diagrama 9. Metodología para la extracción de los ácidos húmicos.


64

7.5. Caracterización de los ácidos húmicos

Teniendo presente la naturaleza particular de los ácidos húmicos de acuerdo con su fuente

de extracción, se hace necesario realizar un estudio del sustrato, con el propósito de

conocer las características físicas y químicas que presente y contrastarlas con las fuentes

teóricas, para poder asegurar de que el sustrato extraído realmente son ácidos húmicos y

así poder determinar la inhibición de estos sobre la bacteria H. P. Esta metodología se

ilustra en el diagrama 10.

Diagrama 10. Caracterización experimental de los ácidos húmicos.

7.6. Tratamiento microbiológico de Helicobacter pylori

Con el propósito de poder realizar un análisis transcriptómico sobre las bacterias, como

terapia alternativa de inhibición, se hace necesario establecer los criterios para obtener,

sembrar y cultivar este microorganismo, así como el procedimiento para determinar y

comparar los halos de inhibición al ser tratados con ácidos húmicos y el antibiótico

seleccionado.

7.6.1. Toma de biopsias: La biopsia a partir de mucosa gástrica es una de las

opciones más habituales para el aislamiento y cultivo de Helicobacter pylori,

pues este tipo de microorganismo se establece principalmente en la zona antral

del estómago, excepto en individuos tratados con IBP (Inhibidores de la Bomba

de Protones) y antihistamínicos, en los que se encuentran densidades más

grandes en el cuerpo. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004). El

protocolo recomendado para la toma de biopsias en pacientes con gastritis

crónica es el propuesto por el sistema Sydney, este establece que se deben


65

tomar dos muestras antrales a partir de las curvaturas mayor y menor con 2 a 3

cm proximales al píloro, dos muestras del cuerpo estomacal a partir de las

curvaturas mayor y menor 8 centímetros distales del cardias y una muestra a

partir de la cisura angularis. No se recomienda realizar la biopsia en pacientes

con úlcera sangrante ya que puede ocasionar una hemorragia (Bayona Rojas,

2013)

7.6.2. Transporte y conservación de las biopsias: Este tipo de procedimiento está

sujeto al tiempo que tome iniciar el cultivo de la bacteria. En el caso de que el

trabajo se vaya a iniciar inmediatamente después de la toma de la muestra, se

recomienda introducir el microorganismo sobre la pared del tubo o en un tubo

estéril con 0,5 mL de suero salino, teniendo en cuenta que la muestra

permanecerá viable hasta un máximo de 6 horas. Cuando la siembra se va a

realizar en un tiempo mayor, la biopsia debe introducirse en un medio de

transporte semisólido a 4ºC, extendiendo la viabilidad hasta un periodo de 48 h.

Sin embargo, la mejor opción es procesar la biopsia en las cuatro horas

siguientes, una vez tomada la muestra. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et

al. 2004).En la bibliografía hay pocos reportes sobre el adecuado transporte y

condiciones de aislamiento de Helicobacter pylori de biopsias gástricas,

especialmente si estas deben transportarse por un largo periodo de tiempo. De

ahí la importancia de trabajar adecuadamente en este aspecto, pues la

estabilidad de la muestra bacteriana durante su transporte puede llegar a limitar

la recuperación de esta.

7.6.3. Cultivo y aislamiento de Helicobacter pylori: Tanto el cultivo como

el aislamiento de Helicobacter pylori dependen del adecuado control

de diferentes variables que incluyen la recogida, el transporte, el

almacenamiento, los medios de cultivo y las condiciones de

incubación. Es necesario ser muy riguroso en este tipo de

procedimientos, especialmente si la muestra se obtiene a partir de

una biopsia gástrica, ya que esta aporta diversas ventajas en el

estudio histológico de la bacteria, tales como la sensibilidad y/o la

resistencia a los diferentes antibióticos. Tanto la recuperación de la

bacteria, como las características de crecimiento deben hacerse de

forma correcta, ya que de estas dependen estudios de epidemiología ,

diversidad genética y susceptibilidad a antibióticos o antimicrobianos.

https://paperpile.com/c/3MxZs7/PGpw

https://paperpile.com/c/3MxZs7/PGpw


66

(Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004). Las muestras de

biopsia deben triturarse o pulverizarse con una pequeña cantidad de

solución salina antes de aplicarse sobre el medio, una vez

homogeneizado, debe colocarse de inmediato sobre el medio, para

esto se toma el asa y se extiende sobre la superficie del medio de

cultivo elegido.

7.6.3.1. Medios de cultivo:

Un adecuado cultivo de Helicobacter pylori, permitirá conocer sus características de

crecimiento, su diversidad genética, su epidemiología y la posibilidad de determinar la

resistencia a los antibióticos usados en el tratamiento. El primer paso es realizar una adecuada

homogeneización de la biopsia en un volumen pequeño de suero fisiológico, buscando facilitar

la liberación de las bacterias.

Una de las principales características de Helicobacter pylori es su facilidad de crecer en

diferentes medios de cultivo, sin embargo, en cada uno de estos existen factores de

crecimiento que se deben tener en cuenta (tabla 4). Lograr medios de cultivo líquidos es difícil,

sin embargo, algunos de los más prácticos incluyen el caldo de Brucella, cerebro-corazón,

Mueller-Hinton y tripticasa soja, suplementados con nutrientes, siendo el más común el suero

bovino fetal. En el caso de los medios de cultivo sólidos los más frecuentes son el Mueller-

Hinton y el agar Columbia, suplementados con suero de caballo, lisado de eritrocitos y hemina,

extracto de levadura, peptona, isovitalex, sin embargo, los mejores resultados se obtienen con

suero bovino fetal o sangre.

Autores Medio basal Requerimiento

de Sangre

Suplementos Antibióticos

Tersterman

y cols (2001)

Agar sangre B- ciclodextrina,

colesterol y

suero fetal

bovino


67

Joo y cols

(2010).

Caldo Brucella Suero equino,

extracto de

levadura y

dimetil-beta-

ciclodextrina.

Stevenson y

cols (2000)

Agar

Columbia

Sangre de

caballo

Extracto de

carne y almidón

de maíz.

Vancomicina,

anfotericina

B,

trimetoprima y

cefsulodina

Bilbao y cols

(2007)

Agar

Columbia

7% de sangre

desfibrinada de

cordero.

DENT

(vancomicina,

trimetoprim,

anfotericina B

y cefsulodi).

Yepes y cols

(2008)

Agar Brucella Sangre de

cordero al 5%

Vega y cols

(2012)

Caldo Mueller

Hinton

Extracto de

cianobacterias

(MH-CE)

Vega y cols

(2012)

Caldo Mueller

Hinton

Suero fetal de

ternera (MH-

FCS)

Trespalacios

y cols (2010)

Wilkins-

Chalgren

Isovitalex No se

especifican.

Quiroga y BD Suero de caballo Isovitalex al


68

cols (2005) Helicobacter

Agar

al 8% y

suplemento

selectivo para

Campylobacter

(Merck)

1%.

Tabla 5. Composición de diferentes medios de cultivo empleados en el aislamiento de Helicobacter pylori. Adaptado de: Bayona, 2013

Se debe tener presente la cantidad de sangre que se utilice, pues se ha comprobado que una

relación de 7-10 % favorece en mayor medida el desarrollo de la bacteria; y por otro lado el

tipo de sangre, ya que hay un mayor crecimiento con sangre de caballo al 10% y lisada al 7%.

Lo más importante es que la sangre que se utilice este fresca, pues aunque los medios de

cultivo preparados puedan llegar a funcionar es difícil tener certeza de la frescura de sus

componentes.

Debido a que en la toma de la biopsia es posible encontrar contaminantes junto a Helicobacter

pylori, se hace necesario utilizar inhibidores que no afecten su viabilidad, tales como

vancomicina, sulfametoxazol, trimetropin, cefsulodina y polimixina B, los cuales hacen parte

de la preparación de los medios selectivos. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004).

Es importante tener en cuenta que hay varios medios de cultivos reportados (Tabla 5), donde

su elección está sujeta a la accesibilidad comercial sobre cada uno de los ingredientes. Sin

embargo, de forma general es posible reconocer los elementos básicos que se requieren para

la preparación de estos medios tales como el empleo de un caldo o agar base nutritivo

enriquecido con sangre fresca de cordero o de equino, isovitalex al 2%, suero de equino al

10% y antibióticos. (Bayona, M. A., 2013).


69

Medios sólidos con sangre

de caballo

Medios sólidos con suero de

caballo

Medios sólidos sin sangre

de caballo

Caldo BHI con 10% agar

Agar Brucella

Agar Muller Hinton

Agar Skirrow

Agar Columbia

Agar Campylobacter

modificado

Agar Chocolate

Agar GC (Gonococos)

Caldo BHI

Caldo Muller Hinton

Caldo Brucella

Caldo soya tripticasa

Agar Columbia

Hemina

Rojo fenol

Isovitalex

Urea

Tabla 6. Medios de cultivo útiles para el cultivo de Helicobacter pylori (Majalca-Martínez, Rivera-Cabrera, Ochoa-Pérez, & Giono-Cerezo, 2001)

7.6.3.2. Incubación: La atmósfera en la cual se desarrolla Helicobacter

pylori, no solo se caracteriza por ser microaerofílica sino que

además debe cumplir con los siguiente requerimientos: 5 -10% de

O2, 5-10% de CO2 y 80-90% de N2 a 35-37 ºC, un porcentaje de

humedad del 95% y una incubación de diez días, antes de

considerar negativo el cultivo. Por lo anterior, se hace necesario

utilizar cabinas de microaerofilia o sobre comerciales que generan

las condiciones anteriormente descritas. (Alarcón, T., Baquero, M.,

Domingo, et al. 2004).

7.6.3.3. Identificación del microorganismo: Teniendo en cuenta que la

cepa nativa se debe tomar de varias biopsias diferentes, tras la

incubación se observarán microorganismos de diferentes tipos,

razón por la cual se deben realizar técnicas de contraste, pruebas

microbiológicas y bioquímicas que permitan identif icar plenamente

las cepas correspondientes a Helicobacter pylori.

7.6.3.3.1. Tinción de Gram: Tendiendo en cuenta la clasificación de

Helicobacter pylori, como una bacteria Gram negativa, esta tinción

dará como resultado una coloración rosada, sin embargo, si dentro


70

del protocolo de esta tinción se cambia la safranina por fucsina la

coloración que se observa será de color rojo. El procedimiento

para el desarrollo de esta tinción se presenta a continuación:

Figura 14. Metodología para la tinción de Gram

7.6.3.3.2. Prueba de Ureasa: A través de esta prueba será posible distinguir la

bacteria en cuestión de las Campylobacter, por su capacidad de hidrolizar la

urea en anhídrido carbónico y amonìaco, generando un cambio de color de

la enzima ureasa, debido al marcado incremento de pH que causa el

amoniaco, sin embargo, se debe considerar que la bacteria “in vitro” se

comporta diferente a su estado “in vivo”, pues habrá una marcada menor

cantidad de ureasa dentro de la bacteria, lo que generará muchos resultados

negativos o débilmente positivos.

7.6.3.3.2.1. Procedimiento: Inocular varias colonias del microorganismo en 0,25 ml

de caldo de urea e incubar a 370C. A los pocos minutos se podrá

observar un color rojo.


71

7.6.3.3.3. Prueba de catalasa: Esta enzima está asociada a la superficie de

Helicobacter pylori y la protege de la acción fagocitica de algunos

mediadores químicos de la inflamación, como los neutrófilos y los

metabolitos reactivos de oxígeno, para garantizar su supervivencia en el

tejido inflamado. Debido a su actividad peroxidasa, al poner en contacto

alguna colonia de estas con peroxido de hidrogeno, se formarán burbujas,

pues la Helicobacter pylori hace uso de la enzima catalasa para eliminarlo,

generando agua y oxígeno, de ahí el burbujero observado. (Alarcón, T.,

Baquero, M., Domingo, et al. 2004)

7.6.3.3.3.1. Procedimiento: Inocular un asa con colonias en una gota de H2O2 al

3% depositada en un portaobjetos. La formación de burbujas indica una

prueba de catalasa positiva.

7.6.3.3.4. Prueba de oxidasa: La reacción de esta enzima se debe a que Helicobacter

pylori, presenta un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del

citocromo, reducido por el oxígeno molecular, dando lugar a peróxido de

hidrógeno, de ahí que su acción vaya ligada a la de la enzima catalasa, que

degrada este compuesto como se explicó anteriormente.

7.6.3.3.4.1. Procedimiento: Transferir varias colonias a una tira de oxidasa o a un

papel de filtro impregnado en dihidro-cloruro de N,N,N´,N´ tetrametil-p-

fenilendiamina al 1%. Una reacción azul oscura indica la presencia de la

enzima oxidasa. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004)

7.6.3.4. Sub cultivo del microorganismo: Los resultados de las anteriores pruebas,

permiten identificar la presencia de Helicobacter pylori, y por ende aislarla

de otros microorganismos también presentes en las biopsias. A partir de

esta, será posible realizar una resiembra que servirá como cepa de

referencia nativa y control positivo en los posteriores tratamientos y pruebas

a realizar. Es posible realizarla de dos formas diferentes:


72

7.6.3.4.1. Directamente con el asa, se recoge la biomasa de un aislamiento de

Helicobacter pylori (previamente identificado con las pruebas mencionadas)

y se inocula en un medio no selectivo (tabla 10) y un ambiente

microaerofílico.

7.6.3.4.2. Se prepara una suspensión densa del microorganismo, en caldo BHI o

solución salina y se inoculan en placas con medios no selectivos (tabla 10)

y un ambiente microaerofílico. Es necesario esperar un rango de 48 - 72

horas de incubación para hacer uso de los mismos en las pruebas

siguientes.

7.6.3.5. Conservación de las muestras: Teniendo claro que su realizarán varios

estudios, tanto las biopsias obtenidas, como las cepas de Helicobacter pylori,

deben almacenarse de forma correcta.

7.6.3.5.1. Conservación de las biopsias: Cada biopsia será introducida en un criotubo

con 0,5 mL de BHI. 20 % de glicerol y una incubación con una temperatura

de -80 ºC o 196º C (si se usa nitrógeno líquido).

7.6.3.5.2. Conservación de los aislamientos de Helicobacter pylori: Se deben seguir

los siguientes pasos: primero, resembrar las cepas en dos placas de agar no

selectivo; segundo, esperar 48 horas para recoger e inocular en 2-3 mL de

BHI con 20 % de glicerol; tercer, almacenar en criotubos con una

temperatura de -80 ºC o 196º C (si se usa nitrógeno líquido). (Alarcón, T.,

Baquero, M., Domingo, et al. 2004)

7.6.4. Tratamiento de la bacteria Helicobacter pylori con los ácidos

húmicos y antibióticos comúnmente utilizados en los

tratamientos: Están reportados algunos valores de Concentración

Mínima Inhibitoria (CMI), para la cepa de referencia H. pylori ATCC

43504 en diferentes antibióticos, tales como: amoxicilina (0,016-0,12

mg/L), claritromicina (0,016-0,12 mg/L), metronidazol (64-256 mg/L),

telitromicina (0,06-0,5 mg/L) y tetraciclina (0,12-1,0 mg/L). Con base

en esto, será posible trabajar con algunos de estos antibióticos y los

ácidos húmicos, para el tratamiento de la cepa de referencia nativa,

previamente establecida.


73

7.6.4.1. Cepa de referencia nativa + antibiótico seleccionado: Teniendo

en cuenta los valores establecidos de CMI, a la bacteria en estado

natural, se le tratara con el antibiótico seleccionado, el cual servirá

como un control negativo, que permitirá contrastar con la acción

inhibitoria de los ácidos húmicos.

7.6.4.2. Cepa de referencia nativa + ácidos húmicos: Se emplearán los

ácidos húmicos en diferentes concentraciones 0.5%, 0.625% y

0.75%, que en investigaciones anteriores mostraron ser las que

generaron los halos de inhibición más altos.

7.6.5. Determinación de sensibilidad frente a agentes antimicrobianos: Con el

propósito de normalizar cada uno de los procedimientos que existen frente a la

determinación de la susceptibilidad in vitro, existen normas según la zona

geográfica, por ejemplo, en América se rige la norma del Clinical and Laboratory

Standards Institute (CLSI) a través de su Subcommittee of Antimicrobial

Susceptibility Testing. (Balouiri et al, 2016) Una vez que se han aislado colonias

de Helicobacter pylori, la cual ya se ha identificado como patógeno potencial, es

necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de

sensibilidad:

● A partir de la cepa nativa de Helicobacter pylori, previamente caracterizada, con la

ayuda de un asa se toman de 3-5 colonias, para facilitar la detección de la

resistencia y se suspenden en 5mL de suero fisiológico, caldo de Mueller – Hinton

o agua destilada (Cavalieri et al, 2005).

● Se debe ajustar la turbidez a un 0,5 de la escala de McFarland (lo que corresponde

a aproximadamente 1,5 X 10 8 CFU/ml). Se puede ajustar visualmente, utilizando

una tarjeta blanca, a la cual se le hacen varias líneas blancas de diferente grosor,

para contrastar el patrón de turbidez y el inóculo.

● La preparación del patrón de turbidez incluye la preparación de sulfato de bario, a

partir de la reacción entre 99.5 mL de ácido sulfúrico y 0,5 mL de cloruro de bario.


74

La lectura de absorbancia de este patrón debe estar entre 0.08 – 0.10 con filtro de

625 nm.

● Con ayuda de un hisopo o un asa estéril, se humedece con el inóculo y se siembra

sobre la superficie del medio de cultivo barriendo tres veces y dejando reposar entre

cinco y quince minutos. Los medios de cultivo más utilizados para Helicobacter pylori

son Mueller-Hinton o Columbia suplementado con 5 a 10% de sangre (de caballo o

carnero).

● Se colocan los discos de papel filtro impregnados con el antimicrobiano

seleccionado, incluyendo los ácidos húmicos, con una pinza anatómica,

correctamente esterilizada. Para Helicobacter pylori, se sugiere un disco de

metronidazol de 5 μg, donde las medidas del halo son, <16 mm para resistencia,

16-21 mm para intermedio y >21 para sensible. En claritromicina se puede preparar

un disco de 2 μg, siendo resistente cuando hay ausencia de halo de inhibición, o un

disco de 15 μg y se considera resistente si el halo es de <18 mm. Los discos se

conservan a 4ºC y se extraen cuatro horas antes de su uso, para que lleguen a la

temperatura ambiente.

● El tamaño de la caja de petri determinará la cantidad de los discos a utilizar. Para

un diámetro de 100mm, debe haber un máximo de 5 discos, y para un diámetro de

150 mm, máximo pueden haber 12 discos. Cabe aclarar que entre cada disco debe

existir una distancia de 2.5 cm. Se deben incubar invertidas a 35ºC, luego de que

hayan transcurrido 15 minutos de la colocación de los discos. La interpretación se

realiza a partir de las tablas provistas por el CLSI. (Trigoso. C.)

7.6.5.1. Interpretación de resultados: Tras una incubación por un tiempo de 18

horas y a una temperatura de 35 ºC, se miden los halos de inhibición con

ayuda de una regla. Con base en las tablas provistas por el CLSI, se podrán

establecer los puntos de corte, lectura de halos, relación con los valores de

CIM y la susceptibilidad, resistencia o punto intermedio para cada grupo

bacteriano (Trigoso. C.). De igual forma, se comparan estos resultados con

los de los ácidos húmicos, para establecer los halos de inhibición que estos

generen, en las diferentes concentraciones trabajadas.


75

7.6.6. Extracción de RNA total: El RNA que se extraiga a partir de las colonias

bacterianas de Helicobacter pylori, puede ser copiado a moléculas de DNA

bicatenaria y a su vez estas pueden dar origen a cDNA. Por lo tanto la calidad

en los procesos de extracción del RNA, es el paso fundamental para iniciar el

estudio de secuenciación. Este ácido nucleico es el más abundante en la célula,

sin embargo, su obtención se dificulta debido a diversas impurezas, tales como

RNAasas, proteínas y polisacárido. De forma general los procesos de extracción

incluyen de una lisis celular, separación, purificación, precipitación, lavado y

disolución. (Sandoval-Pineda et al, 2017)

7.6.6.1. Lisis celular: Las células bacterianas se homogenizan en una solución de

isotiocianato de guanidina y fenol (pH 5 a 6), logrando su lisis e inactivación

de las ribonucleasas endógenas. El isotiocianato de guanidina en muy buen

desnaturalizante de proteínas, por lo cual podrá inhibir las RNAsas, mientras

que la solución ácida de fenol facilita la formación de fases orgánicas (donde

queda retenido el DNA) y acuosas (donde queda suspendido el RNA) y

también facilita la desnaturalización de proteínas e inactivación de

nucleasas.

7.6.6.2. Separación: Con una solución de etanol, se diluye el lisado y se introduce

en una columna de resinas de intercambio aniónico. Esta resina está hecha

de sílice con grupos cargados positivamente de dietil-amino-etil (DEAE), los

cuales interaccionan con los grupos fosfatos del RNA. Los contaminantes

se retiran mediante lavados.

7.6.6.3. Precipitación: El RNA que está en la columna se eluye con soluciones

iónicas acuosas y se purifica a partir de esta fse a través de precipitación y

centrifugación con isopropanol a bajas temperaturas haciendo que el RNA

sea óptimo para técnicas de secuenciación. (Salazar Montes et al, 2013)


76

7.6.5.2. Análisis transcriptómico

La transcriptómica corresponde al estudio del conjunto de los RNAs presentes en un

organismo o célula. Este se caracteriza por ser dinámico y responder a las condiciones

ambientales. En este conjunto de transcritos no solo se incluye el RNAm que refleja los genes

que están siendo expresados de forma activa sino también otros tipos de RNA con actividad

estructural, catalítica y reguladora (Valledor, n.d.).

El estómago humano es un entorno dinámico y hostil en que H. pylori se encuentra con una

variedad de factores ambientales estresantes tales como las fluctuaciones del pH, las

limitaciones de nutrientes, las cambiantes disponibilidades de los iones metálicos, el estrés

oxidativo generado por el sistema inmunitario del huésped, entre otros. A pesar de estar muy

bien adaptado al nicho gástrico humano, este patógeno requiere sistemas reguladores para

cambiar rápidamente su expresión génica y así adaptar las condiciones de colonización

(Backert & Yamaoka, 2016). Dichos cambios en la expresión génica serán inducidos in vitro

en la bacteria siendo los ácidos húmicos extraídos del carbón leonardítico colombiano el factor

estresante y de los cuales se sabe que generan una reacción inhibitoria sobre el patógeno,

tras esta interacción patógeno-inhibidor, es posible realizar un análisis transcriptómico con

fines comparativos entre cultivos desarrollados bajo estrés e inhibición y cultivos desarrollados

en condiciones normales.

El análisis transcriptómico permite realizar una caracterización funcional de los sRNAs que

junto con la identificación de las proteínas de unión al RNA asociadas, ayuda a comprender

los roles potenciales en la virulencia de Helicobacter y la respuesta al estrés.

El estudio de RNAs pequeños bacterianos (50 a 400 nt de largo) actúan como reguladores

postranscripcionales en diversas condiciones de estrés y crecimiento o durante la virulencia,

estos son una clase emergente de reguladores de la expresión de genes postranscripcionales

que actúan durante la respuesta al estrés bacteriano o el control de la virulencia en patógenos

(Papenfort y Vogel 2010; Storz et al. 2011)

El análisis del transcriptoma de Helicobacter pylori presenta una gran importancia en el

desarrollo de esta propuesta ya que proporcionará información acerca de las condiciones en

que se requiere la expresión de ciertos genes y sus funciones fisiológicas orientando la

elucidación del mecanismo de acción del factor externo y objeto de estudio (ácidos húmicos).

En este sentido, los métodos de secuenciación de la próxima generación han resultado ser

https://paperpile.com/c/3MxZs7/hgnC

https://paperpile.com/c/3MxZs7/4sW1


77

una herramienta eficaz para descubrir la estructura del transcriptoma e identificar

transcripciones novedosas en procariotas. Los perfiles de expresión basados en RNA-seq de

bacterias cultivadas en diferentes condiciones o en comparación con cepas mutantes

ayudarán a identificar sRNAs, que se inducen en ciertas condiciones de estrés o virulencia.

Así mismo, la comprensión completa de los procesos de infección requiere la investigación

paralela de la expresión de genes tanto en el patógeno como en el huésped, aspecto que

podría considerarse en futuros trabajos relacionados (Sharma & Pernitzsch, 2012).

https://paperpile.com/c/3MxZs7/SrDK


78

8. Conclusiones

El desarrollo de esta propuesta implica el trabajo multidisciplinar de distintos grupos

de investigación centrados en áreas como la química, la microbiología y las ciencias

de la salud, buscando establecer desde diferentes enfoques el tratamiento

alternativo frente a H. pylori que se puede realizar a partir del uso de sustratos de

tipo natural, como lo son los ácidos húmicos.

Para la puesta en marcha tanto de esta propuesta como de otras similares, se le

sugiere a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, mejorar la

infraestructura a nivel de equipos y laboratorios, así como implementar materias

como microbiología, que permitan tener unas bases teóricas y experimentales más

claras, facilitando el planteamiento y la interpretación de resultados del proyecto

investigativo.

La secuenciación del RNA de H, pylori inhibida con los ácidos húmicos, permitirá

comparar y reconocer los cambios a nivel del transcriptoma generados en el

microorganismo bajo una condición específica, sentando las bases teóricas y

experimentales para nuevas rutas terapéuticas.

El análisis global del transcriptoma de H. pylori, implica el desarrollo de varias fases

experimentales donde cada uno influirá en gran medida en la validez de los

resultados obtenido, para la identificación plenas de los genes diferencialmente

expresados.


79

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