Ludovic Hallo

Candice Mezel, Agnès Souquet,

Jérôme Breil

Journée de l’Institut de Physique Fondamentale13 novembre 2008

Projection de cellules vivantes par procédé laserDispositif expérimental et modélisation

LASER

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CollaborationDominique Descamps, Vladimir TikhonchukCELIA, Université Bordeaux 1, CNRS, CEA, France

Olivier SautInstitut de Mathématiques de BordeauxUniversité Bordeaux 1, France

Publications: C. Mézel et al, PoP (2008) E. Gamaly et al., Current Applied Physics (2008) L. Hallo, Conference New Models and Hydrocodes for Shock Wave processes in

Condensed Matter, (Lisbonne 2008) L. Hallo et al., IFSA 07

L. Hallo et al., Phys. Rev. B 76, 024101 (2007) Journée IPF 13/11/2008

Fabien Guillemot, Reine BareilleINSERM U577 – Biomatériaux et Réparation TissulaireUniversité Bordeaux 2, France

John Lopez, Marc FauconALPHANOV Centre Technologique Optique et LasersUniversité Bordeaux 1, France

Pere Serra, Martí DuocastellaDepartment of Applied Physics and OpticsUniversitat de Barcelona, Espagne

Antoine Bourgeade, David HébertCEA CESTA, Le Barp, France

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Introduction

Ingénierie Tissulaire

→ Développer des substituts biologiques qui vont restaurer, maintenir ou améliorer la fonction des tissus

BioPrinting

→ Utiliser des cellules et/ou des matériaux bioactifs comme blocs de construction pour fabriquer des produits thérapeutiques nouvelle génération à base de cellules et biomatériaux et des systèmes biologiques.

Applications

→ Dépôt de cellules sur des prothèses

→ Préfonctionnalisation – Micropatterning de biomateriaux

GIS Biomatériaux pour la santé U 577 – CELIA …

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Dispositif expérimental :

• Laser impulsionnel• Cible avec biomatériau • Substrat receveur

Cible 2 ou 3 couches :

• Support transparent à laser

• Couches de transferts• Couche optionnelle absorbante

LIFT modifié :

• MAPLE-DW **

• AFA-LIFT *** & BioLP ****

** MAPLE-DW : Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation Direct Write

*** AFA-LIFT : Absorbing Film-Assisted LIFT

**** BioLP : Biological Laser Printing

Procédé de transfert par laser :Laser Induced Forward Transfer (LIFT)

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Différents Régimes de Transfert

Régime sous-seuil Régime éjection

Impulsion laser

Film Liquide(eau)

Couchetransparente

Poche devapeur

Vapeurdétendue

Liquideéjecté

Couche absorbante(ablateur)

Matièreablaté

Régime de contact

Modèle proposé :

Processus élémentaires du LIFTMécanismes d’éjection d’une bulle de liquide

I. Zergioti et al. , Appl. Surf. Sci. 127-129, 601 (1998)

Plots de CrCu sur Silice

10 µm

J. Bohandy et al.J. Appl. Phys. 63, 1158 (1988)

Formation d’un jet

Processus élémentaires du LIFT

Plots d’Aluminium

D.A. Willis and V. Grosu , Appl. Phys. Lett. 86, 244103 (2005) Journée IPF 13/11/2008

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Approche ExpérimentaleBut :

Réaliser des Transferts de biomatériaux et de cellules dans les meilleures conditions

Moyens :

• Laser Nd:YAG pompé par diode

• 1064 nm

• Durée de l’impulsion : 30 ns

• Fréquence : 5 kHz

• Fluence : 80 à 200 mJ/cm²

• Distance de transfert : 300 µm

INSERM U577ALPhANOV

• Laser Nd:YVO4 pompé par diode

• 1064 nm

• Durée de l’impulsion : 30 ns

• Fréquence : 20 kHz

• Fluence : 0.6 à 1 J/cm²

• Distance de transfert : 1 mm

Objectifs:

• Imprimer des matrices de transfert reproductiblesImprimer des matrices de transfert reproductibles

• Trouver les meilleurs paramètres optiques pour minimiser les dommages cellulaires Trouver les meilleurs paramètres optiques pour minimiser les dommages cellulaires

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TRANSFERT D’HYDROGEL

RESULATS EXPERIMENTAUX

• Maîtrise de la taille des éjecta

• Résultats reproductibles

Détermination des paramètres tels que :

- la vitesse des scanners

- la fluence laser

- l’entrefer

- l’épaisseur de la matrice d’hydrogel

- …

f = 5 kHz

F = 134 mJ/cm²

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Impression de [3H]-Lysine sur du PET préfonctionnalisé observée au beta-imager

Transfert de peptide sur un Biomatériau

f = 20 kHz

F = 1.3 J/cm²

e= 800 µm

TRANSFERT D’ ELEMENTS BIOLOGIQUES

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Transfert de cellules

Impression sur une lame de verre de cellules endothéliales EA-hy 926 marquées au Dil-Ac-LDL observées au microscope optique

f = 20 kHz

F = 1.2 J/cm²

e= 1 mm

C = 2.106 cellules/lame

Cellules Endothéliales

+ Les gouttes contiennent des cellules

- Forte Fluence Déformation des gouttes et éclaboussures

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Pourquoi une telle mortalité cellulaire ?

Plusieurs hypothèses : - Dommage cellulaire dû à une fluence trop élevée

- Débris d’or nocif

- Influence du type cellulaire

Cellules Ostéoblastiques

Ostéoblastes MG63 marquées au test Live-Dead

Cellules Epithéliales

→ Résultats similaires aux cellules endothéliales

f = 5 kHz

F = qq 100 mJ/cm²

e= 300 µm

Compréhension des mécanismes, paramètres, physiques : modélisation du CELIA

13Hydrogel → Eau

Modélisation en régime nanoseconde

Substrat receveur

Air

Eau

Silice

Laser

Couche

d’or

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Modèle physico-numérique

• Propagation de l’onde laser

• Conservation de la masse

• Quantité de mouvement

• Energie

laserieeieeee PTTTKuPdt

dE

.

.ii i i ei e i

dEP u K T T T

dt

2

2

22

2

t

E

cx

E

0. udt

d

0 ie PPdt

ud

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Analyse des processus

• Chauffage homogène de la couche d’or ( = épaisseur de peau)

• Hydrogel et Silice restent à température ambiante

• Dépôt d’énergie laser provoque un choc dans l’or qui se propage dans l’eau

• Les ondes de détente mettent en vitesse la couche d’eau éjection !

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Paramètres étudiés :

Vitesse, pression, température, densité

- en fonction du temps pour différentes mailles caractéristiques

- en fonction de la position pour différents temps caractéristiques

Résultats nanosecondes, 1D

Simulation pour :

- une impulsion de 30 ns FWHM

- une fluence de 100 mJ/cm²

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Résultats nano 2D et comparaison aux résultats de Marti Duocastella

M. Duocastella et al. Appl. Phys. A, 93 (2), 453-456, 2008

Modélisation nanosecondeProcessus de formation du jet (2D)

1.35 mus 13.85 mus

26.35 mus 41 mus

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Modélisation nanoseconde Variation du flux laser (t=23.9 mus)

2 * Flux laser nominal

1.5 * Flux laser nominalFlux laser nominal

4 * Flux laser nominal

ExplosionDe vapeur

Jet

JetBulle Liquide jet

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Modélisation en régime femtoseconde

- Plus d’ablateur, on tire dans l’hydrogel- mécanismes hydrodynamiques semblables,Ou même plus simples (temps acoustique >> temps laser)

Difficulté nouvelle : l’eau est transparente au visible !Notion de gap pour créer des électrons libres…

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Silice Eau

= 2,2 g/cm3

Ugap = 9 eVIonisation à 6 photons6 = 9,8 10-70 s-1 (cm2/W)6

Ith = 26 TW/cm2

Pcr = 1.98 MW

= 1 g/cm3

Ugap = 6,5 eVIonisation à 4 photons4 = 4.635 10-61 s-1 (cm2/W)4

Ith = 1,5 TW/cm2

Pcr = 1.87 MW

La puissance nécessaire à l’ionisation est faible

Modélisation en régime femtoseconde

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Estimation de la puissance dans le plan focal

Energie laser absorbée

Puissance critique

0 <

Longueur d’onde: = 800 nmEnergie: E = 30 nJDurée = 100 fsWaist: 0 = 0.3 m

Longueur de Rayleigh = 0.35 m

Ifoc = 90 TW/cm2, Pfoc ≈ 0.3 MW Pcr=

λ2

2π n0n2≈2 MW

Paramètres

RL=πω0

2

λ

Surface focale Sfoc = π0RL= 0.33 m2

Ith = 26 TW/cm2

Un plasma est formé au sein de la matière (absorbant comme un métal)

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Equations de Maxwell couplées à un modèle d’ionisation

Propagation laser et absorption

Evolution de la densité et de l’énergie

laser Équations de Maxwell

currentionisation

current electronic0

1mpiJJB

dt

De

Et

B

eenet nntnItn colrec

66

1)()(

)()(

)(2

3.)( tnU

tntTkEJtUW ecolgap

rec

eeBempigapet

24

Énergie laser absorbée

= 800 nm0 = 0.3 m = 100 fs

Elaser = 5.6 nJ

Emax = 5 109 J/m3Emax = 1.2 1010 J/m3

Elaser = 22.4 nJ

Elaser = 50.5 nJ

Emax = 1.1 1010 J/m3

2525

Simulations hydrodynamiques

Conditions initiales :

dépôt d’énergie Maxwell + ionisation (qq centaines de fs)

Code hydro 2D - 2 températures Ti, Te- Ionisation à l’équilibre- Equipartition électrons-ions- Conduction thermique- Grille mobile “Lagrangienne”- Non structuré, ALE- Equations d’Etats Tabulées (SESAME et Equations “maison”)

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Séquence hydrodynamique après le dépôt

13.2 ns

Rayon maximum de cavité

5 ns

Choc divergent, déformation de la face arrière

Formation d’une « cavité »

7.5 ns

= 800 nm0 = 0.3 m = 100 fsElaser = 50.5 nJ

Collapse de la cavité et formation d’un jet

500ps1 m

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= 800 nm0 = 0.3 m= 100 fsElaser = 50.5 nJ

Séquence de formation du jet hydrodynamique

Pression

Densité

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Influence de la variation de l’énergie déposée

Jet

JetJet, et collapse

0.5 El 0.75 El El

1.5 El 2 El

Processus essentiellementHydrodynamiqueFaible sensibilité à unesur-énergie laser

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Influence de la position du recul de la zone de dépôtDepôt -1 mum Depôt -0.5 mum

Depôt initial Depôt +0.5 mum

Collapse Jet

Jet Jet diphasique

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Conclusion et perspectives

LIFT : Premiers résultats expérimentaux nano « aquitains » Interprétation hydrodynamique en régime nanoseconde

Comparaison expérimentale encourageante Analyse de la sensibilité du processus au paramètre flux laser Chaîne de calcul prédictive en cours de validation

Comparaison à d’autres dispositifs (Or, Titane…)

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