M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédicalmaster-eea.univ-tlse3.fr/wp-content/uploads/2018/03/CM4_M1_ADN.pdf · Selon une célèbre marque de cosmétique française : « Principe

1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines

B- Absorbance dans l’U.V.

C- Densité de charge

2- Nucléosides et nucléotides A- Liaison avec 2 types de sucres

B- Modification avec l’acide phosphorique

C- Nomenclature

3- Structures spatiales A- Association des nucléotides dans un acide nucléique

B- Complémentarité des bases

C- Double hélice/Propriétés

D- Modifications chimiques des acides nucléiques

4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMP

5- Séquençage de l’ADN et PCR

M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical

IV – Les Acides Nucléiques

Selon une célèbre marque de cosmétique française :

« Principe premier de chaque

cellule vivante, l'ADN détient le

pouvoir de croissance et de vie.

Extrait sous sa forme native

grâce à un procédé 100% naturel,

l'ADN Végétal natif est capable

de transférer son exceptionnel

pouvoir de renaissance et de

revitalisation aux cellules de la

peau (test in vitro). »

Mais l’ADN…. C’est quoi ?

À quoi cela ressemble-t-il ?


INTRODUCTION

INTRODUCTION

Les acides nucléiques (ADN, ARN) sont constitués par des molécules

de structure "simple" appelés nucléotides.

Les nucléotides sont les briques élémentaires de la transmission de

l’information génétique.

Les acides nucléiques jouent également un rôle fondamental :

- dans le métabolisme cellulaire sous forme di- et tri-phosphorylée

- dans la transmission de l’information dans la cellule (AMP et GMP

cyclique).


Nucléotide :

- base azotée

- sucre

- acide phosphorique

Fishel Levin

(1869-1940)


Il existe 2 sortes de bases azotées hétérocycliques :

bases pyrimidiques

(noyau pyrimidine)

bases puriques

(noyau purine)

N

N 1

2

3

4

5

6

N

N

N

N

1

2

3

4

5

6 7

8

9

a- Celles retrouvées dans l’ADN et l’ARN



cytosine (C) thymine (T) 5-méthyl-uracile

uracile (U)

ADN/ARN ADN ARN

N

N H

1 2

3 4

5

6

NH2

HN

N H

1 2

3 4

5

6

O

O

CH3 HN

N H

1 2

3 4

5

6

O

O O H

H

H

H

H

fonction amide fonction amide fonction imino-amine





Il existe 2 sortes de bases azotées hétérocycliques :

bases pyrimidiques

(noyau pyrimidine)

bases puriques

(noyau purine)

N

N 1

2

3

4

5

6

N

N

N

N

1

2

3

4

5

6 7

8

9



adénine (A)

NH2

N

N

N

NH

1

2 3

4

5 6

7

8

9

ADN/ARN

HN

N

N

NH

1

2 3

4

5 6

7

8

9

H2N

O

guanine (G)

ADN/ARN




fonction amide fonction imino-amine


b- D’autres bases aux rôles variés

acide urique

caféine

théophylline

théobromine


http://www.lacocinasana.com/media/cafe.jpg

http://www.challenger.be/chocolat.gif

220 240 280 300 320 260 0,0

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Longueur d’onde (nm)

Abs

orba

nce

ADN protéine

A260/A280 = 1,8

Si A260/A280 < 1,8

Contamination protéique

ADN/ARN pur le ratio

Pureté

Quantité

Une solution avec A260 = 1

correspond à une concentration :

de 50 µg/mL d’ADN db

de 40 µg/mL d’ARN ou ADN sb


1- Bases azotées B- Absorbance dans l’U.V.

1- Bases azotées B- Absorbance dans l’U.V.

QUIZZ Quelle est la concentration en ADN de la solution de départ ?

A260 = 0,6 Volume final dans la cuve = 1 mL

20 µL d’ADN q.s.p. 1 mL avec tampon

A- 3 µg/mL

B- 1500 mg/L

C- 15 mg/L

D- 3 mg/L

E- 1500 µg/mL

REPONSE

Concentration dans la cuve

0,6 x 50 µg/mL

Calcul dilution

1000 µl/ 20 µL = 50

A260/A280 = 1,8

A260 = 1 50 µg/mL d’ADN

Concentration solution d’ADN de départ

30 µg/mL x 50


La répartition des électrons à la surface des bases azotées n’est pas uniforme

molécules polarisées.

N

N

R

1 2

3 4

5

6

O

O

CH3/H

H

H

T/U

-0,49

-0,45

+0,19

C

H

N

N

R

1 2

3 4

5

6

N

O H

H

H -0,4

+0,22

-0,65

-0,51

+0,2


1- Bases azotées C- Densité de charge

N

N

N

N

N

R

1

2 3

4

5 6

7

8

9

H H

A

N

N

N

N

R

1

2 3

4

5 6

7

8

9 N

O

H

H

G

H

-0,55

-0,64 -0,4

+0,2

+0,2

+0,2 -0,51

+0,22

-0,52

-0,51

-0,4

-0,55

+0,2

La répartition des électrons à la surface des bases azotées n’est pas uniforme

molécules polarisées.



Les densités de charges déterminent les positions et les orientations des liaisons

hydrogène.

La liaison hydrogène est directionnelle i.e. l’interaction est optimale quand les 3 atomes

sont dans l’axe.

Possibilité avec un angle interaction plus faible.

N H O d+ d-

Les flèches expliquent la complémentarité A=T et G≡C. Cependant plusieurs possibilités

de liaisons hydrogène existent : dans la nature, seules certaines interactions sont

retrouvées.

A côté de l’appariement classique A/T et C/G existent des couples G=A ou G=T.

d-



Nucléotide :

- base azotée

- sucre


Fishel Levin

(1869-1940)


2- Nucléosides et nucléotides

A- Liaison avec 2 types de sucres

pentoses sous forme furanique (5 atomes dans le cycle)

D-ribose

1’

2’ 3’

4’

5’

D-désoxyribose (2’-désoxyribose)

HOH2C

OH OH

OH

1’

2’ 3’

4’

HOH2C

OH H

OH

5’

ARN ADN

O O




O3’

O4’

O5’

C1’ O1

C2’

C3’

C4’

C5’

b

g

d

e

c

H’5’ H5’

n1

n2

n3

n4 n5

C5’ OH

C3’ exo

C3’ endo

C5’ OH

C2’ exo

C5’ OH

C5’

OH

C2’ endo

C2 (pyrimidine)

C4 (purine)

Formes du désoxyribose retrouvées dans l’ADN




Liaison base-sucre

on obtient une liaison carbone-azote : liaison N-glycosidique

N

N

H

1 2

3 4

5

6

H2O

nucléoside

1’

2’ 3’

4’

5’

O HOH2C

OH OH / H

OH

N

N N

H

1

2 3

4

5 6

8

9

N 7

H2O

OH OH / H

1’

2’ 3’

4’

5’ HOH2C OH O




unité

nucléotidique

O2’

O3’

O4’

O5’

C1’ N

C2’

C3’

C4’

C5’

P

P

a

b

g

d

e

z

c

H’5’ H5’

C

C2 (pyrimidine)

C4 (purine)

n1

n2

n3

n4 n5




Nucléotide :

- base azotée

- sucre


Fishel Levin

(1869-1940)




O P OH

HO

O -

H2O

1’

2’ 3’

4’

5’

O HOH2C

OH OH / H

OH

HO

1’

2’ 3’

4’

5’

O CH2

OH OH / H

OH O P O

O -

Liaison phosphoester



pKa = 2

pKa = 7

pKa = 10


désoxycytidine-5’-monophosphate (dCMP) désoxythymidine-5’-monophosphate (dTMP)

1’

2’ 3’

4’

5’

CH2

HO H

O P O

OH

O

1

2 3

4

5 6

H3C

O

1’

2’ 3’

4’

5’

CH2

HO H

O P O

OH

O

3

2 1

6

5 4

NH2

O O

H

- -

N

N O

N

N O

1’

2’ 3’

4’

5’

CH2

HO H

O P O

OH

O

1

2 3

4

5 6

7

8

9

NH2

désoxyadénosine-5’-monophosphate (dAMP) désoxyguanosine-5’-monophosphate (dGMP)

1’

2’ 3’

4’

CH2

HO H

1

2 3

4

5 6 7

8

9

NH2

O

- O

N N

N N

N

N N

NH

O P O

OH

O -

O




purine

purine

pyrimidine

pyrimidine

pyrimidine

adénine (ADN/ARN)

guanine (ADN/ARN)

thymine (ADN)

uracile (ARN)

cytosine (ADN/ARN)

adénosine

guanosine

thymidine

uridine

cytidine

adénylate

guanylate

thymidylate

uridylate

cytidylate

base azotée type de base nucléoside nucléotide

Le préfixe désoxy- ou désoxyribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du désoxyribose. Le préfixe ribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du ribose.


C- Nomenclature


3- Structure spatiale

A- Association des nucléotides dans un acide nucléique

5’ pTpGpApC 3’

TgAC

TGAC


Francis Crick

(1916 - 2004)

James Watson

(1928- )

Rosalind Franklin

(1920-1958)







Appariement de Watson et Crick

A T C G

10 pb

3,4 nm

0,34 nm

ADN B

petit

sillon

grand

sillon




grand sillon

petit

sillon

phosphate

ADN B

Vue de dessous




QUIZZ Quelle est la longueur d’une molécules d’ADN humaine?

Nombre de paires de base dans un génome humain : 3 milliards.

L’Homme est un être diploïde.

Distance entre 2 paires de bases successives : 0,34 nm.

A- 2 km

B- 200 m

C- 2 m

D- 20 cm

E- 20 mm

REPONSE

Longueur d’une molécule d’ADN

3 109 pb x 0,34 10-9 m/pb

Longueur totale

2 copies x 1 m




DENATURATION

Chauffer un ADN double brin rompt les liaisons

hydrogène et modifie la capacité d’absorption de

la lumière des bases azotées.

dénaturation renaturation

5’P- A T C G T A -3’OH

3’OH - T A G C A T - 5’P

5’P- A T C G T A -3’OH

3’OH - T A G C A T - 5’P

La séparation est réversible, la molécule d’ADN

peut se reformer à l’identique en faisant diminuer

lentement la température du milieu.

Une augmentation de l’absorption de lumière U.V.

(effet hyperchrome) permet le suivi du phénomène

par spectrophotométrie.






DENATURATION

230 240 250 260 270 280 290 300 0,0

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

ADN E. coli 25°C ADN E. coli 80°C

Longueur d’onde (nm)

Abs

orba

nce

hyperchromicité

ADN E. coli

10 20 50 60 70 80 90 100 0,40

0,50

0,48

0,46

0,44

0,42

Température (°C)

Abs

orba

nce

(260

nm

)

30 40

Tm = 48°C

L’ADN double brin chauffé à 100°C est dénaturé sous forme de 2 ADN simples brins.

1- On laisse la température du tube redescendre lentement, puis à température

ambiante, on remesure l’absorbance à 260 nm : on retrouve la valeur d’absorbance

initiale avant chauffage.

2- On dépose le tube sur de la glace, l’absorbance à 260 nm n'a pas changé : on

retrouve la valeur d’absorbance après chauffage.

L'ADN s'est ré-apparié, il s'est renaturé.

L'ADN est resté dénaturé.

10 20 50 60 70 80 90 100 0,40

0,50

0,48

0,46

0,44

0,42

Température (°C)

Abs

orba

nce

(260

nm

)

30 40

Le Tm augmente avec le pourcentage de GC

ADN1 ADN2 ADN3




RESPIRATION DE L’ADN

A des températures inférieures au Tm, l’ADN double brin est

globalement stable. Cependant, il se produit des dissociations sur un

nombre limité de paires de bases.

Ces dissociations sont dues à des rotations de liaisons au sein du

cycle furane des désoxyriboses ou des liaisons N-glycosidiques.

Ces phénomènes sont rapides (1 µs environ) et permettent les

interactions entre molécules, insertions de molécules intercalantes,

transitions locales ADN B et autres types d’hélice.



D- Modifications chimiques des acides nucléiques

La cytosine peut être méthylée sur son carbone 5.

La désamination de la cytosine méthylée donne une thymine, base

normale de l’ADN.

Ceci peut entrainer l’apparition d’une mutation.

Chez les eucaryotes, les ARN messagers,

subissent une modification de leur extrémité 5‘ afin

de les protéger contre la dégradation par des

exonucléases.

L’addition d'une 7-méthylguanosine sur le premier nucléotide de l'ARN, par

une liaison 5'-5' triphosphate s’appelle la coiffe. Les deux premiers riboses de

l'ARN transcrit subissent aussi une méthylation de leur fonction alcool en 2‘.

O


4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMPc

liaison phosphoester

Dans les cellules, les nucléosides sont retrouvés sous formes mono, di- et triphosphates.

adénine

adénosine

AMP ou adénylate

ADP

ATP

pKa = 7

La valeur du pKa de la seconde fonction acide du dernier acide phosphorique est de 7,

donc à pH 7, on a 50% de forme protonée, 50% de forme déprotonée.

liaisons anhydride d’acide

1’

2’ 3’

4’

5’

CH2

HO OH

O

O

1

2 3

4

5 6

7

8

9

NH2

- O

N N

N N

O

O -

O

O -

pKa = 2


HO P O P O P O

1 5 6

NH2

N 7

8

N

1’

2’ 3’

4’

5’

O OH

2 3

4 9

O N N

O

P

O

O =

- AMPc

1 5 6

NH2

N

H 7

8

N

1’

2’ 3’

4’

5’

O OH

2 3

4 9

O N N

O

P

O

O =

- GMPc

O

L'AMP cyclique (AMPc) et le GMP cyclique (GMPc), font

partie des messagers secondaires.

L'AMPc est produit à partir d'ATP par l'adénylate cyclase, le

GMPc dérive du GTP grâce à la guanylate cyclase.

AMPc et GMPc activent des enzymes comme les Protéines

Kinases A ou G qui sont des activateur du métabolisme

cellulaire.

AMPc et GMPc sont dégradés par certaines

phosphodiestérases qui sont inhibées par la caféine et la

théine.

4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMPc


3’

5’

1’

2’

4’

CH2

OH H

O P O

OH

O - O

3

2

1

6

5

4 CH3

H

N

N O

O

H

Thymine (T)

3’

5’

1’

2’

4’

- O-P-O-P-O-P-O-CH2

OH H

O

1

2

3

4

5

6 7

8

9

O

H

H

H

H

N

N

N

N N

Guanine (G) O - O - O -

O O O

a b g

3’

5’

1’

2’

4’

CH2

O H

O P O

OH

O

3’

5’

1’

2’

4’

CH2

OH H

O P O

O

-

- O

O

1

2

3

4

5

6 7

8

9

O

H

H

H

H

N

N

N

N N

3

2

1

6

5

4 CH3

H

N

N O

H

Thymine (T)

Guanine (G)

O

PPi a

On a vu l’addition d’un nucléotide en 3’-OH…



3’

5’

1’

2’

4’

CH2

H H

O P O

OH

O - O

3

2

1

6

5

4 CH3

H

N

N O

O

H

Thymine (T)

3’

5’

1’

2’

4’

- O-P-O-P-O-P-O-CH2

OH H

O

1

2

3

4

5

6 7

8

9

O

H

H

H

H

N

N

N

N N

Guanine (G) O - O - O -

O O O

a b g

3’

5’

1’

2’

4’

CH2

O H

O P O

OH

O

3’

5’

1’

2’

4’

CH2

OH H

O P O

O

-

- O

O

1

2

3

4

5

6 7

8

9

O

H

H

H

H

N

N

N

N N

3

2

1

6

5

4 CH3

H

N

N O

H

Thymine (T)

Guanine (G)

O

PPi a

Que se passe-t-il si il n’y a pas de 3’-OH ?

La réaction ne peut avoir lieu….



O -O-CH2

OH

H H

H

H

B O

-O-CH2

H

H H

H

H

B

ddATP

ADN à séquencer

ADN polymérase I

amorce complémentaire (excès)

mélange des 4 dNTPs (dont 1 radioactif)

1 ddNTP différent selon le tube

Méthode enzymatique de Frederick Sanger

L’idée…

ddTTP ddCTP ddGTP



G C A T G G G C A T G A G C T 5’ 3’

C C T T C T C C C G A G A G A 5’ 3’

G C A T G G G C A T G A G C T 5’ 3’

C C T T C T C C C G A G A G A 5’ 3’

5’ 3’ amorce

Chauffage

Diminution de température

Excès!!




Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif. Regardons le tube contenant du ddCTP (ddCTP/dCPT = 0,01).

G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’

5 amorce


G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’

’ 3 ’

ddCTP

5 ’




Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.


5 ’



5 ’ G

ddCTP




C



5 ’



5 ’ G

Si le tube contient 1% de ddCTP et 99 % de dCTP :

- Dans 1 % des molécules, un ddCTP sera incorporé, puis le brin ne

s’allongera plus

- Dans 99 % des molécules, un dCTP sera incorporé : la réaction peut

continuer

dd G

ddCTP




C




G A

dd G

ddCTP


5 ’ 5 ’




T C





G A

dd G

ddCTP

5 ’ 5 ’




T C





G A G

G dd

dd T C G A G

ddCTP

5 ’ 5 ’




C T C





G A G

G dd

dd T C G A G

ddCTP

5 ’ 5 ’




C C T C





G A G

G dd

dd T C G A G

dd C T C G A G

ddCTP

5 ’ 5 ’




C C C T C





G A G

G dd

dd T C G A G

dd C T C G A G C C T C G A G dd

ddCTP

5 ’ 5 ’




C C C T C





G A G

G dd

dd T C G A G


A

ddCTP

5 ’ 5 ’




C T C C C T C





G A G

G dd

dd T C G A G


A

ddCTP

dd T C C C T C G A G A

5 ’ 5 ’




C T C C C T C





G A G

G C

C T C G A G

C C T C G A G C C T C G A G C

A A

ddCTP

G dd

dd T C G A G



5 ’ 5 ’




T C T C C C T C





G A G

G C

C T C G A G


A A

ddCTP

G dd

dd T C G A G



5 ’ 5 ’




T C T C C C T C





G A G

G C

C T C G A G


A A G

ddCTP

G dd

dd T C G A G



5 ’ 5 ’




C T C T C C C T C





G A G

G dd

dd T C G A G


A A G

ddCTP


dd T C T C C C T C G A G A A G

5 ’ 5 ’




G 5’

dd

C T G A G 5’

dd

C T T C T C C C G A G A G A 5’

dd

G 5’

dd G G

5’

dd

C T G A G 5’

dd C C T T G G A A G G

5’

dd

C T T C T C C C G A G A G A 5’

dd C C T T T T C C T T C C C C C C G G A A G G A A G G A A

5’

dd

C T A G 5’

dd

T C T C C C A G A G 5’

dd

C T T C T C C C A G A G A 5’

dd

C T A G 5’

dd

C C T T A A G G 5’

dd

T C T C C C A G A G 5’

dd

T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G 5’

dd

C T T C T C C C A G A G A 5’

dd

C C T T T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G A A 5’

dd

C T C C C A G A G 5’

dd

C T C T C C C A G A G A 5’

dd

C A G dd

5’

C T C C C A G A G 5’

dd C C T T C C C C C C A A G G A A G G

5’

dd

C T C T C C C A G A G A 5’

dd C C T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G A A

5’

dd

C A G dd

5’ C C A A G G

dd

5’

C G 5’

dd

C T C G A G 5’

dd

C T C C G A G 5’

dd

C T C C C G A G 5’

dd

C T C T C C C A G A G 5’

dd

C C T T C T C C C G A G A G A 5’

dd

C G 5’

C C G G 5’

C T C G A G 5’

dd

C T C G A G 5’

C C T T C C G G A A G G 5’

dd

C T C C G A G 5’

dd

C C T T C C C C G G A A G G 5’

dd

C T C C C G A G 5’

dd

C C T T C C C C C C G G A A G G 5’

dd

C T C T C C C A G A G 5’

dd

C C T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G 5’

dd

5’

dd

5’

dd

C C T T C T C C C G A G A G A C C C C T T T T C C T T C C C C C C G G A A G G A A G G A A

dd

Séquences obtenues dans chaque tube.

ddATP ddTTP ddCTP ddGTP


V- Séquençage de l’ADN et PCR


5’

3’ G T A C T A C

C C

G T A

C

C G

A T C G -

+

C C T T C T C C C G A G A G A 5’

Séquence du brin complémentaire Autoradiogramme d’un gel de séquence

d’ADN (polyacrylamide)

≈3-400 bases / gel

Lec

ture

du

bri

n c

om

plé

men

tair

e d

e 5’

vers

3’

Séparation des molécules

marquées par PAGE.




LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN

Sur une scène de crime parfois les quantités de matériel biologiques sont

faibles.

Comment arriver à avoir suffisamment de matériel pour en tirer des

empreintes génétiques?



Il a reçu le prix Nobel de chimie de 1993 pour la découverte de la réaction de polymérisation en chaîne .

Kary Bank Mullis




La PCR comment ca marche?




D

H A

1 cycle




A chaque cycle, la quantité d’ADN présente dans le tube est doublée.

N cycles : quantité initiale x 2N

En fin de PCR l’enzyme (Taq polymérase) a de moins en moins de substrat pour fonctionner

et le rendement de réaction diminue (<2).




EMPRUNTES GENETIQUES



L'empreinte génétique repose sur le fait suivant : bien que deux humains aient une large

majorité de leur patrimoine génétique identique, un certain ensemble de séquences dans

leur ADN reste spécifique à chaque individu (en raison du polymorphisme).

PCR en temps réel utilisant du SYBR Green comme sonde.

LA PCR QUANTITATIVE



Méthode des DD Ct

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