INSTITUT PASTEUR DALGERIE

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LES FLACONS Tubes essaies

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Les pipettes

STERILISATION

PAR LA CHALEUR

PAR L'OXYDE D'ETHYLENETP:1

Recherche et dnombrement des Coliformes en milieux liquides .

Les coliformes se prsentent sous forme de Bacilles Gram ngatifs (BGN), non sporognes, oxydase ngative, aro-anarobies facultatifs, capables de crotre en prsence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production dacides et de gaz, en 24 48 heures 37C.

Les coliformes sont considrs comme indices de contamination fcale.

La recherche et le dnombrement des coliformes peut se faire selon deux mthodes de choix:

Soit en milieu liquide sur BCPL par la technique du NPP (Nombre le Plus Probable).

Soit par filtration sur membrane 0,45( en milieu solide en supposant la disponibilit dune rampe de filtration.

Technique en milieu liquide sur BCPL.

La technique en milieu liquide fait appel deux tests conscutifs savoir :

le test de prsomption : rserv la recherche des Coliformes totaux .

le test de confirmation : encore appel test de Mac Kenzie et rserv la

recherche des Coliformes fcaux partir des tubes positifs du test de

prsomption .

Test de prsomption .

A partir de leau analyser:

50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL D/C muni dune cloche de Durham

5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni dune cloche de Durham

5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni dune cloche de Durham.

Chassez le gaz prsent ventuellement dans les cloches de Durham et bien mlanger le milieu et linoculum.

Incubation :

Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures .

Lecture :

Sont considrs comme positifs les tubes prsentant la fois :

un dgagement gazeux. un trouble microbien accompagn dun virage du milieu au jaune . .

La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP .

Illustration:

InoculumTest de prsomption Nbre Caractristique

1 X 50 ml -0

5 X 10 ml +

+

--

-2

5 X 1 ml +

+

+-

-3

Le nombre caractristique est donc 023 ; ce qui correspond sur la table de Mac Grady au nombre 4.donc: 4104 coliformes totaux /100mlOn considre alors quil y a 4 Coliformes par 100 ml deau analyser.

Test de confirmation ou test de Mac Kenzie.

Le test de confirmation ou test de Mac Kenzie est bas sur la recherche de Coliformes thermotolrants parmi lesquels on redoute surtout la prsence dEscherichia coli.

Les coliformes thermotolrants ont les mmes proprits de fermentation que les coliformes mais 44C.

Escherichia coli est un coliforme thermotolrant qui entre autre:

produit de lindole partir du tryptophane 44C,

donne un rsultat positif lessai au rouge de mthyl,

ne produit pas de lacthyl mthyl carbinol,

nutilise pas le citrate comme source unique de carbone.

Les tubes de BCPL trouvs positifs lors du dnombrement des Coliformes totaux feront lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans tube contenant le milieu Schubert muni dune cloche de Durham.

Incubation :

Lincubation se fait cette fois-ci au bain marie 44C pendant 24 heures .

Lecture :

Sont considrs comme positifs , les tubes prsentant la fois :

un dgagement gazeux

un anneau rouge en surface , tmoin de la production dindole par Escherichia Coli aprs adjonction de 2 3 gouttes du ractif de Kowacs.

La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait que Escherichia Coli est la fois producteur de gaz et dindole 44C.

Illustration

En reprenant lexemple prcdent relatif au dnombrement des Coliformes totaux , cela suppose que nous avons 6 tubes repiquer savoir :

le flacon de BCPL D/C

3 tubes sur 5 de BCPL D/C

2 tubes sur 5 de BCPL S/C.

InoculumTest de confirmationNbr caractristique

150 ml - 0

5 10 ml + - 1

5 1ml - -

- 0

Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Coliformes fcaux est 010 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 1. donc: on a 1 101coliformes fcaux /100 mlLe rsultat final sera donc de :

4 Coliformes totaux dans 100 ml deau analyser

10 Coliformes fcaux dans 100 ml deau analyser

TP: 1Colimtrie en milieu liquide : Test de prsomption

Eau

Analyser

1 X 50 ml 5 X 10 ml 5 X 1 ml

BCPL D/C BCPL D/C BCPL S/C

37C, 24 48 heures

- + + - - - + + + - -

0 2 3Schma n1TP: 2Colimtrie en milieu liquide : Test de confirmation

Repiquage sur milieu Schubert + cloche

44C , 24 heures

Ajouter 2 3 gouttes de Kowacs

- + - - - - - 0 1 0Schma n2TP: 3Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieux liquides

Les Streptocoques fcaux ou Streptocoques du groupe D de la classification de Lancefield , se prsentent sous forme de coccie Gram + , shriques ovodes formant des chanettes , ne possdant pas de catalase mais possdant lantigne du groupe D.

Ils sont capables de se dvelopper en 24 48 heures 37C sur un milieu slectif lazoture de sodium en donnant des colonies caractristiques rduisant le TTC et qui de plus hydrolysent lesculine en 48 heures 44C aprs repiquage dune colonie sur une glose bilie lesculine.

Leur recherche et leur dnombrement peut se faire de la mme manire que pour les coliformes , cest dire laide de deux mthodes distinctes selon la disponibilit ou non dune rampe de filtration et seuls les milieux de culture changent.

Mthode de recherche en milieu liquide

Tout comme la mthode de recherche des coliformes en milieu liquide, celle de la recherche et le dnombrement des Streptocoques fcaux fait appel deux tests conscutifs savoir :

le test de prsomption

le test de confirmation : rserv la confirmation relle des Streptocoques fcaux partir des tubes positifs du test de prsomption .

Test de prsomption .

A partir de leau analyser:

50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu ROTHE D/C,

5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE D/C,

5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C.

Bien mlanger le milieu et linoculum .

Incubation :

Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures .

Lecture :

Sont considrs comme positifs les tubes prsentant un trouble microbien,

doivent par contre, faire lobjet dun repiquage sur milieu EVA LITSKY dans le but dtre confirms.

Illustration:

InoculumTest de prsomption

1 X 50 ml+

5 X 10 ml+

+

+-

-

5 X 1 ml+

+

+

++

Test de confirmation .

Le test de confirmation est bas sur la confirmation des Streptocoques fcaux ventuellement prsents dans le test de prsomption.

Les tubes de ROTHE trouvs positifs feront donc lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans tube contenant le milieu EVA LITSKY.

Bien mlanger le milieu et linoculum .

Incubation :

Lincubation : 37C, pendant 24 heures .

Lecture :

Sont considrs comme positifs , les tubes prsentant la fois :

un trouble microbien

une pastille violette (blanchtre) au fond des tubes.

La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du NPP .Illustration

En reprenant lexemple prcdent relatif au test de prsomption, cela suppose que nous avons 5 tubes repiquer savoir :

2 tubes sur 5 de ROTHE D/C, et

3 tubes sur 5 de ROTHE S/C.

Tableau Rcapitulatif

InoculumTest de confirmationNbr caractristique

1 50 ml + 1

5 10 ml +

+ - 2

5 1 ml +

+

+

+ - 4

Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Streptocoques fcaux est donc 124 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 12.

Le rsultat final sera donc de :

12 Streptocoques fcaux dans 100 ml deau analyser

TP: 4 . STREPTOMETRIE

Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide:

Test de Prsomption

Eau

Analyser

1 X 50 ml 5 X 10 ml 5 X 1 ml

ROTHE D/C ROTHE D/C ROTHE S/C

37C, 24 48 heures

+ + + + - - + + + + +Schma n3.

TP: 4 . STREPTOMETRIE

Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide:

Test de Confirmation

Repiquage Repiquage

sur milieu Eva sur milieu Eva

37C , 24 heures

+ + + + + + + 1 2 4Schma n4

TP: 6

Recherche et dnombrement des Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs

Les anarobies sulfito-rducteurs (ASR) se prsentent sous forme de bactries Gram +, se dveloppant en 24 48 heures sur une glose Viande Foie en donnant des colonies typiques rduisant le sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en prsence de Fe2+ donne FeS (sulfure de fer ) de couleur noire.

Les spores des ASR constituent gnralement des indices de contamination ancienne.

A partir de leau analyser:

prendre environ 25 ml dans un tube strile, qui sera par la suite soumis un chauffage de lordre de 80C pendant 8 10 minutes, dans le but de dtruire toutes les formes vgtatives des ASR ventuellement prsentes.

Aprs chauffage, refroidir immdiatement le tube en question, sous leau de robinet.

Rpartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes diffrents et striles, raison de 5 ml par tube.

Ajouter environ 18 20 ml de glose Viande Foie, fondue puis refroidie 45 (1C, additionne dune ampoule dAlun de fer et dune ampoule de Sulfite de sodium.

Mlanger doucement le milieu et linoculum en vitant les bulles dair et en vitant lintroduction doxygne.

Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber 37C, pendant 24 48 heures.

La premire lecture doit absolument tre faite 16 heures car trs souvent les colonies des ASR sont envahissantes auquel cas on se trouverait en face dun tube compltement noir rendant ainsi linterprtation difficile voire impossible et lanalyse sera refaire en utilisant des dilutions dcimales de 10-1 voire 10-2, la deuxime lecture se fera 24 heures et la troisime et dernire 48 heures.

Dnombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamtre, poussant en masse.

Interprtation des rsultats .

Il est donc impratif de reprer et de dnombrer toutes les colonies noires poussant en masse et de rapporter le total des colonies 20 ml deau analyser.

Identification biochimique .

Certains auteurs prconisent lidentification biochimique de toute colonie suspecte car trs souvent il y a dveloppement de colonies de Staphylocoques et de Bacillus ct, quon prendrait tord pour des colonies de Clostridium Sulfito-rducteur.

Pour cela il sagit de casser le tube laide dune lime mtallique 1 cm au dessus de la colonie suspecte et de prendre exactement le centre de la dite colonie.

Le centre de la colonie noire suspecte ( qui est en ralit blanche mais entoure dune aurole noire ) sera alors dpos soigneusement dans un tube contenant du bouillon T G Y ou T Y pralablement rgnr 80C pendant 15 minutes.

Placer ensuite ce tube dans un agitateur ( Vortex ) pour bien mlanger la colonie dans le milieu puis lincuber 37C en anarobiose pendant 24 48 heures.

Aprs la priode dincubation, constater le trouble du milieu, puis raliser les tapes suivantes :

Etat frais pour constater sil y a mobilit ou non ...

Coloration de Gram pour constater les types de colonies et leur coloration

Sil sagit de bacilles Gram positifs , faire un isolement sur deux boites de

glose au sang de mouton frais :

* lune sera incube 37C en arobiose ,

* lautre sera incube 37C en anarobiose .

Aprs 24 48 heures dincubation :

* slectionner les boites ayant pouss strictement en anarobiose ,

* noter le type dhmolyse ,

* faire une coloration de Gram puis une raction catalase ,

* sassurer quil sagit bien dune souche pure , sinon purifier ,

* puis ensemencer une Galerie biochimique Api 20 A incuber

toujours 37C et toujours en anarobiose TP: 6

Recherche et dnombrement des

Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs

Eau

Analyser

25 ml deau analyser

Chauffage 80C , 10 minutes

Refroidissement brutal sous leau de robinet

Rpartir raison de 5 ml par tube dans 4 tubes

Ajouter environ 15 ml de glose VF fondue puis refroidie 45 ( 1C

Laisser solidifier puis incuber 37C, 16 24 puis 48 heures

Absence des sporesTP: 7

Recherche de Salmonella

Les Salmonella sont des entrobactries qui se prsentent sous forme de Bacilles Gram Ngatifs (BGN), ne fermentant pas le lactose, mais fermentant le glucose avec production de gaz et de H2S; elles se divisent en deux grands groupes: les mineures et les majeures (hautement pathognes ).

Jour 1 . Premier Enrichissement.

Le premier enrichissement seffectue sur le milieu de Slnite - Cysten D/C rparti raison de 100 ml par flacon.

Ce dernier sera donc ensemenc laide de 100 ml deau analyser, puis incub 37C pendant 18 24 heures, comme lindique le schma n9.

Jour 2 . Deuxime enrichissement et Isolement.

Ce flacon fera lobjet:

dune part, dun deuxime enrichissement sur milieu Slnite en tubes raison de 0,1 ml

dautre part, dun isolement sur glose Hektoen.

Lincubation se fait donc 37C pendant 24 h.

Jour 3 . Lecture des boites et Identification.

Dune part, le tube de Slnite fera lobjet dun isolement,

Dautre part, la boite de glose Hektoen subira une lecture en tenant compte du fait que les Salmonella se prsentent le plus souvent sous forme de colonies de couleur gris bleu centre noir.

Identification morphologique et biochimique.

Cinq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification morphologique et biochimique qui se droulent comme suit :

Etat frais ( bacilles , mobilit ) ,

Coloration de Gram ( bacilles Gram ngatifs ) ,

Ensemencement dun tube de Kligler ( TSI ) qui sera incub 37C , 24 h

( Lactose, Saccharose, Glucose, Gaz et H2S ),

Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub 37C, 24 h qui servira lagglutination sur lame,

Ensemencement :

* soit dune galerie biochimique classique (ONPG, Oxydase, LDC, ODC,

ADH, Tmoin, Ure, Insole, TDA, VP, RM ),

* ou dune galerie biochimique API 20E.

Identification Antignique .

Cette dernire repose sur lagglutination sur lame de verre, partir des mmes colonies isoles la veille sur GN incline en tubes, laide des srums de groupes dabord OMA, OMB puis les autres aprs.

TP: 7

Recherche de Salmonella

Eau

Analyser

100 ml

Bouillon Slnite

37C , 18 24 heures

Isolement sur Hektoen Deuxime enrichissement

37C , 24 h

Gram

Etat fraisTSI

Ure Indole TDA

ONPG

Oxydase

LDC , ODC , ADH 37C , 24 h

GN incline

API 20 E

Agglutination (OMA, OMB ) Idem

TP: 9

Recherche de Vibrion cholrique

Les Vibrionacae se prsentent sous forme de Bacilles Gram Ngatifs droits ou incurvs (BGN), trs mobiles, possdant une oxydase, aro-anarobies facultatifs, fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S. (hautement pathognes ).

Jour 1 . Premier Enrichissement.

Le premier enrichissement seffectue sur le milieu Eau Peptone Alcaline 10 fois concentr rparti raison de 50 ml par flacon auquel on ajoute asptiquement 450 ml deau analyser au moment du prlvement.

Ce dernier sera par la suite incub 37C pendant 18 24 heures.

Jour 2 . Deuxime enrichissement et Isolement.

Ce flacon fera lobjet:

dune part, dun deuxime enrichissement sur milieu EPA en tubes raison de 1 ml

dautre part, dun isolement sur glose GNAB 1.

Lincubation se fait donc 37C pendant 24 h.

Jour 3 . Lecture des boites et Identification.

Dune part, le tube dEPA fera lobjet dun isolement sur GNAB 2,

Dautre part, la boite de glose GNAB 1 subira une lecture en tenant compte du fait que les Vibrions se prsentent le plus souvent sous forme de grosses colonies lisses et transparentes caractristiques.

Identification morphologique et biochimique.

Ensemencement dun tube de KIA qui sera incub 37C, 24 h

( Saccharose, Glucose, Gaz et H2S ),

Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub 37C, 24 h qui servira lagglutination sur lame,

Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au srum polyvalent O1 est ngative, faire une minigalerie base sur l'tude des acides amins

TP: 9

Recherche de Vibrion cholrique

Eau

Analyser

450 ml

Bouillon EPA 10X[ ]

37C, 18 24 heures

1 ml

Isolement sur GNAB 1 Deuxime enrichissement

37C, 24 h

Oxydase

Gram

Etat fraisKIA

LDC, ODC, ADH

GN incline 37C, 24 h

Agglutination

Idem

Schma n11

3120