INSTITUT PASTEUR DALGERIECOURS NATIONAL DHYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS

UNITE : MICROBIOLOGIE DES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

MANUEL DES TRAVAUX PRATIQUES

du 19 au 30 Octobre 2002

Responsable des TP : Dr LEBRES IPAAssistants : Mr Azizi Djamal Mr Hamza Abdenour

METHODESI.1. Prise dessai .

GENERALES

I . PREPARATION DES ECHANTILLONS .Les laits tant des produits liquides constitueront demble donc une solution mre. Les produits laitiers ( laits secs en poudre, yaourt, fromages, desserts lacts et autres tant des produits solides, feront lobjet de dilutions dcimales, mais au pralable il est ncessaire de procder leur homognisation laide de techniques et dappareils appropris (Broyeurs homognisateurs, Stomatcher ..) . Les prises dessai sont effectues sur lchantillon homognis en tenant compte de deux facteurs essentiels savoir : le nombre de pices soumises lanalyse dune part, les oprations analytiques conduire ... Mais, en gnral, on prlve trois fois 25 ml ou 25 gr : les premiers serviront lanalyse bactriologique courante, les seconds serviront la recherche de Salmonella Shigella, les troisimes serviront la recherche des Listeria.

I.2. Cas des produits liquides.Dans le cas des produits liquides, le mlange de trois cinq sachets de lait par exemple constituera la solution mre (SM = 1). Dilutions dcimales : Introduire ensuite asptiquement laide dune pipette en verre gradue et strile, 1 ml de la SM, dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant : cette dilution est alors au 1/10 ou 10-1. Introduire par la suite 1ml de la dilution 10-1 dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant : cette dilution est alors au 1/100 ou 10-2 . Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en verre gradue et strile, 1 ml de la dilution 10-2 dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant ; cette dilution est alors au 1/1000 ou 10-3 . Voir schma n1.

I.3.Cas des produits solides.Dans le cas des produits solides, introduire aseptiquement 25 grammes de produit analyser dans un bocal strile pralablement tar ou dans un sachet strile de type Stomatcher contenant au pralable 225 ml de diluant soit le TSE ( Tryptone Sel Eau ) . Homogniser. Cette suspension constitue alors la dilution mre (DM) qui correspond donc la dilution 1/10 ou 10-1. Dilutions dcimales : Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en verre gradue et strile 1ml de la DM, dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant : cette dilution sera alors au 1/100 ou 10-2. Introduire par la suite 1ml de la dilution dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant : cette dilution est sera alors au 1/100 ou 10-3. Introduire ensuite aseptiquement laide dune pipette en verre gradue et strile, 1 ml de la dilution 10-3 dans un tube vis strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant : cette dilution est alors au 1/1000 ou 10-4 . Voir schma n2. Ces dilutions serviront la recherche des germes suivants : Germes arobies msophiles totaux Coliformes totaux et fcaux Staphylococcus aureus Levures et Moisissures.2

Remarques : 1. Au moment de la ralisation des dilutions dcimales, il est impratif de changer de pipettes entre chaque dilution. 2. Contrairement cela, lors de lensemencement il est recommander de commencer par la plus forte dilution savoir 10-3 dans le but justement de ne pas changer de pipettes. On travaillera alors laide dune pipette gradue en verre strile de 5 ml.

1 ml

1 ml

LAIT

9 ml TSE

9 ml TSE

SM: 1

10-1 10-2 Schma n1 : Cas des Produits Liquides. 1 ml 1 ml

25 gr dans 225 ml TSE

9 ml TSE

9 ml TSE

DM:10-1

10-2 10-3 Schma n2 : cas des Produits SolidesTP : 1

Recherche et dnombrement des germes arobies msophiles totauxA partir des dilutions dcimales allant de 10-3 10-1 voire 1, porter aseptiquement 1 ml dans une boite de Ptri vide prpare cet usage et numrote comme lindique le schma n3. Complter ensuite avec environ 20 ml de glose PCA ou TDYM fondue puis refroidie 451C : le choix des milieux dpend de la nature des denres analyser. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de 8 pour permettre linoculum de se mlanger la glose utilise. Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxime couche denviron 5 ml de la mme glose ou de glose blanche. Cette double couche a un rle protecteur contre les contaminations diverses. Incubation : Les boites seront incubes couvercle en bas 30C pendant 72 heures avec : - premire lecture 24 heures, - deuxime lecture 48 heures, et - troisime lecture 72 heures. Lecture :3

Les colonies des G A M T se prsentent sous forme lenticulaire en masse. Dnombrement : Il sagit de compter toutes les colonies ayant pouss sur les boites en tenant compte des facteurs suivants : - ne dnombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier toujours le nombre trouv par linverse de sa dilution, - faire ensuite la moyenne arithmtique des colonies entre les diffrentes dilutions. Illustration : Inoculum 10-1 10-2 10-3 Nbre de Colonies 160 70 19 Pour revenir 1 X 10 X 100 X 1000 Nbre rel 1600 7000 19 000 Moyenne arithm tique 27600 / 3 = 9200 GAMT/gr

TP : 1 Recherche et dnombrement des germes arobies msophiles totauxA partir des dilutions dcimales :

10-1

10-2

10-3

1 ml

1ml

1ml

-

Ajouter environ 20 ml de glose TDYM Laisser solidifier sur paillasse Ajouter une double couche (5 ml) Incuber 30C, 24 48 et 72 h Dnombrer les colonies lenticulaires en masse.

4

TP : 2 Recherche et dnombrement des Coliformes en milieu liquideDans les laits et produits laitiers, les Coliformes sont dnombrs : soit en milieu liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable) laide du bouillon VBL (bouillon lactos bili au vert brillant) rparti raison de 10 ml par tubes munis dune cloche de Durham. soit en milieu solide, sur le milieu au Dsoxycholate 1. La technique en milieu liquide fait appel deux tests conscutifs savoir : le test de prsomption : rserv la recherche des Coliformes totaux. le test de confirmation : appel encore test de Mac Kenzie et rserv la recherche des Coliformes fcaux partir des tubes positifs du test de prsomption. Test de prsomption. Prparer dans un portoir une srie de tubes contenant le milieu slectif (VBL) raison de trois tubes par dilution. A partir des dilutions dcimales 10-3 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant une dilution donne comme lindique le schma n4. Chassez le gaz prsent ventuellement dans les cloches de Durham et bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation : Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture : Sont considrs comme positifs les tubes prsentant la fois : un dgagement gazeux (suprieur au 1/10 de la hauteur de la cloche ), un trouble microbien accompagn dun virage du milieu au jaune (ce qui constitue le tmoin de la fermentation du lactose prsent dans le milieu). Ces deux caractres tant tmoins de la fermentation du lactose dans les conditions opratoires dcrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady qui se trouve en annexe. Illustration : Inoculum V B L. Test de Prsomption Nbre Caractristique -1 10 + + + 3 10-2 + + 2 -3 10 + 1 Le nombre caractristique est donc 321 ; ce qui correspond sur la table de Mac Grady au nombre 15. On considre alors quil y a 15 Coliformes par gramme de produit la dilution 10-1. Pour obtenir le nombre rel de Coliformes totaux, il suffit de multiplier ce nombre par linverse de la premire dilution pour revenir 1 soit : 15 X 10 = 150 Coliformes totaux par gr de produit analyser. Test de confirmation ou test de Mac Kenzie. Les tubes de VBL trouvs positifs lors du dnombrement des Coliformes totaux feront lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans la fois : - un tube de VBL muni dune cloche et sur, - un tube deau peptone exempte dindole, comme lindique le schma n5. Chasser le gaz prsent ventuellement dans les Cloches de Durham et bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation : Lincubation se fait cette fois-ci au bain marie 44C pendant 24 heures. Lecture : Sont considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois :5

un dgagement gazeux dans les tubes de VBL, un anneau rouge en surface, tmoin de la production dindole par Escherichia Coli aprs adjonction de 2 3 gouttes du ractif de Kowacs dans le tube deau peptone exempte dindole. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table de Mac Grady en tenant compte du fait que Escherichia Coli est la fois producteur de gaz et dindole 44C. Illustration En reprenant lexemple prcdent relatif au dnombrement des Coliformes totaux , cela suppose que nous avons 6 tubes repiquer savoir : 3 tubes de la dilution 10-1 2 tubes de la dilution 10-2 1 tube de la dilution 10-3. Test de Inoculum Prsomption VBL.37 C 10-1

10-2 10-3

+ + + + + +

Nbre Test de Confirmation Caract VBL.44C E.P.E.I ristiq ue + + 3 + + + + 2 + + 1 + Tableau Rcapitulatif -

Nbre Caractristique

2 1 0

Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Coliformes fcaux est donc 210 , ce qui correspond sur la table de Mac Grady 1,5 la dilution 10-1. Mais pour revenir 1, il faut multiplier ce nombre par linverse de la premire dilution savoir : 1,5 X 10 = 15 Coliformes fcaux par gr de produit analyser. Le rsultat final sera donc de : 150 Coliformes totaux / gr de produit 15 Coliformes fcaux / gr de produit Remarque : Etant donn que les Coliformes fcaux font partie des Coliformes totaux, il est pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fcaux que de Coliformes totaux.

TP : 3 Recherche et dnombrement des Coliformes en milieu solide

A partir des dilutions dcimales allant de 10-3 10-1 voire 1, porter aseptiquement 2 fois 1 ml dans deux boites de Ptri vides prpares cet usage et numrotes comme lindique le schma n6. Complter ensuite chaque boite avec environ 20 ml de glose au Dsoxycholate 1 ou dfaut par de la glose VRBL ou VRBG, fondue puis refroidie 451C. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de 8 pour permettre linoculum de bien se mlanger la glose utilise. Incubation :6

Une srie de boites sera incube 37C, pendant 24 48 h et servira la recherche de Coliformes totaux, lautre srie sera incube 44C pendant 24 48 h et servira la recherche de Coliformes fcaux.. Que se soit 37 ou 44C, les premires lectures se feront au bout de 24 h et consistent reprer les petites colonies rouges ayant pouss en masse mais fluorescentes, ce qui signifie que la lecture doit se faire dans une chambre noire et sous une lampe UV. Les autres colonies non fluorescentes ne sont ni des coliformes totaux ni des coliformes fcaux. Dnombrement : Il sagit de compter toutes les colonies ayant pouss sur les boites en tenant compte des facteurs de dilutions, de plus : - ne dnombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier toujours le nombre trouv par linverse de sa dilution, - faire ensuite la moyenne arithmtique des colonies entre les diffrentes dilutions. - il est impossible de trouver plus de Coliformes fcaux que de Coliformes totaux. TP : 3 Recherche et dnombrement des Coliformes en milieu solide

A partir des dilutions dcimales :

10-11ml

10-21 ml

10-31 ml

1ml

1ml

1 ml

37C, 24 48 h

44C, 24 48hAjouter auparavant environ 20 ml de glose au Dsoxycholate 1 Laisser solidifier sur paillasse Dnombrer les colonies fluorescentes ayant pouss en masse

Schma n6 TP : 47

Recherche et dnombrement des Streptocoques fcauxDans les laits et produits laitiers, les Streptocoques du groupe D ou Streptocoques fcaux sont recherchs et dnombrs en milieu liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable). La technique en milieu liquide fait appel deux tests conscutifs savoir : le test de prsomption : rserv la recherche des Streptocoques sur milieu de Rothe, le test de confirmation : rserv la confirmation proprement dite sur milieu EVA, des tubes trouvs positifs au niveau des tests de prsomption. Test de prsomption. Prparer dans un portoir une srie de tubes contenant le milieu slectif de Rothe raison de trois tubes par dilution. A partir des dilutions dcimales 10-3 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant une dilution donne comme lindique le schma n7. Bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation : Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture : Sont considrs comme positifs les tubes prsentant un trouble microbien. Mais attention il ny a aucun dnombrement faire se niveau. Test de confirmation ou test de Mac Kenzie. Chaque tube de Rothe trouv positif lors du test de prsomption fera lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans un tube de milieu EVA Lytski. Bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation : Lincubation se fait 37C, pendant 24 heures. Lecture : Sont considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois : un trouble microbien, une pastille blanchtre ou violette au fond du tube. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table de Mac Grady en tenant compte uniquement des tubes dEVA positifs ou ngatifs. Illustration Si, sur milieu de Rothe : * la dilution 10-1 : 2 tubes sur 3 sont positifs, donc repiquer, -2 * la dilution 10 : 2 tubes sur 3 sont positifs, donc repiquer, * la dilution 10-3 : 1 tube sur 3 est positif, donc repiquer. Cela signifie, quon a 5 tubes repiquer sur milieu EVA. Aprs repiquage et incubation, si : * la dilution 10-1 : 1 tube sur 2 est positif, * la dilution 10-2 : les 2 tubes sont ngatifs, -3 * la dilution 10 : le tube repiqu est positif, Le nombre caractristique sera de 101 , ce qui correspond 0,7 sur la table de Mac Grady. On considre donc quil y a 0,7 Streptocoques fcaux la dilution 10-1. Mais tenant compte du facteur de dilution et pour revenir 1, il faut multiplier ce nombre par linverse de la premire dilution soit : 0,7 X 10 = 7. Le rsultat final sera donc de 7 Streptocoques fcaux par gr ou ml de produit analyser. Dilutions Test de prsomption Test de confirmation + + 10-1 + + 10-2 + + +8

10-3 Nombre Caractristique

/

101

TP : 4 Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux

A partir des dilutions dcimales :

10-1 3 X 1 ml

10-2 10-3 3 X 1 ml 3 X 1 ml Test de prsomption, 37C, 24 48 h.

+

+

-

+

+

-

+

-

-

Test de confirmation, 37C, 24 h.

+1

-

0

-

+1 TP : 59

Recherche de Salmonella.Comme convenu dans le chapitre (I.1), la recherche des Salmonella ncessite une prise dessai part. Jour 1 : Pr-enrichissement. Prlever 25 ml ou 25 gr de produit analyser dans 1 sachet strile de type Stomatcher contenant 225 ml deau peptone tamponne. Broyer cette suspension dans un broyeur de type Stomatcher, la transposer dans un flacon strile quon incube 37C pendant 18 heures. Jour 2 : Enrichissement. Lenrichissement doit seffectuer sur deux milieux slectifs diffrents savoir : - le milieu de Rappaport Vassiliadis rparti raison de 10 ml par tube, - le milieu de Slnite - Cysten rparti raison de 100 ml par flacon. Lenrichissement proprement dit, se fait donc partir du milieu de pr-enrichissement de la faon suivante : - 0,1 ml en double pour les tubes de Rappaport Vassiliadis, - 10 ml en double pour les flacons de Slnite Cystn, comme lindique le schma n8. Incubation. Le premier tube de Rappaport sera Le deuxime tube de Rappaport sera Le premier flacon de Slnite sera Le deuxime flacon de Slnite sera incub incub incub incub 37C, 24 h. 42C, 24 h. 37C, 24 h. 42C, 24 h.

Jour 3 : Isolement. Chaque tube et chaque flacon fera lobjet dun isolement sur deux milieux gloss diffrents savoir : - le milieu glos Hektoen - le milieu glos Bili lactos au vert brillant et au rouge de phnol. Toutes les boites ainsi ensemences seront incubes 37C pendant 24 h. Jour 4 : Lecture des boites et Identification. Les Salmonella se prsentent de la faon suivante : - colonies roses entoures dune zone rouge sur glose BLVBRP. - colonies le plus souvent gris bleu centre noir sur glose Hektoen. Identification morphologique et biochimique. Cinq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification morphologique et biochimique qui se droulent comme suit : Etat frais (bacilles, mobilit), Coloration de Gram (bacilles Gram ngatifs), Ensemencement dun tube de Kligler (TSI) qui sera incub 37C, 24 h (Lactose, Saccharose, Glucose, Gaz et H2S), Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub 37C, 24 h qui servira lagglutination sur lame, Ensemencement : * soit dune galerie biochimique classique (ONPG, Oxydase, LDC, ODC, ADH, Tmoin, Ure, Indole, TDA, Citrate de Simmons, VP, RM), * ou dune galerie biochimique API 20E. Identification Antignique. Cette dernire repose sur lagglutination sur lame de verre , partir des mmes colonies isoles la veille sur GN incline en tubes , laide des srums de groupes dabord OMA , OMB puis les autres aprs.

TP : 6

10

Rechercher de Listeria monocytogenes : Mthode AFNOR V08. 055Comme convenu dans le chapitre (I.1), la recherche des Listeria ncessite une prise dessai part. Jour 1 : Pr-enrichissement. Introduire aseptiquement 25 gr de produit analyser dans 225 ml de bouillon Fraser additionn de supplment comme lindique le schma n9. Bien mlanger milieu et inoculum, puis incuber 30C pendant 24 h. Jour 2 : Enrichissement et isolement. A partir du bouillon Fraser : Prendre aseptiquement 0,1 ml du bouillon Fraser dans un tube contenant 10ml de bouillon Fraser additionn lui aussi de son supplment. Bien mlanger milieu et inoculum, puis incuber 37C, 24 h.

Procder un isolement sur glose Palcam (P1), puis incuber 37C, 24 Jour 3 : Isolement sur P2.

48h.

Procder un isolement sur glose Palcam (P2) partir du bouillon Fraser, puis incuber 37C pendant 24 48h. Jour 4 : Lecture des isolements et Identification biochimique. Observer les colonies noires caractristiques ayant pouss sur glose Palcam, puis effectuer les tests suivants : Catalase, Coloration de Gram (petits BGP), Mobilit (en Etat Frais ou mieux en glose mobilit 22C), Camp-test ou glose au sang, API Listeria. Sur le plan biochimique, Listeria monocytogenes est : aro-anarobie facultatif, Catalase + Oxydase Nitrate rductase Glucose +, H2S , Gaz Esculine + Indole , Ure , TDA , VP + et RM + Hmolyse de type . Remarques : 1. Utiliser avec chaque chantillon ou groupe dchantillons, une souche tmoin de Listeria monocytogenes. Si le tmoin ne marche pas, lanalyse est refaire. 2. Concernant le supplment pour le milieu Fraser, il faut le reconstituer strilement un flacon par 22,5 ml dun mlange, volume 1/1, eau/thanol strile. Mlanger doucement pour dissoudre. Ajouter strilement alors : * 2,25 ml du flacon 225 ml de bouillon Fraser * 0,1 ml du flacon 10 ml de bouillon Fraser Bien mlanger avant de rajouter linoculum. Ce supplment est constitu de : Acriflavine ... 28,1 mg Acide nalidixique .. 22,5 mg Citrate de fer ammoniacal ..11,25 mg Concernant le supplment pour le milieu Palcam, il faut le reconstituer strilement laide de 5 ml deau distille strile. Mlanger doucement pour dissoudre. Ajouter strilement 2,25 ml du flacon 225 ml de glose de base Palcam fondue puis refroidie 45C environs. Bien mlanger et rpartir en boites de Ptrie . Ce supplment est constitu de :11

Sulfate de Polymyxine B .. 50 000 UI Ceftazidime .. 10 mg Acriflavine .. 2,5 mg

TP : 6 Recherche de Listeria monocytogenesJour 1 25 gr dans 225 ml de Fraser 30C, 18 24 h

Isolement

0,1 ml

Jour : 2

Palcam ou RapidLmono

Fraser

Enrichissement Secondaire

37C, 24 h

30C, 24 h

Jour : 3 Palcam ou RapidLmono 37C , 24 h 5 Colonies TSAYE Jour : 4 Purification Catalase Gram Mobilit Camp-test Galerie API Listeria

Suite Idem

12

Schma n9

Camp-test

Listria monocytogenes de rfrence Staphylococcus Aurus Rhodococcus Equi

Glose TSA

Souche tester Le tableau suivant indique quelques caractres biochimiques du genre Listeria. Camp-test Fermentation des SucresEspces L.monocyto L.ivanovii L.innocua L.welshimri L.seeligeri S.aurus + + R.qui + D-xylose + + + L-rhamnose + + ou + ou & mthyl D-mannoside + + + -

TP : 7 Recherche de Staphylococcus aureus.Selon la disponibilit des milieux de culture, trois techniques diffrentes sont recommandes pour la recherche de Staphylococcus aureus savoir : mthode de Baird Parker mthode denrichissement sur milieu de Giolliti Cantonii mthode denrichissement sur milieu de Chapman. Mthode de Baird Parker. Prparation du milieu. Au moment de lemploi faire fondre un flacon contenant 225 ml de glose Baird Parker , le refroidir ensuite dans un bain deau 45C , puis ajouter 15 ml dune solution de jaune duf au Tllurite de potassium. Mlanger soigneusement et aseptiquement, puis rpartir le milieu en boites de ptri raison de 15 18 ml par boite.13

Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis les scher en les plaant retournes couvercle en bas (bord de la boite sur le bord du couvercle) dans une tuve de schage rgle entre 45 55C. Ensemencement. A partir des dilutions dcimales 10-5 dans le cas des toxi-infections alimentaires et partir de 10-3 dans le cas des contrles de routine, porter aseptiquement 1 ml de chaque dilution rparti en surface raison de 3 fractions sensiblement gales dans trois boites contenant le milieu de Baird Parker puis taler laide dun mme taleur en commenant par les boites de plus forte dilution, comme lindique le schma n11. Incubation. Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture. Seront considres comme positives, les boites contenant des colonies caractristiques savoir des colonies noires, brillantes, convexes entoures dune zone de transparence qui peut tre translucide. Aprs 24 heures, peut apparatre dans cette zone transparente, un anneau opalescent immdiatement au contact des colonies. Pour sassurer quil sagit bien de colonies de Staphylococcus aureus, effectuer sur 2 3 colonies de chaque boite des tests biochimiques rapides savoir : une preuve la catalase ( laide de leau oxygne) une preuve la coagulase ( laide de plasma de lapin). Quelques caractres biochimiques de diffrentes espces de staphylocoques sont rsums dans le tableau ci aprs. Staphylocoque aureus intermedius saprophyticus epidermitis Catalase + + + + Coagulase + + Mannitol en + anarobie Rsistance la Novobiocine S S R S (5 Micro-gr ) Remarques : 1. Les boites coules avec de la glose Baird - Parker non sches peuvent tre conserves entre 0 et +5C au maximum 24 heures . 2. Des colonies non caractristiques peuvent apparatre sur les boites : il sagit de colonies noires , brillantes , convexes ou gris noirtres ayant parfois un aspect mat et une texture sche, dpourvues de zone de transparence, de catalase et de coagulase. Mthode denrichissement au milieu de Giolliti Cantonii. Prparation du milieu denrichissement. Au moment de lemploi, ouvrir aseptiquement le flacon contenant le milieu de Giolliti Cantonii pour y ajouter 15 ml dune solution de Tllurite de Potassium. Mlanger soigneusement. Le milieu est alors prt lemploi. Ensemencement. A partir des dilutions dcimales retenues, porter aseptiquement 1 ml par dilution dans un tube vis strile. Ajouter par la suite environ 15 ml du milieu denrichissement comme lindique le schma n 12. Bien mlanger le milieu et linoculum. Incubation. Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture. Seront prsums positifs, les tubes ayant virs au noir. Pour sassurer quil sagit bien dun dveloppement de Staphylococcus aureus, ces tubes feront lobjet dune confirmation par isolement sur glose Chapman pralablement fondue , coule en boites de ptri et bien sches. Les boites de Chapman ainsi ensemences seront incubes leur tour 37C pendant 24 48 heures. Aprs ce dlai, reprer les colonies suspectes savoir les colonies de taille moyenne, lisses, brillantes, pigmentes en jaune et pourvues dune catalase et dune coagulase.14

Expression des rsultats. - Si la dilution 10-3, le tube a noirci au bout de 24 heures dincubation, mais lisolement sur Chapman, il ny a pas de colonies caractristiques ; ce tube est considr comme ngatif. - Si par contre la dilution 10-1, le tube a noirci au bout de 24 heures dincubation, et lisolement, il y a des colonies caractristiques, il faut tenir compte de la dilution en question, car le nombre rel de Staphylococcus aureus correspond linverse de la dilution. Dans ce cas, il y a donc 10 Staphylococcus aureus par gramme ou millilitre de produit analyser. TP : 7 Recherche de Staphylococcus aureus par la mthode de Giolitti Cantonii

A partir des dilutions dcimales :

10-1

10-2

10-3

1ml 15ml GC 15ml GC

1ml 15ml GC

1ml

37C, 24 48 h

Raction Positive Isolement sur Chapman

Raction Ngative

37C , 24 48 h Catalase, coagulase

TP : 815

Recherche de spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs et de Clostridium perfringensSelon la disponibilit des milieux de culture, deux techniques sont recommandes pour la recherche de Clostridium perfringens savoir : mthode gnrale sur glose Viande Foie 37C, mthode slective sur glose TSN ou TSC 46C. Mthode gnrale. Prparation du milieu. Au moment de lemploi faire fondre un flacon de glose Viande foie, le refroidir dans un bain deau 45C puis ajouter une ampoule dAlun de Fer et une ampoule de sulfite de sodium. Mlanger soigneusement et aseptiquement. Le milieu est ainsi prt lemploi, mais il faut le maintenir dans une tuve 45C jusquau moment de lutilisation. Ensemencement. Les tubes contenant les dilutions 10-2 et 10-1 seront soumis : dabord un chauffage 80C pendant 8 10 minutes, puis un refroidissement immdiat sous leau de robinet, dans le but dliminer les formes vgtatives et de garder uniquement les formes sporules. A partir de ces dilutions, porter aseptiquement 1 ml de chaque dilution en double dans deux tubes vis striles de 16 mm de diamtre, puis ajouter environ 15 ml de glose Viande Foie prte lemploi, dans chaque tube comme lindique le schma n13. Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes. Incubation. Ces tubes seront ainsi incubs 37C pendant 16, 24 ou au plus tard 48 heures. Lecture. La premire lecture doit se faire imprativement 16 heures, car, - dune part les colonies de Clostridium Sulfito-rducteurs sont envahissantes auquel cas on se trouverait en face dun tube compltement noir rendant alors linterprtation difficile voire impossible et lanalyse est refaire. - dautre part, il faut absolument reprer toute colonie noire ayant pouss en masse et dun diamtre suprieur 0,5 mm. Dans le cas o il ny a pas de colonie caractristique r-incuber les tubes et effectuer une deuxime lecture au bout de 24 heures voire 48 heures. Interprtation des rsultats. Il est donc impratif de reprer toute colonie noire, puis procder son identification biochimique. Certains auteurs prconisent de casser le tube laide dune lime mtallique 1 cm au dessus de la colonie suspecte et de prendre le centre de la dite colonie, car trs souvent il y a dveloppement de colonies de Staphylocoques et de Bacillus ct, quon prendrait tord pour des colonies de Clostridium Sulfitorducteur. Identification biochimique. Le centre de la colonie noire suspecte ( qui est en ralit blanche mais entoure dune aurole noire ) sera alors dpos soigneusement dans un tube contenant du bouillon T G Y ou T Y pralablement rgnr 80C pendant 15 minutes . Placer ensuite ce tube dans un agitateur (Vortex) pour bien mlanger la colonie dans le milieu puis lincuber en anarobiose pendant 24 48 heures. Aprs la priode dincubation, constater le trouble du milieu, puis raliser les tapes suivantes : Etat frais pour constater sil y a mobilit ou non ... Coloration de Gram pour constater les types de colonies et leur coloration Sil sagit de bacilles Gram positifs, faire un isolement sur deux boites de glose au sang de mouton frais : * lune sera incube 37C en arobiose, * lautre sera incube 37C en anarobiose. Aprs 24 48 heures dincubation :16

* slectionner les boites ayant pouss strictement en anarobiose, * noter le type dhmolyse, * faire une coloration de Gram puis une raction catalase, * sassurer quil sagit bien dune souche pure, sinon purifier, * puis ensemencer une Galerie biochimique Api 20 A incuber toujours 37C et toujours en anarobiose. Mthode Slective. La mthode slective de recherche de Clostridium perfringens est identique la mthode gnrale, mise part : le milieu de culture : il sagit cette fois ci dun milieu slectif TSN ou TSC ( Tryptone Sulfite Nomycine ou Tryptone Sulfite Cyclosrine), ces deux antibiotiques inhiberont toute la flore ventuellement prsente hors mis les spores de Clostridium perfringens, rendant ainsi le milieu slectif . la temprature dincubation : 46C, la slection est encore plus stricte. La suite des oprations reste sans changement. TP : 8 Recherche de spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs et de Clostridium perfringens

A partir des dilutions dcimales :

10-1

10-2

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Ajouter 15 ml de glose V F par tube Laisser solidifier sur paillasse, puis incuber 37C, 48h.

Dnombrer les colonies noires ayant pouss en profondeur

TP : 9 Recherche et dnombrement de Levures et Moisissures17

A partir des dilutions dcimales, 10-3 10-1, porter aseptiquement 4 gouttes dans une boite de ptri contenant de la glose OGA ou Sabouraud au Chloramphnicol, comme lindique le schma n14. Etaler les gouttes laide dun rteau strile, puis incuber 22C pendant 5 jours. Dans le souci de ne pas se trouver en face de boites envahies soit par les Levures soit par les Moisissures, on doit effectuer des lectures et des dnombrements tous les jours, Levures part et les Moisissures part. Remarques importantes : 1. Oprer de la mme faon et dans les mmes conditions, avec le diluant (TSE), c'est--dire quil faut prendre quatre gouttes du diluant, les taler avec un rteau part et les incuber dans le mme endroit que les boites tests, cette boite constitue le tmoin diluant. 2. Incuber telle quelle, une boite du milieu utilis savoir OGA ou Sabouraud, cette dernire sera incube galement telle quelle dans le mme endroit et dans les mmes conditions de temprature, elle constitue le tmoin du milieu. 3. Au moment de la lecture, commencer obligatoirement par les deux boites tmoin milieu et diluant, si lune dentre elles est contamine, lanalyse est ininterprtable donc refaire. Interprtation des rsultats : Etant donn dune part, quon a pris 4 gouttes des dilutions dcimales, Etant donn dautre part, quon considre que dans 1 ml, il y a 20 gouttes, Pour revenir 1 ml, il faut multiplier le nombre trouv par 5. Par ailleurs, tant donn quon a travaill avec des dilutions dcimales, on doit multiplier le nombre trouv par linverse de la dilution correspondante, faire ensuite la moyenne arithmtique, puis exprim le rsultat final en ml ou en gr de produit analyser.

TP : 9 Recherche et dnombrement de Levures et MoisissuresA partir des dilutions dcimales :

10-1

10-2

10-3

TSE

OGA

4gttes

4gttes

4gttes

4gttes

OGA

OGA

OGA

22C, 5jours, avec lecture tous les jours. NORMES & INTERPRETATION18

En attendant lapparition du prochain arrt interministriel fixant les critres microbiologiques de certaines denres alimentaires, linterprtation des rsultats des analyses bactriologiques se fait actuellement conformment larrt interministriel du 27 Mai 1998 paru sur le journal officiel de la RADP n 35/98. Ces rsultats sont exprims selon trois critres : satisfaisants : cest dire conformes aux normes imposes par la lgislation. non satisfaisants : cest dire pour lesquels le seuil dacceptabilit est dpass. acceptables : pour lesquels le rapport c/n est infrieur 2/5. c : tant le nombre dunits dchantillons donnant des valeurs comprises entre m et M . n : tant le nombre dunits par chantillon . m : nombre minimal de micro-organismes trouvs (limite infrieure) M : nombre maximal de micro-organismes trouvs (limite suprieure)

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