Rapport de stage présenté par Béatrice Tandavarayen

Master Sciences Technologies Santé

Master Professionnel Mention Biochimie spécialité Ingénierie Biochimique et biotechnologies

Maître de stage : Dr Bruno Cavallini

Directeur du développement des BioProcédés

Soutenance : septembre 2010

Remerciements :

Je souhaite remercier dans un premier temps l’équipe pédagogique et les intervenants de ma formation

Master Sciences Technologies Santé mention Biochimie spécialité Ingénierie Biochimiques et

Biotechnologies de la faculté Lyon 1, pour leurs enseignements.

Je tiens également à remercier et à témoigner toute ma gratitude envers les personnes suivantes, pour

l’expérience enrichissante et pleine d’intérêt qu’elles m’ont permis de vivre durant ces 7 mois de stage

au sein d’iDD biotech :

Claudine Vermot-Desroches, Directrice Recherche et Développement, pour son accueil et la confiance

qu’elle m’a accordée.

Bruno Cavallini, Directeur du département Développement des BioProcédés, mon tuteur, pour

m’avoir accordé sa confiance, pour le temps qu’il m’a consacré tout au long de cette période, et toute

la pédagogie dont il a fait preuve. Tout au long de ma mission, ses attentes m’ont permis d’évoluer

constamment.

Corinne Bresson, Chercheur en Développement des Bioprocédés pour ses conseils précieux, ses

encouragements, et son soutien permanent.

Chanthy Kong, Attachée de recherche, et Marc Godinat, Technicien, pour le temps qu’ils m’ont

consacré et pour leur participation active à ma formation tout au long de ma mission.

Un grand merci à tous les collaborateurs d’iDD biotech (Laurence Bourdin, Chantal Catala, Florence

Gaden, Rémi Laporte, Emilie Lavocat, Julie Raimond, Carine Rousset, Olivier Subiger, Sandrine

Toussaint, Boris Vuillermoz) avec qui j’ai travaillé de près ou de loin et pour leur gentillesse, leur

bonne humeur tout au long de ces 7 mois de stage.

S o m m a i r e

I. PRESENTATION DE L’ENTREPRISE ...................................................................................... 1

II. INTRODUCTION ....................................................................................................................... 2

III. MATERIELS ET METHODES ................................................................................................ 8

III.1 - Culture cellulaire ................................................................................................................................................. 8 III.1.1 - Cultures d’entretien ......................................................................................................................................... 8 III.1.2 - Cultures en rollers ........................................................................................................................................... 8 III.1.3 - Cultures en bioréacteur .................................................................................................................................... 9 III.1.4 - Numération cellulaire ...................................................................................................................................... 9

III.2 - Filtration et clarification .................................................................................................................................... 10 III.2.1 - Clarification .................................................................................................................................................. 10 III.2.2 - Filtres ........................................................................................................................................................... 10 III.2.3 - Dispositif et méthodologie ............................................................................................................................. 11

III.3 - Techniques d’analyse ......................................................................................................................................... 11 III.3.1 - Spectrophotomètrie et turbidimétrie ............................................................................................................... 11 III.3.2 - Mesure de la concentration en Ac par ELISA................................................................................................. 12 III.3.3 - Dosage des anticorps par HPLC .................................................................................................................... 12 III.3.4 - Gel SDS-PAGE............................................................................................................................................. 13

IV. RESULTATS ............................................................................................................................ 13

IV.1 - Conditions de cultures........................................................................................................................................ 13

IV.2 - Clarification ....................................................................................................................................................... 14 IV.2.1 - Comparaison de filtres d’une même gamme .................................................................................................. 14

IV.2.1.1 - Gamme Millipore .................................................................................................................................. 14 IV.2.1.2 - Gamme Sartorius ................................................................................................................................... 15

IV.2.2 - Comparaison de deux gammes de filtres ........................................................................................................ 15 IV.2.2.1 - Filtres simples ....................................................................................................................................... 15 IV.2.2.1 - Filtres en cascades ................................................................................................................................. 16

IV.3 - Quantification .................................................................................................................................................... 18

IV.4 - SDS-PAGE ......................................................................................................................................................... 19

V. DISCUSSION ............................................................................................................................. 20

VI. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................. 27

ANNEXE 1 : CORRELATION ENTRE DENSITE OPTIQUE ET DENSITE CELLULAIRE ... 1

ANNEXE 2 : CORRELATION ENTRE DENSITE OPTIQUE ET TURBIDITE ........................ 3

Liste des abréviations

Ac : Anticorps

Ac Mo : Anticorps Monoclonaux

AU : Unité d’Absorbance

BSA : Serum Albumine Bovine

CASY : Analyseur et compteur de cellules (Cell counter and analyser System)

¢ : Cellules

CHO : Cellule d’ovaire de hamster doré (Chinese Hamster Ovary)

DO : Densité Optique

DSP : Procédé de purification (Down Stream Process)

DTT : DiThioThréitol

ELISA : Dosage d’immunoabsorption par enzyme liée (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Fc : Fraction Cristallisable

Fab : Fragment liant l’antigène (Fragment Antibody Binding)

Gln : Glutamine

HPLC : Chromatographie liquide à haute performance (High-performance Liquid Chromatography)

HR : Humidité relative

NTU : Unité de néphélométrique de turbidité (Nephelometric Turbidity Unit)

PBS : Tampon phosphate (Phosphate Buffered Saline)

P : Pression

PM : Poids Moléculaire

Pmax : Pression maximale

USP : Procédé de production (Upstream process)

UF/DF : Ultra-Filtration/Dia-Filtration

Rpm : Rotation Par Minute

SDS-PAGE : Electrophorèse en gel polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (Sodium

Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

TMB : 3,3´,5,5´-TetraMéthylBenzidine

- 1 -

I. Présentation de l’entreprise

La société iDD biotech, basée à Dardilly (France) a été créée en Mai 2008, à l'initiative d'Hélène

Rouquette (Présidente) en collaboration avec Claudine Vermot-Desroches, (Directrice R&D), par la

reprise du groupe de R&D de la société OPi-EUSA. iDD biotech poursuit ainsi un travail de

génération et de caractérisation d’anticorps monoclonaux (Ac Mo) innovants à visée thérapeutique

humaine, dérivant de la banque d'Ac Mo murins, propriété d’iDD biotech (1000 hybridomes, 75

spécificités).

iDD biotech est constituée d’une équipe scientifique de chercheurs, attachés de recherche, techniciens

spécialisés en biologie moléculaire, en immunologie ou en procédés de bioproduction. Elle dispose de

tous les équipements et appareillages nécessaires aux travaux de R&D de la société, qui sont

rassemblés dans un laboratoire de 300 m². Cette équipe dispose également du soutien logistique et de

l’engagement financier de sociétés « sœurs », iDD-Tech et Bio-Optisis.

Le marché des protéines recombinantes (protéines thérapeutiques, vaccins recombinants et Ac Mo) a

représenté 30 milliards de dollars en 2008 après une croissance de 14% en 2006 et 20% en 2008. Les

Ac Mo représentent 31 % des protéines recombinantes commercialisées, soit plus de 10 milliards de

dollars. A fin 2008 le nombre d’anticorps et dérivés en développement clinique (ayant atteint au moins

la phase I) est évalué à entre 200 et 300 [La Merie, 2009].

Parmi les anticorps les plus vendus, le rituximab (Genentech), produit actuellement indiqué pour le

traitement des Lymphomes non Hodgkiniens, représente un chiffre d’affaires de 3,9 milliards de

dollars. Le bévacizumab, nom commercial Avastin, commercialisé par Genentech-Roche, a généré un

chiffre d’affaires en 2007 de 4,2 $ milliards. Ces revenus pourraient doubler d’ici 2011 en fonction

des cancers pour lesquels son efficacité sera prouvée [La Merie, 2009].

Les développements initiés par iDD biotech ont pour vocation de générer des candidats médicaments

susceptibles d’alimenter le pipeline des industries pharmaceutiques. Ils s'articulent autour de plusieurs

axes complémentaires :

Développer des Ac d'immunothérapie dans des indications majeures et conclure des accords

avec des sociétés pharmaceutiques pour leur développement ultérieur,

Développer et commercialiser de façon indépendante des Ac thérapeutiques pour certains

marchés ciblés,

Développer une structure de bio-production afin d’assurer les étapes précliniques et cliniques,

Licencier des anticorps issus de sa banque propriétaire à des sociétés intéressées pour générer

des revenus à court et moyen termes.

- 2 -

iDD biotech a ainsi pour finalité de proposer aux industriels du médicament un potentiel de molécules

innovantes dans le domaine de l’oncologie, des maladies auto-immunes, infectieuses, cardio-

vasculaires, métaboliques ou neuro-dégénératives.

Ces programmes de R&D s’appuient sur des réseaux académiques et hospitalo-universitaires et la

collaboration avec d’autres structures industrielles. iDD biotech focalise ses ressources humaines et

ses moyens financiers sur trois programmes, labélisés par le pôle de compétitivité Lyon-Biopôle :

Le programme GLIADYS, a pour objectif de générer des AcMo adaptés au traitement des

gliomes, afin de limiter la prolifération tumorale et les récidives. Différents formats d'Ac

seront développés tels que des Ac fonctionnels, ou conjugués à des drogues ou radio-isotopes.

Le programme PRAVIC a visé le développement d'AcMo à propriétés fonctionnelles

optimisées ciblant entre autres certains cancers viro-induits. Ce programme maintenant achevé

est poursuivi à travers le programme IPROMAH dont les enjeux sont l’établissement de la

preuve de concept in vivo et l’établissement de procédés de production compatibles avec un

futur développement industriel.

II. Introduction

Trente ans après leur invention par César Milstein et Georges Köhler, les Ac Mo sont devenus de réels

outils thérapeutiques. De nombreux travaux menés ces deux dernières décades ont visé à l'obtention

d’Ac Mo de seconde ou de troisième génération, possédant des affinités élevées, moins immunogènes

et ayant de meilleures fonctions effectrices. Depuis 1995, plus de 21 bio-médicaments fondés en tout

ou en partie sur des anticorps (fragments Fab, anticorps nus et anticorps conjugués, protéines de

fusion à portion Fc d’IgG) ont obtenu une autorisation de mise sur le marché [La Merie, 2009].

Ces nouveaux bio-médicaments ont bouleversé la prise en charge des patients, pour des maladies aussi

diverses et invalidantes que : la polyarthrite rhumatoïde (infliximab, étanercept, adalimumab,

rituximab), la maladie de Crohn (infliximab, adalimumab), l’asthme (omalizumab), la sclérose en

plaques (natalizumab), la dégénérescence maculaire liée à l’âge (ranibizumab)…

Les Ac Mo murins issus de la clonathèque d’iDD biotech font l’objet d’ingénierie moléculaire afin de

disposer d’Ac Mo chimériques ou humanisés, en fonction de l’application thérapeutique ciblée.

L’obtention de données expérimentales in vitro & in vivo (preuve de concept), le développement de

bioprocédés de production ainsi que l’acquisition d’une propriété intellectuelle représentent les

objectifs majeurs d’iDD biotech dans chacun de ses projets.

A terme, iDD biotech disposera de plateformes pluridisciplinaires complémentaires

(cf fig 1), plateformes permettant :

- le criblage et la sélection de candidats (2008-…)

- l’ingénierie des Ac Mo via la chimérisation (2008) et l’humanisation (2010-2011)

- 3 -

- l’optimisation de la partie Fc (2009)

- la vectorisation de drogues (2010 - 2011)

- la production d’Ac Mo purifiés grade recherche (2008) puis bio-process (2009-2010)

- le développement de bioprocédés de production (2008-2011)

Figure 1 : Plateforme d’iDD-biotech

La mission que j’avais en charge durant mon stage, au sein du département de développement des

bioprocédés de production a consisté à mettre en place un procédé de clarification d’une suspension

cellulaire.

L’augmentation de la production mondiale d’Ac, 1000 kg par an en 2002 à 6000 kg (estimation) par

an en 2006 a été redue possible par les progrès des systèmes d’expression et de culture cellulaire.

(Coco-Martin, 2004). La culture de cellules de mammifères (CHO, PERC6, NSO) permet de produire

des quantités importantes de protéines recombinantes glycosylées sécrétées dans le surnageant de la

culture. (Coco-Martin, 2004 ; Savage, 1997). C’est là l’intérêt de ces outils cellulaires.

Industriellement ces cellules sont cultivées en bioréacteur, jusqu’à 10000 litres, selon différents modes

de culture. L’objectif est d’obtenir une densité et productivité cellulaire importantes gage d’une

production élevée, tout en maintenant une qualité de produit maximale.

La culture de type batch consiste à remplir le bioréacteur de milieu de culture et à l’ensemencer à

basse densité cellulaire. La croissance est maintenue aussi longtemps possible sans ajout de

nutriments, mais en contrôlant la température, le pH, l’oxygénation, seuls des auxiliaires de

production, tels que des anti-mousses, sont ajoutés pendant la culture. (Carson, 2005 ; Tokashiki &

Yokoyama, 1997). La culture de type batch est plus aisée à mettre en œuvre. Elle répond aux attentes

de nos développements initiaux, à savoir réaliser des volumes de cultures cellulaires de l’ordre de

200 litres, afin de produire la quantité d’Ac nécessaire aux étapes précliniques et cliniques. Ce mode

de culture permet de limiter la quantité de débris cellulaires, les viabilités étant meilleures, le

- 4 -

processus de purification est alors facilité (Yavorsky & al, 2003). Une culture en fed-batch débute

comme une culture en batch mais à faible volume, puis du milieu de culture frais est progressivement

ajouté tout au long de la culture, le plus souvent à un rythme croissant. Ce milieu de culture

ajouté, qui peut être le même ou différent du milieu initial, apporte les nutriments nécessaires à la

culture (Carson, 2005 ; Tokashiki & Yokoyama, 1997). Ces ajouts permettent de maîtriser le

métabolisme des cellules et d’obtenir une concentration en produit plus importante que la culture en

batch. La culture en chemostat est une culture en flux continu. La récolte a lieu, par soutirages

réguliers, au fur et à mesure de la culture. Dans le même temps, des ajouts du milieu de culture sont

réalisés. Ceci permet de pallier à l’épuisement du milieu de culture, de réduire les concentrations en

enzymes protéolytiques, à l’origine de la dégradation du produit, et en métabolites secondaires

néfastes pour la croissance des cellules. (Tokashiki & Yokoyama, 1997). Les principaux

inconvénients de ce type de culture sont un mauvais usage du milieu de culture et la faible

concentration en Ac de la solution récoltée. La purification est en conséquent rendue plus difficile. La

culture en perfusion est une variante de la culture en chemostat. La récolte a lieu, par soutirages

réguliers, de surnageant de culture acellulaire. Dans le même temps, des ajouts du milieu de culture

sont réalisés. Ce type de culture permet d’augmenter la densité cellulaire (10.106 ¢.ml

-1) la

productivité et l’usage du milieu (Tokashiki & Yokoyama, 1997).

C’est actuellement, la culture en bioréacteur en batch qui est utilisée par iDD biotech qui vise à terme

la culture de type fed-batch en bio-production.

Pour le bon avancement de ma mission, j’ai également été amenée à générer puis à travailler avec des

cultures cellulaires réalimentée produite en rollers (bouteilles roulantes).

La culture cellulaire (USP) se réalise en plusieurs temps. Pendant la phase de croissance les cellules se

multiplient intensivement. La viabilité cellulaire se maintient à des niveaux élevés. Durant cette

phase, la densité cellulaire augmente de façon exponentielle. Puis la croissance ralentit avant de

stagner. Durant cette phase stationnaire, il y autant de cellules qui se multiplient que de cellules qui

meurent. Le plus souvent c’est à ce stade que les cellules produisent de façon intensive, c’est la phase

de production. Après cette phase, les cellules mourantes sont plus nombreuses que celles qui se

divisent, la densité cellulaire commence à chuter et la viabilité cellulaire décroît de façon accélérée.

Après le choix des meilleurs clones producteurs et l’optimisation des méthodes de culture obtenir la

production d’Ac la plus importante possible passe par l’allongement des phases de croissance et de

production via la maîtrise du métabolisme des cellules. Une attention particulière est portée à la

viabilité cellulaire. En effet une mortalité trop importante des cellules entraîne une libération dans le

surnageant du contenu cytoplasmique des cellules avec pour conséquence de compliquer le processus

de purification et d’entrainer la dégradation du produit. (Yavorsky & al, 2003).

- 5 -

Après la culture cellulaire, la première étape de procédé de purification (DSP) est la clarification. La

viabilité affecte l’efficacité de cette clarification. Plus la viabilité cellulaire est faible moins son

efficacité est importante. Ceci se traduit par une augmentation de la valeur de turbidité du clarifiat

(Lammarino & al, 2007). Un compromis doit donc être trouvé entre la concentration en produit, la

densité cellulaire et la viabilité finale. Classiquement il est réalisé à environ de 70 % de

viabilité, valeur à laquelle la culture cellulaire est stoppée et le processus de purification est mis en

œuvre.

En bio-production, l’objectif des étapes de DSP est d’obtenir un titre en produit élevé, un taux de

pureté supérieur à 99 %, pour un nombre d’unité de process le plus réduit possible. Un procédé type

de production d’anticorps est composé des étapes schématisées en fig 2.

Figure 2 : Unités de process d’un « procédé type »de bioproduction d’un AcMo Les couleurs de fond représentent le zonage classiquement appliqué en zone de production afin de respecter les

recommandations des agences sanitaires et les règlementations en vigueur.

Selon les cas toutes les étapes ne sont pas toujours réalisées. Cependant l’étape de clarification qui

intervient en premier est une étape essentielle, elle retirera les cellules, les débris cellulaires, les

colloïdes et toutes autres particules solides du milieu de culture (Siwak, 2009). Cette première étape

du processus de purification est cruciale car de son efficacité dépendra en grande partie celle des

étapes suivantes, ainsi que la préservation de l’intégrité du produit. La clarification doit avoir une

efficacité maximale, un rendement élevé (supérieur à 95 %), une bonne reproductibilité. (Siwak, 2009

; Yavorsky & al, 2003). Généralement elle procède en deux phases. La première consiste à éliminer

Décongélation

Stockage à 4°C

Clarification

Amplification

Bioréacteur 20 l

Filtration 0,2 µm

Bioréacteur 200 l

Capture sur colonne de protéine A

UF/DF

Ajustement du pH

Inactivation virale

Chromatographie échangeuse de cations

UF/DF

Filtration virale

Filtration à 0,2µm

Chromatographie échangeuse d’anions

UF/DF

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les cellules entières et les débris cellulaires et la seconde les colloïdes et les autres particules ainsi que

les débris cellulaires qui n’auraient pas encore été retenus. Selon la culture et les volumes à traiter

différents moyens existent pour cette première phase (Yavorsky & al, 2003). A grande échelle (pour

des volumes supérieurs à 1000 l par lot) des technologies de décantation ou de centrifugation sont

souvent mises en œuvre (Schimer & al, 2010). Pour les volumes à traiter inférieurs à 2000 l des filtres

en profondeur peuvent être utilisés seuls ; ils présentent l’intérêt de limiter les investissements requis.

C’est cette solution qui a ici été retenue. Les mêmes technologies de filtres sont également utilisées

pour la seconde phase.

Les filtres en profondeur sont composés, dans la plupart des cas de fibres de cellulose, d’éléments

inorganiques tels que des terres de diatomées, et de polymères parfois chargés positivement. Ils sont

constitués de plusieurs de couches présentant des maillages : lâche pour la première, puis de plus en

plus resserrée. Au cours de la clarification, les particules sont capturées par tamisage mais aussi par

adsorption dans la profondeur du filtre (Yavorsky & al, 2003 ; Shukla & al, 2008).

Figure 3 : Principe de la filtration en profondeur

De part, leur mode de fonctionnement complexe il est certes important de prendre en compte les

recommandations du fournisseur, mais également d’évaluer au cas par cas l’adéquation du média à la

suspension à traiter. Contrairement à la filtration stérilisante la clarification sur les filtres en

profondeur n’obéit pas à un mode de rétention absolu mais statistique. Mon travail a consisté en

l’évaluation de diverses options de clarification en profondeur appliquées à des suspensions cellulaires

issues de culture batch réalisées en rollers ou en bioréacteur.

Au cours de mes travaux j’ai appliqué sur des filtres uniques ou montés en cascade des débits adaptés.

Afin de contrôler l’efficacité du filtre, des aliquots des filtrats ont été prélevés régulièrement au cours

de la clarification puis leur densité optique (à 600 nm) ou leur turbidité ont été mesurées 1.

Les filtres utilisés pour effectuer la clarification doivent présenter un rendement d’au moins 95 %, une

bonne reproductibilité d’usage, et être efficaces. De plus, leur capacité de clarification doit être aussi

1 Préalablement il a été vérifié qu’il y avait bien corrélation entre la densité optique et la densité cellulaire (cf. annexe1) . Pour les expériences finales une mesure de turbidité a été substituée à la mesure de la DO, après vérification de la corrélation entre ces paramètres (cf. annexe 2).

Rétention en surface

Rétention en profondeur

Rétention par adsorption

Interactions hydrophobes

Interactions de charge

Particule non retenue par le filtre

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élevée que possible. La capacité de clarification est exprimée par le volume maximal d’une

suspension donnée que peut traiter un filtre pour une pression d’entrée donnée (Yavorsky & al, 2003).

Sur la base de l’expérience déjà disponible au laboratoire, les filtres de marque Millipore et Sartorius

ont été retenus pour évaluation. Ces deux fournisseurs possèdent une grande expérience dans ce

domaine et proposent des technologies différentes. Il a donc été convenu de tester les deux types de

filtres afin de retenir la solution la mieux adaptée à nos besoins.

Ces fournisseurs proposent chacun des gammes de filtres de surfaces croissantes présentant les mêmes

propriétés. Ils peuvent être ainsi évalués à l’échelle du laboratoire (quelques centaines de

millilitres), testés en développement à l’échelle de 5-10 l, puis mis en œuvre à l’échelle de la bio-

production, pour des volumes de 200 à 2000 litres. Il est aussi possible à partir des tests réalisés en

développement, d’extrapoler les résultats pour une application industrielle en bio-production.

Les filtres de la gamme Millipore et Sartorius sont composés de fibres de cellulose combinées avec

des terres de diatomées, encapsulées dans des résines et des structures en polypropylène (Dave & al,

2009). Parmi les filtres testés au cours de cette étude, certains ne résistent pas à des pressions excédant

2 bar. Par soucis de sécurité, tous les essais de clarification ont donc été arrêtés en colmatage quand la

pression a atteint cette valeur. En bio-production, travailler à faible pression, facilite la mise en place

du processus et allège les investissements. Les pressions maximales acceptables sont alors comprises

entre 0,5 et 0,75 bar. De plus les pompes péristaltiques utilisables, pour traiter des volumes de l’ordre

de 200 litres en systèmes à usage unique ne sont pas capables, sauf exception, d’atteindre les pressions

excédant 2 bar sur une cascade de filtres.

Pour permettre une extrapolation possible des résultats, les capacités de clarification des filtres ont été

déterminées à la pression de 0,75 bar, garantissant ainsi une cascade de deux filtres n’excédant jamais

2 bar en fonctionnement normal.

Dans le but d’appréhender le mode de fonctionnement et de déterminer la capacité des filtres, la

pression exercée sur les filtres est contrôlée régulièrement. Ce paramètre permet de rendre compte du

colmatage du filtre au cours de la clarification.

Un des risques observé de l’utilisation des filtres en profondeur est le phénomène de « percement ».

Suite à l’apparition d’un chemin préférentiel, le filtre laisse ponctuellement passer des cellules ou/et

des débris cellulaires. Au cours de la clarification, la mesure de DO/turbidité de la solution en sortie

de filtre et la mesure de pression appliquée sur les filtres permettent de rendre compte d’éventuels

percements et de colmatage du filtre (Siwak, 2009). Une étape de mouillage et un débit adéquat

limitent ces phénomènes et sont indispensables au fonctionnement correct du filtre.

L’absorption du produit (Ac Mo) sur les filtres est un paramètre critique pour faire un choix de filtre.

En effet, la clarification est la première des étapes du processus de purification elle doit avoir un

rendement aussi élevé que possible, classiquement ≥ 95 %. Afin de contrôler la perte d’Ac sur les

- 8 -

filtres, des aliquots de solutions avant filtration et après filtrations ont été prélevés. Ces aliquots ont

été analysés par différents moyens tels que l’ELISA, l’HPLC, pour déterminer leur concentration en

Ac, et le SDS-PAGE. Les résultats obtenus à partir des deux premières techniques ont été utilisés pour

calculer le rendement des filtres et identifier les filtres les plus performants.

Les critères d’évaluation des filtres que nous avons retenus sont donc : une capacité élevée, une mise

en œuvre aisée, la rétention du maximum de cellules, de débris cellulaires et de colloïdes, et

l’absorption d’un minimum d’anticorps.

III. Matériels et méthodes

III.1 - Culture cellulaire

La lignée cellulaire utilisée a été établie par iDD biotech. C’est une lignée mammifère stable, dérivant

d’une lignée établie, produisant constitutivement, les chaînes lourde et légère de l’Ac Mo iDD-000 et

dont une banque a été constituée au laboratoire. Elle porte un gène de résistance à la généticine

(G418).

III.1.1 - Cultures d’entretien

Les cellules Cell 003 en culture agitée sont maintenues en Erlenmeyer ventilés, en polycarbonate, de

125 ml (Corning, réf 431143) dans 20 ml de milieu de culture Mc2 contenant 0,75 mM de glutamine

(Sigma, réf 67513), 0,1% d’acide pluronique (F68) (Invitrogen, réf 24040) et 0,3 mg.ml-1

de

généticine (Invitrogen, réf 10131). Les Erlenmeyer sont maintenus sous agitation orbitale (rayon = 16

ou 25 mm) à 130 rpm, à 37°C, et 8% CO2 sous 95% HR. Les cultures sont ainsi propagées à la densité

de 1.105 ¢.ml

-1 dans 20 ml de milieu frais, à J0 et J3 ou J4.

III.1.2 - Cultures en rollers

A partir de la culture d’entretien, une amplification est débutée à J–7. Les cellules sont ensemencées à

la densité de 1.105 ¢.ml

-1 dans un Erlenmeyer de 125 ml dans 20 ml de milieu de culture Mc2

contenant 0,75 mM de glutamine, 0,1% d’acide pluronique et 0,3 mg.ml-1

de généticine.

L’Erlenmeyer est maintenu dans les mêmes conditions que la culture d’entretien. A J-4 les cellules

amplifiées sont utilisées pour la préparation de l’inoculum : les cellules sont ensemencées dans un

roller (bouteille tournante) ventilé, en polystyrène (BD-Falcon, réf. 353068) à la densité de 1.105 ¢.ml

-

1 dans 200 ml de milieu Mc2, 0,75 mM Gln, 0,1% acide pluronique et 0,3 mg.ml

-1 de généticine. La

culture est placée à 37°C, 8% CO2 et 95% HR avec une vitesse de rotation des rollers fixée à 3 rpm

(vitesse périphérique 108 cm.min-1

). A J0, les cellules sont ensemencées à la densité de 2.105 ¢.ml

-1

dans 1200 ml de milieu Mc3, 1 mM Gln, 0,1% acide pluronique et 0,3 mg.ml-1

de généticine. La

culture est répartie dans 6 rollers (37°C, 8% CO2 et 95% HR 3 rpm vitesse 108 cm.min-1

). Une

- 9 -

réalimentation est faite à J3 par ajout de 300 ml de milieu frais (Mc3, 1 mM Gln, 0,1% acide

pluronique et 0,3 mg.ml-1

de généticine) par roller (volume final : 3000 ml).

III.1.3 - Cultures en bioréacteur

A partir de la culture d’entretien, une amplification est débutée à J–7 comme pour la culture en roller.

A J-4 les cellules amplifiées sont ensemencées dans 4 Erlenmeyers de 500 ml à la densité de

2.105 ¢.ml

-1 dans 4x 250 ml de milieu de culture Mc2, 0,75 mM de Gln, 0,1% d’acide pluronique et

0,3 mg.ml-1

de généticine. Les Erlenmeyer sont maintenus sous agitation orbitale (rayon = 16 ou

25 mm) à 130 rpm, à 37°C, et 8% CO2 sous 95% HR. A J0, les cellules sont regroupées à la densité de

3.105 ¢.ml

-1 dans 4000 ml de milieu Mc3 frais, 0,75 mM de Gln, 0,1% d’acide pluronique et

0,3 mg.ml-1

de généticine. La culture est transvasée par pompage dans un bioréacteur stérile

thermostaté à double enveloppe d’un volume utile de 5 l (Applikon, réf Z61103CT07), réglé pour

maintenir 45 % de pO2, un pH de 7,1, et une température de à 37 °C sous une agitation de type vortex

(vitesse de 80 rpm, pale de diamètre de 65 mm), les consignes de régulation sont contrôlées par un

Bio Controller ADI 1010 (Applikon) et régulées par la console Bio Console ADI 1025 par ajout de

CO2 ou de soude (0,5 M) pour la régulation du pH, par régulation de la température de l’eau circulant

dans la double enveloppe et par injection d’air en profondeur via un spargeur en « L » pour le maintien

de la pO2.

III.1.4 - Numération cellulaire

Les mesures de densité et viabilité cellulaire ont été réalisées à l’aide d’un compteur de particules

(Casy Cell Counter & Analyser System, modèle TT, Roche-Innovatis AG, Reutlingen, D) après

dilution au 1/100 (100 µl de suspension cellulaire dans 9,9 ml de solution de mesure Casyton (Roche-

Innovatis AG, réf 043-90037 P)). L’appareil procède à l’aspiration d’une aliquote de la suspension à

travers un orifice calibré pourvu d’une électrode portée à un potentiel alternatif contrôlé par l’appareil.

Pour chaque particule franchissant la cellule de mesure, l’appareil évalue la taille de la particule et son

caractère électriquement polarisable. Une cellule vivante, à la membrane intacte, sera entièrement

polarisable, une cellule morte ne présentera qu’un noyau polarisable, de plus petit diamètre. Pour les

cellules Cell 003, les mesures sont réalisées selon le « Setup 16 » ainsi : curseur bas = 4,88 µm,

curseur haut = 9,63 µm, Agg. Factor = Null. Les particules comptées entre 0 et 4,88 µm (curseur bas)

correspondent aux débris cellulaires. Les particules comptées entre 4,88 µm et 9,63 µm (curseur haut)

correspondent aux cellules mortes. Les particules de taille > 9,63 µm correspondent aux cellules

vivantes. Conformément aux conditions établies lors de la mise en place de la méthode de comptage et

retenues depuis au laboratoire, aucune correction n’est apportée pour l’agrégation des cellules. Les

mesures réalisées sont reportées sur un graphique Excel pour l’analyse sous forme d’un histogramme

liant l’effectif cellulaire au diamètre cellulaire (1024 classes équidistantes entre 0 et 50 µm).

- 10 -

L’appareil calcule le diamètre moyen des évènements considérés comme cellules vivantes

(polarisables), le diamètre cellulaire au pic de population, le pourcentage de viabilité cellulaire.

III.2 - Filtration et clarification

III.2.1 - Clarification

Différents tests de clarification ont été réalisés mettant en jeu un ou deux filtres, en une seule étape ou

en deux étapes, selon les recommandations du fournisseur. L’ensemble des tests est répertorié en fig 4.

Figure 4 : Ensemble des tests réalisés Lorsque deux filtres ont été utilisés consécutivement, ils sont figurés l’un au dessus de l’autre, non connectés. En cas d’utilisation en cascade continue, ils sont figurés l’un au dessus de l’autre connectés par une flèche traversante.

Expériences réalisées à partir de biomasse issue de bioréacteur (A, B, C, E) ou roller (D).

A : Evaluation des produits de la gamme Millipore ; B : Evaluation des produits de la gamme

Sartorius ; C : Comparaison des filtres simples de gammes différentes D et E : Evaluation de cascade de filtres.

III.2.2 - Filtres

Les caractéristiques des filtres utilisés au cours de cette étude sont regroupées dans le tableau suivant.

Tableau I : Caractéristiques des filtres utilisés

Gamme Filtres Références Surface (cm²) Bornes

Mil

lip

ore

Mil

list

ak

+®

C0HC MC0HC23HH3 23 cm² 0,2 µm – 2 µm

X0HC nd 23 cm² 0,5 µm – 0,05 µm

D0HC SG3J017A03 23 cm² 0,2 µm – 5µm

F i l t r a t i o n s t é r i l i s a n t e

Capsule Durapore * SVGLA7H 17 cm² taille de pores de 0,2 µm

Capsule MILLEX GV * SLGV033RB 5 cm² taille de pores de 0,2 µm

Sa

rto

riu

s

Sa

rto

cle

ar

®

PB1 295PB1P13ACFF--M 25 cm² 4 – 11 µm

PB2 295PB2P13ACFF--M 25 cm² 1 – 8 µm

F i l t r a t i o n s t é r i l i s a n t e

Sartopore 2 5445307HS--HH--M 13 cm² Première membrane : 0,45 µm

Seconde membrane : 0,2 µm

* Ces deux capsules comportent la même membrane Durapore sous 2 surfaces de filtration différentes. La capsule de surface de 5 cm² a été parfois

utilisée afin de réduire les volumes engagés pour les tests.

B.

PB2 PB1

C.

PB2

Sartopore 2

0,2 µm

D0HC

Capsule Millex

GV 0,2 µm

D.

X0HC

D0HC x2 PB1

PB2

A.

C0HC

Capsule Durapore

0,2 µm

D0HC

X0HC

Capsule Millex

GV 0,2 µm

E.

Capsule Millex

GV 0,2 µm

X0HC

D0HC x2 PB1

PB2

Sartopore 2

0,2 µm

- 11 -

III.2.3 - Dispositif et méthodologie

Les essais de clarification ont été réalisés à l’aide du dispositif suivant.

Figure n°5 : Schéma du dispositif expérimental

La culture est progressivement appliquée à travers le ou les filtres à un débit constant ajusté en

fonction de la surface des filtres.

La pompe péristaltique Masterflex (mod. 77201-60, tête à quatre galets mod. 7523-70, tuyaux silicone

réf 96410-16), applique un débit à faible niveau pulsatoire de 6 ml.min-1

pour les essais de

clarification, ou 1 ml.min-1

.cm-² de filtre pour les filtrations stérilisantes. L’agitateur magnétique et les

manomètres permettant le relevé de valeur des pressions exercées au cours de la filtration font partie

intégrante du système Labscale TFF Millipore. Une balance Sartorius (CPA 3400 1P, 22608342) est

utilisée pour suivre la masse de la solution filtrée ou clarifiée au cours de la filtration.

Le suivi de la masse au cours de la filtration, permet de surveiller le débit réel cumulé par cm² sur la

base d’une densité de 1 g.ml-1

. Ces données seront rapprochées des densités optiques (ou turbidité) et

des pressions relevées au cours du temps pour obtenir des données en fonction du volume normalisé

de culture appliqué par centimètre carré de filtre.

Des échantillons sont prélevés avant et après filtration. Ils sont centrifugés à 3040 g pendant 5 min

puis les surnageants sont prélevés pour dosage de l’Ac ou analyse SDS-PAGE.

III.3 - Techniques d’analyse

III.3.1 - Spectrophotomètrie et turbidimétrie

Spectrophotométrie : Des aliquots de 1 ml de filtrat, ont été prélevés toutes les 3 min et les DO

ont été directement mesurées à 600 nm par un spectrophotomètre (Pharmacia Biotech, mod

Ultrospec1000). Les cultures initiales ont été évaluées de la même manière.

Culture cellulaire

Mesure de la pression à

l’entrée du filtre

Mesure de la pression à

l’entrée du filtre

Mesures régulières de turbidité ou

de DO à 600 nm

Solution clarifiée

- 12 -

Turbidimétrie : Des aliquots de 13 ml de la solution en sortie de filtre, ont été prélevés toutes

les 10 min et les turbidités ont été mesurées directement par un turbidimètre (AQUA LYTIC, AL

250T-IR). Les cultures initiales sont évaluées de la même manière.

III.3.2 - Mesure de la concentration en Ac par ELISA

Les puits d’une plaque Maxisorp (Nunc, réf 468667) sont incubés à 4°C pendant une nuit, avec 100 µl

d’une solution d’anticorps polyclonaux de chèvre dirigés contre la chaîne humaine kappa de l’Ac

d’intérêt (Bethyl, réf A80-115A), dilué à 5 µg.ml-1

par du tampon PBS 1x (préparé à partir d’une

solution mère PBS 10x (Invitrogen, réf. 70013-016) et de l’eau purifiée). Les puits sont lavés à deux

reprises avec la solution de lavage composée de 0,05 % Tween®

20-eau distillée (v/v) (Sigma, réf

P3563-10PAK). La saturation de la plaque est achevée en incubant les puits pendant 2 h, à

température ambiante dans 200 µl d’une solution de BSA-PBS 1x 5 % (Sigma, réf 03803-1KG) (m/v).

Les plaques sont à nouveau lavées 2x avec la solution de lavage puis séchées 2 à 3 h à l’obscurité et à

température ambiante.

Un anticorps standard OPR003 (50 µg.ml-1

) est utilisé pour réaliser deux gammes d’étalon et comme

contrôle positif Ac purifié (15 µg.ml-1

). Un Ac contrôle positif dilué dans le milieu de culture est

également inclus (15 µg.ml-1

).

20 µl d’échantillons sont dilués au 1/10 dans 180 µl de BSA-PBS 1x 5%, dans les premiers puits, puis

des dilutions en cascade au ½ sont réalisées (n = 7x) couvrant ainsi la gamme de dilution de 1/10 à

1/1280. Selon l’objectif de l’expérience, les échantillons sont déposés en simple, en double ou en triple.

Après incubation 1 h à température ambiante. Les puits sont vidés puis lavés (2x 200 µl) avec la

solution de lavage. 100 µl d’une dilution au 1/80000 d’Ac secondaire couplé à la peroxydase sont

introduits dans chaque puits et incubés 1 h à température ambiante. La plaque est à nouveau vidée et

lavée (2x 200 µl) avant d’être incubée avec la solution de TMB (Interchim, réf UP664782) pendant 5

à 10 min. La réaction enzymatique est arrêtée par ajout d’acide sulfurique 1N (Merck, réf HC939390).

Les DO des divers puits sont ensuite lues à l’aide d’un lecteur de plaque MrxII (DYNEX

Technologies réf 20100) à la longueur d’onde de 450 nm. Les valeurs obtenues sont corrigées de

l’absorbance des blancs et une régression de type log/lin (concentration/OD) est appliquée.

III.3.3 - Dosage des anticorps par HPLC

L’analyse HPLC est réalisée au sein de la société d’iDD Tech. Les aliquots de solutions destinés à être

filtrés et de solution filtrée, sont analysés. Les échantillons (200 µl) sont injectés sur une colonne de

Protéine G (POROS G-20, réf 102-00) équilibrée dans le PBS 1x. Après lavage par 4 ml de PBS 1x

(2 ml.min-1

) l’élution procède par 8 ml de tampon phosphate acide (pH2). La détection de l’Ac élué se

- 13 -

fait en UV à 280 nm. Une gamme étalon est réalisée avec une solution standard (1 à 50 µg d’Ac), les

aires des pics d’échantillons sont intégrées et analysées relativement à la gamme.

Les résultats de la quantification sont reportés en µg.ml-1

d’AcMo standard. Ceci conduit à une

estimation de la perte d’Ac par surface de filtre et aux rendements des filtres.

III.3.4 - Gel SDS-PAGE

Les échantillons (25µl, non dilués) sont additionnés de 5µl de solution de dénaturation (DTT

50 mM, 1x XT sample buffer) préparée à partir de la solution stock 4x, (Biorad, réf 161-

0791), vortexés brièvement, dénaturés par chauffage (5 min, 95°C) et stockés sur glace jusqu’au

chargement (30 µl) sur gel Criterion XT (Biorad, réf 345-0124). Un marqueur de poids moléculaires

(250 kDa – 10 kDa) Precision plus protein Dual color (Biorad, réf. 161-0374) est également dénaturé

et chargé (5 µl). Le gel est développé (200 V constants, 55 min) en tampon 1xT MOPS (préparé à

partir de solution stock 20x, Biorad réf 161-0788). Le gel est démoulé, rincé à l’eau purifié et coloré

75 min dans une solution de bleu de Coomassie (Biorad réf 161-0786) Le gel est alors successivement

décoloré dans 3x 200 ml d’eau purifiée et photographié pour archivage des données.

IV. Résultats

IV.1 - Conditions de cultures

Une numération de la culture cellulaire est effectuée le jour de la clarification. L’absorbance ou la

turbidité de la culture cellulaire de départ sont également déterminées. Pour la culture en rollers la

densité finale obtenue était de 2,4.106 ¢.ml

-1, la viabilité cellulaire était de 75 % et les turbidités

initiales entre 355 et 363 NTU. Pour les cultures en bioréacteur les densités finales sont comprises

entre 1,2.106 ¢.ml

-1 et 2,8.10

6 ¢.ml

-1, les viabilités entre 61 et 72 % et les débris cellulaires entre

3,8.105 ml

-1 et 9,6.10

5.ml

-1, les densités optiques initiales entre 0,430 et 0,571 AU pour les premières

expériences, pour les dernières les turbidités initiales étaient comprises entre 150 et 237 NTU.

- 14 -

IV.2 - Clarification

IV.2.1 - Comparaison de filtres d’une même gamme

IV.2.1.1 - Gamme Millipore

Figure 6 : Evaluation des filtres de la gamme Millipore à partir d’une culture issue de bioréacteur A : Absorbance résiduelle du filtrat en fonction du volume de culture par cm² de filtre ; B : Pression en fonction du volume

cumulé de culture clarifiée par cm² de filtre.

Les valeurs de DO en sortie de filtre C0HC restent faibles jusqu’à achèvement de la clarification

tandis que pour le filtre D0HC la DO augmente progressivement avec la pression2. Les DO observées

en sortie de filtre X0HC restent de faibles valeurs avec un pic transitoire (à 0,1 AU à 60 ml.cm-²).

Au cours de la clarification sur C0HC la pression commence à augmenter à 47 % en volume de la

capacité de clarification (43 ml.cm-²) tandis que sur le filtre D0HC elle commence à augmenter à 60 %

en volume de sa capacité (96 ml.cm-²). Pour le filtre X0HC, la pression augmente peu, elle est de

0,7 bar en fin de la clarification.

La capacité de clarification du filtre C0HC, pour une pression de 0,75 bar, est de 43 ml.cm-² tandis

que celle de D0HC est de 96 ml.cm-² à la même pression. Pour le filtre X0HC il n’est pas possible de

calculer la capacité du filtre, la pression finale n’ayant pas atteint le seuil de 0,75 bar avant épuisement

du surnageant disponible.

Figure 7 : Evaluation des filtres Millex GV et la capsule Durapore (Gamme Millipore)

2 La nature double de la courbe des DO observée pour l’essai de clarification sur D0HC, n’est pas définitivement expliquée, elle est peut être liée à un artéfact spectrophotométrique (positionnement de la cuvette).

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 20 40 60 80 100 120

DO

à 6

00

nm

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Absorbance en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtre

filtre DOHC filtre COHC filtre XOHC

A

.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtre

filtre DOHC filtre COHC filtre XOHC

B

.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

Pre

ssio

n (

Bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtre

Millex GV Capsule Durapore

- 15 -

Toute la solution issue de la clarification sur C0HC a été filtrée à 0,2 µm sur une membrane Durapore,

la pression augmente de façon quasi-exponentielle jusqu’à une valeur de 2 bar ; tandis que pour la

solution issue de la clarification sur D0HC la pression est restée nulle, durant la filtration stérilisante.

IV.2.1.2 - Gamme Sartorius

Figure 8 : Evaluation des filtres de la gamme Sartorius à partir d’une culture issue de bioréacteur A : Absorbance résiduelle du filtrat en fonction du volume de culture par cm² de filtre ; B : Pression en fonction du volume

cumulé de culture par cm² de filtre.

Les valeurs absolues de DO mesurées en sortie de filtre PB1 sont plus basses que celles mesurées en

sortie du filtre PB2. Des excursions transitoires de la DO du filtrat sont observées sur le filtre PB1 (69

et 100 ml.cm-²). Ceci qui n’est pas observé sur le filtre PB2.

Une augmentation de pression sur le filtre PB2 est mesurable dès le début de la clarification ce qui

n’est pas le cas du filtre PB1 pour lequel la pression reste nulle sur la premier quart de la clarification

avant de croitre progressivement. La Pmax est supérieure à 2 bar sur PB2 (1 bar sur PB1).

Le filtre PB1 et PB2 ont respectivement des capacités de 102 ml.cm-² et de 49 ml.cm

-² à P = 0,75 bar.

IV.2.2 - Comparaison de deux gammes de filtres

IV.2.2.1 - Filtres simples

Figure 9 : Evaluation des filtres PB2 et D0HC à partir d’une culture issue de bioréacteur A : Absorbance en fonction du volume de culture par cm² de filtre ; B : Pression en fonction du volume cumulé de culture

par cm² de filtre.

-0,05

-0,04

-0,03

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 20 40 60 80 100 120 140

DO

à 6

00

nm

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Absorbance en fonction du volume culture par unité de

surface de filtre PB1 PB2

A.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

Pre

ssio

n (

Bar

)

Volume de culture passé par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtrePB1 PB2

B.

A.

-0,015

-0,01

-0,005

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 10 20 30 40 50 60 70 80DO

à 6

00

nm

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Absorbance en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtrePB2 D0HC

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtrePB2 D0HC

B.

- 16 -

Les valeurs absolues d’absorbances mesurées en sortie de filtre PB2 sont groupées et comprises entre

0,001 et 0,005 à l’exception de deux excursions à 0,006 et -0,011 AU. Celles mesurées en sortie du

filtre D0HC sont plus étalées, comprises entre 0,001 et 0,022.

Après une phase de stabilité à pression quasi nulle, pour les deux filtres le profil d’évolution de

pression est de type quasi exponentiel sans plateau final observable. Les filtres se colmatent

progressivement au cours de la clarification.

Les filtres D0HC et PB2 présentent respectivement une capacité de 65 et de 32 ml.cm-² à P = 0,75 bar.

Figure 10 : Filtration à 0,2 µm sur membrane Durapore et Sartopore 2

En cours de filtration à 0,2 µm de la solution préalablement clarifiée sur le filtre D0HC, la pression

augmente quasi-linéairement, et ce dès le début de la filtration sur membrane Durapore, tandis qu’elle

reste constamment nulle pour la filtration sur la membrane Sartopore 2 de la solution issue de la

clarification sur le filtre PB2. Dans ces conditions, la capacité de filtration mesurée de la membrane

Sartopore 2 (70 ml.cm-²) est supérieure à celle de la membrane Durapore (34 ml.cm

-²).

IV.2.2.1 - Filtres en cascades

Figure 11 : Evaluation des cascades de filtres PB1-PB2 et D0HC-X0HC sur une culture produite en rollers A : Turbidité en fonction du volume de culture traité par unité de surface de filtre ; B : Pression en fonction du volume de

culture traité par unité de surface de filtre.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume passé par unité de surface de

filtreDurapore Sartopore 2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50 60

Tu

rbid

té (

NT

U)

Volume de culture passé par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Turbidité en fonction du volume de culture passé par unité de

surface de filtre

D0HC-X0HC PB1-PB2

A.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture passé par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtre

Filtre D0HC Filtre X0HC Filtre PB1 Filtre PB2

B.

Changement

de filtre

- 17 -

Les filtres D0HC et X0HC ont été montés en série afin de réaliser en cascade la clarification

d’une culture cellulaire produite en rollers (2,4.106

¢.ml-1

, viabilité 75 %). Un premier filtre D0HC a

été le filtre limitant au cours de cette clarification il a alors été remplacé par un second filtre D0HC du

même lot toujours en amont du même et unique X0HC. La pression exercée sur le premier filtre

D0HC, reste nulle sur 49 % de sa capacité (21 ml.cm-² pour P ≤ 0,75 bar) avant d’augmenter selon un

profil quasi-exponentiel. Cette augmentation reflète le colmatage de ce filtre.

Le second filtre D0HC commence à se colmater dès le début de la clarification dans le même temps,

la pression à l’entrée du filtre X0HC augmente (pour atteindre une valeur finale de 0,25 bar) et les

valeurs de turbidités observées sont plus faibles. En présence d’une contre-pression, la cascade retient

mieux les cellules et débris cellulaires.

Pour la cascade de filtre PB1-PB2, la pression à l’entrée du filtre PB1 reste nulle sur 26 % de

la clarification. Puis le filtre se colmate progressivement. La capacité de la cascade pour la valeur

seuil de pression est de 36 ml.cm-². La pression à l’entrée du filtre PB2 reste nulle sur 97 % de la

clarification puis s’accroît progressivement jusqu’à valeur finale enregistrée (de 0,1 bar).

Figure 12 : Evaluation des cascades de filtre PB1-PB2 et D0HC-X0HC à partir d’une culture issue

de bioréacteur A : Turbidité du clarifiat en fonction du volume cumulé de culture par cm² de filtre ; B : Pression en fonction du volume de culture traité par cm² de filtre.

Pour la cascade de filtre D0HC-X0HC, un premier filtre D0HC (amont) a été le filtre limitant.

Il s’est colmaté progressivement jusqu’à présenter une valeur de contre pression Pmax de 2 bar, la

pression exercée sur le filtre X0HC (aval) est restée faible 0,2 bar << Pmax. Un second filtre D0HC

du même lot a donc été utilisé en remplacement toujours sur le même et unique X0HC, comme pour la

clarification précédente. Les capacités à Pmax = 0,75 bar des deux filtres D0HC se montent à

28 ml.cm-². Celle de X0HC est supérieure à 56 ml.cm

-², il n’est pas possible de la déterminer

précisément, la pression finale exercée sur filtre étant de 0,2 bar seulement. Les valeurs de turbidités

en sortie de cascade sont groupées et comprises entre 0,137 et 1,43 NTU.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tu

rbid

ité

(NT

U)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Turbidité en fonction du volume de culture par unité de

surface de filtrePB1-PB2 D0HC-X0HC

A.

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture passé par unité de

surface de filtre

Filtre PB1 Filtre PB2 Filtre D0HC Filtre X0HC

B.

Changement

de filtre

- 18 -

Pour la cascade PB1-PB2, la pression exercée sur le filtre PB1 est restée nulle sur 50 % de sa

capacité (de 46 ml.cm-² à P ≤ 0,75 bar), avant d’augmenter. L’évolution de la pression exercée sur le

filtre PB1 présente un premier plateau à une valeur de pression de 1 bar avant de reprendre sa

croissance pour atteindre une valeur finale de 1,7 bar. La pression exercée sur le filtre PB2 reste nulle

sur l’ensemble de la clarification. Les valeurs des turbidités en sortie de cascade sont groupées et

comprises entre 0,160 et 3,54 NTU à l’exception d’une excursion à 13 NTU, reflet d’un percement

ponctuel du filtre (49 ml.cm-²).

Figure 13 : Evaluation de la membrane Durapore sur de différents produits de clarification. Evaluation de la

membrane Sartopore 2

La pression exercée en amont de la membrane Durapore au cours de la filtration du produit de

clarification de la cascade PB1-PB2 augmente dès le début de la filtration et culmine à 1,8 bar pour

une capacité de 26 ml.cm-².

La pression en amont de la membrane Sartopore 2 au cours de la filtration du produit de clarification

par la cascade PB1-PB2, reste nulle sur 34 % de la capacité du filtre (188 ml.cm-², à P ≤ 0,75 bar)

avant d’augmenter de façon quasi-linéaire pour atteindre une valeur finale de 1,05 bar. La filtration

n’a pas été menée à son terme (à Pmax = 2 bar), par manque de surnageant.

La pression en amont de la membrane Durapore, au cours de la filtration d’un produit clarifié par la

cascade de filtres D0HC-X0HC est constante à une valeur de 0,3-0,4 bar sur 85 % de la capacité de la

membrane Durapore (261 ml.cm-², P ≤ 0,75 bar), cette pression croît ensuite de façon quasi-

exponentielle pour atteindre une valeur de 2 bar.

IV.3 - Quantification

Tableau 2 : Rendements des filtres et calcul de la perte d’Ac par unité de surface de filtre

Rendements Pertes par cm² de filtres

Filtres ELISA HPLC ELISA HPLC

C0HC 71 % 80 % 370 µg.cm-² 270 µg.cm-²

Durapore (*) (*) (*) (*)

D0HC 90 % (*) 250 µg.cm-² (*)

0,75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 50 100 150 200 250 300 350

Pre

ssio

n (

bar

)

Volume de culture par unité de surface de filtre (ml.cm-²)

Pression en fonction du volume de culture passé par unité de

surface de filtre

Sartopore 2 Durapore (filtrat D0HC-X0HC) Durapore (filtrat PB1-PB2)

- 19 -

Rendements Pertes par cm² de filtres

X0HC (*) 85 % (*) 340 µg.cm-²

Durapore (*) 99 % (*) 6 µg.cm-²

PB1 (*) 82 % (*) 560 µg.cm-²

PB2 (*) 90 % (*) 130 µg.cm-²

D0HC (*) nd (*) nd

Durapore (*) nd (*) nd

PB2 75 % nd 100 µg.cm-² nd

Sartopore 2 99 % nd 12 µg.cm-² nd

PB1-PB2 98 % 85 % 18 µg.cm-² 210 µg.cm-²

D0HC-X0HC (*) 78 % (*) 300 µg.cm-²

PB1-PB2 93 % nd 60 µg.cm-² nd

Sartopore 2 (*) nd (*) nd

D0HC-X0HC 97 % nd 18 µg.cm-² nd

Durapore (*) nd (*) nd * Rendements calculés supérieurs à 100%.

Pour les filtres de la gamme Millipore, le rendement du filtre C0HC est compris entre 71 et

80 %, tandis que celui des filtres D0HC et X0HC est respectivement de 90 et 85 %. Il y a plus de

pertes d’Ac en utilisation du filtre simple C0HC par rapport à l’utilisation d’une cascade D0HC suivi

de X0HC. La perte d’Ac sur la cascade D0HC-X0HC est très variable et comprise entre 18 et

300 µg.cm-². Pour les filtres de la gamme Sartorius, PB1 présente un rendement de 82 %, inférieur à

celui de PB2 (90 %). Montés en cascade ces filtres présentent un rendement de 93 à 98 %.

IV.4 - SDS-PAGE

Figure 14 Analyse SDS-PAGE d’échantillons de clarification

Noter que la numérotation procède de droite à gauche. Colonne 1 et 10, marqueurs de PM (250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20 et 10 kDa de haut en bas). Colonnes 2 et 3 : culture

cellulaire initiale issue de bioréacteur (brute et diluée au 1/5, 25µl). Colonne 4 : Surnageant de culture acellulaire initiale

centrifugée, issue de bioréacteur (brut, 25µl). Colonnes 5 et 6 : Culot cellulaire issu de 25 µl de culture initiale de

bioréacteur, brut et dilué au 1/5). Colonnes 7, 8 et 9 : AcMo contrôle (OPR-003), (1 µg, 500 ng et 250 ng respectivement).

Colonnes 11 à 14 : Filtration en cascade ; Colonne 11 : Surnageant de culture acellulaire initiale centrifugée, issu de

bioréacteur (25µl). Colonne 12 : Clarifiat issu de cascade PB1+PB2 (25µl). Colonne 13 : Filtrat issu de filtration sur

membrane Sartopore 2 (0,45 + 0,2 µm) (25µl) ; Colonne 14 filtrat issu de filtration sur membrane Durapore (0,2 µm)

(25 µl).

11 3 14

13 12 10 9 8 7 6 5 4 2 1

Taille (kDa)

250

150

100

75

50

37

25

20

10

Chaine lourde

Chaine légère

- 20 -

Les chaine lourde, à ~ 50 kDa et légère à ~ 25 kDa sont présentes dans le contrôle positif (1 µg)

(colonne 7). Ces mêmes polypeptides sont également présents aux mêmes masses moléculaires dans

la culture cellulaire initiale (colonne 2). Pour la culture cellulaire dilué au 1/5

ème (colonne 3), aucune

bande n’est observée du fait de la dilution. Dans le surnageant de la culture cellulaire (colonne 4), les

deux bandes caractéristiques des deux chaines de l’Ac sont détectées tandis qu’elles ne le sont pas

dans l’échantillon de culot cellulaire repris (colonne 5). Pour tous les échantillons de la clarification

en cascade, les deux chaînes sont présentes. Il n’y a pas de différence observable entre les deux

filtrations stérilisantes (colonnes 13 et 14) ni dans l’intensité ni dans la position des bandes observées.

V. Discussion

Les anticorps sont devenus des outils thérapeutiques efficaces pour un grand nombre de maladies. Ils

tiennent une place primordiale dans l’industrie biopharmaceutique. Dans le cadre des développements

d’iDD biotech, des cultures à grandes échelles de cellules de mammifères, seront utilisées pour la

production de ces biomolécules. Pour purifier les Ac sécrétés dans le milieu de culture il est

nécessaire, dans un premier temps d’éliminer la biomasse cellulaire.

Aux échelles de travail finales envisagées par iDD biotech, à ce jour, (200 l), les technologies reposant

sur la centrifugation en continue ne sont pas économiquement envisageables. Les filtres frontaux

plissés, bien que performants pour la rétention des cellules et débris cellulaires ne le sont pas en ce qui

concerne la rétention des colloïdes, contaminant également des cultures cellulaires brutes. La micro

filtration à flux tangentiel est également une technique performante avec une efficacité de clarification

pouvant atteindre 99,5 % (Yavorsky & al, 2003). Elle requiert cependant de lourds investissements et

accroît la lyse cellulaire et les contaminations initiales.

Pour effectuer la clarification c’est donc l’utilisation de filtres en profondeur qui a été retenue par iDD

biotech.

Les offres commerciales de deux fournisseurs disposant de gammes extrapolables en condition

cBPF, Millipore et Sartorius ont été étudiées. Puis des essais de clarification ont été réalisés en

utilisant leurs produits en filtres simples ou configurés en série, conformément à leur

recommandations et à nos besoins estimés (cf fig 4)

Dans le but de caractériser le mode de fonctionnement des filtres, différents paramètres ont été

contrôlés :

- la DO (ou la turbidité), reflet de fuites ponctuelles ou continues du filtre

- la pression exercée sur les filtres, reflet du colmatage du filtre

La filtrabilité de la solution clarifiée et les rendements des filtres ont également été évalués pour

permettre le choix final du (ou des) filtre(s).

- 21 -

Les filtres de la gamme Millipore destinés à l’usage unique (C0HC) ou en cascade (D0HC, X0HC)

ont d’abord été évalués. Au cours de la clarification sur le filtre C0HC les valeurs d’absorbance de la

solution clarifiée sont comprises 0 et 0,007 AU (cf fig 6A) soit un maximum de 1,2 % de la DO

initiale (0,571 AU). Pour une capacité de 43 ml.cm-² à P ≤ 0,75 bar, ce filtre effectue une clarification

efficace. Toute la solution issue de cette clarification, a pu être traitée sur la membrane Durapore qui

est bien adaptée à sa tâche, dans les conditions de cet essai (cf fig 7).

Pour la clarification sur les filtres D0HC suivi de X0HC, le filtre D0HC présente une capacité de

96 ml.cm-² (à P ≤ 0,75 bar). La pression exercée à la surface du filtre X0HC atteint un maximum de

0,7 bar (cf. figure 6B). Ce filtre commence à se colmater bien après le filtre D0HC ; il n’est pas

limitant et est bien adapté à sa tâche. Il est probable que le filtre X0HC a lui été utilisé en dessous de

sa capacité maximale. La capacité de la membrane Durapore a été déterminée comme supérieure à

120 ml.cm-², sans que la saturation n’ait finalement été atteinte. Ce point se situe nettement au-delà de

sa capacité (68 ml.cm-²) quand elle est utilisée après clarification sur le filtre C0HC (cf fig 7).

Les absorbances mesurées en sortie de filtre D0HC varient de 0 à 0,06 AU et sont significativement

plus élevées que celles mesurées en sortie de filtre C0HC (de 0 à 0,007, cf. figure 6A). En sortie du

filtre X0HC les absorbance mesurées varient de -0,007 à 0,004 (avec un pic à 0,1 indicatif d’une fuite

à caractère très ponctuel n’affectant pas l’efficacité globale de ce filtre). Ceci est cohérent avec les

bornes relatives annoncées par le fabricant : [0,2 - 5µm] pour le filtre D0HC et [0,05 - 0,5 µm] pour le

filtre X0HC.

Globalement le filtre C0HC retient plus d’éléments absorbant à 600 nm que le filtre D0HC, au prix

d’une capacité globale beaucoup plus réduite. Utilisés consécutivement les filtres D0HC/X0HC

présentent une capacité de filtration (96 ml.cm-²) presque deux fois plus importante que le filtre

C0HC (43 ml.cm-²).

La filtration stérilisante suivant le filtre C0HC s’achève à 2 bar de pression. Celle appliquée après le

couple D0HC/X0HC s’achève, sans qu’il y ait eu augmentation de pression (cf fig 7).

Il pourrait paraître intéressant d’utiliser deux filtres C0HC configurés en parallèle pour arriver à une

capacité équivalente à celle du couple D0HC/X0HC, avec un débit double et donc un important gain

de temps à l’utilisation. Cependant, la filtration à 0,2 µm sur une membrane Durapore se ferait alors

dans des conditions beaucoup plus désavantageuses avec un surface nécessaire plus que doublée et un

coût accru.

L’association D0HC/X0HC/Durapore 0,2 µm, est donc plus performante que l’association

C0HC 2 x/Durapore pour cette culture cellulaire. D’autant plus qu’il y a moins de perte d’Ac par

surface de filtre pour D0HC suivi de X0HC (250 et 340 mg.cm-²) que pour le filtre C0HC (270 à

370 mg.cm-²) (cf. tableau 2).

- 22 -

Au cours des essais de clarification sur les filtres de la gamme Sartorius (cf fig 8), les valeurs

d’absorbance de la solution en sortie du filtre PB1 sont plus basses (de 0,003 à -0,045 AU avec des

pics ponctuels 0,032 et 0,036 AU) que celles observées en sortie de PB2 (de -0,014 à 0,007) (cf fig

8A). Or le filtre PB2, plus resserré de [1-8 µm] devrait retenir plus d’éléments turbides que le PB1 [4-

11 µm]. Cette observation pourrait s’expliquer par un artéfact de la mesure spectrophotométrique déjà

observé dans d’autres circonstances ou par une rétention différentielle de certains éléments de la

suspension cellulaire. Une observation en microscopie optique ou une analyse avec le compteur de

particules des aliquots recueillis en cours de clarification auraient pu nous renseigner sur ce point.

La clarification sur PB1 n’a pas été menée à son terme (à Pmax = 2 bar) par manque de surnageant de

culture cellulaire (cf fig 8). La limite de capacité de ce filtre n’a pas pu être atteinte lors de cet essai

mais il est probable qu’elle a été approchée si l’on considère la pression constatée (~1 bar), déjà

élevée lors de l’interruption de l’essai, et le caractère généralement exponentiel de son augmentation

en fin d’utilisation. Le filtre PB1 a un comportement plus progressif au cours de la clarification. De

plus il montre une capacité utilisable (à P = 0,75 bar) plus importante que le filtre PB2 (102 ml.cm-²

contre 49 ml.cm-², cf fig 8). Le filtre PB1 présente des épisodes de perçage ponctuels sans réelle

conséquence sur la qualité du filtrat final (10 % des fractions collectées sont concernés) Cependant au

vu de ces résultats il semblerait nécessaire d’effectuer un autre test qui permettrait d’atteindre les

limites de ce filtre et d’appréhender ainsi son mode de fonctionnement. Dans une perceptive d’usage

industriel, il serait important de connaître son mode de dégradation finale : colmatage ou perçage

permanent à pression modérée (< 2 bar).

Globalement le filtre PB1 se montre plus performant que le filtre PB2 quant à sa capacité

volumétrique de clarification aux dépens d’un rendement plus faible (82 % contre 90 % pour le PB2)

et de fuites de débris cellulaires qui ne sont pas observées au cours de la clarification sur le filtre

PB2, ceci sous réserve de s’assurer de la filtrabilité à 0,2 µm du produit clarifié.

Lors de l’étude comparative de D0HC et PB2 (cf fig 9), l’évolution de pression permet d’affirmer que

le filtre D0HC a un comportement plus progressif que PB2 (cf fig 9B). En effet la hausse de la

pression (reflet du colmatage du filtre) exercée sur le filtre D0HC est moins rapide que celle constatée

sur le filtre PB2. La capacité du filtre D0HC est plus importante (65 ml.cm-²) que celle du PB2

(32 ml.cm-²) au dépens de l’efficacité de clarification. En effet, le filtre D0HC laisse passer plus

d’éléments absorbant à 600 nm que le filtre PB2 (cf fig 9A). Ceci est confirmé par nos résultats de

filtrations stérilisante sur membranes Durapore et Sartopore 2 : Celle se déroulant en sortie de filtre

D0HC se déroule avec une montée en pression très rapide jusqu’à colmatage à 2 bar, Celle se

déroulant après le filtre PB2 à pression quasi nulle tout au long de la filtration (cf fig 10). Dans les

- 23 -

conditions testées, la clarification sur le filtre PB2 répondrait convenablement à nos attentes en

éliminant la biomasse cellulaire et en protégeant les filtres utilisés aux étapes suivantes.

Au prix d’une capacité volumétrique réduite, le filtre PB2 à lui seul suffirait à réaliser une clarification

efficace, contrairement au filtre D0HC.

A ce stade de nos travaux, et devant les capacités réduites des filtres utilisables en mode unique, il

apparait indispensable d’étudier la possibilité de combiner des filtres en cascade. Les cascades D0HC-

X0HC et PB1-PB2, homogènes quant au fournisseur de filtres, ont été retenues pour l’évaluation.

Pour l’étude comparative des cascades de filtres la mesure de turbidité a été substituée à la mesure

d’absorbance après vérification de la corrélation ente ces paramètres. La densité optique est un

paramètre classiquement utilisé pour le suivi de croissance cellulaire en microbiologie, mais elle

présente l’inconvénient de ne plus être proportionnelle à la densité cellulaire pour des valeurs de DO

supérieures à 0,5 AU [Joubert & al, 2010]. La turbidité est quant à elle classiquement utilisée dans les

industries de process ; pour évaluer la qualité de l’eau par exemple, elle mesure le trouble des

suspensions initiales et filtrats. Dans le cas de cette mission ce sont les cellules et les particules solides

qui sont responsables du trouble de la solution. De par son principe de mesure (diffusion à 90°) la

turbidité ne présente pas les limites de détection observées en densité optique et la gamme de

proportionnalité entre la turbidité et la charge cellulaire est plus large. De plus cette technique bien

adaptée pour détecter la présence d’agrégats. [Joubert & al, 2010]. Au cours de cette étude et après

acquisition de l’équipement nécessaire ce paramètre a donc été substitué à la DO pour quantifier la

présence de cellules, débris cellulaires et autres particules solides dans la solution en sortie de filtre.

Au cours de l’étude comparative des deux cascades de filtres D0HC-X0HC et PB1-PB2 (cf fig 11) le

filtre PB1 a présenté une capacité de 36 ml.cm-². Les deux filtres D0HC testés ont démontré une

capacité de 21 et 22 ml.cm-², celle du filtre X0HC est supérieure à 43 ml.cm

-² et n’a pas pu être

démontrée à son maximum (cf fig 11). Les turbidités des solutions en sortie de filtres sont comprises

entre 1,45 et 0 NTU pour les deux cascades, il ne semble pas y avoir de différence d’efficacité.

Au vu des profils d’augmentation de pression (cf fig 11) il pourrait paraître intéressant de

surdimensionner le filtre PB1 (en le doublant) cela permettrait d’augmenter la capacité d’une cascade

PB1 2x -PB2 qui serait alors au moins 1,7 fois supérieure à celle d’une cascade D0HC x2-X0HC pour

une efficacité équivalente et pour un meilleur rendement (85 % pour la cascade PB1-PB2 contre 78 %

pour la cascade D0HC-X0HC). Ce test n’a pas été conduit par manque de suspension cellulaire.

Une seconde comparaison des cascades a été réalisées sur une culture cellulaire cette fois ci produite

en bioréacteur (1,6.106 ¢totales.ml

-1 et 72 % de viabilité cellulaire pour la cascade D0HC-X0HC et

2,6.106¢totales.ml

-1 et 62 % de viabilité) (cf fig 4,E et 12). La capacité du filtre PB1 est elle de 46

ml.cm-²). Les mêmes phénomènes de saturation des filtres D0HC sont observés, les deux filtres D0HC

- 24 -

ont une capacité de 28 ml.cm-².Comme pour les tests en cascade précédents, les filtres X0HC et PB2

sont là encore non limitants.

Nous avons cependant voulu évaluer la possibilité d’effectuer une filtration stérilisante puisqu’elle

dépend essentiellement de l’efficacité de la clarification.

Au cours des filtrations stérilisantes, une différence importante de capacité de filtration est observée

pour les membranes Durapore selon le produit de clarification. Pour celui de la cascade PB1-PB2 la

capacité du filtre est de 26 ml.cm-² tandis que pour le produit issu de la cascade D0HC-X0HC la

capacité du filtre est de 261 ml.cm-² soit 10 fois plus (cf fig 13). La filtrabilité à 0,2 µm renseigne

directement sur l’efficacité de clarification qui est donc meilleure sur la cascade D0HC-X0HC que sur

la cascade PB1-PB2. Ceci est confirmé par le profil d’évolution des valeurs de turbidité des solutions

en sortie des deux cascades : elles varient de 0,160 à 3,54 NTU avec un pic à 13 NTU pour la cascade

PB1-PB2 et de 0,137 à 1,43 NTU (cf fig 12) pour la cascade D0HC-X0HC. Ceci est attendu puisque

la cascade D0HC-X0HC [0,2-5µm] est plus resserrée que la cascade PB1-PB2 (1-11 µm), la

membrane Durapore est donc mieux protégée. Cette observation est aussi confirmée par la capacité

mesurée de cette membrane (26 ml.cm-²) sur un clarifiat PB1-PB2 (cf fig 13).

La cascade D0HC-X0HC a cette fois ci présenté un meilleur rendement (97 %) que la cascade PB1-

PB2 (93 %).

Le filtre Sartopore 2 présente lui une capacité nettement meilleure de 188 ml.cm-² sur un clarifiat PB1-

PB2. Cette capsule est composée de deux membranes, une ayant une taille de pores de 0,45 µm suivie

d’une autre de 0,2 µm. Ce type de filtre est bien mieux adapté à la filtration d’un produit clarifié sur

cascade PB1-PB2.

Au cours de la clarification sur la cascade PB1-PB2 un plateau à une valeur de 1 bar de pression est

observé, sur le profil d’évolution de pression du filtre PB1 (cf fig 12). Le profil d’évolution de

pression, plus progressif sur la cascade PB1-PB2 que celui de la cascade D0HC-X0HC, offre plus de

« confort » dans le cadre d’une application industrielle. De plus, comme évoqué plus haut la capacité

de clarification peut être nettement accrue, voire doublée en surdimensionnant le filtre PB1.

In fine, suivie d’une membrane Sartopore 2 pour réaliser une filtration stérilisante, la cascade PB1-

PB2 est plus performante que la cascade D0HC-X0HC suivie d’une membrane Durapore.

Les rendements et les pertes des différents filtres ont été calculés à partir des quantifications des Ac

par HPLC et ELISA. Entre les deux techniques d’analyse, nous avons observé des écarts

importants, de 10 % pour le rendement du filtre C0HC et 13 % pour celui de la cascade PB1-PB2. De

grandes variations ont également été constatées lors de la mesure des pertes d’Ac par cm² de filtre (cf

tableau 2).

- 25 -

Ces différences sont dues entre autres à la technique d’ELISA. En effet cette technique si elle est plus

spécifique que l’HPLC, pose des problèmes de précision pour des concentrations en Ac

élevées, mesurées à l’issue de dilution multiples. Des études annexes (résultats non exposés) ont

démontré que la variabilité entre les dosages ELISA est en grande partie responsable de ces écarts et

que le dosage HPLC est quant à lui sensible à la nature du milieu de culture cellulaire (et donc

potentiellement à la méthode de bioproduction en roller ou bioréacteur).

Les rendements calculés pour les filtres PB1 et PB2 en usage simple, respectivement 82 et 90 % sont

inférieurs aux rendements obtenus quand ils sont utilisés en cascade 93 et 98-85 % (cf tableau 2).

Cette anomalie n’est à ce jour pas expliquée. Cependant, il paraît raisonnable de penser que les

variabilités entre les dosages ELISA en sont responsables.

L’analyse des dosages des filtrats issus des filtrations stérilisantes montre des rendements parfois

supérieurs à 100 %, les autres se situant proches de 100 %. Dans le cadre de cette étude il a donc été

considéré que les pertes d’Ac sur les membranes Durapore et Sartopore 2 de filtration stérilisantes

étaient négligeables. Cependant du fait de l’incertitude, ces résultats n’ont pas été considérés pour le

choix de la meilleure cascade de filtres. Il conviendra avant tout de résoudre les problèmes rencontrés

en dosage ELISA et HPLC avant de s’appuyer sur des données de rendement pour exercer un choix

final.

Une analyse SDS-PAGE nous a également permis de suivre la présence de l’Ac dans différents

échantillons (cf fig 14). La manipulation se déroulant en conditions dénaturantes, ce sont les chaines

lourdes (49,20 kDa) et légères (23,40 kDa) de l’Ac qui sont détectées. Les surnageants prélevés au

cours de la clarification sur la cascade PB1-PB2, montrent la présence des deux chaînes de l’Ac tout

au long du processus de clarification. Bien que l’analyse par SDS-PAGE ne soit pas adaptée à une

quantification précise, on peut exclure une perte massive de l’Ac sur les différents filtres utilisés au

cours de la clarification/stérilisation (cf fig 14 colonnes 11 à 14). Cette méthode d’analyse ne permet

pas de détecter de différences notables entre les filtrations sur membranes stérilisantes (cf fig 14

colonnes 13, 14).

Cette technique apporte également des informations sur la sécrétion de l’Ac. Les deux chaines sont

présentes dans la culture initiale (cf. fig 14 colonne 1) et dans le surnageant de la culture (cf fig 14

colonne 4), mais ne sont pas présentes dans le culot cellulaire repris (cf fig 14 colonnes 5 et 6). L’Ac

est donc bien principalement sécrété dans le surnageant en fin de culture (J7) cellulaire, il n’y a pas

d’accumulation d’Ac à l’intérieur des cellules.

Il aurait été informatif à ce stade d’effectuer une analyse par Western-blot, dans le but de détecter une

possible dégradation de l’Ac au cours de la culture cellulaire ou au cours du processus de clarification.

- 26 -

En conclusion la cascade de filtres D0HC-X0HC et Durapore qui présente une clarification très

efficace, et une bonne capacité a été écartée au profit des filtres PB1-PB2 et Sartopore 2, qui

présentent également une efficacité satisfaisante mais aussi une meilleure capacité de clarification. En

prenant en compte les résultats actuels il faudrait utiliser 1 m² de filtre PB1 configuré en cascade avec

0,5 m² de filtre PB2 ; puis 0,1 m² de membrane Sartopore 2 ; pour le traitement de 200 l de culture

cellulaire ayant une densité cellulaire de 2.106¢.ml

-1. Ces surfaces sont à réévaluer en fonction de

l’accroissement des densités des cultures cellulaires au cours du développement de cytoculture.

Un effort accru de mise au point doit également être fait dans le but d’améliorer la reproductibilité des

dosages par HPLC et ELISA avant de pouvoir prendre en compte les mesures de pertes et rendements.

- 27 -

VI. Références bibliographiques

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September, 2005, Volume 23, number 9, pp 1054-1058

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Broth, BioProcess International, Nov. 2007, pp38-50

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Production, 1997 p245-246 et 251

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Settling, BioProcess international, January 2010, pp32-39

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Culture, Biopharm, Mai 2008, pp1-10

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Implementation, Millipore Bioprocess Division October 2009

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David Yavorsky et al, The clarification of Bioreactor Cell Culture for Biopharmaceuticals, Pharmaceutical Technology, March 2003 pp 62-74

- 1 -

Annexe 1 : Corrélation entre densité optique et densité cellulaire

Afin d’évaluer l’impact de la viabilité cellulaire sur la technique de mesure, une culture de cellules

Cell 003 a été propagée en Erlenmeyer dans du milieu de culture Mc2. A 4 et à 10 jours de culture, un

échantillon de culture cellulaire a été prélevé pour effectuer une étude de DO en fonction de la densité

cellulaire.

1. Etude avec une culture cellulaire âgée de 4 jours

Culture cellulaire à J4 :

- densité de cellules vivantes 1,5.106¢.ml

-1

- densité de cellules totales de 1,6.106¢.ml

-1

- viabilité 93 %

Différentes dilutions ont été réalisées et l’absorbance a été mesurée à 600 et 650 nm. Le blanc a été

fait sur du milieu Mc2. Ces longueurs d’onde ont été choisies, afin d’évaluer l’impact de la viabilité

cellulaire sur la technique de mesure, elles sont classiquement retenue pour le suivi de croissance de

cultures bactériennes ou fongiques.

Figure A : Absorbance à 600 et à 650 nm en fonction de la densité cellulaire

Que les DO soient mesurées à 600 ou à 650 nm, il y corrélation entre la densité optique et la densité

cellulaire.

Il y a bien proportionnalité entre les deux paramètres. On ne note pas de différence évidente de

sensibilité ou de reproductibilité entre les deux longueurs d’onde.

L’utilisation de la densité optique pour évaluer l’efficacité de clarification est possible.

y = 0,3147x + 0,019

R² = 0,9895

y = 0,3121x + 0,0198

R² = 0,9892

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

Abso

rban

ce

Densité cellulaire (x106) (¢ totales.ml-1)

Absorbance en fonction de la densité cellulaire

DO à 600 nm DO à 650 nm

- 2 -

Afin de vérifier s’il y avait proportionnalité pour de plus faibles viabilités la même étude a été faite

avec une culture âgée de 10 jours.

2. Etude avec une culture cellulaire âgée de 10 jours

Culture cellulaire à J10

- densité de cellules vivantes 5,6.105¢.ml

-1

- densité de cellules totales de 1,2.106¢.ml

-1

- viabilité 46 %

Différentes dilutions ont été réalisées et l’absorbance a été mesurée à 600 et 650 nm. Le blanc a été

fait sur du milieu Mc2.

Figure B : Absorbance en fonction de la densité cellulaire

Comme pour l’étude précédente, pour les deux longueurs d’onde choisies, de bons coefficients de

corrélation pour les droites sont observés. Ceci traduit la proportionnalité entre l’absorbance et la

densité de cellules totales.

Pour une viabilité élevée, à J4 (94%) ou pour une viabilité faible à J 10 (46 %), il y proportionnalité

entre la densité optique et la densité cellulaire totale.

Dans ces conditions, l’absorbance paraît bien adaptée au contrôle de l’efficacité de clarification pour

les cultures de densité inférieure à 2.106 ¢.ml

-1.

La longueur d’onde de 600 nm a été choisie pour contrôler l’efficacité de clarification.

y = 0,0327x - 0,0054

R² = 0,9941

y = 0,0331x - 0,0027

R² = 0,996

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 2 4 6 8 10 12

Abso

rban

ce

Densité cellulaire (x105) (¢ totales.ml-1)

Absorbance en fonction de la densité cellulaire

DO à 650 nm DO à 600 nm

- 3 -

Annexe 2 : Corrélation entre densité optique et turbidité

A partir de la culture cellulaire issue de Bio-003, différentes dilutions ont été réalisées en utilisant

comme milieu de dilution :

- milieu Mc3

- l’eau purifiée

Culture Bio-003

- densité cellulaire : 1,7.106 ¢ totales.ml

-1

- débris cellulaires : 1,0.106.ml

-1

- viabilité : 52 %

Pour chaque dilution les mesures suivantes ont été effectuées :

- absorbance à 600 nm

- turbidité

Figure A : Turbidité et DO en fonction de la densité cellulaire en milieu Mc3

y = 10,467x - 7,0399R² = 0,994

y = 0,0274x - 0,007R² = 0,9744

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 5 10 15 20

DO

à 6

00 n

m

Turb

idit

é (N

TU

)

Densité cellulaire (x105) (¢ totale.ml-1 )

Absorbance et Turbidité en milieu Mc3 en fonction de

la densité cellulaireTurbidité DO à 600 nm

- 4 -

Figure B : Turbidité et DO en fonction de la densité cellulaire dans de l’eau purifiée

Il y a proportionnalité entre la densité optique et densité cellulaire, comme observé au cours de l’étude

précédente. Il y a également proportionnalité et entre la turbidité et la densité cellulaire.

La turbidité peut donc être aisément utilisée pour évaluer l’efficacité de clarification. De plus cette

technique de par son principe de détection est moins sensible que la mesure de la densité optique. Par

ailleurs, à la saturation lorsqu’on traitera des densités cellulaires élevées les éléments de petites tailles

restent très bien détectés par un turbidimètre tandis qu’un spectrophotomètre verra ses capacités varier

avec la taille des particules et leur distribution.

Afin de vérifier que l’on peut comparer les données accumulées avec le spectrophotomètre et celles

obtenues à partir du turbidimètre une étude de corrélation entre les deux paramètres a été réalisée.

Les résultats sont présentés figure C.

y = 0,0305x - 0,0041

R² = 0,9804

y = 11,248x - 10,219

R² = 0,9896

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 5 10 15 20

Turb

idim

étri

e (N

TU

)

DO

à 6

00 n

m

Densité cellulaire (x105) (¢ totale.ml-1)

Absorbance et Turbidité dans l'eau en fonction de la

densité cellulaire

DO à 600 nm Turbidité

- 5 -

Figure C : Turbidité en fonction de l’absorbance à 600 nm

Il y a corrélation entre la turbidité et la densité optique quelque soit le milieu de dilution.

y = 350,54x - 0,519

R² = 0,9799

y = 346,69x - 8,5231

R² = 0,9943

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

Turb

idit

é (N

TU

)

DO à 600 nm

Turbidité en fonction de l'absorbance à 600 nm

Milieu Mc3Eau purifiée