BIOCHIMIE, 1971, 53, 25-34.

Mdthode d'dtude des rdaction enzymatiques sur unc interfiwe,

p a r D. G. DERVICHIAN.

Serv ice de B i o p h y s i q u e - - lns l i tu t Pasteur, Paris 15 °.

S u m m a r y . - - The reaction of an enzyme dissolved in water with the substrate spread over its surface as a monomolecnlar layer is followed by measuring with precision, under constant surface pressure, the amount of snbstrate which disappears per unit of time.

A new definition of the rate of reaction is given which is relevant to these part icular conditions. The discussion is relative to the adwtntages of such measurements performed directly at the molecular scale on a substrate with all molecules oriented and with a determined molecular area.

INTRODUCTION.

Certains subs l ra ts sont inso lub les dans l ' eau et de ce f a r l eu r i n t e r a c t i o n avec l ' e n z y m e sp6ci- flque ne peut se f a i r e en phase h o m o g b n e c'est-~- dire entre mol6cules d issoutes du subs t ra t et de l 'enzyme. L ' ac t i on a l ieu sur la su r face qui s6pare la masse du subs t ra t de la so lu t ion aqueuse de l ' enzyme . Tel le est la s i tua t ion p r i n c i - palement p o u r les g lyc6r ides ou les p h o s p h o l i - pides lors de leur h y d r o l y s e p a r les l ipases ou les phosphol ipases . Le cas de l ' h y d r o l y s e des prot6ines inso lubles (ou r endues insolu,bles) p a r des prot6ases p o u r r a i t ~tre 6ga lement envisag~ clans les m6mes cond i t ions .

Ces cond i t i ons p a r t i c u l i b r e s d ' u n e r6ac t ion enzymatique s ' e f fec tuan t sur une su r face p e u v e n t 6tre exploi t6es a v a n t a g e u s e m e n t en ce sens que la c in6t ique peu t 6tre ~tudi6e sur une su r face dont l ' a i re est p a r f a i t e m e n t d6finie et sur laque l le ne se t rouve qu 'une seule assise de mol6cules du substral. De pins, non s eu lement l ' o r i e n t a t i o n des molecules du subs t ra t est connue , mats les di- mensions et l ' a i re q u ' o c c u p e n t i n d i v i d u e l l e m e n t ces mol6cules se t r o u v e n t d6termin6es .

C'est la t e c h n i q u e des couches super f ic ie l les monomol6cula i res qu i a 6t6 adapt6e h de tel les 6tudes et qui est d6cr i te dans ce p r e m i e r a r t i c le qui sera suiv ie d ' au t re s po r l an t sur des r6sultats.

Le substrat 6ta16 h la su r face de l ' eau darts laquelle se t r ouve dissous l ' e n z y m e p e u t 6tre con- eentr6 ou dilu6 tout en res tan t t ou jou r s sous l '6paisseur d 'une seule assise de mo16cules ; cee i en faisant v a r i e r h vo lont6 l ' a i re to ta le d i spo-

n ible p o u r une quant i t6 donn6e de substrat . La couche m o n o m o l 6 c u l a i r e de subs t ra t pcu t a insi 6tre soumise h l ' a t t aque de 1 'enzyme dans des c o n d i t i o n s d6finies d,e sa densi t6 super f ic ie l le ou a u t r e m e n t dit de l ' a i r e disponi~ble p a r mol6cule .

De plus, on peu t d i l ue r supe r t i c i e l l emen t lc subs t ra t en le m61angeant dans toutes les pro- p o r t i o n s vou lues avec un au t re co rps suscep t ib le aussi de s '6 ta ler sur l ' e au ma t s su r lequel cepen- dan t l ' e n z y m e n 'a aucune ac t ion . On r6al ise a ins i une (~ so lu t ion super f ic ie l le 7> des mol6cules du substrat , t ou jou r s or ien t6es mats d i spers6es dans une couche m o n o m o l 6 c u l a i r e mix te . C'est lh, d ' une par t , une aut re fagon de fa i re v a r i e r la densi t6 super f ic ie l le du suhs t ra t et, d ' au t r e par t , de d o n n e r "h ces mol6cules un e n v i r o n n c m e n t de mol6cules d i f f6rentes don t on peu t cons t a t e r l ' a c t ion a c t i v a t r i c e ou i n h i b i t r i e e sur la r6ac t ion enzyma t ique .

II est inu t i l e de sou l igner l ' in t6r6 t que pr6- sen ten t de tel les 6tud,es, e f fec tu6es h l '6chel le mr)me de la molecu le , darts la r e c h e r c h e sur les i n t e r a c t i o n s enzyme-subs t ra t .

L ' a c t i o n d 'un e n z y m e sur une c o u c h e mono- mo l6cu ta i r e a 6t6 6tudi6e d6s 1935 p a r Hue, tins I l l en m e s u r a n t la v a r i a t i o n du po ten t i e l 61ec- t r ique de surface . Darts ces exp6r i enees , les p ro - dui /s de la r6ac t ion , eux-m~mes insolubles , de- m e u r a i e n t il la su r face et mod i f i a i en t p rogress i - v e m e n t la c o m p o s i t i o n de la couche , l ,a d6ter- ru ina t ion de la v i tesse d ' h y d r o l y s e ne pouva i t donc 6tre q u ' i n d i r e c t e en essayan t de r e l i e r le po ten t i e l 61ectr ique de su r f ace .h la c o m p o s i t i o n de la couche .

26 D. G. Derv ichian .

Un autre proc6d6 uli:iis6 par DAWSON et BAN- ~HAM [2~ utilise un substrat marqu6 et mesure la perle de la radioact ivi t6 de la surface au cours du temps. ]l faut pour cela que l 'enzyme et le substrat soient choisis de facon telle que Pun des produits de la r6action porte l 'atome radioact i f et qu'il soit soluble. Ainsi, ce produi t diffusant dans I'eau au fur et i~ mesure de sa formation, la radioact ivi t6 dc la surface se trouve diminu6e.

l.a m6thode d6crite ici, lorsqt~'elle peut 6tre utilis6e, est p,lus directe, elIe ltermet une d6fini- lion exacle des parambtres et une plus grande souplesse dans leurs variat ions.

M~THODE. Princi ,es .

Afin que tous les parambtres soient d6finis, il faut que pendant route la dur6e de la r6action la concentra t ion tie l 'enzyme dans l 'eau qui se t rouve sous route l '6tendue de la surface occup6e par ]a couche reste fixe. I1 faut aussi que soit fixe la concentra t ion superficielle de la touche de substrat. Pour cela il suffit de s 'assurer que la press[on superficiell.e est constante, puisque l 'une est function tie l 'autre. Le substrat disparaissant i~ la suite de son hy'drolyse la press[on superfi- cielie tombe. En r6duisant la surface disponible pour r6tablir la press[on h la valeur fix6e, on r6tablit en m6me temps la concentra t ion super- ficielle. La diminut ion de la surface par unit6 de temps permet d '6valuer la vitesse de ]a r6a,ction : quantit6 relat ive de substrat disparu par unit6 (le temps pour une concentra t ion volumique d 'enzyme et une concentra t ion superficiefle de suhstrat donn6es. Cette vitesse ne peut qu'6tre constante au cours du temps.

Dans le cas des couches mixtes (substrat dilu6 avec une substance inerte), le substrat disparais- sant progressivement , la composi t ion de la cou- che et par suite la concentra t ion superficielle du substrat dinfinue au tours du temps, bien qne l'on maint ienne la press[on superficielle cons- tante. La vitesse de diminut ion de l 'a i re varie done en fonction du temps. It faut alors extra- poler au temps z6ro pour ohtenir la vitesse de la r6action cor respondant ~ la composi t ion don- n6e au d6part et "~ la press[on superficielle choi- s~e.

Pour que la mesure de l 'a ire occup~e par la couche (sous pression superficielle constante) expr ime "/I chaque instant la quantit~ de substrat non encore transformS, i l e s t n6cessaire que les produits de la rdaction ne demeurent pas ~ la

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1.

surface de l 'eau. En util isant eomme substrat des compos6s h chaines hydrocarbon6es relati- vement courtes, cette condi t ion est faci lement remplie. S'il s 'agit d 'uu phosphol ip ide attaqu5 par une phosphol ipase A, il suffit qt~e les chaines hydrocarbon6es aient un~e longuem" inf6r ieure h 11 atomes de carbone (exemple : did6canoyl, d inonanoyl ou dioctanoyl phosphat idyl choline) pour que d'une part l ' ae ide gras lib~r6 par l 'hy- drolyse et d 'autre part la lysol6cithine qui en r~sulte soient suffisamment solubles pour quit ter aussit6t la surface e t s e disperser dans l'eau. L 'exp6r ience montre en effet que fes aeides gras en C~0, C.~, C s ( e t a fort[or[ ceux h chalne plus courte) dbs qu'i ls sont 6ta16s h la surface dispa- raissent dans la masse de l 'eau sans pouvoir se mainteni r en une touche superficielle. I1 en est de m6me avec les lysol6cithines ayant moins de 12 C dans leur chalne unique.

Pour les g]yc6rides, le probl~me se pose autre- ment. Les at[des gras p rovenant de l 'hydrolyse disparaissent rap[dement de |a surface lorsqu' i ls cont iennent moins de 11 atomes de carbone dans leurs mol6elfles. Mats les diglyc6rides avec d, es ehaines de 10 et mdme de 8 C sont encore prati- quement insolu,bles dons l 'eau et demeurent h la surface. Les monoglyc6r ides par eontre sont suf- fisamment solubles lorsque leur chalne unique a moths de 11 C. L 'act ion d 'une lipase peut done 6tre 6tudi6e faci lement par cette m6thode sur des diglyc6rides ayant des chalnes dont les ion- gueurs sont inf~riel~res 5 11 C. Les deux produi ts de la r6action (at[de gras et monoglyc6r ide avec n ~ 11), d~s qu'i ls apparaissent, cfuitten¢ alors la surface et disparaissent dans la masse de l 'eau.

Du point de vue de la cin6tique enzymatique, un point impor tant dolt 6ire soulign6 : les pro- dulls de la rg~action ne peuvent inh iber l 'action de [ 'enzyme car Ieur concentra t ion effective est n6gligeable. En effet, la quantit6 totale de sub- stance 6tal6e est de l 'o rdre de 30 ~. Le volume d'eau sous-jacent 6rant de l 'o rdre du litre, en prenant le cas extrdme off tout le substrat est bydro]ys~ et a diffus6 dans l 'eau, la concentra- t ion des produi ts de la r6action serait au plus de 30 ~, par litre. Il font toutefois r emarquer que la r6action ayant lieu h la surface, les produits n 'ont pas l,e temps de diffuser darts route la masse de l 'eau. Si l 'on n,e considbre alors que 1/10 de mm d'~paisesur d 'eau dons laquelle les produits de la r6aetion peuvent diffuser sous la coucbe, on se rend eompte par un calcul 616men- taire que leur concentra t ion ne peut at teindre 10 ~, par ml. Ce qui est encore n6gIigeable.

R d a c t i o n s e n z y m a t i q u e s s u r u n e i n t e r l a c e . 27

On est moins 6tonn6 de ~es r6sul tats , si l 'on ne perd pas de vue que dans cet te t e c h n i q u e les mesures sont r6alis6es ~ l '6chel le m o l 6 c u l a i r e e t que, si la densi t6 du subs t ra t es t tr6s g r a n d e dans le plan de la su r face (mol6cules jo in t ives ) , son 6paisseur n 'es t que d ' une seule assise de mo- 16cules, c 'est-~-dire de l ' o r d r e de 10-7 cm. Ains i les mol6cules d ' e n z y m e dissoutes dans l ' eau ren- contrent sur la su r face une p o p u l a t i o n de mol6- cules aussi dense que s ' i l s ' ag issa i t du subs t ra t pur (non dissous) ; p a r eont re , les p r o d u i t s de la r6action se t r onvan t d i lu6s p r a t i q u e m e n t ~ l ' in - fini ne peuven t i n t e r v e n i r darts un 6qui l ibre .

Dispositif de mesure.

Les mesures sont fai tes au m o y e n d 'un appa- reil enreg is t reur con~u p a r l ' au t eu r su ivan t le pr incipe de la << cuve de L a n g m u i r ~. Cet appa- reil a subi des t r a n s f o r m a t i o n s success ives au eours des ann6es. Une de ses fo rmes t r ans i t o i r e s utilis6e dans ce l a b o r a t o i r e a 6t6 d+cr i te en 1957 par J. Mossg [3!. Des mod i f i c a t i ons p lus par t i - euli6res en ce qui c o n c e r n e le c a d r e et la c u r e ont 6t6 appor t6es p o u r l '6 tude de la c in6 t ique en- zymatique superf ic ie l le .

a) Apparei l g~n~ral.

II est caraet6r is6 p r i n c i p a l e m e n t :

1 °) par la g r ande d i m e n s i o n de la sur face , ce qui pe rmet un bon 6 ta lement et une g r a n d e pr6- cision dans la d 6 t e r m i n a t i o n des a i res ,

2 °) pa r la poss ib i l i t6 de fa i re v a r i e r la sensi- bilit6 darts la m e s u r e de la pI, ess ion super f lc ie l le = exerc6e pa r la couche , jusqu '~ p o u v o i r appr6- cier 10 -2 dyne cm-1,

3 °) pa r la poss ib i l i t6 de p o u v o i r d6p lace r le piston a u t o m a t i q u e m e n t dans les deux sens (com- pr imer ou d6 tendre la couche) h des v i tesses va- riables mais d6finies a l lan t de 20 cm fi 1 cm p a r minute.

L'eau pure ou tan lponn6e , qui ser t de suppo r t h la couche est eon t enue dans une g r a n d e c u r e reetangtflaire en p lex ig lass de 1 m6t re de long, 20 em de large et p r o f o n d e de 3 cm (Fig. 1).

La surface de l ' e au est d61imit6e p a r un cad re flottant (Fig. 1 [5], fa i t de bandes &e feuiUe de mica paraffin6. Une bande l e t t e en m i c a para f - fin6 [1], s ' appuyan t h ses ex t r6mi t6s sur les deux grands e6t6s du cadre , eons t i tue le p i s ton qui permet de c o m p r i m e r ou de d6 tendre la couche . Ce piston est en t ra in6 a u t o m a t i q u e m e n t p a r un chariot roulant sur deux ra i l s cy l i nd r iques .

D ' o r d i n a i r e , une deux i6me bande le t t e (Fig. 1 [2] et Fig. 2 [4]) d61imite la su r face off se t r o u v e 6tal6e la couche . Sa l o n g u e u r est un peu inf6- r i eu re h la d i s t ance des deux bords du c a d r e ; elle est re l i6e "l ceux-e i au m o y e n de ills de soie vasel in6s qui f lot tent sur l 'eau. Ces ills emp6- chen t la c o u c h e d,e fu i r et p e r m e t t e n t h la ban- dele t te de subi r de pet i t s d6p lacements . Cette deux i6me band.elet te cons t i tue la pa r t i e essen-

1 S

I l'lllll

Fro. 1. - - Sch('ma de la cuoe et du manomMre superficiel.

1 - - Bandelette de mica paraffin6 constituant le << piston >>. Cette l)andelette est entraln6e pat" un chariot roulant sur des rails le long de la cuve.

2 - - Petit cadre se mouvant sous l 'action de la pres- sion superficielle et faisant partie du manom~tre. Les quatre angles de ce petit cadre rattach6s au grand cadre par des ills de soie vaselinds qui flottent h la surface de l 'eau et emp~chent le passage de la couche du compart iment II dans le compart iment III.

3 et 4 - Paires de chicanes form6es de lames de plexiglass pos~es sur la tranehe perpendiculai- rement au fond de la cure.

5 - - Grand cadre en mica paraffin6 flottant h la sur- face de l 'eau et d6limitant les diffSrents eompar- timents.

t ie l le du m a n o m 6 t r e qui ser t h la m e s u r e de la p r e s s ion super f ic ie l l e ~ de la c o u c h e (semblable une p r e s s i o n osmot ique) . Sous Fac t i on de la pres- s ion super f ic ie l l e =, la bande l e t t e p i v o t e au tou r d ' un axe v e r t i c a l passan t pa r l ' une de ses extr6- mit6s. Ce m o u v e m e n t en t r a ine ce lui d ' un 6qu ipage so l ida i r e d ' une suspens ion bi f i la i re . Un m i r o i r flx6 sur l ' 6qu ipage pe rme t , an m o y e n d 'un spot lumi - neux, d ' e n r e g i s t r e r les d6p l acemen t s (Fig. 2).

Dans une su spens ion bi f i la i re , le coup le de tor- s ion est p r o p o r t i o n n e l fi la masse du sys tSme et ne d6pcnd que de la l o n g u e u r ,et de la d i s t ance des ills. Au m o y e n de d i f f6rentes s u r c h a r g e s p lac6es sur l ' 6qu ipage , on peu t ob t en i r des sens ib i l i t6s dif f6rentes , a l lan t de 0,78 d y r m s / c m '~ 5,70 d y n e s / cm p a r cen t im6 t r e de d 6 p l a c e m e n t s ' 6 c h e l o n n a n t sur c inq sens ib i l i t6s i n t e rm6d ia i r e s .

L ' 6qu ipage est so l ida i r e d ' u n d i spos i t i f d ' a m o r - t i s semen t cons t i tu6 p a r une l a m e t r e m p a n t dans de l ' hu i l e de vase l ine .

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1.

28 D. G. Deroichian.

P o u r les p e t i t s d 6 p l a c e m e n t s que s u b i t la sus- p e n s i o n b i f i l a i re , l ' ang l e de r o t a t i o n et p a r su i te le d 6 p l a c e m e n t du spo t son t p r o p o r t i o n n e l s '~ l ' i n - t ens i t6 de la p r e s s i o n super f i e ie l l e . P o u r a m p l i f i e r lc m o u v e m e n t du spo t l u m i n e u x , le c h e m i n o p t i q u e est a l long6 p a r un jeu de d e u x m i r o i r s . Le f a i s c e a u a b o u t i t en fin de c o m p t e s u r u n s u i v e u r de spo t

ce l lu le pho to61ec t r i que . Les ddp lac . ement s du spot , qu i son t p r o p o r t i o n n e l s h la p r e s s i o n , se fon t

i I

i I j

Fro. 2. Suspension bifilaire el (;hh~alion. (I) Fils de suspension main tenus avec un ,)cartement

fixe d6termin6. (2) Masse in terchangeable permel tan t tie modiIicr la

valeur du couple de torsion. (3) Lamelle verticale en plexiglas,s. Cette lamelle

plonge darts la cuve en t raversant , dans le c.'~s gdndral, la bandele t te de mica paraffind (4) qui llotte sur l 'eau et son mouvement de rota t ion sous l 'action de la pression de la touche ent ra ine celui de tout l 'dquipage. Les extrdmitds de (4) sont relides aux bords du grand cadre (5) par des tils tie sole vaselin6s qui flottent /~ la surface de l 'eau et qui assm'ent l 'dtancbditd tout en ne g6nant pas les mouvements de la bandele t te mobile. Dans le disposit if adapt~ '~ la cin6tique superficielle cctte bandele t te (4) est remplac6e pa r le peti t cadre (2J de la figure 1. La lamelle (3) t raverse alors le grand cSt5 de ce pet i t cadre (2).

(5) Cadre l imi tau t la surface. (6) Miroir du spot lumineux. (7) Amort isseur form6 d 'une feuille m6tal l ique plide,

t r empan t darts de l 'hui le de vaseline.

h o r i z o n t a l e m e n t d a n s une d i r e c t i o n 1)er l )endieu- l a i r e au d 6 r o u l e m e n t du p a p i e r , qui, lui , est sol i - d a i r e du m o n v e m e n t du c h a r i o t qu i e n t r a i n e le p i s t o n . A ins i se t r o u v e n t e n r e g i s t r 6 c s a u t o m a t i -

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1.

q u e m e n t tes v a r i a t i o n s de la p r e s s i o n en f o n c t i o n de ce l les de l ' a i r e , ce qu i d o n n e u n e i s o t h e r m e p r e s s i o n s u p e r f i c i e l l e - a i r e : ~ = f (A), la p r e s s i o n supe r f i c i e l l e ~ 6 tau t e x p r i m 6 e en d y n e s p a r c m et l ' a i r e A 6 t an t l ' a i r e p a r mo l6cu l e m e s u r 6 e en ~2 (soi t 10 -16 cm2).

b) Adaptation particuli~re £t la cindtique enzg- matique.

P o u r b i e n d61 imi te r le v o l u m e 4e l ' e a u d a n s le- que l est d i s sous l ' e n z y m e / i u n e c o n c e n t r a t i o n con- hue deux b a r r i b r e s doub le s , [3] et [4], f o rm6es de l a m e s de p l e x i g l a s s d i v i s e n t la c u r e en t ro i s c o m p a r t i m e n t s (Fig. 1). E l les s ' 6 t e n d e n t su r route la l a r g e u r de la cuve et son t pos6es su r la t r a n c h e p e r p e n d i c u l a i r c m e n t au fond . La h a u t e u r est te l le qu ' e l l e s a r r i v e n t '5 que lques m i l l i m 6 t r e s de la sur- face de l ' e a u s ans t o u t e f o i s a f f l eu re r .

L ' e n z y m e es t i n j ec t6 sous la s u r f a c e darts le c o m p a r t i m e n t I[. Le bu t des b a r r i b r e s 3 et 4 est d o u b l e : d ' u n e p a r t , e l les e m p 6 c h e n t la d i f fus ion de l ' e n z y m e darts le c o m p a r t i m e n t II d o n t la sur - face do l t r e s t e r p r o p r e ; d ' a u t r e p a r t , el les d6 t imi- t en t un v o l u m e p lus p e t i t de d i m e n s i o n c o n n u e ~ l ' i n t 6 r i e u r de la c u r e , ce qu i p e r m e t d ' u t i l i s e r de p lus p e t i t e s q u a n t i t 6 s d ' e n z y m e .

Le s u b s t r a t est 6ta16 d ' a b o r d su r une su r f ace p lus g r a n d e , i l est e n s u i t e r a s s e m b l 6 a u - d e s s u s du c o m p a r t i m e n t H, jus te a v a n t d ' i n j e c t e r l ' e n z y m e darts ce m S m e c o m p a r t i m e n t II, h ) r sque c o n u u e n c e l ' 6 tude de la r 6 a c t i o n .

Ai in d ' i s o l e r e n c o r e m i e u x le c o m p a r t i m e n t su- pe r f i c i e l HI, qu i est d e r r i 6 r e le m a n o m 6 t r e et qu i ne do l t pa s 6 t re c o n t a m i n 6 p a r a d s o r p t i o n de l 'en- zyme, la b a n d e l e t t e o r d i n a i r e qu i se r t 'h m e s u r e r ]a p r e s s i o n superf ic ie l l .e est r e m p l a c 6 e p a r un p e t i t c a d r e e n feui l le de m i c a p a r a f f i n 6 en f o r m e de t r a p 6 z e (Fig. 1 [2]) . Le g r a n d c5t6 de ce t ra - p6ze joue l e m 6 m e r61e que la s i m p l e b a n d e l e t t e o r d i n a i r e m e n t ut i l i s6e . Les e x t r 6 m i t 6 s de ce g r a n d c5t6 se t r o u v e n t d o n e re l i6es aux b o r d s du g r a n d c a d r e p a r des ills de sole vase l in6s , n o n t endus . La f o r m e en t r a p 6 z e p e r m e t h l ' e n s e m b l e de tour - n e r s ans t o u c h e r les b o r d s .

L ' u t i l i s a t i o n d ' u n p e t i t cad~e au l i eu d ' u n e s im- ple b a n d e l e t t e a p o u r b u t de c r6e r u n e zone de s6cur i t6 e n t r e la b a n d e l e t t e m a n o m 6 t r i q u e et le c o m p a r t i m e n t III .

I1 f au t en effet 6v i t e r que l ' e n z y m e d i f fuse d a n s le c o m p a r t i m e n t l l I , d e r r i e r e le m a n o m 6 t r e , c a r s ' a d s o r b a n t "5 la su r f ace , i l e x e r c e r a i t a lo r s une p r e s s i o n qui s ' o p p o s e r a i t h cel le p r o d u i t e p a r le

Rdac t ions enz l . lmot iques sur rote in ter lace . 29

substrat et que l 'on veut mesurer. I.es lames de pl.exiglass [4], d6j& d6crites, sont destin6es /i em- p~cher la diffusion de l 'enzyme en profondeur . A la surface, le petit cadre permet d ' isoler une zone off l 'enzyme, qui ayant accidentel lement fran- chi la lame de plexiglass, peut ainsi s 'adsorber sans risquer de per turber les mesures.

Sous l 'action de la pression stLperficielle, l 'en- semble du petit cadre subit un mouvement de rota- tion, qui ne d6passe pas quelques degr6s, en pivo- tant autour d'une des extr6mit6s d,e son grand c6t6, Ce monvement entraine celui de l '6quipage solidaire de la suspension bifilaire.

Mode opdratoire.

La cuve 6rant remplie de la solution tampon et le dispositif de mesure 6rant mis en place, le pis- ton est recul6 au maximum pour disposer de la plus grande aire possibIe.

Le substrat (glyc6ride on phosphol ipide) est alors d6pos6 h la surface h 1'aide d 'une micro- seringue h par t i r d 'une solution ~ concentrat ion connue dans l '6ther de p6trole. On laisse tomber les gouttes en diff6rents points de la surface pour obtenir un bon 6talement. Le solvant s'6tant 6va- por6 en quelques minutes, la conche monomol6cu- laire du substrat est comprirn6e jusqu'~ la pres- sion choisie pour l 'exp6rience. Celle-ci se lit sur le papier millim6tr6 de l 'enregistreur, puisqu 'un 6talonna.ge pr6alable a permis d '6tablir la corres- pondance entre les dynes et les cm. On s'assure que, la bandelette piston 6rant arr6t6e, la pression reste stable.

Une quantit6 connue de l'enzym,e, en solution dans au moths 30 ml du m6me tampon que celui qui sert de support h la couche, est rap idement inject6 an moyen d 'une pipette h boule dans le compartiment II sous toute la surface occup6e par la couche de substrat. Afin d '6viter toute con- tamination de la surf 'me occupbe par la couche. l'exlr6mit6 de la pipette est in t rodui te sous la cou- che . travers la surface l ibre h l 'ext6rieur du cadre. Pour rendre la solution d 'enzyme bien homogbne, le l iquide du compar t iment II (Fig. 1) est bien brass6 en remplissant la pipette par aspi- ration puts la vidant dans la masse h plusieurs reprises et en promenant l 'extr6mit6 submerg6e de la pipette tout au long du compar t iment II, sans jamais produire de bulle d'air. Le chronom6tre est d6clench6 en m6me temps.

D~s qu'une petite quantit6 de substrat est hydro- lys6e et quitte la surface, la pression superficielle

diminue et la t)lmne de l ' enregis t reur s '6carte sur le papier du trait de rep6re de la pression x choi- sic. On r6tablit la pression par compress ion de la couche en faisant mouvoi r le piston par l ' inter- m6diaire d'un in te r rupteur 61ectrique. Cette suc- cession de compressions et d'arr(:ts se t radui t sur le graphique par de petites oscil lat ions autour d 'une droi te parall~le 5 l 'axe des aires (pression eonstante). En m6me temps des intervalles de temps 6gaux sont inscri ts sur le papier (1 on 2 mi- nutes par exemple) pour eonst iuer l '6chelle des temps (Fig. 3).

)=

f Lq ..J

(J

k l

.o u3

CC

If co.-,stoot .//

/ /

/ "

L . J

t~ !

L

2 3 4 5 5 7 8 mm

. . . . . . . . . . . . J

< AIRKS 0

FIG. 3. - - Exemple d'un enregislrement de ia varia- tion de la surface au cours du temps. II s'agit de l'hydrolyse d'une couche de 16eithine ayant 2 chaine:~ hydrocarbon6es de 10 atomes tie carbone (diddeanoyl- phosphatidyteholine) sous Faction d'un venin de ser- pent purifiC

I . - Enregistrement de l'isotherme au tours (ie la compression de la touche (avant l'injection de l'enzyme) jusqu'h atteindre la pression constante (11 dynes/era dans l'exemple pr6sent).

II. - - Evolution de la touche apr6s injection de l'enzyme. Les oscillations antour de ]a l)ression fixe sont dues aux compressions et arr~t:, successives sont notSes par des traits verticaux.

IiI. - - Compression de la touche aprbs la fin de l'expd- rience pour constater que l'isotherme n'est pas modifi6e.

Pour fixer les id6es, on peut dire qu' i l s 'agit de l '6quivalent "~ deux dimensions (changement de l 'aire) de la mesure du changement de volume d'un gaz, sous pression constante, au eours d 'une r6action.

Ddfinition de la vitesse de r~action.

Les mesures, h pression superficielle constante, de la var ia t ion de l 'a ire de la couche au cours du temps, donnent d i rec tement la vitesse sp6cifique

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1.

30 D. G. Dervichian.

( f r a c t i o n du s u b s t r a t qui d i s p a r a i t p a r u n i t 6 de t e m p s ) :

1 t i m 1 d m V, = - - - = . . . . . . (1)

m tit dt m

off m est la q u a n t i t 6 to ta le de s u b s t r a t p r 6 s e n t h la d m

s u r f a c e h u n i n s t a n t d o n n 6 et - - tit la quan t i t~

de s u b s t r a t h y d r o l y s 6 p a r un i t6 de t e m p s .

E n effet, si S est r a i r e o c c u p 6 e p a r 1 ' e n s e m b l e du s u b s t r a t , sous u n e p r e s s i o n supe r f i c i e l l e d o n - n6e, au t e m p s t, et si dS est la d i m i n u t i o n de ce t te a i r e d a n s un i n t e r v a l l e de t e m p s d t a u t o u r de t p a r su i te de la r 6 a c t i o n , on a

d S / S = d m / m

p u i s q u e S (h u n e p r e s s i o n supe r f i c i e l l e d o n n 6 e ) , est p r o p o r t i o n n e l h m, S = am, et q u ' a u s s i dS = adm.

La r e l a t i o n 1 p e u t d o n c s ' d c r i r e

1 dS V 8 - - - - - - -

dl S otl e n c o r e

d i n s V~ - - (2)

dt

E n p o r t a n t s u r u n g r a p h i q u e les v a l e u r s suc- c e s s ive s de InS en f o n c t i o n de t, o n o b t i e n t u n e d r o i t e $ p e n t e n6ga t i ve d a n s t o u s l e s cas 6 tud i6s (Fig. 4). Ce qui , d ' a p r 6 s la r e l a t i o n (2), i n d i q u e que V s est c o n s t a n t au c o u r s du t e m p s . On p o u r - r a i t p r 6 v o i r ce r6 su l t a t e x p 6 r i m e n t a l p u i s q u e les c o n d i t i o n s n e v a r i e n t p a s au c o u r s d u t e m p s : m a l g r 6 le p r o g r b s de la r 6 a c t i o n , n o n s e u l e m e n t ]a c o n c e n t r a t i o n de r e n z y m e , n la i s auss i la c o n c e n t r a t i o n supe r f i c i e l l e du s u b s t r a t r e s t e n t c o n s t a n t e s p u i s q u e la p r e s s i o n est m a i n t e n u e fixe. D ' a n t r e pa r t , a i n s i qu ' i l a 6t6 d i t p lus hau t , il n e p e u t y a v o i r i n h i b i t i o n p a r le p r o d u i t de la r6ac- t im, , ce lu i -c i se t r o u v a n t d i lu6 c o n s i d 6 r a b l e m e n t . Au c o n t r a i r e , clans les 6 tudes o r d i n a i r e s de c in6- t i que e n z y m a t i q u e la c o n c e n t r a t i o n du s u b s t r a t d i m i n u e au c o u r s du t e m p s .

Ains i , p u i s q u e V s es! c o n s t a n t , si l ' on d6s igne p a r S o la v a l e n r de l ' a i r e de la couch,e de s u b s t r a t h un i n s t a n t a r b i t r a i r e p r i s p o u r o r i g i n e des t e m p s , la r e l a t i o n (2) d o n n e

lnS i lnso = Vst o n e n c o r e

lnS/S~, = Vst

E n p r a t i q u e , l ' a i r e S de la c o u c h e 6 t a n t p r o p o r - t i o n n e l l e h sa l o n g u e u r 1,, p u i s q u e la l a r g e u r du c a d r e qu i la c o n t i e n t est fixe, il suff i t de p r e n d r e

L su r le p a p i e r d ' e n r e g i s t r e m e n t les r a p p o r t s 1~o des

l o n g u e u r s m e s u r 6 e s h p a r t i r de l ' o r i g i n e ( p o s i t i o n du p i s t o n acco l6e h la b a n d e l e t t e m a n o m 6 t r i q u e et c o r r e s p o n d a n t "~ u n e a i r e nul le) . La v i t e s se est a lo r s d o n n 6 e p a r la r e l a t i o n

1 L Vs ~ - - In - -

Soi t en l o g a r i t h m e s o r d i n a i r e s

2,3O Vs ----- - - log L / L .

t

L o r s q u e les c o u c h e s son t f o rm6es de deux sub- s t ance s d o n t l ' u n e s c u l e m e n t et h y d r o l y s 6 e p a r l ' e n z y m e , r a u t r e f a i s a n t f o n c t i o n de d i l u a n t , la

" -x

. j

{)

1/200

1,1oo

~,ooo

0,900

O,8OO

o,7oo

o,6oo

I I I I i I I I

1 2 3 4 5 6 7 8 minutes

Fro. 4. - - Var ia t ion de la surface de la couche en fonct ion du temps au cours de la r6action. Les aires 6tant propor t ionnel les "& la longueur de la couehe, il suffit de t racer la var ia t ion du logar i thme de eette longueur L en fonction du temps. La courbe obtenue est une droite. Ceci montre la constance de la vitesse an cours du temps. La pente de la droite donne V~.

c o n c e n t r a t i o n supe r f i c i e l l e du s u b s t r a t d6c ro i t l o r sque p r o g r e s s e la r 6 a c t i o n . - d s / d t c o r r e s p o n d t o u j o u r s & - d m / d t (m 6 t an t la q u a n t i t 6 to t a l e du s u b s t r a t seul) et d o n n e b i e n la v i t e s se sp6cif ique V s, m a i s ce t te v i t e s se ne p e u t que v a r i e r au cours du t e m p s p u i s q u e la c o n c e n t r a t i o n en s u b s t r a t di- m i n u e et que la c o m p o s i t i o n supe r f i c i e l l e var ie . Mais seu les la c o n c e n t r a t i o n et la c o m p o s i t i o n au d 6 p a r t son t c o n n u e s . On c o n s t a t e e x p 6 r i m e n t a l e - meri t que la c o u r b e S o u L = f(t) n ' e s t pas une d r o i t e c o m m e d a n s le cas de la c o u c h e h u n seul c o n s t i t u a n t . P o u r ca. lculer la v i t e s se V s de la r6ac- t i o n et la r e l i e r ~ la c o m p o s i t i o n et ~ la p r e s s i o n

BIOCHIMIE, 1971, 53, n" 1.

R~act ions e n z y m a t i q u e s sur une in ter face . 31

de la couche , il f au t e x t r a p o l e r au t e m p s O la courbe de S o u L en f o n c t i o n de t. Malgr6 le f a i t que l ' h o m o g 6 n 6 i s a t i o n de la s o l u t i o n d ' e n z y m e , aprbs i n j ec t i on et b r a s s a g e , ne se fa i r p a s i n s t a n - tan6ment , l ' i n d 6 t e r m i n a t i o n s u r le t e m p s z6ro de la r6ac t ion ne d6pas s e pa s 15 h 20 s e c o n d e s a i n s i qu 'on peu t le v6r i f i e r en e x t r a p o l a n t les d r o i t e s lnS/S o = f(t) o b t e n u e s d a n s le cas des c o u c h e s '~ un seul c o n s t i u a n t .

Autres expressions de la Vitesse.

An l ien de la v i t e s se sp6c i f ique V s o u v i t e s se relative, on p e u t d6 f in i r et c a l c u l e r d e u x a u t r e s vitesses : u n e v i t esse en m o l 6 c u l e s Vn et u n e v i t es - se eB masse Vm.

a) Vitesse en molecules, Vn : E l le e x p r i m e le nombre de mol6cu le s d n de s u b s t r a t h y d r o l y s 6 e s par uni t6 de su r f ace (cm2) et p a r un i t6 de t e m p s (seconde), n 6 tan t le n o m b r e de m o l 6 c u l e s p a r cm2 ( c o n c e n t r a t i o n super f i c i e l l e ) ,

d u \?rL ~ - -

tit

Si A est l ' a i r e p a r m o l 6 c u l e s en cm2 (a i r e mol6- culaire) , le c h a n g e m e n t d ' a i r e p a r cm2, dfi au d6part de dn mol6cu les , est Adn . Le c h a n g e m e n t mesur6 de l ' a i r e to t a l e S 6 t an t dS, le c h a n g e m e n t

dS par cm 2 est auss i d e - - .

S

d n 1 dS On a d o n e - - A - - - -

dt d t S

d n 1 1 dS 1 et Vn = - - - - = - - - - - - - - = Vs

( i t A ( i t S A

b) Vitesse en masse, V,a : E l le e x p r i m e la m a s s e en gr de s u b s t r a t h y d r o l y s 6 p a r cm 2 de s u r f a c e et par s econde :

d m V m - -

dt

La masse m o l a i r e d u s u b s t r a t 6 t a n t M, et le nombre d ' A v o g a d r o N, la m a s s e d ' u n e m o l 6 c u l e

M est - .

N

Un n o m b r e dn de mo16cules h y d r o l y s 6 e s p a r em 2 c o r r e s p o n d d o n e h u n e m a s s e

M d m = - - d n

N (1'o11

V m ~ - - d m M d n M M

- - - - Vn ~- Vs dt N d t N AN

La vi tesse V s 6 t an t d 6 t e r m i n 6 e d i r e c t e m e n t h par t i r des seules m e s u r e s de c h a n g e m e n t d ' a i r e au

c o u r s du t e m p s , V n ou V m p e u v e n t en 6 t re d 6 d u i t e s en m u l t i p l i a n t p a r des f a c t e u r s c o n s t a n t s .

Isothermes des Couches.

Le ca lcu l de la v i t c s se V m fair a p p a r a i t r e la n6cess i t6 de c o n n a i t r e l ' a i r e m o l 6 c u l a i r e A ou au m o i n s l ' a i r e sp6ci f ique p a r gr ou mgr . Mais ce t te a i r e est f o n c t i o n de la p r e s s i o n supe r f i c i e l l e et, d a n s tous les cas (Vs, V= ou Vm), la c o n n a i s s a n c e tie l ' i s o t h e r n l e de la c o u c h e m o n o m o l 6 c u l a i r e du s u b s t r a t es t i n d i s p e n s a b l e . On pou t a in s i t r a d u i r e une p r e s s i o n supe r f i c i e l l e c h o i s i e en u n e a i r e m o l 6 c u l a i r e (ou u n e a i r e p a r gr.) d 6 t e r m i n 6 e et 6 t u d i e r la v a r i a t i o n de la v i t esse de r 6 a c t i o n en f o n c t i o n soi t de l ' a i r e m o l 6 c u l a i r e (a i re en A2 o c c u p 6 e p a r m o l 6 c u l e su r la su r f ace ) , so i t de la c o n c e n t r a t i o n supe r f i c i e l l e ( h o m b r e de m o l 6 c u l e s p a r cm2 --- de l ' o r d r e de 1014 p a r era2). P o u r les c o u c h e s de s u b s t r a t pu r , l ' i s o t h e r m e d o n n a n t la p r e s s i o n supe r f i c i e l l e ~: en f o n c t i o n de l ' a i r e mol6- c u l a i r e A est ~ tab l ie u n e fois p o u r t ou t e s darts u n e 6 tude p r 6 1 i m i n a i r e . P o u r les c o u c h e s mix te s , l ' 6 tude de la r 6 a c t i o n ef fec tu6e 'h d i f f ~ r e n t e s p r e s - s i o n s su r c h a q u e m41ange do i t 6 t re p r 6 c 6 d 6 e de l ' 6 t a b l i s s e m e n t de l ' i s o t h e r l n e :: = f (A) qui cor- r e s p o n d h ce m61ange, en p r e n a n t p o u r A, soi t l ' a i r e p a r m g (lu m61ange, so i t l ' a i r e m o l 6 c u l a i r e m o y e n n e .

REMARQUES E T C O N C L U S I O N .

l l est n 6 c e s s a i r e d ' i n s i s t e r e n c o r e su r la ( l if t& r e n c e e n t r e ]a v i t e s se te l le qu ' e l l e s ' i m p o s e p o u r les r 6 a e t i o n s supe r f i e i e l l e s et la v i tesse de r 6 a e t i o n tel le qu ' e l l e est d6f in ie en e i n 6 t i q u e e n z y m a t i q u e c l a s s ique .

En c i n 6 t i q u e c l a s s i q u e les m e s u r e s p o r t e n t sur la v a r i a t i o n de la c o n c e n t r a t i o n vohunique c p a r un i t6 de t e m p s : d e / d t , l c i le m a i n t i e n de la t o u c h e de s u b s t r a t sous u n e p r e s s i o n supe r f i e i e l l e e o n s t a n t e , et p a r su i t e h u n e c o n c e n t r a t i o n s u p e r - f ie iel le F c o n s t a n t e (en p r 6 s e n c e d ' u n e c o n c e n t r a - t i on fixe en e n z y m e ) a u r a i t p o u r a n a l o g u e une r 6 a e t i o n e n z y m a t i q u e en p h a s e h o m o g 6 n e qui s e r a i t e f fee tu6e 'a p r e s s i o n o s n m t i q u e c o n s t a n t e , c 'es t - ' a -d i re h c o n c e n t r a t i o n c o n s t a n t e du s u b s t r a t , au t o u r s du t e m p s . D a n s ees c o n d i t i o n s la m e s u r e qui s ' i m p o s e r a i t s e r a i t ce l le de la v a r i a t i o n du vo tmne , la c o n c e n t r a t i o n du s u b s t r a t d e m e u r a n t c o n s l a n t e (cel le de l ' e n z y m e auss i ) . R a p p e l o n s que le p r o d u i t de la r 6 a c t i o n se t r o u v e 61imin~ "h c b a q u e i n s t a n t .

La v a r i a t i o n du vo lume , d r / d r , s e r a i t 6v idem- m e n t p r o p o r t i o n n e l l e au v o l u m e to ta l v, de so r t e

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1.

32 D. G. Deruichian.

que, p o u r d o n n e r h la m e s u r e une v a l e u r sp6ci=

fique, on en v i e n d r a i t h d6finir une vi tesse sp6ci-

fique : V s = - - 1 / v . d v / d t

Ceci c o r r e s p o n d en d6f in i t ive fi la d 6 t e r m i n a t i o n

de la f r ac t i on de la quan t i t6 de subs t ra t d m / m qui , c o n c e n t r a t i o n cons tan te , d i spa ra i t p a r uni t6 de

temps. En effet, pu i sque la c o n c e n t r a t i o n c e s t cons t an te et que v = re~c,

V s = - - 1 / v . d v / d t = - - 1 / m d m / d t . (3)

Ains i l ' i n t r o d u c t i o n d 'une vi tesse sp6ci f ique se t r o u v e impos6e p a r les c o n d i t i o n s m6me de la

m6 thode de mesure .

La r e l a t ion d6f inissant la v i tesse sp6ci f ique /~

c o n c e n t r a t i o n cons t an te peut aussi s ' 6c r i re

- - d m / d t = V~m. (4)

I1 faut b ien r e n m r q u e r qne l:l re la t ion (4) est

f o n c i b r e m e n t d i f f6rente de la re la t ion c lass ique

d 'une r6ac t ion du p r e m i e r o r d r e :

- - dc ..... = kc, (5) dt

Celle-ci s ' e f fec tue h vo lume cons tan t et, pu i sque c = m / v , on pent en d6du i re que

- - d n l

kin. (6) dt

En c o m p a r a n t les r e l a t ions (4) et (6) on sera i t tent6 de c o n c l u r e qne V~ est i d e n t i q u e h k. Or, i l

n ' en est r ien, ca r la re la t ion (6) c o n c e r n e le cas oh le v o l u m e est cons t an t et la c o n c e n t r a t i o n

var iab le , et l 'on salt que k est i n d 6 p e n d a n t de c,

sans cela la r6ac t ion ne se ra i t pas du p r e m i e r ordre . Pa r cont re , la re la t ion (4) c o n c e r n e le cas

ou la c o n c e n t r a t i o n est cons tan te et le v o l u m e var iab le . V , bien q u ' i n d 6 p e n d a n t e de m e t v, peut ,

a ins i que nous le v e r r o n s p lus bas, 6tre fonc t i on

de la c o n c e n t r a t i o n .

Tou t ce qui v ien t d '6 t re dit est une t r anspos i -

t ion an cas des r6ac t ions en v o l m u e de ce qui a 6t6

d6fini et mesur6 dans les r6ac t ions sur une sur-

face. I c i les a i res S se subs t i tuen t aux vo lmnes v, - - d S

et dt -- V~. Ou bien, si nl est la quant i t6 c~e

subs t ra t se t r o u v a n t '~ la su r face h un ins tan t

donn6,

- - d nl . . . . . . ~ V s . n l

dt

Mais, si I" r ep r6sen te la c o n c e n t r a t i o n superfi- ciel le , e x p r i m 6 e p a r e x e m p l e en mo16cul~es pa r era2, on ne dol t pas en d6dui re que

- - d F = k l ' ,

dt

En effet, ~ 1 'occasion d 'un cas p a r t i c u l i e r qui sera examin6 dans le s econd de cet te s6rie d 'ar - t ic les , nous m o n t r e r o n s que V s va r i e cons id6rab le - m e n t avec la c o n c e n t r a t i o n super f ic ie l le F. Du p o i n t de vue c lass ique , la r6ac t ion n 'es t done pas du p r e m i e r o rdre . C e p e n d a n t cec i a p p a r a l t mo ins i m p o r t a n t que le fair trbs in t6ressan t que V~ var ie b r u s q u e m e n t lo r sque l ' on passe pa r ce r ta ines c o n c e n t r a t i o n s superf ic ieHes (ou a i res mol6cu- la i res) pa r t i cu l i6 res .

I1 faut soulign.er aussi que les c o n d i t i o n s de cet te h y d r o l y s e d 'un subs t ra t 6ta16 en couche

m o n o m o l 6 c u l a i r e se pr6te d ' une fa~on trbs favo-

rab le ~ l '6.1aboration d ' une th6or ie . Pu i sque le

subs t ra t est m a i n t e n u ~ une c o n c e n t r a t i o n superfi-

c ie l le cons tan te , en p r6sence d 'une c o n c e n t r a t i o n

fixe en enzyme, a lors que le p r o d u i t d,e la r6ac t ion se t r o u v e 61imin6 ,h chaque ins tant , la v i tesse sp6- c i f ique V~ mesur6e a p p a r a i t c o m m e une mesu re

d(e l ' e f f icaci t6 des chocs des mol6cu les de l ' e n z y m e sur cel les du strbstrat m a i n t e n u e s f x e s . De plus, une th6or ie bas6e sur des f r6quences de co l l i s ion

se t rouve ribs le d6par t s implif i6e, t )uisqu ' i l ne faut e n v i s a g e r que la co l l i s ion des mol6cules de

l ' e n z y m e sur une su r face cons t i tuee p a r Fen-

semble des mol6cules du substrat . II faut r emar - q u e r aussi que routes les mol6cules dans la couehe

sont or ient6es , c 'es t -h-di re que toutes les mol6- cules du subs t ra t p r6sen ten t de f acon i d e n t i q u e le

site impl iqu6 clans la r6ac t ion . Enfin , modi f i e r la c o n c e n t r a t i o n superf ic ie l le , c 'es t -h-di re l ' a i r e mol6-

cu la i re m o y e n n e du substra t , r e v i e n t /~ modi f ie r d 'une fa~on c o n n u e la c ible p o u r la mol6.cule d 'en- zyme qni v ien t f r a p p e r la surface . Cette modif ica-

t ion de la c ib le peu t se f a i r e soi t en cc~mprimant ou d6 tendan t les mol6cules de la couche de sub-

strat , soit en i n t e r c a l a n t en t re ces mol6cu les des

mol6cules 6 t rangbres suscep t ib les d ' a c t i v e r ou

d ' i n h i b e r la r6ac t ion . Une 6tu, de para l l~ le des

c h a n g e m e n t s de l '6tat p h y s i q u e de ta couche de substrat , soi t en fonc t i on de la densi t6 superf iciel-

le, soi t en f o n c t i o n de la c o m p o s i t i o n (cas des

m61anges), f ou rn i t des r e n s e i g n e m e n t s sur les

6nergies d ' i n t e r a c t i o n mol6cu la i re . On peru ainsi

esp6rer r e l i e r les va r i a t i ons de ces 6nergies aux

va r i a t i ons de la v i tesse de r6ac t ion .

I;IOCH1MIE. 1971, 53, n ° 1.

Rdac t ions e n z y m a t i q u e s sur une in t e r face . 33

R~suM~.

La r~action d 'une enzyme d issoute darts l ' cau avec une couche monomol~cula i re de s u b s t r a t ~tal~e h sa surface cst suivie en m e s u r a n t avec precision, sous pression superficielle constante , ]a quan t i t t ~ de sub- strat qui d i spara i t pa r uni td de temps.

Une nouvellc d~,finition de la vitesse de rdactio~ est donn~e qui est adapt~e h c e s condi t ions part icu- lieres. La d i scuss ion por te sur les avan tages de telles mesures, effeetug~es d i rec tement h l '~chelle moldcu- laire sur un subs t r a t dont les moldcules sont toutes orient~es et dont l 'aire mol~culaire est d~terminde.

ZUSAMMENFASSUNG.

Die Reakt ion eines im W a s s e r gel6sten Enzyms rail einer m o n o m o l e k u l a r e n Subs t ra t sch ich t , welche aui

der Wasseroberfl~tche ausgebre i te t wird, wi rd ver- folgt, indem ]nan die per Zei te inhei t versehwindende Subs t r a tmenge u u t e r k o n s t a n t e m Oberfli ichendruck genau miss t .

Einc neue Definition der Reakt ionsgeschwindigkei t , welche an diese besonderen Bedingungen angepass t ist, wird gegcben. Die Vortei le solcher Messungen, welche direkt an e inem Subs t r a t gemacht werden. dessen Molekiile alle or ien t ie r t siud und dessen Mole- kularfl~iche b e s t i m m t ist, werden besproehen .

BIBLIOGRAPHIE.

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