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Membranes biologiques : vers un modèle physique

Le modèle fondateur de Singer et Nicolson proposé pour décrire les membranes biologiques postulait unematrice fluide formée par une bicouche lipidique dans laquelle les protéines sont distribuées de manièrealéatoire et libres de diffuser. Les expériences menées depuis, principalement par des mesures de ladiffusion, ont cependant révélé une grande complexité de l’organisation dynamique des membranesbiologiques, reliée aux fonctions biologiques qui y sont accomplies. Ce domaine de recherche très actifréunit aujourd’hui une communauté scientifique interdisciplinaire œuvrant à établir un modèle plus réalistedes membranes cellulaires.

es cellules vivantes renferment une importantequantité de membranes qui assurent une grandediversité de rôles, en faisant une composante

omniprésente et essentielle de la vie cellulaire. Leurfonction première est sans aucun doute la comparti-mentation. Celle de la cellule elle-même, par la mem-brane plasmique, mais également du noyau, par lamembrane nucléaire, et des autres organites internes(tels l’appareil de Golgi ou le réticulum endoplasmique).Le transport de matériel (protéines) d’un compartimentà un autre de la cellule est par ailleurs pris en charge pardes vésicules « cargos », particules sphériques envelop-pées par une membrane, qui se déplacent en suivant lesautoroutes de la cellule que sont les filaments du cytos-quelette. Les membranes assurent l’intégrité descompartiments qu’elles délimitent en empêchant oufreinant considérablement le libre passage de macro-molécules et d’ions. Un transport actif et régulé est tou-tefois assuré à travers la membrane pour permettre leséchanges nécessaires à la survie et au fonctionnementcellulaire, ainsi que la transduction du signal qui trans-forme une information reçue à la périphérie de la cellulesous forme de photon, ion, petite molécule ou macro-molécule en cascade d’événements biochimiquesconduisant à la réponse cellulaire.

Les membranes biologiques ont deux constituantsprincipaux, représentant chacun environ 50 % en masse :les lipides et les protéines. Les lipides sont des moléculesamphiphiles qui comportent deux parties distinctes :une tête polaire (hydrophile) et deux chaînes d’acidesgras (hydrophobes). En milieu aqueux, les interactionshydrophobes conduisent à un auto-assemblage supra-moléculaire spontané des lipides en bicouche. Les chaî-nes d’acide gras sont au centre pour minimiser leurcontact avec l’eau, et les parties polaires sont en péri-phérie, en contact avec l’eau. Parmi l’immense familledes lipides qui se distinguent en particulier par des têtespolaires de nature et état de charge différents, le choles-térol, abondant dans les cellules animales (il représente20 à 50 % des lipides de la membrane plasmique),

occupe une place particulière. Il altère l’ordre des chaî-nes d’acides gras des lipides environnants au point depouvoir modifier l’état de phase de la bicouche lipidique(voir encadré 2). On distingue par ailleurs deux types deprotéines membranaires. Les protéines intrinsèques outransmembranaires sont insérées dans la membrane et latraversent de part en part, leur cœur hydrophobe au con-tact des chaînes d’acide gras des lipides et leurs partiespolaires plus ou moins protubérantes des deux côtés de lamembrane. Les protéines extrinsèques ou périphériquessont accolées à la membrane, par des interactions élec-trostatiques ou par des ancrages (chaînes carbonées ouséquence d’acides aminés hydrophobes).

En l’absence de liaisons covalentes entre l’ensembledes constituants membranaires, leurs interactions sontfaibles et la membrane peut généralement être considé-rée comme un fluide bidimensionnel, ce qui confèreaux lipides et aux protéines une grande dynamique dif-fusionnelle. Néanmoins, la grande variété de lipides etde protéines (plusieurs milliers) au sein d’une mêmecellule, ainsi que le caractère hors équilibre de ce sys-tème vivant, en font un système multi-moléculairecomplexe fortement inhomogène. Les membranes sontainsi caractérisées par des hétérogénéités de distri-bution et d’état de phase de leurs constituants, à deséchelles allant de la dizaine de nanomètres à la dizainede microns. Un degré de complexité supplémentaireprovient de l’environnement immédiat de la membranesusceptible d’interagir avec les protéines mais égalementles lipides (figure 1). Du côté intracellulaire, le cytos-quelette sous-membranaire est un réseau de filamentsd’actine ponctuellement ancré à la membrane. Du côtéextra-cellulaire, le glycocalix est formé par des chaînessaccharidiques ramifiées greffées sur des moléculesmembranaires.

Un grand défi de la biologie, que la physique devraitaider à relever, est d’établir et de comprendre les rela-tions entre la subtile organisation dynamique des mem-branes et les fonctions biologiques qui y sontaccomplies. Bien entendu, une description précise de la

L

Article proposé par : Laurence Salomé, laurence.salome@ipbs.fr, Institut de pharmacologie et de biologie structurale, UniversitéToulouse 3/CNRS, Pierre-François Lenne, lenne@fresnel.fr, Institut Fresnel, Université Aix-Marseille 1/Université Aix-Marseille 3/CNRS, etNicolas Destainville, Laboratoire de physique théorique, nicolas.destainville@irsamc.ups-tlse.fr, Université Toulouse 3/CNRS

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Membranes biologiques : vers un modèle physique

membrane est illusoire, et surtout inutilepour répondre à ces questions aux échellesde temps et d’espace d’intérêt. Il s’agit plu-tôt de proposer une modélisation réalistecapable d’appréhender les caractéristiquespertinentes de la membrane.

L’évolution du concept de membrane biologique

Les premiers modèles de la membranecellulaire remontent à la fin du XIXe siècle.Ils sont fondés sur les similarités qui existententre les propriétés des membranes cellulai-res et les lipides tels que ceux présents dansl’huile d’olive. En 1925, les biologistesGorter et Grendel solubilisent les lipides deglobules rouges et les déposent à la surface de l’eau dansune cuve de Langmuir. En mesurant les aires de lamembrane du globule rouge et de la mono-couchedéposée, ils déduisent que la membrane est forméed’une double couche de lipides. Les protéines entrentdans la description quelques années plus tard mais leurlocalisation et leur distribution restent à élucider. Cettequestion demeure encore d’actualité. Entre 1940 et1950 apparaissent deux techniques qui permettent desprogrès rapides dans la connaissance de la structure cel-lulaire et de la membrane plasmique : l’ultracentrifuga-tion différentielle et la microscopie électronique. Lesobservations de microscopie électronique renforcentl’hypothèse de bicouche, révèlent l’asymétrie de lamembrane et suggèrent la présence de structures globu-laires, composées de protéines. Après diverses spécula-tions, le modèle de mosaïque fluide est proposé parSinger et Nicolson en 1972. La membrane y est décritecomme une bicouche fluide dans laquelle sont inséréesdes protéines pouvant y diffuser librement. Ce modèleprévaut encore actuellement.

Que révèle la diffusion des protéines et des lipides ?

A peine quelques années plus tard, les techniques deFRAP et FCS (pour « Retour de fluorescence aprèsphoto-blanchiment » et « Spectroscopie de corrélationde fluorescence », voir encadré 1) étaient développéespar W.W. Webb, grand pionnier (encore en activité)dans le développement d’outils expérimentaux de laphysique pour l’imagerie et la spectroscopie de cellulesbiologiques. Les premiers résultats ont soulevé d’embléedeux questions fondamentales encore non résolues : – quelle est la cause du ralentissement des protéines dansles membranes plasmiques cellulaires ? La constante dediffusion d’une protéine y est effectivement de l’ordrede 0,1 µm2/s, soit un à deux ordres de grandeur plus

faible que dans une membrane modèle constituée d’unebicouche lipidique pure dans laquelle sont insérées desprotéines en faible concentration. La diffusion seraitdonc limitée soit par un fort encombrement en protéi-nes, soit par un confinement (éventuellement tempo-raire) des protéines dans des domaines membranaires ;– quelle est l’origine des hétérogénéités de distributionlatérale à l’échelle micro et submicrométrique ? Les frac-tions de lipides et protéines mobiles à la surface de cel-lules vivantes accessibles par FRAP, toujours inférieuresà 1, sont là aussi la signature que leur diffusion est forte-ment perturbée par des hétérogénéités membranaires.

Il n’a fallu ensuite attendre qu’une décennie pourque se développe la technique de Suivi de particule uni-que (Single Particle Tracking ou SPT, suivi du SingleMolecule Tracking ou SMT, voir encadré 1) permettantla détection et le suivi de molécules individuelles avecune résolution spatiale nanométrique. Avoir ainsi accèsaux comportements individuels, masqués dans les mesu-res d’ensemble obtenues en FRAP ou FCS, a permis derévéler une grande diversité des modes de diffusion, nonseulement entre molécules différentes, mais aussi au seind’un échantillon de molécules identiques dans unemême cellule. Une caractéristique remarquable des tra-jectoires de SPT ou SMT est qu’elles montrent trèsgénéralement un confinement de la diffusion aux tempscourts (< 1 s), dans des domaines dont le diamètre variede quelques dizaines à quelques centaines de nanomè-tres. Ce confinement peut être temporaire, en alter-nance avec des périodes de diffusion libre, oupermanent. Dans ce dernier cas, peut se superposer àcette diffusion confinée une diffusion plus lente auxtemps longs (> 1 s). Un tel comportement est révélé parle déplacement quadratique moyen de la position(cf. figure 2 de l’encadré 1).

Ces observations ont donné lieu à l’émergence deplusieurs modèles d’organisation dynamique des mem-branes, proposant différentes origines au confinement(voir encadré 2). Ainsi, dans le modèle de « corrals », ce

Figure 1 – Schéma de la membrane plasmique, avec ses composants évoqués dans le texte. Labicouche a une épaisseur de l’ordre de 5 nm. D’après Greg Geibel, http://sun.menloschool.org/∼cweaver/cells/c/cell_membrane/.

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Analyser la diffusion des molécules membranairesEncadré 1

L’étude de la diffusion utilise couramment des monta-ges de microscopie optique, le plus souvent de fluores-cence. La conjugaison d’un fluorophore peut se faire parvoie chimique ou génétique. Les méthodes de FRAP etFCS réalisent une mesure moyenne, alors que les SPT etSMT suivent des molécules uniques et permettent unecaractérisation plus fine des sous-populations.

1) « FRAP » ou Retour de fluorescence après photo-blanchiment : l’intensité de fluorescence est mesurée dansune zone bien définie après photodégradation des sondespendant un temps court. L’analyse du retour de fluores-cence, dû à la diffusion des molécules marquées non-pho-todégradées extérieures à cette zone (figure 1a), fournit laconstante de diffusion (dans une gamme comprise entre 10−3

et 10 µm2/s) et la fraction de molécules mobiles. La réalisa-tion d’expériences à taille de zone variable (de 1 à 5 µm)permet d’identifier s’il existe une compartimentation del’espèce diffusante, et d’estimer la taille des compartiments(> 150 nm).

2) « FCS » ou Spectroscopie de corrélation defluorescence : c’est une méthode d’étude des fluctuationsde fluorescence produites par un petit nombre de molé-cules entrant et sortant d’un volume d’observation d’unefraction de femtolitre, défini par un faisceau laser focalisé(figure 1b). Le temps de diffusion τd d’une espèce molé-

culaire est déduit de la fonction d’auto-corrélation tempo-relle g(2) (τ) = ⟨I(t) I(t + τ)⟩/⟨I(t)⟩2, où I(t) est l’intensité defluorescence. Dans le cas simple d’une diffusion brow-

nienne libre, , où N est le

nombre moyen de molécules dans la surface d’observation.τd est relié au « waist » transversal w du faisceau laser focaliséet à la constante de diffusion D par τd = w2/(4D). La FCS aune excellente dynamique temporelle car la fonctiond’auto-corrélation temporelle est construite pour τ allant dela nanoseconde à la minute, et une résolution spatiale limi-tée par la diffraction optique (environ 200 nm).

3) Le suivi de molécule unique (SPT et SMT) : Lesprogrès technologiques de la décennie passée ont permis ledéveloppement du suivi des déplacements de moléculesindividuelles par vidéomicroscopie couplée à l’analysed’images. Les sondes utilisées sont soit des particules submi-crométriques (particules de latex, nanocristaux ou colloïdesd’or, couplés à la molécule d’intérêt par un anticorps), et onparle alors de suivi de particule unique ou SPT, soit desmolécules fluorescentes (suivi de molécule unique ouSMT). La résolution spatiale est de l’ordre du nanomètre.La résolution temporelle généralement imposée par lacadence vidéo peut atteindre la centaine de Hz. Aller au-delà par des techniques d’imagerie est d’ores et déjà possiblemais nécessite une puissance d’éclairement telle que l’éléva-tion de température peut biaiser les mesures sur cellulesvivantes. A partir des trajectoires des molécules, le calcul dudéplacement quadratique moyen de la position en fonctiondu temps permet de déterminer les modes de diffusion.

Figure 1 – Principes du FRAP et de la FCS. Ces deux méthodes utilisentun laser pour éclairer une petite région de la membrane (en vert) et col-lectent la fluorescence de molécules marquées (en rouge) à l’aide d’unmontage confocal. D’après Marguet et al. 2006. Dynamics in the plasmamembrane - How to conciliate fluidity and order. Embo. J., sous presse.

20151050 101 102 103 104 105 106

g(2) 1/N

A Retour de fluorescence après photoblanchiment - FRAP

Photoblanchiment Retour de fluorescence

Inte

nsité

de

fluo

resc

ence

(u. a

.)

Time (s)

τd

0.40.30.20.10 0.80.70.60.5

B Spectroscopie de corrélation de fluorescence - FCS

In

tens

ité

de fl

uore

scen

ce (u

. a.)

Time (s) Délai (µs)

τdFigure 2 – Gauche : Le schéma de principe du « suivi de moléculeunique ». La particule ou molécule (ici un colloïde d’or) suivie en vidéo-microscopie est greffée à la protéine ou au lipide d’intérêt par l’intermé-diaire d’un anticorps, en bleu ; Droite : en haut une trajectoire acquisepar cette technique (pendant 2 mn), en bas le déplacement quadratiquemoyen (MSD) de la position en fonction du temps, calculé à partir decette trajectoire. A une diffusion rapide et confinée aux temps courts sesuperpose une diffusion lente aux temps longs.

g2( ) τ( ) 1

1N---- 1

1 τ τd⁄+---------------------×+=

1 umµ

0 5 10 15t (s)

0.00

0.01

0.02

0.03

MS

Dm(t

) (µ

m2 )

t (s)

MSD

(

um )

2µ

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Modèles de domaines membranairesEncadré 2

Différents types de trajectoires impliquant un confine-ment de la diffusion ont pu être identifiés (voir texte).Chacun a été associé à un modèle propre dont nous don-nons les principales caractéristiques. Cette liste n’inclut pasles domaines visibles en microscopie électronique tels lescavéoles et vésicules recouvertes de clathrine, dont les struc-tures et fonctions sont mieux comprises, et donc moinssujets à débat.

1) Radeaux lipidiques ou « Rafts » : ce concept a étéproposé en 1988 par deux biologistes, K. Simons et G. VanMeer, pour expliquer l’asymétrie du transport membra-naire. Ces micro-domaines de quelques dizaines de nano-mètres serviraient de plates-formes de tri et de signalisation,en recrutant des protéines ayant pour eux une grande affi-nité. Ils sont décrits comme étant riches en cholestérol, gly-colipides, sphingolipides et en phospholipides présentantmoins d’insaturations que celles des lipides dans la mem-brane environnante, ce qui permet un meilleur compactagedes chaînes saturées de sphingolipides. Dans cette descrip-tion, la présence de cholestérol induirait une phase liquideordonnée ayant une fluidité plus faible que le reste de lamembrane. De nombreuses questions concernant cesmicro-domaines sont encore débattues : existent-ils (ilsn’ont en effet jamais été observés directement et n’ont puêtre mis en évidence que par des méthodes biochimiquesinvasives sujettes à caution) ? Sont-ils stables ? Quelle estleur distribution de taille et leur dynamique ? Confinent-ilsles molécules et si oui, lesquelles et comment ?

2) « Corrals » ou domaines délimités par le cytos-quelette : inspiré du modèle établi pour expliquer les com-portements diffusionnels à la surface des globules rouges, cemodèle de « barrières et piquets » (groupe d’A. Kusumi,1993 puis 2002) propose que les protéines membranairessont confinées par leur collision, soit avec les filamentsd’actine du cytosquelette sous-membranaire, soit avec desprotéines liées au cytosquelette ancrées à la membrane. Lesdomaines ont un diamètre de quelques centaines de nano-mètres. Les sauts entre domaines permis par les fluctuations

thermiques conduisent à une diffusion lente aux tempslongs. Ce modèle rend compte de la restriction de la diffu-sion observée pour les protéines ainsi que les lipides.

3) « Agrégats dynamiques » : ce modèle de « particulesbrowniennes en interaction », proposé par nos équipes en2003, fait appel à des interactions attractives entre protéinesà suffisamment longue portée comme source de leur confi-nement sous forme d’assemblées dynamiques de quelquesdizaines de protéines (pas nécessairement identiques). Entenant compte du fort encombrement en protéines desmembranes plasmiques, il décrit parfaitement les expérien-ces où la rareté des sauts exclut un modèle de corrals. Ladiffusion aux temps longs est assurée par la diffusion lentedes centres de masse des assemblées (typiquement, desassemblées de N particules ont des constantes de diffusionN fois plus faibles que les particules individuelles). Cemodèle explique la loi d’échelle, observée maintenant pourplusieurs protéines différentes, entre la constante de diffu-sion D aux temps courts et la taille L du domaine : D ∼ L2.

Figure 1 – Schéma de radeau lipidique ou « raft », et des molécules quisont supposées s’y regrouper préférentiellement. D’après le livre deB. Alberts et al., Molecular biology of the cell (Garland Publishing, NewYork, 2002).

Figure 2 – Dans un modèle de « barrières et piquets », le cytosquelette(orange) constitue des mailles de quelques centaines de nm qui bloquentpartiellement les protéines membranaires (bleu, marron, vert). Est repré-sentée ici la face interne de la membrane. D’après Fujiwara et al., 2002.

Figure 3 – Simulation d’un modèle de « particules browniennes eninteraction ». Les interactions attractives entre protéines membranaires(en rouge) assurent l’existence d’assemblées de protéines causant leurconfinement.

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comportement est attribué à des sauts entre domainesmembranaires adjacents délimités par le cytosquelette,dont la taille est de quelques centaines de nanomètres.Toutefois, des travaux récents de deux de nos équipessur le récepteur µ aux opioïdes, qui appartient à lagrande famille des récepteurs couplés aux protéines G,ont mis en évidence des mécanismes qui ne sont pasphysiquement compatibles avec ce modèle. Nous avonsélaboré un algorithme de détection de sauts dans les tra-jectoires issues de SPT, basé sur des arguments simplesde théorie de la diffusion. Il nous a permis de montrerque ces trajectoires comprennent trop peu de sauts pourpouvoir être décrites par un modèle de barrières rigides.Par ailleurs, nous avons observé que la constante de dif-fusion aux temps courts D est fortement corrélée à lataille L du domaine de confinement : D ∼ L2. Ainsi lerécepteur suivi « perçoit » l’ensemble de son domainede confinement à des temps beaucoup plus courts quecelui qu’il met pour explorer le domaine par diffusion.Ceci ne peut pas être expliqué par un modèle de corralset ne peut être compris qu’en faisant appel à un com-portement collectif des protéines membranaires. Notremodèle de « particules browniennes en interaction »(voir encadré 2) tient précisément compte d’un telcomportement collectif. Les protéines y sont coupléespar des interactions à suffisamment longue portée. Ildécrit correctement la loi d’échelle précédente, ainsiqu’une loi similaire pour la constante de diffusion DMaux grands temps : DM ∼ L2. Ce dernier point fait appelà une description de la dynamique des protéines par unmodèle de Langevin.

Grâce à sa très bonne résolution temporelle, la FCSpermet elle aussi de distinguer des comportements dif-fusifs apparemment proches, mais pouvant résulter dedifférents types d’organisation membranaire. Pour testerle modèle de domaines isolés, de type radeaux lipidiques(encadré 2), une de nos équipes a mis en œuvre uneméthode fondée sur la FCS (voir encadré 1). Une loi dediffusion FCS représente le temps de diffusion moyen τdd’une espèce moléculaire en fonction de l’aire A de lasurface d’observation. La plupart des molécules étudiéesne diffusant pas librement aux échelles d’observationentre 400 nm et 1 µm, τd n’est pas strictement propor-tionnel à A : τd = τ0 + kA, où τ0 et k sont deux constan-tes. Nous avons montré que la diffusion de moléculespiégées transitoirement dans des domaines isolés detaille sub-longueur d’onde (typiquement < 500 nm)conduit à une constante τ0 strictement positive (propor-tionnelle au temps de confinement dans un domaine),alors qu’elle est négative dans le cas d’une diffusion dansun réseau de barrières de type « corrals ». Lorsqu’ondiminue la concentration en cholestérol, le confinementrévélé par la constante τ0 disparaît pour un certain nom-bre de lipides et de protéines trouvés par des voies bio-chimiques dans les radeaux lipidiques. Ce résultat révèleune organisation en domaines isolés, sub-micromé-triques, stabilisés par le cholestérol, et confinant certai-nes molécules pendant quelques dizaines de ms. La

constante τ0, déterminée à des échelles spatiales plusgrandes que la taille des domaines, est révélatrice deprocessus de diffusion transitoire, qu’il est importantd’étudier à plus petite échelle. Dans ce but, nous utili-sons actuellement des nanostructures optiques permet-tant de réduire la surface d’observation sous la limite dediffraction. Ceci devrait nous renseigner sur des régimesde diffusion jusqu’alors inaccessibles en FCS.

Au-delà de ce type de résultat, l’enjeu est bien d’éta-blir les liens possibles entre le confinement de la diffu-sion observé et les processus biologiques impliquant lesconstituants membranaires. Des approches biochimi-ques suggèrent en effet que les protéines membranairesne sont pas simplement distribuées aléatoirement à lasurface de la cellule, mais qu’elles sont au contraire préa-lablement triées dans des compartiments favorisant leurrencontre. Ainsi, une plate-forme de signalisation estsupposée regrouper au préalable les différents acteursimpliqués dans une chaîne de transduction du signal.Une hypothèse naturelle est alors de supposer que leszones de confinement observées dans les trajectoiresindividuelles correspondent à de tels compartiments.Un modèle basé sur les interactions entre constituantsmembranaires est plus à même de proposer des solutionsintéressantes à cette problématique qu’un modèle debarrières : en jouant sur la modulation des paramètresd’interaction entre différentes espèces moléculaires, ilest susceptible de conduire à de la ségrégation, dans unmême domaine, d’espèces appelées à se rencontrer.

Sans permettre une cartographie complète, jusqu’àl’échelle moléculaire, et en temps réel de la distributiondes protéines et lipides dans la membrane, les outilsd’étude de la diffusion renseignent toutefois sur l’envi-ronnement des molécules marquées en termes de struc-turation à différentes échelles. En revanche, reconstituercet environnement à partir de l’observation de quelquesprotagonistes reste un enjeu considérable et, à l’heureactuelle, il ne semble pas exagéré d’affirmer que cestechniques ont soulevé plus de questions qu’elles n’enont encore résolues !

La physique incontournable pour appréhender ces systèmes complexes

L’histoire récente de cette discipline en émergencequ’est l’étude des membranes biologiques prouve que laphysique est appelée à y jouer un rôle central, et ceci àplusieurs niveaux. Des techniques sophistiquées faisantappel à des concepts physiques novateurs ont été déve-loppées pour sonder en temps réel cet état de la matièreà l’échelle moléculaire (nanométrique). Les conseils desphysiciens aux expérimentateurs biologistes ont égale-ment montré qu’ils pouvaient être d’une grande utilité,

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en termes de pertinence physique des hypothèses misesen avant pour expliquer telle ou telle observation.

D’autre part, ces percées expérimentales ont donnédes perspectives passionnantes aux théoriciens, qui ontenfin accès à ces échelles de temps et d’espace, soit pour ytester des développements théoriques de la matière molleparfois anciens, soit pour proposer de nouveaux paradig-mes susceptibles de rendre compte des expériences.Ainsi, le modèle de « particules browniennes en inter-action » demande pour être affiné de justement préciser lanature des interactions dominantes entre protéines. Au-delà des interactions « standard », comme les interactionsélectrostatiques (écrantées) entre protéines chargées, lesinclusions membranaires connaissent des interactionsspécifiques propagées par la membrane, non complète-ment comprises à ce jour. Ensuite, il s’agira de détermi-ner, par les outils de la physique statistique, dans quellephase thermodynamique se trouvent les assemblées deprotéines soumises à ces interactions : phases « gaz »,« liquide », « solide » ou encore phases « cluster ». Cecisans oublier qu’une membrane de cellule vivante n’estpas à l’équilibre thermodynamique puisqu’elle échangesans arrêt, de façon active, de l’énergie et de la matièreavec le reste la cellule.

Revenons aux expériences. Observer spécifique-ment une espèce moléculaire et ses partenaires dans desconditions physiologiques reste un des enjeux impor-tants de la biologie et une belle question de physique.L’étude expérimentale de la membrane cellulairerequiert des méthodes devant être la fois sensibles, peuinvasives et spécifiques. Dans ce contexte, nous avonsvu que la microscopie optique par fluorescence tientune place importante. Le développement de marqueursfluorescents performants requiert l’effort conjoint dechimistes, physiciens et biologistes. Ainsi, la synthèse denanostructures de type nanocristaux (voir Images de laPhysique 2005, p. 126) a offert récemment une alterna-tive aux sondes plus classiques, en raison de leur fortebrillance et de leur stabilité sous éclairement (très faiblephoto-blanchiment).

Si les techniques d’imagerie dont nous avons parléont a priori une résolution nanométrique, elles ne don-nent pas nécessairement accès à la dynamique à cetteéchelle, parce que les limitations en fréquence d’acquisi-tion bornent la taille des structures détectables dans les-quelles les molécules diffusent. En effet, en diffusion,pour bien observer des structures de taille L à unefréquence d’acquisition f, on doit avoir f ��D/L2, oùD est la constante de diffusion, ici de l’ordre de0,1 µm2/s. A cadence vidéo standard, f = 40 Hz et doncL �� 50 nm. Gagner un facteur 10 en L suppose gagner

un facteur 100 en fréquence, et l’imagerie rapide demolécules individuelles pose un problème technologi-que ardu encore non résolu.

La résolution spatiale est également limitée dans ledomaine de l’optique en champ lointain, en FRAP ouFCS, en raison du critère de Rayleigh. Pour contournercette limitation, la première stratégie utilise des phéno-mènes d’optique non linéaires pouvant réduire levolume d’observation par plus d’un ordre de grandeur.La seconde met à profit des structures de diffraction oudes nanostructures, qui convertissent les ondes de hautesfréquences spatiales (ondes évanescentes) en ondes pro-pagatives qu’on peut alors collecter par des systèmesoptiques traditionnels.

Les développements actuels en physique théorique(en particulier en physique statistique) et en photoniquevont certainement permettre d’atteindre une meilleurecompréhension de la structure dynamique des membra-nes cellulaires. Il est à parier qu’en dépit de la grandecomplexité de ces systèmes, la lumière pourra ainsi êtrefaite sur de nombreuses énigmes de la biologie cellulaire.

POUR EN SAVOIR PLUS

T. Fujiwara, K. Ritchie, H. Murakoshi, K. Jacobson, A. Kusumi,Phospholipids undergo hop diffusion in compartementali-zed cell membrane, J. Cell. Biol., 157, 1071, 2002.

F. Daumas, N. Destainville, C. Millot, A. Lopez, D.S. Dean, L.Salomé, Confined diffusion without fences of a G-protein-coupled receptor as revealed by single particle tracking,Biophys. J., 84, 356, 2003.

Y. Chen, B. Yang, K. Jacobson, Transient confinementzones : A type of lipid raft ?, Lipids, 39, 115, 2004.

L. Wawrezinieck, H. Rigneault, D. Marguet, P.-F. Lenne, Fluo-rescence correlation spectroscopy diffusion laws to probethe submicron cell membrane organization, Biophys. J.,89, 4029, 2005.

N. Meilhac, L. Le Guyader, L. Salomé, N. Destainville, Detec-tion of confinement and jumps in single protein mem-brane trajectories, Phys. Rev. E, 73, 011915, 2006.

P.-F. Lenne, L. Wawreziniec, F. Conchonaud, O. Wurtz, A.Boned, X.-J. Guo, H. Rigneault, H.-T. He, D. Marguet,Dynamic molecular confinement in the plasma membraneby microdomains and the cytoskeleton meshwork, EMBOJ. (sous presse), 2006.

Ont également participé à ce travail les membres de nos équipesrespectives que nous remercions : équipes « Organisation et dyna-mique fonctionnelles des membranes biologiques » (IPBS),« Mosaic » (Institut Fresnel), « Dynamic organization of molecularcomplexes in biomembranes » (CIML, Marseille) et D. Dean (LPT).