REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ETPOPULAIRE MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE -EL HADJ LAKHDER -BATNA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MEMOIRE Pour lobtention du diplme de MAGISTER En Biologie Option : Biochimie Applique Prsent par DJEMAI ZOUGHLACHESOUMIA THEME Devant le jury : * Mme HAMBABA L.Matre de confrences, universit de Batna Prsidente * Mr YAHIAM. Matre de confrences, universit de BatnaRapporteur * Mr LAROUIS.Matre de confrences, universit de BatnaExaminateur* Mme ZAAMA D.Matre de confrences, universit de Constantine Examinatrice *Mr YAHIA A. Matre de confrences, universit dOumExaminateur El Bouagui Anne Universitaire : 2008/2009 Etude de lactivit biologique des extraits du fruitdeZizyphus lotus L. Remerciement Avant toute chose, jeremercie Dieu, le tout puissant, pour mavoirdonne la force et la patience. Jexprime dabord mes profonds remerciements et ma vive connaissance Mr YAHIA M, Matre de confrences la facult des sciences Universit de Batna pour avoir encadr et dirig ce travail avec une grande rigueur scientifique, sa disponibilit, ses conseils et la confiance quil maccord mont permet de raliser ce travail. Jexprime mes vifs remerciements Mme HAMBABA L, Matrede confrences lUniversit de Batna pour sa prcieuse aide et ses conseils, et pour lhonneur quelle nous a fait en acceptant de prsider le jury de ce mmoire Je tiens exprimer galement ma profonde reconnaissance au Mr ABDEDDAIM M, Matre assistant- charg de cours de lUniversit de Batna tout dabord pour mavoir fait confiance et pour mavoir inspir le sujet ensuite pour ses orientations judicieuses. Je tiens exprimer ma trs grande considration et ma vive reconnaissance Mme ZAAMA D, Matre de confrences Universit de Constantine pour lhonneur quelle nous a fait en acceptant de faire partie de jury. Mes remerciements Mr YAHIA A, Matre de confrences Universit de Oum ElBougui davoir bien voulu accepter de juger ce travail. Mes remerciements vont galement Mr LAROUI S, Matre de confrences Universit de Batna davoir accepter de faire partie du jury. Jexprime mes vifs remerciements aux Mr ABERKANE M-CH et Mr AYACHI qui nous permet de raliser une grande partie de mon travail au sein de leurs laboratoires. En guise de reconnaissance, je ddie ce travail mes chers parents, ma famille ainsi qu toutes mes amies. Sommaire Liste destableaux Liste desFigures Introduction gnrale Partie I Etude bibliographique Chapitre I. Gnralits sur le Zizyphus lotus I-1-Description botanique du Zizyphus lotus ..1 I-2-Classification botanique 1 I-3-Rpartition gographique.2 I-4-Composition biochimique du Zizyphus lotus 3 I-5-Activits biologiques et thrapeutiques du Zizyphus lotus4 I.5.1. Activits anti-inflammatoires et analgsiques 4 I.5.2. Activits anti-fongiques et anti-mollusques .4 I.5.3. Activits anti-ulcrogniques4 I.5.4. Autres activits .5 Chapitre II. Les composs phnoliques II.1. les flavonodes 7 II.1.1.Localisation et distribution 7II.1.2.Structure chimique et classification.. 7 II.1.3.Activits biologiques des flavonodes..8II.2. Les tanins 12 II.2.1. Localisation et distribution.. 12 II.2.2.structure chimique et classification.. 12 II.2.3.Activits biologiques et thrapeutiques des tanins. 14 Chapitre III : Les espces ractives oxygnes et stress oxydant III.1.les espces ractives oxygnes19 III.2. Sources des espces ractives oxygnes20III.2.1.sources exognes.20 III.2.2. Sources endognes21 III. 3. Stress oxydant23 III.4. Les antioxydants.23III.4.1. Les antioxydants enzymatiques..23 III.4.2. les antioxydants non enzymatiques 24 Partie II Etude Exprimental Chapitre I.Matriel et mthodesI.1. Matriel25 I.1. 1. Matriel vgtal 25 I.2. Mthodes. 25 I.2.1. Dtermination de la teneur en eau 25 I.2.2. Dtermination de la teneur en cendre26 I.2.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus . 26 I.2.3.1. Extractions avec des solvants polarit croissante.26 I.2.3.2. Extrait aqueux .. 26 I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus 27 I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus..27 I.2.4.1.1.Tests prliminaires 27 I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince 28 I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18.28 I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus29 I.2.4.2.1. Dosage des polyphnols29 I.2.4.2.2. Dosage des flavonodes. 29 I.2.4.2.3. Dosage des tanins condenss. 30 I.2.5. Tests des activits biologiques. 30 I.2.5.1. Activit antimicrobienne... 30 I.2.5.2. Tests dactivit antioxydante.31 I.2.5.2.1. Test du blanchissement du carotne31 I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH... 32 I.2.5.2.3. Analyses statistiques.. 32 Chapitre II. Rsultats et discussionII.1. Dtermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus.33 II.2. Dtermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus33 II.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus34II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus. 35II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus ... 35 II.4.1.1.Test prliminaire. 35 II.4.1.2. Analyses chromatographiques.36 II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince 36 II.4.1.2.2. Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18 39 II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus...44 II.5. Activits biologiques.........................................................................................49II.5.1. Activit antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus ...49 II.5.2. Activit antioxydante 52 II.5.2.1. Test du blanchissement du -carotne52 II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH56Conclusion gnraleRfrences bibliographiques Liste des abrviations AAR : Activit antioxydante relative ANOVA : Analyse de variance APR : Pouvoir antiradicalaire AQ: Extrait aqueux ATTC : Collection du type Amricain de culture BHT: Butylated hydroxytoluen BAW: n-Butanol/Acide actique/eau CCM: Chromatographie sur couche mince DMSO: Dimthylsulfoxyde DPPH:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50: Concentration effective 50% EDCM: Extrait dichloromthanique ET: extrait thrique HPLC: Chromatographie liquide haute performance IC50: Concentration inhibitrice 50% MET:Extrait mthanolique Mg EAG/g dextrait: milligramme dquivalent acide gallique par gramme dextrait Mg ECT/g dextrait : milligramme dquivalent catchine par gramme dextrait Mg EQ/g dextrait : milligramme dquivalent querctine par gramme dextrait MO : Matire organique RF : Rapport frontal SD : Standard dviation TR : Temps de rtention UV : Ultrat violet Liste des tableaux

N0 du tableauTitredu TableauPage Tableau1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en mtabolite primaire..3 Tableau 2.Composition en mtabolites secondaires des diffrents organes de Zizyphus lotus ................................................................................................ 3 Tableau 3. Principales espces ractives oxygnes ...19 Tableau 4.La teneur en eauet de matire sche des fruits du Zizyphus lotus ...............33 Tableau 5. La teneur en cendre et de matire organique des fruits du Zizyphus lotus 33 Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit du Zizyphuslotus................................................................................................................ 34 Tableau 7. Rsultats des testes prliminaires des flavonoides et des tanins sur les diffrents extraits du Zizyphus lotus............................................................... 35 Tableau 8.Rapports frontaux et couleurs aprs rvlationdes standards...38 Tableau 9. Temps de rtention des standards tests 41 Tableau 10. Les standards dtects dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus............41 Tableau 11.Dosage des polyphnols totaux, des flavonoides et des tanins condenss dans les diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus 45 Tableau 12.Diamtres des zones dinhibition de la croissance microbienne obtenus par diffrents extraits du Zizyphus lotus .............................................................. 49 Tableau 13.Activit antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus..

57 Listes des figures N0 de figure Titres des figures Page Figure 1. Les diffrentes parties du Zizyphus lotus...1 Figure 2.Aire de rpartition du Zizyphus lotus L en Algrie...2 Figure 3. Quelques structures des composs phnoliques6 Figure 4. Squelette de base des flavonoides..........................................................7 Figure 5. Elments essentiels pour lactivit antioxydante des flavonoides.........10 Figure 6. Pigeage des espces ractives oxygnes par les flavonoides.............10 Figure 7. Structure des tanins condenss et leur monomre.13 Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associs..14 Figure 9. Les diffrentes espces ractives oxygnes.20 Figure10. Origine et rponse cellulaire aux ROS..24 Figure 11.Diffrentes parties du fruit du Zizyphus lotus........25 Figure 12.Diffrentes tapes dextraction par puisement successive du matriel vgtal 27 Figure 13.La raction entre la vanilline est les tanins condenss..........................30 Figure 14.Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du Zizyphus lotus aprs rvlation par la vanilline sulfurique............... 36 Figure 15.Chromatographiesurcouchemincedesextraitsdesfruitsdu Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))..... 37 Figure16.Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du Zizyphus lotus (Rvlation par la vanilline sulfurique) 37 Figure 17.Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Rvlation par une solution de DPPH). 38 Figure 18.Chromatogrammes des diffrents standards tests dans lHPLC40 Figure 19.Chromatogrammes obtenus pour lextrait thrique du Zizyphus lotus....................................................................................................... 42 Figure 20.Chromatogrammesobtenuspourlextraitdudichloromthanedu Zizyphus lotus 43 Figure 21.Chromatogrammes obtenus pour lextrait mthanolique du Zizyphus lotus 43 Figure 22.Chromatogrammes obtenus pour lextrait aqueux du Zizyphus lotus44 Figure 23.Droite dtalonnage de lacide gallique.............................................46 Figure 24.Droite dtalonnage de la querctine. . 47 Figure 25. Droite dtalonnage de la catchine.......................................................47 Figure 26.Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et laquantit des flavonoides des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05). 48 Figure 27.Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la quantit destanins condenss des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05)......................................................................................... 48 Figure 28.Structure de la paroi bactrienne...50 Figure 29.Zones dinhibitions obtenues par diffrents extraits.............................. 51 Figure 30. Figure 31. Figure 32. Structure chimique de -carotne.. Cintique de blanchissement du -carotne 490 nm en absence et enprsence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT............................Activit antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus, duBHTdans le systme carotne/acide linolique... 52 54 54 Figure 33.Corrlation linaire entre la teneur en polyphnols et le pourcentagede lactivit antioxydante relative....................... 55 Figure 34.Corrlation linaire entre la teneur en tanins et le pourcentage de lactivit antioxydante relative.. 55 Figure 35.Raction dun antioxydant avec le DPPH.............................................56 Figure 36.Activit antiradicalaire des extraits polaires (MET, AQ) des fruitsduZizyphus lotus.. 59 Figure 37.Activit antiradicalaire des extraits apolaires (DCM, ET) des fruitsdu Zizyphus lotus. 59 Figure 38.Activit antiradicalaire des standards la querctine , le BHT,la rutine et la vitamine C.. 60 Figure 39.Corrlation linaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoirantiradicalaire(p0,01). 60 Introduction gnrale Lesplantesmdicinalesreprsententunesourceinpuisabledessubstanceset compossnaturelsbioactifs.Eneffet,lesmtabolitessecondairesfontetrestent lobjet de nombreuses recherches in vivo comme in vitro, notamment la recherche de nouveaux constituants naturels tels que les composs phnoliques. Rcemmentledveloppementdelarsistancemicrobienneauxantibiotiques,et latoxicitdesantioxydantssynthtiques,aconduitdechercherdessubstances naturelles dotesdactivit antimicrobienne et antioxydante. Lesradicauxlibres(RL)engnraletlesespcesractivesdeloxygne(ROS) enparticuliersontimpliqusdansplusieurspathologieshumainesallantde linflammationaucancertoutenpassantparlesmaladiescardio-vasculaires, larthriterhumatode,lediabteetleprocessusdapoptose ;enplusdeleuraction directe en ragissant avec la plupart des macromolcules. Dans ce contexte sinscrit ce prsent travail de recherche, dont le but principal est dtudier les activits antimicrobiennes et antioxydantes des diffrents extraits du fruit duZizyphuslotus(Sedra),plantelargementutilisedanslamdecinetraditionnelle commeadoucissantdansletraitementdelagorgeetlesirritationsbroncho-pulmonaires,unmollientdansletraitementdesfuroncles.Dailleurs,ellepossde plusieursactivitsthrapeutiques :anti-inflammatoire,analgsique,anti-ulcrognique, antifongique et antidiabtique Dans ce prsent travail, nous avons fix les objectifs suivants : Analyse qualitative des diffrents extraits aqueux et organiques du fruit du Zizyphus lotus en utilisant la CCM et lHPLC Analyse quantitative du contenu en polyphnols, et en flavonoides et tanins des diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus. Etudedelactivitantimicrobiennedesdiffrentsextraitsdufruitdu Zizyphus lotus Etude de lactivit antioxydante des diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus, en utilisant deux mthodes (Test de blanchissement du -carotne et test au DPPH). Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus

1 I.1. Description botanique du Zizyphus lotus LeZizyphuslotus(jujubier)estunarbustefruitier,pineuxappartenantlafamille desRhamnaces(RsaissietBouchache,2002).CommunmentappelenAfriqueduNord Sedra (Borgi et al ., 2007(a)). Il forme des touffes de quelques mtres de diamtres pouvant atteindre 2m de haut. Sesfeuillessontcourtementptioles,glabres,caduquesalternesetovalesmarges entires.Chaquefeuilleportesabasedeuxstipulestransformesenpineingaleet vulnrable.Lesfleurssontjaunes,pentamtresetgroupeseninflorescencecymeuses.Les fruits sont des drupes noyaux souds, lendocarpe mucilagineux appel Nbeg (Figure 1) (Rsaissi et Bouchache, 2002). Figure 1. Les diffrentes parties du Zizyphus lotus (Rsaissi et Bouchache, 2002)

I.2. Classification botaniqueEmbranchement : Spermatophytes. Sous embranchement : Angiospermes. Sous classe : Dicotyldone. Ordre : Celastrales Famille : Rhamnaces. Genre : Zizyphus. Espce : Zizyphus lotus L. (Quezel et Santa, 1962). Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus

2 I.3. Rpartition gographique Dans le mondeLegenreZizyphusrenfermeenviron50espcesdesrgionstropicalesetsubtropicales des deux hmisphres. Lune entre elles, Zizyphus lotus, est spontanedans le sud dEspagne etduPortugal,enSicile,enGrce(Bross ,2000).Onlerencontreaussidanslessteppes dsertiques dAfrique du Nord et Asie Mineure (Paris et Dillemann, 1960). En AlgrieLeZizyphuslotusestrpandudanstoutelAlgriesaufleTellAlgro-constantinois (Quezel et Santa, 1962).

Aire de Zizyphus lotus L. Figure 2. Aire de rpartition du Zizyphus lotus L en Algrie (Quezel et Santa, 1962). Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus

3 I.4. Composition biochimique du Zizyphus lotus Les tudes phytochimiques mene sur le Zizyphus lotus montrent la prsence de mtabolites primaires et secondaires. a) mtabolite primaire Tableau 1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en mtabolite primaire (Catoire et al ., 1999). La fraction de la pulpe du fruit Le pourcentage sucres 20% 32% lipides 0,1% 0,3% protides 0,8% 2,1% b) mtabolites secondaires Le Zizyphus lotus est connu par son contenu en molcules biologiquement actives tels que lespolyphnols(flavonoides,tanins),lestriterpnes,lesantrachinones,lesalcalodes (cyclopeptidesetisoquinolides),lessaponosides(BorgietChouchane,2006 ;Catoireetal., 1994). Tableau 2. Composition en mtabolites secondaires des diffrents organes du Zizyphus lotus : Organe vgtalComposition chimiqueRfrences Fruits-flavonoides, tanins saponines, alcalodes (Borgi et al .,2007 (b)) Feuilles -flavonoides, tanins, alcalodes. -saponines de type dammarane : -jujuboside B -jujubogenin glycoside -driv sulfat de jujubasaponine IV (Borgi et al .,2007 (b)) (Macuek et al .,2004) Ecorce des racines -flavonoides, saponines de type damarane. -tanins. -alcalode cyclopeptidiques lotusines A-G (Borgi et al .,2007(a)) (Borgi et al .,2007(b)) (Le crouour, 2002) Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus

4 I.5. Activits biologiques et thrapeutiques du Zizyphus lotus LesdiffrentesespcesduZizyphussontlargementutilisesdansletraitementde certainesmaladiescomme :lestroublesdigestives,lafaiblesse,lesaffectionsdufoie, lobsit,lestroublesurinaires,lediabte,lesinfectionscutanes,lafivre,ladiarrheet linsomnie (Abu-Zarga et al .,1995,Abdel-Zaher et al ., 2005 ; Suksamrarn et al ., 2005). Les recherchesactuellessurlesdiffrentesactivitspharmacologiquesdeZizyphuslotus ont ressorti plusieurs effets de grande importance pour la mdecine moderne. Parmi ces effets on souligne les plus importants : I.5.1. Activits anti-inflammatoires et analgsiques Les flavonodes et les saponines de lcorce des racines du Zizyphus lotus ont montr une activit anti-inflammatoire significative (Borgi et Chouchane, 2006). LeZizyphuslotusinhibelaproductiondemonoxydedazote(NO),cetteactivitapparat potentiellement avec lextrait mthanolique de lcorce des racines qui est la source possible delagentanti-inflammatoiredanslaractiondelhypersensibilitretardeinduitepar oxazolone (Borgi et al ., 2008). Les feuilles du Zizyphus lotus possdent des effets analgsiques attribus leur contenu en principes actifs ; les flavonoides et les saponines(Borgi et al ., 2007 (a). Borgi et al ., 2008). Toutescesactivitsconfirmentlusagetraditionneldecetteplantedanscertaines maladies inflammatoires et douloureuses (Borgi et al ., 2007(a)). I.5.2.Activits anti-fongiques et anti-mollusques Lesdiffrentsextraits(thr,chloroformique,extraitdactatedthyleetmthanolique) deZizyphuslotussesontavrstrsactifsinvitrovis--visdeneufssouchesdes champignonspathognesetdesmollusquesBalinustruncatus(htesintermdiaireset vecteurs de la transmission de la bilharziose) (Lahlou et al ., 2002).

I.5.3.Activits anti-ulcrogniques LeZizyphuslotus(lesfeuilles,lcorcedesracines)possdeuneimportanteactivitanti-ulcrogniqueattribuelaprsencedestaninsetdesflavonodesconnusparleureffets gastroprotecteur (Borgi et al ., 2007(b)). Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus

5 I.5.4. Autres activitsLes fruits de Zizyphus lotus sont dcrits comme adoucissant, et entrent dans le traitement de la gorge et les irritations broncho-pulmonaires. De mme, la poudre des feuilles sches et des fruits est applique dans le traitement des furoncles (Borgi et al ., 2007(a)). Dailleurs lcorce des racines du Zizyphus lotus est utilise dans la mdecine traditionnelle dans le traitement du diabte (Ghedira et al .,1995). Chapitre II Les composs phnoliques Chapitre IILes composs phnoliques 6 Lescomposantsphnoliquessontdesmtabolitessecondairescaractrissparla prsenceduncyclearomatiqueportantdesgroupementshydroxyleslibresouengags avec des glucides. Ilssontprsentsdanstouteslespartiesdesvgtauxsuprieures(racines,tiges, feuilles,fleurs,pollens,fruits,grainesetbois) ;etsontimpliqusdansdenombreux processusphysiologiquescommelacroissancecellulaire,larhizognse,lagermination des graines et la maturation des fruits (Boizot et Charpentier, 2006). Lesprincipauxclassesdescomposantsphnoliquessontlesacidesphnoliques (acidecafique,acidehydroxycinnamique,acideferulique,acidechlorogenique),les flavonoides, les tanins, et les coumarines (King et Young, 1999 ; Tapiero et al ., 2002). Lescomposantsphnoliquessontdesmolculesbiologiquementactives(Kinget Young,1999),ilssontlargementutilissenthrapeutiquecommevasoconstricteurs,anti-inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques, antioxydants et antiradicalaires,antimicrobiens, (Bahorun, 1997 ; Cetkovic et al ., 2008) (Figure 3). Figure 3. Quelques structures des composants phnoliques (Gervaise ,2004). Chapitre IILes composs phnoliques 7 II.1. Les flavonodesLes flavonoides dsignent une trs large gamme de composs naturels appartenant la famille des polyphnols (Marfak, 2003). Ces molcules sont considres comme des pigments quasiment universels des vgtaux ; ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles (Bruneton, 1999). Ils existent le plus souvent ltat naturel sous forme dhtrosides (Ghestem et al ., 2001) II.1.2. Localisation et distribution Lesflavonodessontamplementrpandusdanslergnevgtal(graines,fleurs, fruits,feuilles)(Dacosta,2003).OnlestrouveaussichezlesPsylotales,lesFougres, Angiospermes, Asteraceae etc. Lesformeshtrosidiquesdesflavonodeshydrosolublessaccumulentdansles vacuoles,etselonlesespcesseconcentrentdanslpidermedesfeuilles,ouse rpartissententrelpidermeetlemsophile.Danslecasdesfleures,ilssontconcentrs dans les cellules pidermiques (Bruneton, 1999). II.1.3. Structure chimique et classification Les flavonodes sont des drivs benzo--pyran (Skerget et al ., 2004). Leur structure debaseestcelledundiphnylpropane15atomesdecarbone(C6-C3 -C6),constitude deuxnoyauxaromatiques(ouanneaux)quedsignentleslettresAetB,relisparun htrocycles oxygns, qui dsigne la lettre C (figure 4) (Dacosta, 2003).

Figure 4 : Squelette de base des flavonoides (Girotti-Chanu, 2006). Laclasse des flavonodes comporte elle seule plus de 4000 substances qui ont t isolesetidentifiespartirdesmilliersdesplante(ForkmannetMartens,2001),quen diviseenplusieurscatgories :Lesflavones,lesflavonolsetlesdihydroflavonols,les Chapitre IILes composs phnoliques 8 isoflavonoides,lesbiflavonoides,lesflavanones,lesflavanols,lesflavanediols (leucocyanidines),lesanthocyanidines,leschalconesetlesdihydrochalcones,lesaurones (Dacosta, 2003). II.1.4. Activits biologiques des flavonodesLes flavonodes sont des composants naturels hautement actifs. Plusieurs tudes ont dmontr une large gamme des effets biochimiques et pharmacologiques de ces molcules. a) Activit anti-inflammatoire des flavonoidesDe nombreux travaux semblent indiquer que les flavonoides possdent des proprits anti-inflammatoires(Milane,2004).Souslactiondelacyclooxygnase(CO)etla lipooxygnase(LO),lacidearachidoniquesemtaboliserespectivementen prostaglandines,etleucotrinesinduisantainsidesphnomnesinflammatoires(Marfak, 2003 ; Formica et Regelson, 1995).Les flavonodes inhibent la synthsedes eicosanodes parinhibitiondelactivitdeLOetCO,aussiilsprovoquentlinhibitiondela perooxydation non enzymatique des acides gras poly insaturs ncessaires pour lactivation decesoxygnasescequiprovoqueuneffetanti-inflammatoire(FormicaetRegelson ,1995). Parailleurs,lesflavonodesontuneffetpolliatifsurlinflammationdseseffets inhibiteurssurlasynthsedesleucotrinesetlalibrationdelhistamine,etsesactivits comme pigeurs de superoxyde (Formica et Regelson ,1995)

b) Flavonodes comme inhibiteurs enzymatiques Lesfavonodessontdesinhibiteursenzymatiques,ilsinhibentplusieursenzymes intervenant dans divers mcanismes biologiques. Ilinhibentlhistidinedcarboxylase,llastase,lahyaluronidasecequipermettrait deconserverlintgritdelasubstancefondamentaledelagainevasculaire ;ilsinhibent aussidunemanirenonspcifiquelacatchol-O-mthyltransferase,cequiaugmenterait laquantitdelacatcholaminedisponibleetdoncprovoqueraitunelvationdela rsistance vasculaire.Enplus,lesflavonoidesinhibentlaphosphodiestrasedelAMPCcequipourrait expliquerleuractivitanti-agrganteplaquettaire ;aussi,ilsinhibentlaldoserductase quest implique dans la pathognie de la cataracte (Bruneton, 1999). Chapitre IILes composs phnoliques 9 Parailleurs,lesflavonodespeuventinhiberlapromotiondetumeurtraversun effet inhibiteur sur la phosphoxylase C et la protine kinase (Formica et Regelson, 1995).

c) Flavonodes et les maladies cardiovasculaires Lesflavonodessontdescompossveinoactifs,ilssontcapablesdediminuerla permabilitdescapillairessanguinsetderenfoncerleurrsistance.Cetteactionest appele vitaminique P (Bruneton, 1999). Dailleurs, ils ont un effet protecteur des maladies cordiovasculaires.Ils induisent la vasodilatationetprovoquentlarelaxationdesmuscleslissescardiovasculairescequi engendreuneactivitanti-hypertensiveetdeseffetsantiarrhythmiques.Enplusles flavonodesprotgentLDLdeloxydationetparconsquentempchentlaformationdes plaquesathrosclerotiques,aussi,ilsontdeseffetsantithrombotiquestravers lempchement de lagrgation plaquettaire (Formica et Regelson, 1995). d) Activit antioxydante des flavonoidesLesflavonoidespossdentuneforteactivitantioxydantequestleprincipede plusieurs activits biologiques doues par ces molcules (Saija et al ., 1995). Lactivitdupigeagedesradicauxlibresestlundesmcanismesimportantsde lactivitantioxydante,pourlesflavonoides,cemcanismeestlileurstructureetde larrangement des groupements hydroxyles (Sokol-Letowska A et al ., 2007). Destudesfaitessurlacapacitdesflavonoidespigerlesradicauxlibresont montr que les composs les plus actifs sont ceux qui combinent les trois critres suivants : La structure ortho dihydroxy sur le cycle B (groupement catchol) qui confre la stabilit au radical flavonoxy et participe la dlocalisation des lectrons. La double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo La prsence du groupe 3OH en combinaison avec la double liaison C2-C3. A titre dexemple, la querctine satisfait tous ces critres et par consquent, elle est le compos le plus actif de la famille des flavonoides (figure 5) (Marfak, 2003). Chapitre IILes composs phnoliques 10 Figure 5. Elments essentiels pour lactivit antioxydante des flavonoides(Marfak, 2003) LapropritantiradicalairedesflavonoidesestdirigeprincipalementversHOet O2- aussi les radicaux peroxyl et alkoxyl. Enplus,commecescomposantsprsententuneforteaffinitpourlesionsdufer (catalysentplusieursprocessusconduisantlapparitiondesradicauxlibres),leuractivit antiperoxydativepeuttreaussiattribueunecapacitconcomitantedechlationdufer (Saija et al .,1995). Parailleurs,linhibitiondesenzymesprsenteunautremcanismedelactivit antioxydante,lesflavonoidespeuventagirsurlactivitdelaxanthineoxydaseetpar consquent,peuventfairergresserlamaladiedelagoutteenrduisantlafoisles concentrations dacide urique et celle du radical superoxyde dans les tissus humains. Une tude faite a montr que les flavonoides sont aussi des bons inhibiteurs dautres enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygnase et la lipooxygnase (figure 6) (Marfak, 2003).

Figure 6. Pigeage des espces ractives oxygnes par les flavonoides (Marfak, 2003)

e) Effet anticancreux des flavonodes Certainsflavonoidespossdentuneactivitantitumeuraleetanticancrogenique significative .Par blocage de la production de la tumeur de la peau, la querctine peut tre considreeffectif dans la prvention du cancer de la peau. Chapitre IILes composs phnoliques 11 LinhibitiondelaglyoxylaseIparlaquerctinepeuttreexpliquesonactivit anticancerogne,commelesystmeglyoxylasejoueunrledanslaproductiondeD lactate et la rgnration du glutathion ,des facteurs importants dans linduction du tumeur et la croissance (Formica et Regelson,1995). Dailleurs,laquerctineinhibelacroissancecellulaireenempchantcertaines phases du cycle cellulaire et en bloquant les sites rcepteurs des hormones (Marfak, 2003). f) Activit antimicrobienne des flavonodes Lesflavonoidespossdentdespropritsantimicrobiennes(Petitetal.,2007).Ils sontcapablesdagirauniveaudelasynthsedesprotinesvirales.MucsietPragaien 1985 ont galement montr une corrlationentreleffet inhibiteur de certains flavonoides surdiversvirusdherpsetleurcapacitaugmenterlestauxintracellulairesenAMPC dans les cellules infectes .Des travaux ont mis en vidence un impact des flavonoides sur le rtrovirus HIV responsable du syndrome dimmunodficience acquise (SIDA), aussi les flavonoides se sont avrs de bons inhibiteurs de transcriptase reverse. Autre tude a montr que, les flavonoides pouvaient avoir une action plus slective en interagissant avec une glycoprotine de surface du virus HIV, empchant ainsi la liaison du virus la cellule hte .Enfin, les flavonoides seraient susceptibles dinhiber lintgrase rtrovirale du virus HIV-1.Cette enzyme permet lintgration du gnome viral celui de la cellule hte.Thoriquement, les flavonoides pourraient exercer des effets antibactriens puisquils sontdepuissantsinhibiteursinvitrodelADNgyrase.Dautrepart,unetudeamontr leffet bactricide de diffrentes flavanones sur un Staphylococcus aureus.Unetudercenteamontrleffetantibactriendecertainsflavonoidesisolsde Dorstenia barteri (Mbaveng et al ., 2008). Lactivit antifongique des flavonoides est aussi tablie, une tude faite sur Dianthus caryophyllus a mont lefficacit de ses flavonoides sur des souches fongiques (Galeotti et al ., 2008). Lemcanismedeseffetsantimicrobiensdespolyphnolsestsansdoutetrs complexe .parmi les hypothses avances, il faut citer : Linhibition des enzymes extracellulaires microbiennes. Squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation de mtaux tels que le fer. Linhibition du mtabolisme microbien (Milane, 2004). Chapitre IILes composs phnoliques 12 g) Autres activits des flavonodes A ct des activits cites prcdemment, les flavonoides possdent dautres activits : Activit anti-allergique, antihpatotoxique, anti-ostoporotique (Ielpo et al ., 2000), activit hypocholestrolmiante (Formica et Regelson,1995), activit antidiabtique (Marfak,2003), activit antimitotique,antiprotozoaires et activit anxiolytique (Cabrera et al.,2007). II.2. Les taninsLestaninssontdesmtabolitessecondairespolyphnoliques(KhanbabaeeetRee, 2001),hydrosolublesdemassemolaireentre500-2000D.Leurstructurechimiqueleur confre une capacit trs dveloppe de se fixer sur des molcules telles que les alcalodes, laglatine,lespolysaccharides,etessentiellementlesprotines(ZimmeretCordesse, 1996 ;Bruneton,1999).Parmilescaractristiquesdestaninslegotastringencequiest une sensation tactile due la prcipitation des protines salivaires et qui cre une sensation dasschement dans la bouche (Peronny, 2005). Le rle biologiquedes tanins dans la plante est li sa propre protection contre les infections,lesinsectesetlesanimauxherbivores(KhanbabaeeetRee,2001),enplusdela protection contre les attaques fongiques et bactriennes (Peronny,2005). II.2.1. Localisation et distribution Lestaninssonttrsrpandusdanslergnevgtal,ilssontparticulirement abondants chez les Conifres, les Fagace, les Rosace (Ghestem et al ., 2001). Touslesorganesvgtauxpeuventenrenfermer(lcorce,lebois,lesfeuilles,les fruits, les racines, les graines) (Khanbabaee et Ree ,2001).Les tanins sont prsents dans une varit de plantes utilises dans lalimentation notamment les crales et les lgumineuses (sorgho,millet,orge,haricotssecs,petitspois,caroubeetlesfruitscomme(pomme,mre ,canneberge,datte,raisin,aubpine,pchepoire,kaki,prune,framboiseetfraise (Peronny,2005). II.2.2. structure chimique et classification A la base de leur caractristique structurale, il est possible de diviser les tanins en 2 groupes : Tanins condenss (proanthocyanidines). Chapitre IILes composs phnoliques 13 Tanins hydrolysables. a)Tanins condenss (proanthocyanidines)Ce sont des polymres ou oligomres flavanique, constitus dunits flavan-3-ols, le plus souvent picatchine et catchine, avec un degr de polymrisation entre deux et plus de50units(KhanbabaeeetRee,2001).Cesunitsliesentreellesparuneseuleliaison carbone-carbone C4-C8 ou C4-C6dans le type Bdes proanthocyanidines ;ou par une liaison interflavaniquedouble(C4-C8ouC4-C6)et(C2-O-C7)dansletypeA(figure7) (Bruneton,1999 ; Xie et Dixon,2005 ;Vivas et al ., 2006). Figure 7. Structure des tanins condenss et leur monomre (Peronny, 2005).

b) Tanins hydrolysablesCesontdesoligooudespolyestersdunsucre(oudunpolyolapparent)etdun nombrevariabledacidephnolique.Lesucreesttrsgnralementleglucose.Lacide phnoliqueestsoitlacidegalliquedanslecasdestaninsgalliques,soitlacide hexahydroxydiphnique (HHDP) et ses drivs dans le cas des tanins llagiques (Figure 8) (Bruneton, 1999) Chapitre IILes composs phnoliques 14 Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associs (Peronny, 2005). II.2.3. Activits biologiques et thrapeutiques des taninsLestaninssontdesmolculesbiologiquementactives,douesdactivits pharmacologiques remarquables et des effets significatifs sur la sant humaine (Chavan et al ., 2001 ; Okuda, 2005). a) Activits antimicrobiennes des tanins Lactivitantimicrobiennedestaninsestimportante.Lacroissancedeplusieurs bactries, virus, champignons et levures est inhibe par les tanins (Chung et Wei, 2001). -Activit antibactrienneDenombreusestudesontmontrlactivitantibactriennedestanins.Ces molculesonttrapportescommebactriostatiqueoubactricidesurplusieurssouches bactriennes :Aeromonassobria,Bacillusanthracis,bolulinum,Desuomaculum nigrificans,Klebsiellapneumonia,Plesiomonasshigelloides,Pseudomonasaeruginosa, Pseudmaltophila,solanacearum ,Staphilococcusaureus,Staphepidermis, Streptococcus lactis , Strept mutans , Strept pneumonia , Strept sobrinus etc. Chapitre IILes composs phnoliques 15 Chungetsescollaborateursonttrouvquelacidetanniqueainhiblacroissance desbactriesdesalimentscomme :Alealigenesfaecalis,Enterobacteraerogenes, Escherichiacoli,Kpneumonia,Proteusvulgaris,Pseudfluorescens,Salmonella enteritidis,Sparatyphi,Staphaureus,Streptfaecalis,StreptpyogenesetYersinia enterocolitica. Lesbactriesintestinaleshumainescomme :Bacteroidesfragilis,Clostridium clostridiiforme,Cperfringens,Cparaputrficum,Enterobactercloacae,Escherichiacoli et Salmonella typhimurium sont inhibes par lacide tannique (Chung et Wei, 2001).

-Activit antiviraleLactivitantiviraledestaninsestduelafixationdesmolculesdestanins lenveloppeprotiqueduvirusoulamembranedelacellulehteetparconsquent linhibition de ladsorption et la pntration virale ; cependant, dans certains cas la fixation causeseulementdeschangementsmineurslasurfacevirale,lapntrationrestemais lenlvement de lenveloppe virale est inhib. Plusieurs types de virus sont inactivs par les tanins, le virus Herpes simplex (HSV-1 ,HSV-2) est inhib par les tanins hydrolysables et les tanins condenss galloyls de plusieurs extraits des plantes (De Bruyne et al.,1999). Lestaninsontaussirapportsdinactiverlevirustobaccomosaique,etpoliovirus. Lacide tannique est capable dinhiber la rplication du virus dinfluenza, Coxsackievirus, echovirus, reovirus, virus dherpes (Chung et Wei, 2001). Lesoligomresproanthocyanidinsprsententuneactivitantiviralecontrelevirus respiratoire syncytial (RSV), virus dinfluenza A (FLU-A) et le virus para influenza (PIV), en outre lhpatite A et B. Les tanins ont un autre effet inhibiteur de la rplication virale ,cest linhibition de la transcriptase inverse des rtrovirus comme virus (HIV) ; cette inhibition est influence par lagalloylation,ltenduedeloligomrisation,ladiffrencedelaliaisoninter-flavan,la strochimie de la fonction 3 hydroxyle (De Bruyne et al.,1999). Activit antifongique et anti-levure Plusieurstypesdechampignonssontinhibsparlestanins.Leschampignons filamenteuxcommeAspergillusniger,Botrytiscinerea,Chaetomiumcupreum, Collectotrichumgraminicola,Coniphoraolivacea,Coriolusversicolor,Crinepellis perniciosa,Fomesannosus,Gloeophyllumtrabeum,Meruliuslacrymans,Penicillium, Chapitre IILes composs phnoliques 16 Poriamonticola,TrameteshirsutaetTrichadermaviridesontinhibsparlestaninsde diffrentes prparations . De mme, diffrentes levures incluant Saccharomyces crevisiae sont aussi sensitives aux tanins (Chung et Wei, 2001). b) Activit thrapeutique due lastringencePar voie externe, les tanins impermabilisent les couches les plus externes de la peau et des muqueuses, protgeant ainsi les couches sous-jacentes ; elles ont galement un effet vasoconstricteur sur les petits vaisseaux superficiels. En limitant les pertes en fluides et en empchant les agressions extrieurs, les tanins favorisentlargnrationdestissusencasdeblessuressuperficiellesoudebrlure (Bruneton,1999).Surlesblessures,lestaninsinduisentlacicatrisationpardiffrents mcanismescellulaires,enfavorisantlacontractiondeblessure,laugmentationdela formationdesvaisseauxcapillairesetdesfibroblastes ;etinduisantlaprolifrationdes kratinocytes (Lopes et al ,2005). Parvoieinterne,ilsexercentuneffetantidiarrhque(Bruneton,1999),quiestdu linhibition de la motilit intestinale (De Bruyne et al. 1999). c) Inhibition enzymatiqueLafixationdestaninsaveclesprotinespeuttreengendrelinhibitiondeplusieurs enzymes(DeBruyneetal.,1999).Leblocagedela5-lipoxygnasepargraniine, corilagine,inhibitiondelenzymedeconversiondelangiotensine ,delactivationdela hyaluronidase,desglucosyltransferasesdesmicroorganismesimpliqusdansla cariogense ;inhibitiondestopoisomrasesparlasanguiineH6oulacidechbulagique ; inhibitiondelaprotineskinaseCparlestaninsllagiquesetlestaninscomplexes (Bruneton,1999) ;inhibitiondeamylasesalivairehumainequijoueunrledansla formation des caries dentaires (Kandra et al ., 2004). Dailleurs,lesdimresprocyanidoliquesontuneactivitinhibitricesurlhistidine dcarboxylase et llastase (Bruneton, 1999).

Chapitre IILes composs phnoliques 17 d) Activit antioxydante des tanins Lestaninsontdegrandescapacitsantioxydantesduesleursnoyauxphnols (Peronny, 2005) .Elles ont la particularit dinhiber la peroxydation des lipides, en agissant commedonneurdeprotonetaccepteurderadicauxlibres,stoppantainsilemcanisme dauto oxydation (Perret, 2001). Les tanins hydrolysables et condenss sont 15 30 fois plus efficace que les phnols simples(Peronny,2005).Demme,ilatdmontrinvitroquelestaninssontplus actives que les vitamines .Des tudes faites montrent que les procyanidines B1 et B3 sont desantioxydantspourlacidelinolique,etilsontuneactivitantioxydantesuprieure celle de lacide ascorbique et l tocophrol. Dans une autre tude faite sur la proprit du pigeage radicalaire, il a t remarqu quelesprocyanidinesdimriquespeuventemprisonner8radicauxpyroxylesalorsque lacide ascorbique emprisonne un seul radical, et l tocophrol emprisonne deux radicaux. Uchidaetsescollaborateurssuggrentquelestaninscondenssgalloylsontune actiondepigeageradicalairesurleradical1-1diphnyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)aussi sur lanion superoxyde et OH, OOH. Plusieurs proprits structurales des tanins augmentent leur activit antioxydante : La galloylation, prfrablement en position 3 augmente la capacit du pigeage pour les deux O2 et OH, aussi le pigeage de O2 est plus important pour les dimres procyanidines coupls par une liaison (48) que les dimres lis par (46) (De Bruyne et al ., 1999). e) Activit anti cancrognique des tanins Le potentiel anticarcinognique des tanins peut tre li leur proprit antioxydante qui apparat importante dans la protection cellulaire des dommages oxydatifs. Plusieurstudesmontrentlactivitanticancrogniquesdestanins,Migamatoet sescollaborateursmontrentlactivitantitumoraledeplusieursoligomresdestanins hydrolysables incluant : agrimoniin, oenothein B et coiiariin A contre la sarcoma (Chung et Wei,2001).UnetudefaitesurlaplanteEugeniajambosatsuggrequelestanins hydrolysables de cette plante induisent lapoptose sur les cellules humaines leucmiques ce qui prsente un autre mcanisme dactivit antioxydante des tanins (Yang et al .,2000). Autre tude faite sur les tanins de sorghum suggre lactivit anticancrognique des tanins de sorghum sur les cellules humaines de mlanome (Awika et Rooney, 2004). Chapitre IILes composs phnoliques 18 f) Autres activits biologiques des taninsLestaninsontuneactivitantiinflammatoire.Titsetsescollaborateursmontrent une importante activit anti inflammatoire des prodelphinidines isols de Ribes nigrum. Leseffetscardiaquesetvasculairesdestaninssontaussidmontrs,Calixtoetses collaborateursdnotrentquelacidetanniqueaffecteladisponibilitducalciumpourla contraction des muscles lisses et cardiaques .En effet par fixation de lacide tannique avec le Ca++ , lacide tannique prsente un effet hypotensif.Dailleursdestudesfaitesmontrentleffetdinhibitiondagrgationplaquettaire dans le plasma humain et le plasma du rat par deux procyanidines trimriques et un dimre thioether. Outre ces activits, les tanins prsentent une activit antiulcreuse et antiparasitaire, en effet, la consommation des plantes tanins peut affecter la biologie de certaines espces de parasites intestinaux (Peronny, 2005). Chapitre III Les espces ractives oxygnes et stress oxydant Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 19III.1. Les espces ractives oxygnesLavieenarobiesetraduitauniveaucellulaireparlexistencedunechanerespiratoire mitochondriale(CurtayetRobin,2000) ;auniveaudelaquelleloxygneestnormalement transformeneau.Cetteractionderductionimpliquequatrelectrons,etestrenduegrceun systme complexe de protines et denzymes (cytochromes). Elle permet dapporter la cellule toute lnergiencessairesousformedadnosinetriphosphate(ATP)pourassurersesfonctionsvitales.Ceprocessusmitochondrialnesttoutefoispasparfait,car25%deloxygneesttransformen espces ractives oxygnes (ERO) ou reactive oxygen species (ROS) (Gueye, 2007) ; qui sont des formes varies de loxygne active, elles incluent les radicaux libres comme lanion superoxyde(O2.-)etleradicalhydroxyle(.OH),etlesespcesnonradicalairesquisontdesoxydantset/ou facilementtransformesenradicauxcommeleperoxydedhydrogne(H2O2)(Halliwellet Whiteman, 2004) (tableau 3).

Tableau 3. Principales espces ractives oxygnes (Antwerpen, 2006). Espces ractives oxygnes (ROS) Radicalaires Non radicalaires.OHRadical hydroxyle RO.Radical alkoxyl ROO. Radical peroxyl O2. Anion superoxyde NO.Radical oxynitrique H2O2 Peroxyde dhydrogne ROOHPeroxyde organique HOCl Acide hypichloreux 1O2 Oxygne singulet ONOOPeroxynitrite Les radicaux libres oxygns sont des espces chimiques (atomes ou molcules) qui possdent un ou plusieurs lectrons clibataires (lectron non appari) sur leur couche externe (Gueye, 2007). Cela leur confre une grande ractivit chimique (Dacosta, 2003). Leur hyperractivit les engage dans des ractions de dnaturation des constituants cellulaires de type peroxydation avec les glucides, les lipides, les protines et lADN, formants des produits trs instables.Ceuxcidonnentlieudesractionsenchanegnrantdenouveauxradicauxlibres (Curtay et Robin, 2000). Lespceractiveprimairedeloxygneestlanionsuperoxyde(O2)quirsultedela rductionunivalentedeloxygnemolculaire.Unegrandepartiedelanionsuperoxydeest Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 20transformeenperoxydedhydrogne(H2O2)sousleffetduneenzyme,lesuperoxydedismutase (Milane, 2004). Asontour,leperoxydedhydrogneselonlaractiondeFentonpeutsedcomposeren prsence de cuivre cuivreux ou fer ferreux pour donner une espce hautement ractive et a dure de vie trs courte, le radical hydroxyle (OH) (figure 9) (Nzengue,2008). Figure 9. Les diffrentes espces ractives oxygnes (Nzengue, 2008).

III.2. Sources des espces ractives oxygnes Les ROS sont produits dans lorganisme par de nombreux mcanismes tant exognes ou endognes (Figure 10). III.2.1. Sources exognes Lorganisme humain est soumis lagression de diffrents agents capables de donner naissance des espces ractives oxygnes. LesrayonnementsUVinduisentlasynthsederadicauxlibres(O2, OH ,1O2)etdes molcules gnratrices de radicaux libres (H2O2) par lintermdiaire dagents photosensibilisants. Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 21Lesradiationsionisantesprovoquentgalementlagnrationderadicauxlibresdrivsde loxygne. Lingestion dalcool est suivie de la formation des radicaux libres selon divers mcanismes .La xanthineoxydaseetlaldhydeoxydasepeuventoxyderleprincipalmtabolitedelthanol, lactaldhyde, avec production dO2 . Lthanolstimulegalementlaproductiondanionsuperoxydeparinductiondelasynthse des NADPH oxydase, NADPH cytochrome rductase, et du cytochrome P450.Dautre part, Schisler et Singh (1989) ont montr que lalcool pouvait diminuer lactivit des enzymes de protection (SOD-GSH-Px).Demme,lesconcentrationssriquesenslniumetvitamineEsontabaisseschezles alcooliques et corrles avec une atteinte hpatique plus ou moins svre. Des toxiques tels que monoxyde dazote (NO) et le dioxyde dazote (NO2), prsents dans notre environnement(suies,goudron,tabac,polluantsindustriels)participentlagensederadicaux libres,ilssontresponsablesduneauto-oxydationdesacidesgraspolyinsatursdesalvoles pulmonaires.NO,NO2peuventaussiragiravecleperoxydedhydrogneproduitparles macrophages au niveau des alvoles pulmonaires et donner naissance des radicaux OH . La fume decigarette joue un rle majeur dansla formation decesespces radicalaires, elle contientNO,NO2etdesfortesconcentrationsencompossinsaturs,etstimuleparsonaction irritante les macrophages des alvoles pulmonaires (Milane, 2004). DautresfacteurspeuventconduirelaformationdesROS :lesxnobiotiques(toxines, pesticides,herbicides)etmdicaments,enplusdesalimentsquipeuventcontenirdesoxydants (Curtay et Robin, 2000 ; Diallo, 2005).

III.2.2. Sources endognes Lune des sources majeurs des ROS est la chane respiratoire mitochondriale .Cette production rsultedeladditiondunlectronloxygnemolculaire.Unetelleractionestcatalyseparle cytochrome oxydase mitochondrial. O2+ O2 (Marfak, 2003). Autres chanes du transport dlectrons (ex : peroxymes et microsomes) contribuent galement laproductionduO2 danslacellulearobiose.LescytochromesP450etb5delachanedu transportdlectrondesmicrosomespeuventproduiredesROSquandilsinterrompentlecycle redox normal et dtournent le flux dlectrons vers lO2 (Sevanian et al .,1990). Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 22DautrepartlesROSpeuventseproduireaucoursdesprocessuspathologiquesoula productionduradicalrpondunestimulationetintervientdansleprocessus inflammatoire (NADPH oxydase et xanthine oxydase) (Antwerpen, 2006). Lescellulesphagocytairesactivessontlesigedunphnomneappelexplosion oxydative,consistantenlactivationducomplexeNADPHoxydase,enzymecapabledutiliser loxygnemolculairepourproduiredegrandesquantitsdanionssuperoxydesauniveaudela membranecellulaire.Cemcanismelorsquilestcontrlestcapitaldanslalutteinfectieusecaril permetlaphagocytosedesbactriesetdescorpstrangres(Favier,2003).Dailleurslesystme xanthine/xanthine oxydase permet aussi la production de lanion superoxyde : Xanthine + 2O2 +H2Oxanthine oxydase acide urique +2O2 +2H+ (Marfak, 2003). Uneautreespceractiveoxygneproduiteaucoursdelinflammationestleperoxyde dhydrogne(H2O2) ;envuederagirdirectementoudeproduirelacidehypochloreuxpar linterventiondemyloperoxydase.Cetteespce(HClO)estcaractriseparunpouvoiroxydant nettement plus lev que le H2O2. H3+O +H2O2 +ClmyloperoxydaseHClO +2H2O ( Antwepen, 2006). LemonoxydedazoteestproduitaussiparunsystmeenzymatiqueNOsynthtase(NOS), des fins de mdiation par les neurones, les cellules endothliales ou les macrophages (Favier, 2003). DautressystmessontcapablesdeproduirelesROS,citonparexemple :lesractions catalysesparleslipooxygnasesetcyclooxygnasesdanslavoiedesynthsedesleucotrines, thromboxanesetprostaglandines(Babioretal.,2002) ;lesaldhydesoxydasesoulesprotines hmiquesquipeuventoxyderleurfer(I)enfer(III)avecproductionduradicalO2 (Antwerpen,2006). Cestainsilautooxydationdesmonoamines(dopamine,pinphrine,etnorpinphrine) ;et lhmoglobine en prsence de traces de mtaux peut galement tre lorigine de la production des ROS (Gueye, 2007). Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 23III.3. Stress oxydantDans les circonstances normales, les ROS sont produites en faible quantit comme mdiateurs tissulairesoudesrsidusdesractionsnergtiquesoudedfense.Cetteproductionphysiologique est parfaitement matrise par des systmes de dfense, dailleurs adaptifs par rapport au niveau de radicaux prsents. Dans ce cas, la balance antioxydant/prooxydant est en quilibre. Si tel nest pas le cas que ce soit par dficit en antioxydants ou par la suite dune surproduction normes de radicaux, lexcs de cesradicauxconduitaustressoxydant(Favier,2003 ;HaliwelletWhiteman ,2004).Laproduction excessivederadicauxlibresprovoquedeslsionsdirectesdemolculesbiologiques(oxydationde lADN,desprotines,deslipides,desglucides),maisaussideslsionssecondairesduesau caractrecytotoxiqueetmutagnedesmtaboliteslibresnotammentlorsdeloxydationdes lipides. Enfaisantapparatredesmolculesbiologiquesanormalesetensurexprimantcertainsgnes, lestressoxydantseralaprincipalecauseinitialedeplusieursmaladies :cancer,cataracte,sclrose latraleamyotrophique,syndromededtresserespiratoireaigu,odemepulmonaire,vieillissement acclr, maladies cardiovasculaires...etc. (Favier, 2003). III. 4. Les antioxydantsLesantioxydantssontlensembledemolculessusceptiblesdinhiberdirectementla production,delimiterlapropagationoudedtruirelesespcesractivesdeloxygne.Ilspeuvent agir en rduisant ou en dismutant ces espces, en les pigeant pour former des composs stables, en squestrant le fer libre, ou en gnrant du glutathion (Favier, 2003 ; Dan, 2008). Denombreuxantioxydantsinterviennent,ilsagitprincipalementdessystmesenzymatiques et non enzymatiques (Figure10) (Souley Amadou, 2004 ; Yoo et al ., 2008)

III.4.1. Les antioxydants enzymatiquesCette ligne de dfense est constitue principalement de trois enzymes.Il sagit de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase et de glutathion peroxydase (GPX). Cesenzymesontuneactioncomplmentairesurlacascaderadicalaireauniveaudu superoxydeetduperoxydedhydrogne,conduisantfinalementlaformationdeauetdoxygne molculaire. 2O2 +2H+superoxyde dismutaseH2O2 +O2 Chapitre IIILes espces ractives oxygnes et le stress oxydant 24

2H2O2 Catalase 2H2O +O2 H2O2 +2GSH Glutathion perooxydase2H2O +GSSG (Lehucher-Michel et al ., 2001)

III.4.2. Les antioxydants non enzymatiques Cegroupedesantioxydantsrenfermelesprotinesdesquestrationdesmtaux,quiagissent endiminuantladisponibilitdagentsprooxydants,commeFe2+/Fe3+ouCu2+/Cu+(ex :la transferrine, la ferritine, lalbumine, caeruloplasmineetc.). Dautrepart,ilyadesmolculesfaiblepoidsmolculairequiagissentsoitcomme cofacteurs des enzymes cites soit comme antioxydant propre (Antwerpen, 2006). Les antioxydants action directe sont capables de donner des lectrons loxygne radicalaire afin quils puissent le piger, lempcher ainsi dattaquer les structures biologiques. Ils peuvent agir commeagentsrducteurscapablesdepasserleurslectronsauxROSetlesliminer(Kohenet Nyska,2002).Cesmolculesproviennentsoitdesourcesendognes(glutathion,mlatonine,acide urique, la mlanine), soit de sources exognes apports par lalimentation (ex : les carotnodes, la vitamine E, la vitamine C(Curtay et Robin, 2000), les composs phnoliques (Yoo et al ., 2008) etsurtout les acides phnoliques, les flavonoides, les tanins, les coumarine (Siddhuraju,2007). Figure 10. Origine et rponse cellulaire aux ROS (Petropoulos, 2003) Chapitre I Matriel et mthodes Chapitre 1 Matriel et mthodes 25 Matriel et mthodesI.1. MatrielI.1. 1. Matriel vgtal IlestconstitudesfruitsduZizyphuslotus(Figure11),rcoltsdesrgionsdeBatnaen Septembre Octobre 2007, 2008. Les fruits ont t dabord dnoyauts, ensuite la partie comestible a t sche lombre labri de la lumire, temprature ambiante. Aprsschage,lapartiecomestibleatbroyepourobtenirunepoudrefine,quiaservi pour la prparation des diffrents extraits.

Figure11. Diffrentes parties du fruit du Zizyphus lotus I.2. MthodesI.2.1. Dtermination de la teneur en eau Pourdterminerlateneureneau,onfaitunedessiccationdelamatirefrachela tempraturede1032C0dansunetuveisothermeventilelapressionatmosphrique jusqu une mesure pratiquement constante (Audigie et al .,1987). La teneur en eau est la diffrence entre le poids de lchantillon avant et aprs la dessiccation lorsque leur poids soit constant. H% =M1 -M2 x100 P H% : taux dhumidit ou teneur en eau. M1 : masse en g de la capsule avec lchantillon avant la dshydratation. Chapitre 1 Matriel et mthodes 26M2 : masse en g de la capsule avec lchantillon aprs la dshydratation. P : masse en g de la prise dessai. I.2.2. Dtermination de la teneur en cendre : Lateneurenmatireminraleestconventionnellementlersidudelasubstanceaprs minralisationdelamatireschedeschantillons.Elleestobtenueparincinration500-600C0 (Pinta, 1980 ; AOAC, 1984). MO% =M1 - M2x 100 P MO% : matire organique. M1 : masse en g de la capsule et la matire sche avant lincinration. M2 : masse en g de la capsule avec les cendres. P : masse en g de la prise dessai. La teneur en cendre est dtermine comme suit : cendre%=100-MO%

I.2.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus : Selon la mthode de Diallo et al (2004), diffrents types dextraits ont t prpars partir des fruits pulvriss (Figure 12). I.2.3.1. Extractions avec des solvants polarit croissante : 250gdepoudreonttextraitsavec2000mldtherdeptroleetplacssousagitation pendant 24h. Aprs filtration sur papier Whatmann, le marc est ensuite mis en agitation avec 2000 ml de dichloromthane pendant 24 h, puis 2000 ml de mthanol pendant aussi 24h. Les 3 typesextraits ont t concentrs sous vide au Rotavapor. I.2.3.2. Extrait aqueux : Une macration aqueuse a galement t effectue sur 50g de poudre avec 500 ml deaudistille et placs sous agitation pendant 24 h. Aprs filtration, lextrait a t lyophilis. Chapitre 1 Matriel et mthodes 27Matriel vgtale sec broyExtraction froidpar lther de ptrole (24h) Dcantation .Filtration Extrait EtheroptroliqueRsidu vgtal sec Extraction par le dichloromthane Dcantation FiltrationRsidu vgtal secExtrait DichloromthaniqueExtraction par le mthanol Dcantation FiltrationRsidu vgtal secExtrait MthanoliqueFiltrat Filtrat Concentration T=40CFiltrat Concentration T=35C Concentration T=50C Figure 12. Diffrentes tapes dextraction par puisement successive du matriel vgtal. I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotusI.2.4.1.1.Tests prliminaires Mise en vidence des flavonodes A3mldechaqueextrait,onajoute5mldHCl(acidechlorhydrique),puisquelques morceaux du magnsium.En prsence des flavonoides (flavone aglycone), une couleur rouge est apparue (Ciulcl, 1982). Mise en vidence des tanins : Lajout detrichlorure du fer (FeCl3) 1%, permet de dtecter la prsence ou non des tanins. La couleur vire au bleu noir en prsence des tanins galliques, et au bleu verdtre en prsence des tanins catchiques (tanins condenss) (Dohou et al ., 2003). Chapitre 1 Matriel et mthodes 28I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince PourunecaractrisationpartielledesextraitsduZizyphuslotus,onutilisela chromatographie sur couche mince, cette technique de sparation base sur lutilisation dune phasemobile(solvant)lelongdunephasestationnaire(geldesilice),dontlasparation dpend des phnomnes dadsorption et de partage. Lanalyse des extraits du Zizyphus lotus a t ralise sur des plaques de gel de silice avec indicateurdefluorescent(20x20cm,60F254),selonlamthodedeDialloetal(2004)avec quelques modifications,les quatre extraits ont t dissous dans leur solvant dorigine. Lanalyse des extraits polaires (AQ, MET) est effectue par un systme de sparation BAW (butanol/acide actique/eau) avec des proportions (60/15/35). Alors pour les extraits apolaires (DCM, ET) on utilise le systme (ther de ptrole/actate dthyle) avec les proportions (8/2). 5 l de chaque extrait (10mg/ml) et de standard (2mg/ml), sont dposs et les plaques sont ensuiteintroduitesdanslachambredemigrationpralablementsatureparlavapeurdela phasemobile.Aprsmigration,lesplaquessontsches,puisvisualisespar3systmesde rvlation : Rvlation physique sous UV 254nm. Rvlation physique sous UV 366nm. Rvlation chimique par une solution de vanilline sulfurique. RvlationchimiqueparunesolutionthanoliqueduDPPH2,4%pourla dtection des extraits ayant une activit antioxydante (Juma et Majinda, 2004). Les rapports frontaux (RF) des spots issus de la sparation sont calculs (le rapport frontal est le rapport entre la distance parcourue par la tache et celle du solvant) et compars ceux des tmoins permettant ainsi lidentification de diffrents extraits. I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18Pour analyser les diffrents extraits du Zizyphus lotus lHPLC -RP-C18 a t utilis. Lachromatographieliquidehauteperformancephaseinverseestunetechniquede sparation,danslaquellelaphasemobileestunliquidepolaire(solvant),etlaphase stationnaireestunecolonne(125x4,6mm)troitementemballepardesparticulesC18 (apolaire),cesparticulesayantundiamtremoinsde10m,cequincessitedepomperla phasemobiletraverslacolonnehautepression.Lapompegardeundbitprcisdesorte queletempsdertentiondechaquepicpeuttreemploypouridentifierdespicsde lchantillon tester. Chapitre 1 Matriel et mthodes 29Ceciestfaitparcomparaisondeschromatogrammesdesstandardsavecceluidelchantillon. Dans notre analyse, nous avons utilis une lution isocratique dans laquelle une seule source du solvantutilise pour luer les composons travers la colonne .La phase mobile utilise est un mlange mthanol /eau (60/40), le dbit de la phase mobile est 0,5 ml/min. La temprature estrgle40C0.LedtecteurutilisestundtecteurUVunelongueurdonde254nm (Kuntie et al ., 2007). I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus : I.2.4.2.1. Dosage des polyphnolsLespolyphnolssontestimsparlamthode deFolinCiocalteu(Wongetal.,2006).Ce dosagereposesurleractifdeFolinCiocalteuquiestconstitudunmlangedacide phosphotungstique et dacide phosphomolybdique. Loxydation des phnols rduit, ce ractif enunmlangedoxydebleusdetungstneetdemolybdne.lintensitdelacouleurest proportionnelle au taux de composs phnoliques oxyds ( Boizot et Charpentier,2006). 200ldechaqueextrait(dissousdanslemthanolpourlesextraitsorganiques,etleau distille pour lextrait aqueux) sont ajouts 1 ml du ractif de Folin Ciocalteu dilu 10 fois, aprs 4 min, 800 l dune solution de carbonate du sodium (75g/l) sont ajouts. Labsorbance estmesure765nmaprs2hdincubation.Lesconcentrationsdespolyphnolssont dduites partir des gammes dtalonnage tablies avec lacide gallique (0-200g/ml) et sont exprimesenmicrogrammedquivalentdacidegalliqueparmilligrammedextrait(g EAG/mg). I.2.4.2.2. Dosage des flavonodes Lamthodedutrichloruredaluminium(Bahorunetal.,1996)estutilisepourquantifier les flavonodes dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus .1 ml de chaque chantillon et du standard(prparsdanslemthanolpourlesextraitsorganiquesetleaudistillepour lextraitaqueux)avecdilutionsconvenablessontajouts1mldAlCl3(2%dansle mthanol). Aprs 10 min dincubation, labsorbance est lue 430 nm. Les concentrations des flavonodessontdduitespartirdesgammesdtalonnagetabliesaveclaquerctine(0-35g/ml),etsontexprimesenmicrogrammedquivalentdequerctineparmilligramme dextrait (g EQ/mg). Chapitre 1 Matriel et mthodes 30I.2.4.2.3. Dosage des tanins condenss LedosagedestaninscondenssdanslesextraitsduZizyphuslotusesteffectuselonla mthode de Broadhurst et Jones (1978), modifie par Heimler et al. (2006). Le principe de ce dosageestbassurlafixationdugroupementaldhydiquedevanillinesurlecarbone6du cycleAdelacatchinepourformeruncomplexechromophorerougequiabsorbe500nm (Schofield et al .,2001) (Figure 13).

VanillineCouleur rouge Figure13. La raction entre la vanilline est les tanins condenss (Schofield et al ., 2001).-

Pour 400l de chaque chantillon ou standard, on ajoute 3ml dune solution de vanilline (4%danslemthanol),et1,5mldacidehydrochloriqueconcentr.Lemlangeestincub durant 15 min et labsorbance est lue 500nm. Lesconcentrationsdestaninscondensssontdduitespartirdesgammesdtalonnage tabliesaveclacatchine(0-300g/ml),etsontexprimesenmicrogrammedquivalent catchine par milligramme dextrait (g E CT/mg). I.2.5. Tests des activits biologiquesI.2.5.1. Activit antimicrobienneSouches microbiennes testes Les souches microbiennes utilises sont :Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ,Escherichia coli (ATCC 25922) ,Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Salmonella thyphimurium ,Klebsiella pneumonia ATB (1476), Candida albicans. Chapitre 1 Matriel et mthodes 31Test antimicrobien Afin dvaluer lactivit antimicrobienne des extraits des fruits obtenus,nous avons utilis la mthode de diffusion en milieu glos. LeprincipedecettemthodeestdutiliserdesdisquesdepapierWhatmannde6mmde diamtre. Les disques ont t imprgns dans diffrentes solutions (1g/ml) des extraits dissous dans le DMSO (dimethylsulfoxide) pour les extraits organiques, et dans leau distille strile pourlextraitaqueux(UndisqueimbibparleDMSOatemployentantquecontrle ngative).Puis dposs la surface dunmilieu couvillonn par une suspension microbienne dunedensitoptiquede0,5McFarlend.Nousavonsutilispourlessouchesbactriennesle milieuMuller Hinton, etle milieu Saboroud pour la levure. A la fin de la dure dincubation (18-24h pour les souches bactrienneset 48h pour la levure37oc), les diamtresdes zones dinhibition ont t mesurs (Choi et al ., 2006). I.2.5.2. Tests dactivit antioxydante : I.2.5.2.1. Test du blanchissement du carotne LactivitantioxydantedesextraitsduZizyphuslotusestmesureselonlamthodede Khartaletal(2007).Danscetestlacapacitantioxydanteestdtermineenmesurant linhibitiondeladgradationoxydativedecarotne(dcoloration)parlesproduits doxydation de lacide linolique. Lmulsionde-carotne/acidelinoliqueestprpareparsolubilisationde3mgde carotnedans1mlduchloroforme,25ldelacidelinoliqueet200mgdetween40sont additionns, le chloroforme est compltement vapor au rotavapeur, par la suite 100ml deau oxygne est ajout, lmulsion rsultante est agite vigoureusement. 350l de solution dextrait ou antioxydant de rfrence (BHT) (solubilis dans le mthanol sauflextraitaqueuxdansleaudistille(2mg/ml))sontadditionns25mldelmulsion prcdente. Lacintiquededcolorationdelmulsionenprsenceetenabsencedantioxydant (contrlengatifdanslequellchantillonestremplacepar350ldemthanol)estsuivie 490nmdesintervallesdetempsrgulirespendant48heures.Lactivitantioxydante relative des extraits (AAR) est calcule selon lquation suivante : AAR=Abst=48h (chantillon)/Abs t=48h (BHT) x100 Chapitre 1 Matriel et mthodes 32I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH : Afin dtudier lactivit antiradicalaire des diffrents extraits, nous avons utilis la mthode basesurleDPPH(diphnylpicrylhydrayl)commeunradicalrelativementstable,selonle protocole dcrit par Mansouri et al (2005).Dans ce test les antioxydants rduisent le diphnyl picryl hydrayl ayant une couleur violette en un compos jaune , le diphnyl picryl hydrazine , dontlintensitdelacouleurestinversementproportionnellelacapacitdesantioxydants prsents dans le milieu a donn des protons (Sanchez-Moreno,2002). LasolutiondeDPPHestprpareparsolubilisationde2,4mgdeDPPHdans100mlde mthanol.50ldessolutionsdextraitsoustandard(querctine)sontajouts1,95mlde DPPH,lemlangeestlaisslobscuritpendant30min,etladcolorationparrapportau contrle ngatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesure 517nm. Lactivit antiradicalaire est estime selon lquation suivante : % dactivit antiradicalaire= [(Abs517 contrle-Abs517 chantillon)/Abs517controle] x100 Lesconcentrationsdesextraitsdanslemilieuractionnelsontcomprisesentre0-12,5mg/ml,0-4mg/ml,0-2,5mg/ml,0-1mg/mlpourlesextraits :ET ,DCM,MET,AQ respectivement.Alorsquepourlesantioxydantsstandard(Rutine,Querctine,BHT)sont comprises entre 050g/ml et entre 025g/ml pour la vitamine C. I.2.5.2.3. Analyses statistiques Les rsultats des tests effectus sont exprims en moyenne SD. Les sigmodes de lactivit antiradicalairedesdiffrentsstandardsetextraitssonteffectusparlelogiciel(GraphPad Prism V 5,00). La diffrence entre les extraits et les contrles et la dtermination des taux de signification sonteffectus par test ANOVA suivi du test Tukey. Chapitre II Rsultats et discussion Chapitre IIRsultats et discussion 33II.1. Dtermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus Afin de dterminer la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus, nous avons utilis la mthode dAudigie et al (1987), dont le but est dexprimer les rsultats des constituants biochimiques par rapport la matire sche.Tableau 4. La teneur en eauet de matire sche des fruits du Zizyphus lotus Les valeurs reprsentent la moyenne de 30 essais SD Comparativement aux valeurs trouves chez dautres varits du mme genre doccurrence, le Zizyphus mauritiana (Grosskinsky, 1999), Zizyphus spina christi (Anthony, 2005) et Zizyphus jujuba (Catoire et al ., 1994), dont la teneur en eau est comprise entre 46 85%,la valeur que nous avons obtenue pour Zizyphus lotus est nettement faible (8,960,73%). Ce ci sexplique probablement par sa conservation pendant de longues dures, et mme la diffrence des conditions climatiques et la rpartitiongographique. II.2. Dtermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus La teneur en cendre du Zizyphus lotus a t dtermine aprs incinration, la cendre gristre obtenue reprsente les diverses substances minrales.Tableau 5. La teneur en cendre et de matire organique des fruits du Zizyphus lotus

Les valeurs reprsentent la moyenne de 30 essais SD Selon Murdock (2002), la teneur en lments minraux de ce fruit est (0,82% de matire sche), qui est une valeur infrieure celle de notre chantillon (3,5%). Teneuren eau (g/100g)Teneur en matire sche (g/100g) 8,960,73 91,030,73 Teneuren cendre (g/100g)Teneur en matire organique (g/100g) 3,50,31 96,50,31 Chapitre IIRsultats et discussion 34II.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotusLaprparationdesextraitspartirdesfruitsduZizyphuslotusateffectue selonlamthodedeDialloetal.(2004)modifie.Cettemthodeestbasesur lutilisationdessolvantspolaritcroissante(Etherdeptrole DichloromthaneMthanol),aveclaprparationdunemacrationaqueuse 10%. De ce fait, quatre diffrents extraits ont t obtenus. Lextraitthrique(ET),quireprsentelextraitleplusapolaire,etleplus riche en matire grasse. Lextraitdichloromthanique(DCM),reprsentelextraitmoyennement apolaire Lextrait mthanolique (MET) reprsente lextrait polaire Lextrait (AQ), reprsente lextrait le plus polaire. Lacouleur,laspectainsiquelerendementdechaqueextraitparrapportau poids du fruit sec sont reprsents dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit Zizyphus lotus Extrait Aspect CouleurRendement ET DCM MET AQ Huileux Huileux Pteux poudre Vert Vert noir Marron fonc Marron clair0,36% 0,28% 6,4% 40,4% Lesrsultatsobtenusmontrentqueparmilesquatreextraits,lextrait(AQ) reprsente le rendement le plus lev (40,4%), suivi par lextrait mthanolique 6,4%, alorslesextraitsapolairespossdentlesrendementsbas,dontlextraitthrique (0,36%) suivipar lextrait dichloromthanique(0,28%). Chapitre IIRsultats et discussion 35Lutilisationdediffrentssolvantspolaritdiffrentepermetdesparerdes compossselonleurdegrdesolubilitdanslesolvantdextraction.Cettemthode dextractionmenetempratureambianteetsousagitationcontenue,permet dextrairelemaximumdescomposantsbioactifsetdeprvenirleurdnaturationou modificationprobable,dontlatempratureleveprovoquelinactivationdes compossphnoliques,ladiminutiondeleurextractibilitdanslesolvant,aussi affecte leur quantification (Hagermann et al ., 2000). II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus : II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotusII.4.1.1.Tests prliminaires Tableau 7. Rsultats des testes prliminaires des flavonoides et des tanins sur les diffrents extraits du Zizyphus lotus Algarddesrsultatsobtenus,laprsencedesflavonodesetdestaninsdans les fruits du Zizyphus lotus est vidente, ce qui est en accord avec les rsultats obtenus par Borgi et al. (2007(b)). ExtraitsMtabolite testCouleur rsulteRsultats ET DCM MET AQ Flavonode - - Couleur rougeCouleur rouge - - + + ETDCM MET AQ Tanins - - Bleu verdtreBleu verdtre- - + + Chapitre IIRsultats et discussion 36Les extraits polaires montrent une prsence des flavonoides plus importante que lesextraitsapolaires,cecipeuttreattribuladiffrencedudegrdepolaritdes flavonodes, dont les flavonoides polaires reprsentent la fraction la plus leve. Lapparitiondelacouleurbleuverdtrerefltelaprsencedestanins catchiques(condenss)danslesextraitspolaires,alorssonabsencetotaldansles extraits apolaires. Les mmes rsultats sont trouvs par Borgi et al. (2007(b)), qui ont effectuletestprliminairedestaninssurdiffrentsextraitsobtenuspartirdes diffrentsorganesduZizyphuslotus,dontsesrsultatsontrvllaprsencedes taninsdanslesextraitspolaires(aqueuxetmthanolique),etleurabsencedans lextraitchloroformique(solvantquivalentdupointdevuepolaritau dichloromthane utilis dans le prsent travail). II.4.1.2. Analyses chromatographiques II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince PourunecaractrisationpartielledesdiffrentsextraitsduZizyphuslotus,une chromatographiesurcouchemince(CCM)atralise.Lesstandardsutilisssont des composs phnoliques. La rutine (Rut), querctine (Que), catchine (Cat) sont des flavonoides,lacidetannique(At)etlacidegallique(Ag)sontdesacides phnoliques.Lesystmedemigrationutilis(BAW)butanol-acideactique-eau (60/15/35) permet seulement de sparer lextrait MET. Alors pour les extraits DCM et ET, le systme de migration (Ether de ptrole/actate dthyle) (8/2) a t employ

MET AQAgAt QueRutCat Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du Zizyphus lotus aprs rvlation par la vanilline sulfurique Chapitre IIRsultats et discussion 37 METAQ AgAtQueRutCat Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))

ETDCM ETDCM Figure 16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du Zizyphus lotus (Rvlation par la vanilline sulfurique) Chapitre IIRsultats et discussion 38 AQ MET Rut Que ET DCM Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Rvlation par une solution de DPPH)

Tableau8. Rapports frontaux et couleurs aprs rvlationdes standards Aprs rvlation, deux taches apparaissent pour lextrait MET, elles sont visibles sousles rvlateurs (vanilline sulfurique, UV 254nm et UV366nm) (Figure 14,15). Lamesuredesrapportsfrontauxdechacunedestachesrvlequelunedes tache correspond la querctine (RF=0,93) et lautre la rutine (RF=0,52), ceci est en StandardsCouleur aprs rvlation (vanilline sulfurique) RF CatechineRouge0,87 QuerctineJauneorange0,93 Rutineorange0,52 Acide galliqueMauve0,86 Acide tannique Mauve0,83 Chapitre IIRsultats et discussion 39accord avec les rsultas obtenus par Kriventsov et Krakhanova (1970) qui ont montr la prsence des polyphnols et de la rutine dans les fruits du Zizyphus lotus. Alorspourlesystme(Etherdeptrole/actatedthyle)(8/2),plusieurstaches apparaissentpourlesextraitsapolaires(ET,DCM)avecdescouleursmauves,et roses, tmoignant probablement la prsence des strols et terpnes (Figure 16). LarvlationdelaplaqueparlasolutionthanoliquedeDPPHestuneCCMde criblage qui permet lobtention dune vue prliminaire sur lactivit antioxydante des diffrentsextraitstests.Lessubstancesactivessontvisualisescommedestaches jaunes sur un fond violet (Figure 17). Globalement, lintensit des taches jaunes est plus dense dans les extraits polaires (AQ,MET)parrapportauxextraitsapolaires(ET,DCM)quineprsententaucune tache jaune. Notant toutefois quun rsultat ngatif obtenu pour un extrait test ne doit pas exclure la prsence de substances actives dans cet extrait. Lune des taches apparaissent pour lextrait MET, une tache jaune correspondante larutine(RF=0,52),cequiconfirmelersultatobtenusouslarvlationparla vanillinesulfurique,alorsnousavonsremarqulabsencedelatachequiest normalementcorrespondantelaquerctine,cecipeuttreattribulafaible concentration de la querctine prsent dans lchantillon test. Alors pour lextrait AQ unetachejauneapparue,ayantun(RF=0,93)correspondantlaquerctinequi napparat pas sous les autres rvlateurs.II.4.2.2. Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18LHPLC-RPC18permetdidentifierlaprsencedequelquessubstancesdans chacundesquatreextraitstudis,parcomparaisonentreletempsdertentiondes standards (Figure18) et les chromatogrammes des extraits. Chapitre IIRsultats et discussion 40

Acide gallique Acide tannique

Acide cafique Catchine

RutineQuerctine Figure 18. Chromatogrammes des diffrents standards tests par lHPLC Minutes0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0Volts012Volts0120,700 1,3251,6753,175ChannelAsoumia1062RetentionTimeMinutes0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0Volts0,00,51,01,5Volts0,00,51,01,5 1,1081,3081,6422,075ChannelAsoumia1064RetentionTimeMinutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volts0123Volts0123 1,9923,1084,6005,100ChannelAsoumia1139RetentionTimeMinutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volts0,00,10,2Volts0,00,10,20,7501,0251,2171,4331,7422,6753,2753,8584,3174,7256,183ChannelAsoumia1047RetentionTimeMinutes0 2 4 6 8 10 12 14Volts0,00,51,01,5Volts0,00,51,01,50,8251,1081,3751,6251,8503,33312,68313,792ChannelAsoumia1036RetentionTimeMinutes0 2 4 6 8 10 12 14Volts012Volts0120,7250,9421,2251,3581,6832,9503,300ChannelAsoumia1137RetentionTimeChapitre IIRsultats et discussion 41Tableau 9. Temps de rtention des standards tests Standards(TR) min Querctine Rutine Catechine Acide caffique Acide tannique Acide gallique 6,5 3,3 1,7 1,9 1,641,67 Les rsultats obtenus sont montrs dans le tableau suivant : Tableau 10. Les standards dtects dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus Querctine RutineCatechineA.caffiqueA.galliqueAtannique ET- -+ + -- DCM- -+ + -- MET- -- + -- AQ+ - + --- LanalysedesdiffrentsextraitsparlHPLCpermetdidentifierlaprsencedela catchine et lacide cafique dans les extraits apolaires (ET, DCM) (Figure 19,20) AlorspourlextraitMET(figure21),lacidecafiqueestleseulcomposant dtect,ceciestcorrespondantaursultatobtenuparCapanogluetal.(2006)quia ralis lHPLC sur le Zizyphus vulgarisPour lextrait aqueux (Figure 22), deux composants sont dtects, la catchine et la querctine qui est apparu prcdemment aprs rvlation par la solution du DPPH. Chapitre IIRsultats et discussion 42Minutes0 2 4 6 8 10 12 14Volts0,0000,0020,004Volts0,0000,0020,0040,683 1,5751,8332,0832,3582,6753,0003,2923,6674,1174,5755,2586,0086,5087,2258,3759,03310,36711,33312,23314,742Channel Asoumia1003Retention Time S Minutes0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Volts0,0000,0020,004Volts0,0000,0020,004 1,6751,9672,242 2,5332,8753,2333,5423,9504,4424,9335,6675,9587,0337,6259,54210,85012,91715,45016,392Channel Asoumia1004RetentionTime Minutes0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Volts0,0000,0020,004Volts0,0000,0020,004 1,6581,9422,2422,5003,1833,4833,8834,3754,8755,5756,3426,9087,6509,4759,8759,99210,79211,04212,73315,30816,20816,83317,108Channel Asoumia1005Retention Time Figure 19.Chromatogrammes obtenus pour lextrait thrique du Zizyphus lotusChapitre IIRsultats et discussion 43Minutes0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Volts0,00000,00250,0050Volts0,00000,00250,0050 1,4921,9832,2002,8673,5083,9334,3835,0505,4585,5756,2586,88311,60813,875Channel Asoumia1006Retention Time Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volts-0,000250,000000,000250,00050Volts-0,000250,000000,000250,00050 1,3831,7671,9672,1583,6673,8584,0338,400Channel Asoumia1010Retention TimeFigure 20.Chromatogrammes obtenus pour lextrait du dichloromthane du Zizyphus lotus Minutes0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0Volts0,000,050,100,15Volts0,000,050,100,15 1,6922,0082,1422,4583,933Channel Asoumiacafeine011Retention Time Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volts0,00,10,20,3Volts0,00,10,20,3 1,5421,6502,0922,7257,5759,900Channel Asoumia1211Retention Time Figure 21. Chromatogrammes obtenus pour lextrait mthanolique du Zizyphus lotusChapitre IIRsultats et discussion 44

Minutes0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0Volts0,00,10,20,3Volts0,00,10,20,30,508 1,4751,7083,625Channel Asoumia1191Retention Time Minutes0 2 4 6 8 10 12 14Volts0,00,10,2Volts0,00,10,2 1,0831,5421,7752,8084,2926,558Channel Asoumia1066Retention Time Figure 22. Chromatogrammes obtenus pour lextrait aqueux du Zizyphus lotus II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus Afin de caractriser les diffrents extraits prpars partir des fruits du Zizyphus lotus ,un dosage des polyphnols totaux , des flavonoides et des tanins a t effectu.Le choix du dosage deces substances rside dans le fait que la majorit des proprits antioxydantes des plantes leur sont attribus. La mthode du dosage des polyphnols totaux est celle de Folin Ciocalteu (Li et al .,2007). Lacide gallique a t utilis comme standard .Tandis que celui des flavonoidesa t ralis selon la mthode de trichlorure daluminium (Bahorun et al ., 1996) ,enutilisant comme standard la querctine, enfin celui des tanins condenss a teffectu selon la mthode de vanilline (Broadhurst et Jones 1978), modifie par Heimler et al. (2006), en utilisant la catechine comme standard. Les rsultats sontreprsents dans le tableau11et les gammes dtalonnage dans les figures 23, 24,25 Chapitre IIRsultats et discussion 45Tableau 11.Dosage des polyphnols totaux, des flavonoides et des tanins condenss dans les diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus

(a)g dquivalent dacide gallique par milligramme dextrait. (b)g dquivalent de querctine par milligramme dextrait. (c) g dquivalent de catchine par milligramme dextrait. Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 4 mesures SD. Lesrsultatsdudosagedespolyphnolstotauxmontrentquelesextraits polaires(mthanoliqueetaqueux)sontlesextraitslesplusrichesenpolyphnols, dont les valeurs sont trs proches(50,00 versus 5,81,24). Dautre partles extraits apolaires(thriqueetdudichloromthanique)ontmontrdesvaleursvoisines (2,340,54 versus 1,990,12). Dans une tude faite sur cinq varits du jujube chinois (Zizyphus jujuba), Li et al. (2007) ont dos les polyphnols totaux par la mthode de Folin-Ciocalteu dans des extraitspolairesobtenusparextractionbasemthanol/eau(4 :1v/v) ;lersultat obtenupourlundescinqvarits(ZizyphusjujubaSanbianhong)(5,180,29g EAG/mgdextrait)estpresquesimilaireceluiobtenuaveclextraitaqueuxdu Zizyphus lotus (5,181,24 g/mg dextrait). Ladterminationquantitativedesflavonoidestotauxparlamthodedu trichloruredaluminiumrvlequelextraitaqueuxestlextraitleplusricheen flavonoidesavecuneteneurde(1,820,26gEQ/mgdextrait),suiviparlextrait mthanolique (0,830,17 g EQ/mg dextrait). Par la suite vient les extraits apolaires (ET,DCM),dontlextraitdichloromthaniqueavecuneteneurde(0,710,5g EQ/mg dextrait), suivi par lextrait thrique (0,640,4 g EQ/mg dextrait). ExtraitPolyphnols (a) Flavonodes (b)Tanins ET2,340,54 0,640,4- DCM1,990,12 0,710,5- MET 50,00 0,830,174,570,94 AQ5,81,24 1,820,26 6,771,95 Chapitre IIRsultats et discussion 46Capanoglu et al. (2006) ont dos les flavonoides dans lextrait mthanolique du Zizyphus vulgaris, o ils ont trouv une valeur suprieure (5,93g/ml) celle trouve dans lextrait mthanolique du Zizyphus lotus (0,83 g/ml). Entenantcomptedelapolaritdesextraits,ilapparatquelateneuren flavonoidesdansleZizyphuslotusaugmenteaveclapolaritdelextrait (AQ>MET>DCM>ET).Pawliskaetal.(2009)afaitunetudesurdeuxespces Zizyphus jujuba et Zizyphus spina-christi, dont ils ont attribu la diffrence de teneur en flavonoides entre les fruits, non seulement lespce, mais aussi aux conditions de croissance,commelesol,lesconditionsenviromentalesetgographiquesdurantle dveloppement du fruit, le dgre de maturation et la diffrence gntique.Le dosage des tanins condenss montrent la haute teneur de ces molcules dans lesextraitspolaires(mthanoliqueetaqueux),dontlextraitaqueuxreprsente lextraitleplusriche(6,771,95gECT/mgdextrait),suiviparlextrait mthanolique (4,570,94 g ECT/mg dextrait) Lexamen de ces rsultats permet de mettre en vidence une corrlation linaire significative(R2=0,79p0,05)entrelateneurdesextraitsenflavonodeseten compossphnoliques(Figure26).Demme,unecorrlationlinairesignificative (R2=0,98,p0,05)entrelateneurdesextraitsentaninscondenssetencomposs phnoliques (Figure 27). Ceci apparat logique, o les flavonoides et les tanins reprsentent les composs prpondrants des polyphnols.

y=0,0116x+0,0375R2=0,998500,511,522,50 50 100 150 200 250C oncentrationsen(ug/ml)Absorbance 765nm Figure 23. Droite dtalonnage de lacide gallique (moyenne SD de deux essais) Chapitre IIRsultats et discussion 47y=0,0661x+0,0112R2=0,998400,511,522,530 10 20 30 40 50concentrations(ug/ml)absorbance 430nm Figure 24. Droite dtalonnage de la querctine (moyenne SD de deux essais) y=0,0021x+0,004R2=0,997500,10,20,30,40,50,60,70 100 200 300 400c onc entrations(ug/ml)Absorbance 500nm Figure 25. Droite dtalonnage de la catchine(moyenne SD de deux essais)

Chapitre IIRsultats et discussion 48R2=0,7948 0.0 0.5 1.0 1.5 2.002468quantit en flavonoides (ug EQ/mg)Quantit en polyphnols totaux (ug EAG/mg)

Figure 26. Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la quantit des flavonoides des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05)

R2=0,9855

0 2 4 6 802468 Quantit en tanins (g E CT/mg)Ouantit en polyphnols (g EAG/mg)

Figure 27.Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la quantit destanins condenss des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05) Chapitre IIRsultats et discussion 49 II.5. Activits biologiquesII.5.1. Activit antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus LactivitantimicrobiennedesdiffrentsextraitsdesfruitsduZizyphus lotusa tvalueparlamthodedediffusionenmilieuglos,enmesurantlesdiamtres des zones dinhibition de la croissance microbienne (Figure 29). Tableau12.Diamtresdeszonesdinhibitiondelacroissancemicrobienneobtenus par diffrents extraits du Zizyphus lotus Les valeurs sont une moyenne de 3 4 essaisSD (les zones sont mesures en mm) TouslesextraitsduZizyphuslotussesontrvlsactifsavecundegr diffrent,liaucontenudesextraitsauxsubstancesactivitantimicrobienne. Ghdira(1995)amontrquunalcalodedecetteespceprsenteuneactivit antibactriennesignificative,sansngligerleffetsynergiquedesautresmolcules effet antimicrobien. Daprslesrsultatsobtenus,ilapparatquetouteslessouchesmicrobiennes testes sont inhibes au moins par lun des extraits, ce qui confirme le spectre large de lactivit antimicrobienne de ce fruit. LextraitthriqueduZizyphuslotussembleavoirleffetinhibiteurleplus puissant, parmi les quatre extraits, en prsentant des zones dinhibition de croissance avectouteslessouchesmicrobiennessaufSalmonellathyphimurium,demmecet extraitmontre la plus grande zone dinhibition, qui est apparue avec Escherichia coli (une zone dinhibition > 45mm), suprieure toutes les zones obtenues aprs test des antibiotiques sur la mme souche (Amoxilline 22mm, Cefoxitine 26mm). ExtraitsStaphylococcusaureusEscherichiacoli Pseudomonaaeruginosa Klebsiella pneumonia Salmonella thyphimurium Candida albicans ET22,070,8145,720 10,321,6517,160- 90 DCM14,130,58- - --- MT 16,450,496,290,059,761,81 -- - AQ17,411,71- - -70120 Chapitre IIRsultats et discussion 50Cetteactivitdelextraitthriquepeutsexpliquerparleffetantimicrobien puissantdescompossapolairesdelextraitthrique.UnetudefaiteparNasif (2002)surlesgrainesduZizyphusspinachristiamontrquelesacidesgrasdela fractionlipidiqueprsententuneforteactivitcontreEcoli.Lextrait(DCM)a montr seulement une activit avec Staphylococcus aureus. LesextraitspolairesduZizyphuslotusontmontruneactivitantimicrobienne avectouteslessouchesmicrobiennessaufKlebsiellapneumonia,lextrait mthanoliqueamontrdeszonesdinhibitionavectroissouchesbactriennes (Staphylococcus aureus, Escherichia coli etPseudomonas aeruginosa), alors lextrait (AQ)auneactivitavecStaphylococcusaureus,Salmonellathyphimurium et Candida albicans. IlestapparatqueleStaphylococcusaureus(grampositive)estlabactriela plussusceptibleparcomparaisonaveclesautressouches(gramngative) ;cecipeut treattribuladiffrencedelastructureentrelesbactriesgrampositivesetles bactriesgramngatives.Laparoicellulairedesbactriesgrampositivesest constitue par une seule couche alors que la paroi cellulaire des gram ngatives a une structuremulticouchelieparunemembranecellulaireexterne(Ali-Shtayehetal., 1998) (Figure 28) Gram+ Gram- Figure28 .Structure de la paroi bactrienne (Ali-Shtayeh et al ., 1998) Chapitre IIRsultats et discussion 51

Zones dinhibitions de lextrait MET sur Staph a Zones dinhibition de lextrait ET sur Staph a Zones dinhibitions de lextrait ET surPseudo aZones dinhibition de lextrait AQ sur Staph a Zones dinhibitions de lextrait ET surE coli Zones dinhibitions de lextraitAQ surCandida a Zones dinibitions de lexraitET surKlebsiella pFigure 29. Zones dinhibitions obtenues par diffrents extraits du Zizyphus lotus Chapitre IIRsultats et discussion 52II.5.2. Activit antioxydant II.5.2.1.Test du blanchissement du -carotne Dans ce test, loxydation de lacide linolique gnre des radicaux peroxydes, et des hydroperoxydes dine conjugus (Kaur et Kapoor, 2002). Ces radicaux libres vont par la suite oxyder le -carotne hautement insatur (Figure 30) qui perd ses doubles liaisonsentranantainsiladisparitiondesacouleurrouge,quiestsuivi spctrophotomtriquement490nm.Cependantlaprsencedunantioxydant pourraitneutraliserlesradicauxlibresdrivsdelacidelinolique,etdoncprvenir loxydationetleblanchissementdu-carotne(YanishilievaetMarinova,1995 ; Yang et al ., 2008) Figure 30. Structure chimique de -carotne (Diallo, 2005) Lacintiquedublanchissementdu-carotneenabsenceetprsencedes extraits du Zizyphus lotus, du BHT et les activits antioxydantes relatives (AAR) sont reprsents dans (Figure 31,32). Daprscesrsultats,ilestvidentqueleBHTetlesextraitstestsinhibent dune manire significative (p0,01) loxydation couple de lacide linolique et du -carotne par rapport au contrle ngatif qui reprsente (100%) de la peroxydation.Lextraitaqueux(AQ)montrelaplusgrandeactivitinhibitrice,dontson activitantioxydanterelativeest85,05%,maiscetteactivitrestesignificativement infrieure (p0,001) celle du BHT (100%) utilis comme contrle positif.Uneactivitantioxydanteintermdiaireatobtenuequaveclextrait mthanolique(MET)(69,24%)quiauneactivitsignificativementsuprieure(p 0,001) celle de lextrait thrique (36,48%). Chapitre IIRsultats et discussion 53Lactivitdecederniereststatistiquementsimilairecelledelextraitdu dichloromthane (33,9%) qui reprsente lextrait le moins actif.En comparaison avec BHT, lextrait aqueux (AQ) est 1,7fois moins actif que le BHT,lextraitdudichloromthane(DCM)est2foismoinsactifquelextrait mthanolique,et2,5foismoinsactifquelextraitaqueux,etpresque3foismoins actif que le BHT. Le test de blanchissement de -carotne a t ralis par Kamiloglu et al. (2009) sur les extraits mthanoliques de 50 gnotypes du Zizyphus jujube , o la moyenne de lactivitantioxydanteobtenueest73%quiestunevaleurmodrmentsuprieure celle obtenue de lextrait mthanolique du Zizyphus lotus (69,24%). En effet, une corrlation linaire remarquable et significative (R2=0, 99, p0,05) atmiseenvidenceentrelARR(activitantioxydanterelative)desextraitsdu Zizyphuslotusetleurteneursencompossphnoliques(Figure33).Ceciesten accord avec les rsultats obtenus par Yang et al. (2002) qui ont rapport qui il y a une corrlation entre le contenu en composants phnoliques et la capacit antioxydante. Dailleurs, il y a une autre corrlation significative (R2=0, 99, p0,05), entre lAAR et la teneur en tanins condenss des diffrents extraits du Zizyphus lotus (Figure 34), alors cette corrlation est non significative entre lAAR et la teneur en flavonoides des diffrents extraits. Ces rsultats nous permettent de dduire le rle important des polyphnols des extraits du Zizyphus lotus, et prcisment les tanins condenss dans lactivit antioxydante relative, oleur noyau phnolique leur confre une activit antioxydante puissante (Peronny, 2005). Dunemaniregnrale,cesrsultatssontenaccordaveclalittraturequi suggrequelactivitantioxydantedesextraitsvgtauxdpenddutypedusolvant dextractionetdesapolarit,dontladistributiondessubstancesactivit antioxydante entre les diffrents extraits dpend de polarit des extraits (Kang et al ., 2003). Chapitre IIRsultats et discussion 5400,20,40,60,811,21,40 10 20 30 40 50 60temps (h)Absorbance 490 nmBHTETDMCMetAQCON- Figure 31. Cintique de blanchissement du -carotne 490 nm en absence et en prsence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT, (chaque valeur reprsente lamoyenne de trois essais) Figure32. Activit antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus, duBHTdans le systme carotne/acide linolique (les valeurs sont la moyenne de trois mesures SD), les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits significativement diffrentes (p 0,05). BHTETDCMMETAQcontrole (-)050100150abbcde% activit antioxydante relativeChapitre IIRsultats et discussion 55R2=0,9913 0 2 4 6 8020406080100teneur en polyphnols (g EAG/mg)% activit antioxydante relative Figure33.Corrlationlinaireentrelateneurenpolyphnolsetlepourcentagede lactivit antioxydante relative (p0,05).

R2=0,99 0 2 4 6 8020406080100teneur en tanins(g ECT/mg)%activit antioxydante relative

Figure 34. Corrlation linaire entre la teneur en tanins et le pourcentage de lactivit antioxydante relative (p0,05). Chapitre IIRsultats et discussion 56II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH LactivitantioxydantedesdiffrentsextraitsduZizyphuslotusvis--visle radicalDPPHatvaluespectrophotomtriquementensuivantlarductiondece radicalquisaccompagneparsonpassagedelacouleurviolettelacouleurjaune 517 nm (Figure 35). Diphenylpicrylhydrazyl +Antioxydant-OH Diphenylpicrylhydrazine+Antioxydant-O.

(Couleur violet) (Couleur jaune) Figure 35. Raction dun antioxydant avec le DPPH (Molineux ,2004). LeDPPH (diphenylpicrylhydrazyl)est un radical libre organique, toujours utilis commeunractifpourvaluerlactivitantiradicalairedesantioxydants(Oyaizu, 1996). LeDPPHestcaractrisparsonadaptationplusieurschantillonsdansune courte dure, aussi il est assez sensible pour dtecter les ingrdients actifs des basses concentrations,ceteffet,ilatemploypourlecriblagedesactivits antiradicalaires des extraits vgtaux (Yi et al ., 2008). Lesprofilesda