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Meacutethodes d rsquoeacutetude de lacellule
Cellule plus petite quantiteacute de matiegravere vivante capable de subsister agrave
lrsquoeacutetat autonome et de se reproduire
Types cellulaires
La deacutecouverte de la cellule
La theacuteorie cellulaire
Hist
oriq
ue
La deacutecouverte de la cellule
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Cellule plus petite quantiteacute de matiegravere vivante capable de subsister agrave
lrsquoeacutetat autonome et de se reproduire
Types cellulaires
La deacutecouverte de la cellule
La theacuteorie cellulaire
Hist
oriq
ue
La deacutecouverte de la cellule
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Types cellulaires
La deacutecouverte de la cellule
La theacuteorie cellulaire
Hist
oriq
ue
La deacutecouverte de la cellule
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
La deacutecouverte de la cellule
La theacuteorie cellulaire
Hist
oriq
ue
La deacutecouverte de la cellule
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
La deacutecouverte de la cellule
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Robert Hooke observe des petits trous dans lrsquoeacutecorce du checircne (liegravege) qui lui font penser aux cellules dune prison Il les nomme laquo cellules raquo et croit que seul le liegravege preacutesente ces structuress
Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave deacutecrire des unicellulaires qursquoil voyait dans des gouttes drsquoeau mais aussi des globules rouges sanguins et des spermatozoiumldes
Robert Hooke (1665) a inventeacute le mot cellule mais Antonie Van Leeuwenhoek a eacuteteacute le premier agrave observer reacuteellement des cellules
Microscope rudimentaire de Hooke
Cellules dans lrsquoeacutecorce du liegravege
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
La theacuteorie cellulaire
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Ces scientifiques ont meneacute agrave la theacuteorie cellulaire
1 La cellule est la plus petite entiteacute vivante
2 Tout ecirctre vivant est composeacute de cellules
3 Toute cellule provient dune autre cellule
Un an plus tard le zoologiste Theacuteodore Schwann en arrive agrave la mecircme hypothegravese au sujet des animaux
En 1838 Matthias Schleiden un botaniste suggegravere que tous les tissus veacutegeacutetaux sont faits de cellules
En 1855 Rudolf Virchow suggegravere que toute cellule provient dune autre cellule preacuteexistante
Source
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LrsquoORGANISATION CELLULAIRE
rArr Techniques morphologiques
Cest lrsquoexamen drsquoobjets (echantillon) agrandis
MicroscopiquesMicroscopiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Les cellules possegravedent un plan drsquoorganisation
Les 3 domaines du monde vivant
Bacteacuteries Archeacutees
Eucaryotes
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Cellule animaleCellule animale Cellule veacutegeacutetale
MEMBRANE PLASMIQUE (Plasmalemme) CYTOPLASME NOYAU MITOCHONDRIES
REacuteTICULUM ENDOPLASMIQUE (RE) RIBOSOMES APPAREIL DE GOLGI LYSOSOMES
CYTOSQUELETTE
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
PAROI CELLULAIRE OU CELLULOSIQUE (PECTOCELLULOSIQUE) VACUOLE
PLASTES
CENTRIOLE CENTRIOLE
Eleacutements inter cellulaireEleacutements inter cellulaire
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopes utilisent la deacuteviation drsquoun flux ondulatoire (ondes)
de particules soit non chargeacutees les photons soit chargeacutees eacutelectriquement les eacutelectrons agrave travers un systegraveme de lentilles de maniegravere agrave former un objet agrave eacutetudier une image agrandie
Les microscopesLes microscopes
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
microscope Photoniqueagrave lumiegravere
Photoniqueagrave UV
Electroniques TEM
Electroniques SEM
Limite de reacutesolution 0 2 microm
0 1 microm
1nm
2 nm
Grossissement maximum x 2000 x 2000 X 150 000
X 30 000
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Au microscope optique
Au microscope eacutelectronique
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Le microscope optique
contient deux lentilles principales lobjectif et
loculaire La lumiegravere qui traverse la preacuteparation
passe successivement dans chacune de ces deux
lentilles Limage de lobjet y est agrave chaque fois
agrandie
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Le microscope optique est un instrument ougrave srsquoeffectue un double grossissement
Une lentille donne une image primaire agrandie de lrsquoobjet cette image est reprise et agrandie par une
seconde lentille grossissante simple
rArr La lentille de lrsquoobjectif effectue le grossissement primaire et donne une image reacuteelle
rArr La lentille de lrsquooculaire effectue le grossissement secondaire Elle permet agrave lrsquooeil de former une image virtuelle agrandie de lrsquoimage reacuteelle formeacutee par la lentille de lrsquoobjectif
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
OEIL
OCULAIRE
OBJECTIF
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
La preacuteparation
des eacutechantillons
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Observation direct sur cellules vivantes
Observation indirect (cellules mortes (fixeacutees) diams frottis diams coupes
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Observation non coloreacutes
Observation coloreacutesColorants vitalesColorants fixateurs
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
bull rendent les membranes cellulaires et autres eacuteleacutements de la cellule visibles au microscopebull les colorants acides et les colorants basiques selon que le groupement chimique qui confegravere la coloration (groupement chromophore) est acide ou basiquebull reacuteagissent avec les groupements ioniseacutes des proteacuteines acides nucleacuteiques et polysaccharides
Colorants pour microscopie optique Colorants pour microscopie optique
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Types de MO
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Le microscope optique agrave fond noir possegravede un condenseur agrave fond noir et les rayons lumineux arrivent lateacuteralement sur lrsquoobjet La cellule apparaicirct comme un objet brillant sur le fond noir
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Le microscope agrave contraste de phase possegravedent des systegravemes optiques conccedilus pour exploiter les proprieacuteteacutes de diffraction des cellules vivantes La lumiegravere traversant les parties relativement denses ou eacutepaisses de la cellule est retardeacutee par rapport agrave celle qui traverse une reacutegion voisine plus mince Il se creacutee ainsi des effets drsquointerfeacuterences produits par la recombinaison de ces deux seacuteries drsquoondes donnant des images fortement contrasteacutees
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Images obtenues agrave lrsquoaide de la microscopie optique ordinaire (A) et agrave contraste de phase (B)
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Microscope electronique
Lrsquoagrandissement des images peut atteindre 100000 fois et plus
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Dans ces microscopes le faisceau des photons est remplaceacute par un faisceau lrsquoeacutelectrons eacutemis sous vide acceacuteleacutereacutes par une forte diffeacuterence de potentiel et canaliseacutes par une seacuterie de lentilles eacutelectromagneacutetiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Microscopie eacutelectronique
Agrave transmission Agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Microscopie eacutelectronique agrave transmission
Les eacutelectrons non diffracteacutes sont dirigeacutes sur un eacutecran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur 1048774 zone claire1048774 les eacutelectrons diffracteacutes nrsquoatteignent pas lrsquoeacutecran 1048774 zone sombre sur lrsquoeacutecran1048774 grossissement = 1000000 (vs 1000X microscope optique)1048774 limite de reacutesolution peut atteindre 02 nm
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Le speacutecimen est vaporiseacute avec un meacutetal lourd Le speacutecimen est balayeacute par un faisceau drsquoeacutelectrons Eacutemission d rsquoeacutelectrons secondaires par le speacutecimen Produit une vue 3D du speacutecimen
Microscopie eacutelectronique agrave balayage
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Microscopie eacutelectronique agrave fluorescence
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Cellules reacutenales du rat10 micrometer
spermatozoiumldes
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
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Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
En recouvrant la surface des membranes et organites augmentent le contraste des structures irradieacutees avec les eacutelectronsExemplesbullTetroxyde drsquoosmiumbull Aceacutetate drsquouranylebull Aceacutetate de Pb etc
colorants pour microscopie eacutelectronique (Intensificateurs)
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
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1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Preacuteparation drsquoeacutechantillons
Utiliseacutees pour eacutetudier la structure de la cellule
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
En microscopie optique ou eacutelectronique la preacuteparation comporte geacuteneacuteralement 4 eacutetapes
Coupe
FixationDeacuteshydratation
Inclusion
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Utilisation de reacuteactions chimiques qui vont permettre la mise en eacutevidence de moleacutecules particuliegraveres dans la cellule
Meacutethodes cytochimiquesTechniques de marquage
cellulaire
Ces techniques sont toutes baseacutees sur lrsquoemploi de microscopes optiques et eacutelectroniques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Etude des rocircles des constituants celluliare
Differentiation cellulaire
les manipulations sont justifieacutees par les deux exigences de lrsquoexamen au microscope
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Les objets agrave examiner doivent
ecirctre minces
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
Leurs diffeacuterents eacuteleacutements doivent
preacutesenter un certain contraste
But des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
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1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
ETUDE DE LA CONSTITUTION PHYSICO-CHIMIQUE DES CELLULES rArr Techniques analytiques
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
1 Proceacutedeacutes physiques diams Cytophotomeacutetrie diams Diffraction aux rayons X diams Cytophotomeacutetrie de flux
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
2 Proceacutedeacutes chimiquesCytochimie
diams Cytoenzymologie diams Immunocytochimie
3 Methodes biochimiques3 Methodes biochimiques
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
1 Fractionnement diams Ultracentrifugation diams Chromatographie diams Electrophoregravese
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
2 Caracteacuterisation diams Spectrophotomeacutetrie diams Hybridation moleacuteculaire
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Speacutecifiques Non-speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques
deacutetectent un ensemble de moleacutecules aux proprieacuteteacutes chimiques communes eg ADN nucleacuteaire
deacutetectent une moleacutecule particuliegravere eg tubuline
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Meacutethodes de DEacuteTECTION(speacutecifiques ou non-speacutecifiques
Meacutethodes fluorescentes
Meacutethodes radioautographiques
Meacutethodes enzymatiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Meacutethodes enzymatiques
Formation drsquoun deacutepocirctopaque agrave la lumiegravere oudense aux eacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique +densitomeacutetrie)
Meacutethodesradioautographiques Formation de grainsdrsquoargent opaques agrave lalumiegravere ou denses auxeacutelectrons(microscopie optique oueacutelectronique
Meacutethodes fluorescentes Composeacute fluorescent(fluorophor e)spectrofluoromeacutetriemicroscopie agraveeacutepifluorescencemicroscopie confocale agravebalayage)
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
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Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Meacutethodes cytochimiques speacutecifiques
Immunocytochimie Hybridation in situ
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
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Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
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Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
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Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
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Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
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Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
IMMUNOCYTOCHIMIEDeacutetection des proteacuteines ou autres moleacuteculesbull Sondes utiliseacutees anticorps dirigeacutes contre une proteacuteine particuliegraverebull anticorps primaire appliqueacute sur des coupes de tissus1048774 reconnaissance de la proteacuteinebull anticorps secondaire dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire et coupleacute agrave bull une moleacutecule fluorescente (deacutetecteacutee parimmunofluorescence)bull une moleacutecule radioactive (deacutetecteacutee par radioautographie)bull une enzyme (deacutetecteacutee apregraves incubation avec un substrat incolore qui se colorera apregraves reacuteaction)bull Une particule opaque aux eacutelectrons (pour la MET) (eg or colloiumldal)
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
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Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
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membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
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Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Immunocytochimie par fluorescence(immunofluorescence)
CIBLE ici uneproteacuteinemembranair
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Hybridation in situDeacutetection de seacutequences drsquoADN ou drsquoARN speacutecifiquesbull Les sondes sont des ARN ou ADN compleacutementaires aux seacutequences drsquointeacuterecirctbull Appliqueacutees sur les coupes de tissus puis visualiseacutees par diams radioautographie gracircce aux nucleacuteotides radioactifs preacutesents dans la sondeoudiams immunocytochimie gracircce agrave la preacutesence de nucleacuteotidescoupleacutes agrave la digoxigeacutenine alors deacutetecteacutee par un anticorps speacutecifique coupleacute agrave une enzyme ou agrave une moleacutecule fluorescente
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
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membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Hybridation in situHybridation in situsondes fluorescentes(technique duldquoFISHrdquo)
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
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Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
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Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
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eacutelectronique
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Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
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Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
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Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Meacutethodes cytochimiques non-peacutecifiquesMeacutethodes cytochimiques non-peacutecifiques
A) Deacutetection de groupements chimiques preacutesents dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
ExdiamsLa reacuteaction de Milton deacutetection des radicaux pheacutenoliques de la tyrosinediamsLa meacutethode de Feulgen (reacuteactif de Schiff groupements aldeacutehydiques) acides nucleacuteiques et certains glucides et lipides
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Les techniques immunochimiques
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
Questions
Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
Mitochondriescellule animale
bacteriesvirus
membrane plasmique
Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Techniques cytoenzymologiques
Techniques cytoenzymologiques
Deacutetection drsquo activiteacutes enzymatiques preacutesentes dans toutes les proteacuteines les acides nucleacuteiques ou les acides gras
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
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Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
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immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
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Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
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eacutelectronique
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Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Principe Mise en eacutevidence dans une cellule de proteacuteines agrave activiteacute enzymatique
Transformation drsquoun composeacute soluble et incolore en un composeacute insoluble et coloreacute en preacutesence drsquoune activiteacute enzymatique particuliegravere (phosphatases esteacuterases oxydases)
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
Les techniques immunochimiques
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Immunohistochimie leacutechantillon est une coupe de tissu
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immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
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Meacutethodes directes
Il est ensuite reacuteveacuteleacute par un anticorps marqueacute On mesure la fraction lieacutee qui augmente avec la concentration en antigegravene agrave doser
Dosages avec un excegraves de reacuteactif meacutethodes immunomeacutetriques
Meacutethodes directes
L es anticorps marqueacutes avec la fluoresceacuteine sont utiliseacutes pour deacutetecter des constituants cellulaires au niveau du microscope optique alors que la ferritine est utiliseacutee en microscopie eacutelectronique
Association de la microscopie et lrsquoimmunichimie
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Q1 Quelle sont les organites qursquoon distingue avec le microscope
optique
Mitochondriescellule animale
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Q1 Quelle sont les organites qursquoon peut distinguer avec le microscope
eacutelectronique
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Q3 La cellule procaryote est composeacute de
Mitochondriesenveloppe nucleaire
un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
membrane plasmique
Q3 La cellule eucaryote est une cellule helliphelliphelliphelliphelliphelliphellipou helliphelliphellip
est composeacute deMitochondries
enveloppe nucleaireun brin drsquoADN
Deux brins drsquoADNmembrane plasmique
Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
Q4 Quel est le principe et le role des meacutethodes cytochimiques
Meacutethodes qualitativesLe but de limmunochimie est de reacuteveacuteler une moleacutecule biologique preacutesente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps speacutecifiques
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immunocytochimie leacutechantillon est une preacuteparation cytologique
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un brin drsquoADNDeux brins drsquoADN
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Q3 Quels sont les eacutetapes geacuteneacuteral drsquoune preacuteparation cellulaire
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