Méthodes de transformation des plastes

Bréard Dimitri; Delecolle Julien; Di Pascoli ThomasM1 BVP - VRV

PlanI) Introduction

1) Différents types de génomes2) Théorie endosymbiotique 3) Les plastes4) Problèmes rencontrés

II) Transformations5) Différentes types de transformations

La biolistiqueLa méthode des PEGs

2) Mécanismes d’intégrations et d’expressions du transgène

Recombinaison homologueExpression des gènes polycistroniquesGènes marqueurs de sélectionExpression transitoire

3) Comparaison avec la transformation nucléaire

III) Applications4) La « tomate dorée ».5) Autres exemples remarquables

IV) Discussion

V) Références6) Publications7) Images

1) Distribution génomique

I) Introduction

2) La théorie endosymbiotique

3) Les plastes

AmyloplastesOléinoplates

Protéinoplastes

4) Problèmes rencontrés

1) Comment faire passer le transgène dans le chloroplaste?

2) Aucuns virus ou bactéries de connus pour infecter les chloroplastes et servir de vecteur de transfert.

II) Transformations de plastes

Plante modèle pour la transformation des plastes.

Chloroplastes = plastes les mieux étudiés et les plus ciblés pour la transformation.Nicotiana tobacum

1) Les différentes transformations

a) La biolistique :

Particules d’or ou de tungstène de 0,4 à 1μM de diamètre.

L’intégration se fait également dans les plastes

2 régénérations sur milieu sélectif pour n’avoir que des plastes transformés

• Toutes les plantes ne peuvent pas être transformées directement par des sections de leurs feuilles:

Bombarder les tissus (cellules) méristématiques.

• Les cellules peuvent contenir entre 10 et 14 proplastes(100aine de chloroplastes pour une cellule de feuille)

Après divisions, le nombre de plastes transformés augmentera plus rapidement.

Les plastes non-transformés vont se « perdre » par dilution.

SojaCoton

b) Méthode des PEGs :

Polyéthylène Glycol (PEG)

Déstabilisation des membranes plasmiques permettantl’insertion de transgènes.

Protoplastes

• PEG plus cher que la biolistique et mécanismes très peu connus.

• Et Agrobactérium dans tout ça ???

Peu efficace pour la transformation de plastes.

Insertion ciblée à l’aide de séquences homologues.Site d’intégration choisi:moins d’impact sur le développement et la viabilité.

« Copy correction » :Intégration dans séquence répétée inversée (IR), duplication dans l’autre IR.

Augmentation du nombre de protéines recombinantes.

a) Recombinaison homologue

D’après Meyers 2010.

GOI = gene of interest

2) Mécanismes d’intégration et d’expression du transgène

Expression de plusieurs gènes (comme opéron).

Un promoteur et un terminateur pour tous les ORFs.

b) Expression des gènes polycistroniques

Simplification de la transformation (plusieurs gènes d’intérêts).

Réduction du nombre d’étapes de transformation.

Chaque ORF nécessite un site de liaison aux ribosomes (RBS) pour pouvoir être traduits.

Insertion des RBS entre les ORFs.

D’après Meyers 2010.

• Le plus utilisé: gène aadA , résistance à la spectinomycine.• Gènes de résistance kanamycine, Chloramphénicol également utilisés.• Le gène de résistance peut être couplé au système Cre/Lox.

Séquences flanquantes au transgène spécifiquement reconnues par une recombinase codée par le système Cre/Lox. Le gène de résistance sera supprimé de la construction. Utile pour la transformation de plantes de grandes cultures.

c) Gènes marqueurs de sélection

D’après Bock 2011.

d) Expression transitoire

• « Prototypage » du transgène dans Escherichia coli.• Similarité des mécanismes de transcription et traduction de E.coli et du

plaste. Etudes du transgène dans la bactérie.

• Un transgène qui s’exprime bien dans la bactérie devrait bien s’exprimer dans les plastes.

?

3) Comparaison avec la transformation nucléaire.

Noyau Plaste

Méthodes de transformation

1) Agrobactérium = méthode universelle.

2) Biolistique et PEG/protoplastes pour les plantes sans hôtes naturels

1) Biolistique (la plus utilisée).

2) PEG/protoplastes

Rendement de transformation

Avec Agrobactérium, un disque foliaire donne 10aine de

plantes.

Avec biolistique 1 à 2 disques foliaires pour 1 transformant.

Vecteurs de transformation

Le même vecteur binaire utilisé pour plusieurs espèces.

Séquences homologues ajustées d’une espèce à

l’autre. Expression transitoire

Agroinfiltration.Biolistique.

Vecteur viral.

Insertion dans E. coli = évaluation de la construction.

D’après Meyers 2010.

Noyau Plaste

Niveau d’expression des protéines

recombinantes

N’excède pas 1-2% des protéines solubles totales

(TSP).5 à 25% de TSP.

Intégration de plusieurs transgènes

2 à 3 transgènes avec vecteurs binaires classiques

Expression de plusieurs transgènes (polycistronique).

Effets de position Intégration aléatoire effets de position et RNA silencing.

Intégration ciblée recombinaison homologue

minimise les effets de position.

Confinement du transgène

Nécessites d’autres transformations pour rendre

la plante stérile.

Hérédité maternelle des plastes pas de transmission

par le pollen.

Applications biotechnologiques

Insertion de gènes de résistances (herbicide,

insectes).

Insertion d’une voie métabolique (multiples

transgènes); forte expression de protéines recombinantes.

D’après Meyers 2010.

III) Applications

1) La « tomate dorée »

Vitamine A

β-carotène

Solanum lycopersicum L.

D’après Apel 2009.

x2

ββ-carotène 15,15’ monooxygénase

Expériences préalables

a) Expression constitutive de la phytoène désaturase de la bactérie Erwinia uredovora dans la tomate.

Accumulation élevée de β-carotèneBaisse des caroténoïdes totaux

b) Surexpression spécifique de la lycopène-β-cyclase endogène dans le fruit de tomate.

Accumulation élevée de β-carotèneTaux de caroténoïdes constants

Comment augmenter ce taux?

La transplastomique

Augmenter la conversion du lycopène en β-carotène tout en augmentant les taux de caroténoïdes du fruit.

Le gène de la lycopène-β-cyclase de Narcissus pseudonarcissus est introduit dans les plastes de tomate:- Isolement du transgène (gène de la lycopène-β-cyclase)- Clonage dans un plasmide- Transformation par biolistique- Sélection de lignées homoplastomiques

Test d’activité de l’enzyme par un herbicide (CPTA)

Résistance Activité de la lycopène-β-cyclase très fortement augmentée chez les plantes tranplastomiques

D’après Apel 2009.

CPTA = inhibiteur spécifique de la lycopène cyclase

Analyse du phénotype

Transformation du lycopène (rouge) en β-carotène (orange)

D’après Apel 2009.

Teneur en caroténoïdes dans les plastes par HPLC

Augmentation du β-carotène, diminution du lycopène ET augmentation de 52% des caroténoïdes totaux

D’après Apel 2009.

Composition en caroténoïdes dans les feuilles par HPLC

Orientation vers les caroténoïdes de type xanthophylle à la place de la lutéine.

Pas d’augmentation des caroténoïdes totaux D’après Apel 2009.

Conclusion Augmentation de la teneur en β-carotène dans le

fruit

Augmentation des caroténoïdes totaux de 52%

Approximativement 1mg de β-carotène /g de poids sec (AJR de 10mg/jour)

La 2eme transformation de plastes dans une plante de culture (après le tabac)

AJR = apport journalier recommandé

2) Autres exemples remarquables

• Expression de somatotropine (>7% des TSP) dans les plastes de tabac avec formation correcte des ponts disulfures.

• Expression de toxine Bt de 3 à 5% des TSP (issue de Bacillus thuringiensis) dans les plastes de tabac.

TSP = Total Soluble Protein

IV) Discussion

Perspectives:- Insertion d’une RUBISCO plus efficace dans les

plantes de cultures.

- Production de molécules pharmaceutiques avec de forts rendements.

- Production de bioéthanol par augmentation du contenu lipidique synthétisé par les plastes.

V) Références1) Publications

• Transgenic Plastids in Basis Research and Plant Biotechnology - Review Article; Journal of Molecular Biology, Volume 312, Issue 3, 21 September 2001, Pages 425-438.

Ralph Bock• Taming plastids for a green future – Review Article; Trends in Biotechnology, Volume 22, Issue

6, June 2004, Pages 311-318. Ralph Bock; Muhammad Sarwar Khan

• Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana; Nature Biotechnology, Volume 25, Issue 5, May 2007, Pages 593-599.

Rashad Kebeish, Markus Niessen, Krishnaveni Thiruveedhi, Rafijul Bari, Heinz-Josef Hirsch, Ruben Rosenkranz, Norma Stäbler, Barbara Schönfeld, Fritz Kreuzaler & Christoph Peterhänsel

• Enhancement of carotenoids biosynthesis in transplastomic tomatoes by induced lycopene-to-provitamin A conversion; Plant physiology, Volume 51, Septembre 2009, Pages 59-66.

Wiebke Apel, Ralph Bock• Plastid biotechnology: food, fuel and medicine for the 21st century; Plant Physiology

Preview, January 2011, Pages 1-27. Pal Maliga, Ralph Bock

2) Images

• http://fr.academic.ru/pictures/frwiki/80/Plagiomnium_affine_laminazellen.jpeg• http://us.123rf.com/400wm/400/400/eraxion/eraxion0905/eraxion090500096/4844310.jpg• http://www.science-et-vie.net/img/illustrations/S/structure-cellule-vegetale.png• http://www.origin-of-mitochondria.net/wp-content/uploads/endosymbiotic-hypothesis-1.jpg• http://www.skoolbuz.com/content_images/200911/images/biology/cell/sfbox7x1.jpg• http://www.sciencephoto.com/images/showFullWatermarked.html/B100048-Potato_amyloplasts,_ESE

M-SPL.jpg%3Fid%3D661000048• http://www.er.uqam.ca/nobel/m344764/images/Chloroplasts.jpg• http://www.biologie.uni-erlangen.de/mpp/LEHRE/images/Chromoplast-01.jpg• https://www.erowid.org/library/books_online/ayahuasca_apa/images/nicotiana_tabacum.jpg• http://prgdb.cbm.fvg.it/private/organisms/images/Nicotiana%20tabacum.jpeg• https://www.msu.edu/course/isb/202/ebertmay/drivers/mirkov_gentran.jpg• http://collant.files.wordpress.com/2009/02/coton_graine_thmb.jpg• http://www.opalc.org/damien/public/soja_20fruit.jpg• http://sordalab.com/photos/b_photos/b_photo_537_1.jpg• http://www.pharmacopeia.cn/v29240/images/v29240/g-1156.gif• http://microbewiki.kenyon.edu/images/2/27/Gall.jpg• http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/seminar/2002/method/dsmeth/Agrobacterium%20Imag

e.jpg• http://www.ebiologie.fr/upload/Gallery/E_coli_lge.jpg• http://artic.ac-besancon.fr/svt/act_ped/svt_lyc/eva_bac/s-bac2010/images/chloroplaste.gif• http://rookery.s3.amazonaws.com/1135500/1135626_8058_625x1000.jpg• http://www.philippeprimeurs.be/img/news/874