Mise au point de la technique d’électrophorèse ... · Tableau. 06: Programme de voltage (Nagaraj. 2007). 28 Tableau. 07: Solutions utilisées pour la deuxième dimension Selon

I

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université d’Oran Es-Sénia

Faculté des Sciences

Département de Biologie

Mémoire présenté pour l’obtention du diplôme de MAGISTER

en

AMÉLIORATION DES PLANTES

Mise au point de la technique d’électrophorèsebidimensionnelle appliquée à des espèces

sauvages du genre MedicagoPrésenté par :

FELLOUS Samir

Soutenu le: / / 2011

Jury:

Président KROUF Djamil Professeur Université d’Oran Es-Sénia

Examinateurs SAIDI Noureddine M.C.A Université d’Oran Es-Sénia

KACEM Mourad M.C.A Universitéd’OranEs-Sénia

Encadreur FYAD LAMECHE F.Z Professeur Université d’Oran Es-Sénia

II

DEDICACEÀ

À la mémoire de mes grands parents, et à celle de mon frère,

À mes amis, à mon neveu et mes cousins,

À tous mes enseignants,

À mes parents.

Remerciements

I

Table des matières

Introduction générale 01

Partie I : Revue bibliographique

1. Généralités sur le Medicago 03

1. 1. Taxonomie et génétique 03

1. 2. Origine géographique et aire de répartition 03

1. 3. Description botanique de la plante Medicago 04

1. 4. Germination et développement physiologique de la plante 05

1. 5. Intérêt de la plante 05

2. Préparation des échantillons 07

2. 1. Extraction non dénaturante 07

2. 1. 1. Dégradation protéolytique et inhibition des protéases 07

2. 1. 2. Composés phénoliques 08

2. 2. Extraction dénaturante 09

2. 2. 1. La méthode SDS 09

2. 2. 2. Précipitation directe 09

2. 2. 3. Extraction au phénol 10

2. 2. 4. Solubilisation différentielle 10

2. 2. 5. Cas des ponts disulfures 11

2. 2. 6. Rôle des Chaotropes et des surfactant dans l’extraction dénaturante 11

2. 3. Contaminants des préparations protéiques 12

2. 3. 1. Sels 12

2. 3. 2. Lipides 12

2. 3. 3. Acides nucléiques 13

II

2. 3. 4. Polysaccharides 13

3. Électrophorèse 14

3. 1. Historique 14

3. 2. Principe 15

3. 3. Migration électrophorètique 15

3. 4. Quelques méthodes classiques d’électrophorèse 16

3. 4. 1. Électrophorèses en zone 16

3. 4. 2. Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 16

3. 4. 3. Électrophorèse discontinue 17

3. 4. 4. Électrophorèse en gel gradient 17

3. 5. Isoéléctrofocalisation en carriers ampholytes libres (CA-IEF) 18

3. 5. 1. Principe théorique 18

3. 5. 2. Facteurs influençant la formation du pH 19

A) Le phénomène de plateau « plateau phenomenon » 19

B) L’électrœndosmose 20

3. 5. 2. Autre types de gradient de pH 20

3. 6. Électrophorèse bidimensionnelle 20

3. 6. 1. Visualisation des protéines 21

3. 6. 1. 2. Méthodes de coloration par fluorescence 22

3. 6. 1. 3. Coloration négative par le zinc d’imidazole 22

3. 6. 1. 4. Coloration à l’argent 23

3. 6. 1. 5. Détection par radioactivité 23

3. 6. 2. Analyse de l’image 23

3. 6. 3. Évaluation des gels 2-D 24

III

3. 6. 4. Application de l’électrophorèse bidimensionnelle chez les plantes 24

Partie II: Matériels et méthodes

1. Échantillonnage et extraction des protéines totales 27

2. Électrophorèse bidimensionnelle: IEF/SDS-PAG 28

2. 1. Premier dimension: IEF-Carrier ampholytes 4% 28

2. 1. 1. Solubilisation des protéines en IEF 28

2. 1. 2. Préparation des tubes IEF 28

2. 1. 3. Préparation du gel IEF- Carriers ampholytes 28

2. 1. 4. Tampon d’électrodes de l’IEF-Carriers ampholytes 29

2. 1. 5. Focalisation 29

2. 1. 6. Démoulage des boudins 29

2. 2. Deuxième dimension: SDS-PAGE continu 10% 30

2. 2. 1. Préparation du gel et du tampon de la deuxième dimension 30

2. 2. 2. Séparation des protéines 30

2. 2. 3. Coloration, décoloration et fixation du gel 2-D IEF/SDS-PAGE 31

3. Électrophorèse bidimensionnelle: CN/SDS-PAGE 32

3.1 Premier dimension CN-PAGE 32

3. 1. 1 Solubilisation des protéines en CN-PAGE 32

3. 1. 2 Préparations des gels CN-PAGE 32

3. 1. 3. Tampon cuve de la CN-PAGE 33

2. 2. 4. Séparation des protéines en CN-PAGE 33

2. 2. 3. Coloration, décoloration et fixation du gel CN-PAGE 34

3. 2 Deuxièmes dimensions SDS-PAGE 34

IV

Partie III: Résultats et discussions

1. Préparation de l’échantillon

2. Préparation du gel IEF

2. 1. Cristallisation de l'urée

2. 2. Les Carriers ampholyte

2. 3. Coulage des gels d’IEF

2. 4. Temed et l’APS

3. Paramètre de focalisation et de séparation du gel 2-D

4. Électrophorèse bidimensionnelle Gel gradient 4-10%/SDS-PAGE

5. Électrophorèse bidimensionnelle Gel discontinu 4-10%/SDS-PAGE

6. Électrophorèse bidimensionnelle Gel discontinu 4-8%/SDS-PAGE

Partie IV: Conclusion générale et perspectives

Références bibliographiques

V

Liste des figures

Figure. 01 : Feuilles de différents écotypes du genre Medicago (Delalande, 2007) 04

Figure. 02 : Gousse de Medicago Truncatula (Ramakrishnan et al., 2006) 04

Figure. 03 : Réalisation du gradient du gel (Rothe et al., 1982) 18

Figure. 04 : Le principe d’électrophorèse à haute résolution (O’Farrell,1975) 21

Figure. 05 : Gel 2-D de graines matures de M. Truncatula coloré par le Coomassie BrilliantBlue G-250 (Zhentian et al, 2005) 22

Figure. 06 : Dispositif de séparation en éléctrophorèse bidimentionnelle.

Figure. 07: Partie du gel 2-d coloré au bleu de Coomassie représentant trois spots 36

Figure. 08: électrophorèse non dénaturante des protéines totales de graines sauvages deMedicago 40

Figure. 09-a: Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D gradient

4-10%/SDS-PAGE continu 10% des proteines tatale de graines de Medicago. 42

Figure. 09-b : Profil protéique et Rfs des protéines totale des graines

sauvages de Medicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE 42

Figure 11-a: Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu

4-10%/SDS-PAGE continu 10% des proteines tatale de graines de Medicago 47

Figure. 11-b: Profil des protéique et Rfs des protéines totale des graines sauvage deMedicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE 47

Figure. 12-a : Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu

4-8%/SDS-PAGE continu 10% des proteines tatale de graines de Medicago 50

Figure. 12-b: Profil des protéique et Rfs des protéines totale des graines

sauvage de Medicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE 50

Figure. 13-a: Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu 4-8%/SDS-PAGEcontinu 10% des proteines tatale de graines de Medicago 51

Figure. 13-b: Profil des protéique et Rfs des protéines totale des graines sauvage deMedicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE 51

VI

Liste des tableaux

Tableau. 01 : Rendement du blé, après association aux légumineuses (Hireche, 2006) 06

Tableau.02 : Solution d’extraction des protéines (Zivy,1986). 26

Tableau. 03: Tampon de solubilisation UKS (Granier,1988). 27

Tableau. 04: Solution du gel IEF-Carrier ampholytes (O’ Farrell, 2007). 27

Tableau. 05: Solutions des tampons d’électrodes (O’ Farrell, 2007) 28

Tableau. 06: Programme de voltage (Nagaraj. 2007). 28

Tableau. 07: Solutions utilisées pour la deuxième dimension Selon

(Laemmli, 1970. modifié). 29

Tableau. 08 : Solution de coloration et de décoloration au Coomassie G-250

(Blakesley et Boezi, 1977). 30

Tableau. 09: Tampon de solubilisation (Laemmli,1970. modifié). 31

Tableau. 10: Gel gradient 10%.(Laemmli, 1970. modifié). 32

Tableau. 11: Gel discontinue à 8% et à 10%. (Laemmli,1970. modifié). 32

Tableau. 12: Solutions du tampon cuve pour la première dimension (Laemmli,1970). 33

Tableau. 13 : Solution de coloration au Coomassie R-250 (Schägger,2006). 34

VII

Abréviations

BN-PAGE: Bleu native polyacrylamide gel électrophorèsis

CBB: Coomassie Brillant Blue

CCD: Charged Coupled Device

CN-PAGE:Clear native polyacrylamide gel électrophorèsis

2-DE: L’électrophorèse bi-dimensionnelle

DTE: Dithioerythritol:

DTT: Dithiothreitol

E: Force du champ électrique

IEF : Isoelectrofocalisation

IPG: Immobilized PH Gradient

CHAPS: 3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate

mep : Mobilité effective

Mr : Mass moléculaire

NEPHG-IEF : Non Equilibrum PH Gradient IsoElectroFocalisation).

Nonidet P-40 : Non ionique détergeant 40

pI : Point isoélectrique

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate

TBP: Tributyl phospahte

TCA : Tri-chloro-acetique acide

UKS : Urée potassium SDS

vep : Vitesse de migration

d SDS / PAGE : double SDS/PAGE

SUMMARY

Wild species of the genus Medicago, are of great economic interest in an intelligent

farming, in fact, they improve the yield of cereals such as wheat in rotation (Hireche. 2006).

This is relative to their varieties, it follows that their selection is of great importance, hence

the question of the development of two-dimensional electrophoresistechniquesuitedtothem.

Our work aims to present the different methods, largely modified this method for

proteomic analysis.

Keywords: Medicago, two-dimensional electrophoresis, proteomics

Résumé

Les espèces sauvages du genre Médicago, sont d’un grand intérêt économique dans un

cadre d’agriculture intelligente, en effet, elles permettent d’améliorer le rendement des

céréales tel que le blé, en système de rotation (Hireche. 2006). Ceci étant relatif à leurs

variétés, il en découle que leurs sélections est d’une grande importance, d’où la question de la

mise au point de la technique d’électrophorèse bidimensionnelle adaptée à ces dernières.

Nôtre travail consiste à présenter les différents procédés, en grande partie modifiés de cette

méthode d’analyse protéomique.

Mots clefs : Médicago, électrophorèse bidimensionnelle, protéomique.

Introduction générale


1

Les espèces annuelles du genre Medicago L. peuvent jouer un rôle important dans

l’amélioration de la production fourragère en Algérie en produisant un fourrage en quantité et

de qualité supérieure. Elles assurent l’amélioration de la flore des jachères pâturées, entrent

facilement dans la rotation avec les céréales, se régénèrent par auto-semis, et constituent une

bonne réserve de semences dans le sol. Elles ont une capacité unique de fixer l'azote

atmosphérique à travers des relations symbiotique avec les bactéries du sol appelées

Rhizobium. Il en résulte de cette interaction, un apport important de nitrogène, donc une forte

quantité de protéines dans les légumes. C'est pourquoi elles sont considérer comme la source

majeur en alimentation humaine et animale, de plus elles assurent l'azote au sol et permettent

d'éviter l'utilisation de fertilisant chimique (Zhentian. 2005).

De la même façon que l’ensemble des gènes d’un organisme constituent son génome,

l’ensemble des protéines d’une cellule ou d’un tissu constituent son protéome. Alors que le

génome reste constant au cours de la vie d’un même organisme, le protéome de la cellule

change en permanence en réponse aux différentes conditions de vie de la cellule. L’analyse

protéomique, ou analyse du protéome d’une cellule, va donc étudier l’expression des

protéines cellulaires, ainsi que les variations quantitatives de cette expression au cours de

divers mécanismes cellulaires, tel que la différenciation, et l’adaptation aux stress biotique et

abiotiques (Rabilloud. 2003).

Afin d’étudier l’ensemble des protéines exprimées par un organisme ou un type

cellulaire donné, des methodes il convient de mettre en œuvre des méthodes analytiques et

reproductibles. L’électrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) introduite par O’Farrel en 1975

(O’Farrel. 1975) est l’une de ces méthodes. Elle permet, à l’issue de deux migrations

électrophorètiques successives, de visualiser un grand nombre de protéines de façon

simultanée. Cette technique permet l'exploration de la variabilité génétique intra et inter

spécifique qui est une étape préliminaire avant tout programme d'amélioration ou de sélection

variétale (Haynes et Yates. 2000).

La protéomique exige l'utilisation d'échantillons biologiques de qualité. L'extraction de

protéines à partir de tissus, de cellules isolées ou de liquides physiologiques est réalisée à

l'aide de tampons appropriés, mis au point en considérant la nature des protéines à étudier

(protéines cytosoliques, membranaires, nucléaires…), ces protéines doivent être maintenues à


2

l'état soluble durant tout le processus analytique. En effet, les tampons d'extraction à pH bien

déterminé, sont constitués dans des proportions variables, de mélanges d'agents réducteurs, de

détergents, voire de solvants organiques. Ils sont généralement supplémentés d'inhibiteurs de

protéases. Les protocoles expérimentaux doivent éviter les contaminations par des acides

nucléiques, des lipides et les sels. Ces contaminants peuvent perturber la séparation des

protéines par électrophorèse bidimensionnelle (Sheoran. 2009).

L’objectif de ce travail est d'élaborer des protocoles efficaces et reproductibles

d'extraction de protéines totales et de préparation des gels de la premier dimension en

l'occurrence l’isoelectrofocalisation et de la deuxième dimension (SDS-PAGE), pour la mise

au point de la technique d'électrophorèse bidimensionnelle, sur des espèces annuelles

sauvages du genre Medicago.

1

Partie IRevue bibliographique


3

1. Généralités sur le Medicago

1. 1. Taxonomie et génétique

Le genre Medicago (luzerne) regroupe de nombreuses espèces de plantes proches des

trèfles, appartenant comme eux à la famille des Fabacées (ou Légumineuses), et à la sous

famille des Papilionideae. Selon Lesins et Lesins (1989), il comporte 20 espèces herbacées

pérennes, 34 herbacées annuelles et une arbustive (M. arborea). La luzerne cultivée comprend

deux espèces botaniques différentes, la luzerne faucille (Medicago falcata, L) et la luzerne

commune Medicago sativa, mais il existe une luzerne intermédiaire, Media pers ou Medicago

varia martyr, hybride de Medicago sativa x Medicago falcata (Camille. 1980. Cité par

Hireche. 2006).

Dans une étude taxonomique plus récente et complète du genre, Small et Jomphe

(Small et al., 1989) décrivent 83 espèces de Medicago. Environ les deux tiers de ces espèces

sont annuelles, tandis que les autres, dont le M. sativa, sont vivaces. Il existe au sein de ce

genre des espèces allogames et autogames, diploïdes avec 2 n= 16 chromosomes (le nombre

de base X = 8 et rarement X = 7) et d’autre sont tétraploïdes avec 2 n = 4 X = 32

chromosomes (Lesins et Lesins, 1979).

1. 2. Origine géographique et aire de répartition

Il est admis que le centre d'origine du genre Medicago est le Croissant fertile,

recouvrant les pays ou régions actuelles de Turquie, d’Iran, d’Irak, du Sud du Caucase et du

pourtour méditerranéen (Prosperi et al., 1993). Il existe plus spécialement sur l'ensemble du

pourtour méditerranéen 20 autres espèces de luzernes pérennes à allogamie non stricte,

diploïdes ou tétraploïdes (souvent les deux niveaux coexistent chez la même espèce) et 34

espèces annuelles, toutes autogames, et diploïdes à l'exception de Medicago sativa qui est

originaire des hauts plateaux iraniens, et de Medicago falcata qui est originaire de la Serbie

Occidentale, ce qui explique sa remarquable résistance au froid (Prosperi et al., 1995). Cette

double origine géographique et génétique fait que la luzerne est une des espèces les plus

répandues du globe (Hirech. 2005).


4

1. 3. Description botanique de la plante Medicago

Chez le genre Medicago, la morphologie et l’architecture varient fortement entre les

génotypes de la même espèce annuelle, elles sont très dépendantes de l’environnement et

des conditions de culture (Delphine. 2006. Cités par Moulay).

Ce sont des plantes annuelles ou vivaces, le plus souvent herbacées, parfois aussi de

petits arbustes comme Medicago arborea, à feuilles trifoliolées, dont plusieurs espèces

sont cultivées comme plantes fourragères. Chaque axe sur une plante est composé de

phytomers. Un phytomer est l’unité élémentaire utilitaire d’un axe. Les feuilles (Figure 01)

sont trifoliées à folioles finement dentées au sommet et à inflorescence en grappe ou

racème de 10 à 20 fleurs, les fleurs sont violettes, pourpres ou bleuâtres chez la luzerne

commune, jaunes chez la luzerne faucille et violettes bigarrées de jaune chez la luzerne

intermédiaire (Camille. 1980).

M. laciniata M. ciliaris M. truncatula

Figure 01 : Feuilles de différents écotypes du genre Medicago (Delalande. 2007).

Le fruit est une gousse plus ou moins enroulée (Figure 02), soit spiralée (de 1 à 4

spires) pour Medicago sativa. La graine est plus ou moins réniforme est longue d’environ

2,5 mm (Camille. 1980).

Figure 02 : Gousse de Medicago Truncatula (Ramakrishnan et al. 2006).


5

1. 4. Germination et développement physiologique de la plante

La plante passe par différents stades végétatifs : le stade S1 est représenté par

l’apparition des deux cotylédons à la levée ; au cours du stade S2 l’émission des deux feuilles

cotylédonaires ou unifolié se fait ; au stade S3 (stade trifoliées), les feuilles composées de

trois folioles, rattachées à la tige par un pétiole apparaissent, et la tige grandit en produisant

des feuilles alternées ; puis au stade S4, les bourgeons émis forment des tiges secondaires ; Au

stade S5, les bourgeons donnent naissance à des tiges feuillées, alors que le bourgeon axillaire

de la première feuille aboutit à une tige secondaire, deux autres tiges secondaire pousse

depuis le niveau des cotylédons, les luzernes de type non dormant produisent plus de tiges

secondaires à partir du niveau du cotylédon que les types dormants, dont la croissance est

stoppé en hiver, c’est cet ensemble de tiges qui va former le collet, le développement des tiges

suit un ordre bien précis.

On distingue des tiges primaires, secondaires, et tertiaires ; Au stade S6, on observe

l’élongation des entrenœuds avec une croissance de plus en plus rapide, et l’apparition des

boutons floraux, au stade bourgeonnement, les fleurs apparaissent entre le 6ème et le 14ème

entrenœuds, selon les conditions du milieu de culture et le déterminisme génétique ; enfin, le

stade S7 est le stade de la floraison, de la fécondation, et de la maturité des graines,

l’accroissement en matière sèche se poursuit suivant une courbe en S, jusqu’à la pleine

floraison. Dès l’apparition des boutons floraux, l’élongation est très ralentie. Parallèlement la

proportion de matière sèche s’accroît dans la plante entière, mais celle des feuilles (riche en

protéines) diminue (Hireche. 2006).

1. 5. Intérêt de la plante

Les espèces annuelles du genre Medicago présentent un intérêt économique très

important. Cultivée pour la production de foin, la luzerne est utilisée depuis quelques

décennies par un nombre croissant d’usines de déshydratation, pour la fabrication d’aliments

d’excellente qualité. Elle est aussi utilisée sous forme de fourrages déshydratés, ou de farines

dans l’alimentation animale. Au-delà de cette fonction de base, les scientifiques s’intéressent

aux vertus d’un de ses constituants protéiques, la RuBisCO (Ribulose-1,5-bisphosphate

carboxylase oxygenase).


6

Celle-ci pourrait avantageusement remplacer les protéines de soja dans la nutrition

humaine, car elle est beaucoup plus riche en acides aminés essentiels, et se rapproche

davantage des protéines laitières (Hireche. 2006).

Ces plantes fourragères sont souvent utilisées dans les systèmes de rotation « céréales-

luzerne » (tableau 01). En Algérie, l'intégration céréaliculture pâturage temporaire d'espèces

annuelles de Medicago, nécessite la disponibilité d'écotypes adaptés, et ce au dépend des

jachères, peu productives en zones céréalières (Yahia et Fyad-Lameche. 2003).

L’interaction mutuelle entre les légumes et les microbes (Rhizobium, Sinorhizobium,

Brady rhizobium…etc.) représente un aspect important de la biologie des plantes, qui ne peut

être étudiée en utilisant le modèle Arabidopsis thaliana, car cette dernière ne peut établir une

symbiose avec les bactéries rhizobia, l’utilisation d’espèces tels que, le soja ou, l’alfa alfa

pour étudier la biologie des plantes est très compliquée, vu leurs génomes polyploïdes, et du

très grand nombre de séquences répétitives dans leur génomes. C’est pourquoi, Medicago

truncatula a émergé durant les dix dernières années comme modèle dans l’étude moléculaire

et génétique des légumineuses (Barker. 1990), cela est due en partie au petit nombre diploïde

de son génome et de sa pollinisation autogame, ainsi que sa capacité de se régénérer par

embryogenèse somatique (Bell. 2000 ; Cook. 1997).

Tableau 01 : Rendement du blé, après association aux légumineuses (Hireche. 2006).

Précédent cultural Rendement en blé en %Ecotype 1ère année 2ème année

M. littoralis 132 138M. scutellata 120 118M. truncatula 132 118

Trifolium Subterranéum 131 130M.sativa 118 116

Végétation spontanée 100 100

2. Préparation des échantillons

Les modalités de préparation de l’échantillon conditionnent la réussite d’une analyse

par électrophorèse bidimensionnelle (2-D). Les protéines cellulaires diffèrent par leur

solubilité en relation avec leurs caractéristiques physico-chimiques.


7

Les protéines cytoplasmiques sont généralement solubles dans l’eau, tandis que les

protéines nucléaires et membranaires sont souvent extrêmement hydrophobes et insolubles en

milieu aqueux (De Marqui. 2006 ; Stanley. 2003). L’absence de méthodes universelles

d’extraction des protéines implique une optimisation des conditions de préparation des

échantillons selon le type d’échantillon, et de la question biologique posée.

La solution de solubilisation est composée généralement d’un agent chaotrope (agent

biochimique désorganisant la structure protéique), d’un détergeant non ionique ou

zwitterionique, d’un agent réducteur (prévient l’oxydation des groupements SH (thiol) et

rompt les ponts disulfures), et d’un mélange d’ampholytes (composé chimique pouvant jouer

le rôle d’un acide ou d’une base) qui facilitent la séparation des protéines lors de

l’isoélectrofocalisation (Görg. 2000 ; Görg. 2004). Afin de minimiser les risques de

dégradation protéique lors de la préparation de l’échantillon, un mélange d’inhibiteurs de

protéases est couramment inclus dans la solution de solubilisation, afin de sauvegarder la

structure tridimensionnelle des protéines.

2. 1. Extraction non dénaturante

Ce type d'extraction est utilisé en particulier pour l’étude de la protéomique

fonctionnelle, et structurelle ainsi que pour les analyses ultérieures d’identification des

protéines (spectrométrie de masse). Dans cette méthode, la diminution du pH pendant la lyse

cellulaire effectuée pour la récupération des protéines solubles est compensée par des tampons

(Zivy. 1983).

2. 1. 1. Dégradation protéolytique et inhibition des protéases

La dégradation protéolytique est causée par les protéases, ces derniers sont des

enzymes qui catalysent l’hydrolyse des liaisons peptidiques (Huffaker. 1990). La présence des

protéases dans les graines dormantes a été confirmée par leur identification à ce stade de vie

(Duarte. 1996) où ils coexistent avec les protéines de réserve (St Angelo et al., 1969 ;

Mikkonen et al., 1986).

Généralement, des inhibiteurs de protéases sont utilisés pour éviter la dégradation des

protéines dans les tampons d’extraction non dénaturante.


8

Cashmore (Cashmore et al., 1976) ont utilisé un inhibiteur de protéases serine actif,

appelé PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) pour extraire les protéines des graine du pois,

en effet, le PMSF est largement utilisé par de nombreux auteurs (Meza-Basso. 1986 ; Tingey.

1987). Cependant, l’utilisation d’un cocktail de protéases est plus efficace permettant 80%

d’inhibition, plutôt que 50% quand un seul inhibiteur est utilisé (Benchabane. 2008).

Pour éviter la protéolyse, il est possible de jouer sur la spécificité d’action des

protéases, par exemple, les protéases lysosomales sont actives sur des pH faibles et inhibés à

des pH élevé, il existe aussi des inhibiteurs de protéases qui s’attaquent aux substrats de

l’enzyme et empêchent la protéolyse (trypsine inhibiteur) (Rabilloud. 1996).

2. 1. 2. Composés phénoliques

Les polyphénols sont une famille de molécules organiques largement présente dans le

règne végétal, caractérisés par la présence de plusieurs groupements phénol associés en

structures plus ou moins complexes généralement de haut poids moléculaire, ces composés

sont les produits du métabolisme secondaire des plantes (Bate-Smith. 1962 ; Levin. 1971 ;

Meier et al., 2008 ).

Les plantes sont riches en composées phénoliques surtout dans les tissus verts, ou ils

s’accumulent principalement dans les vacuoles sous différentes formes, souvent solubles et

posent problème en extraction non dénaturante. En effet, l’oxydation des composés

phénoliques par la phénoloxydase ou par les peroxydases produit des traînais ou des stries

dans le gel (Hari. 1981).

Des inhibiteurs de la phenyloxydase tel que le PVP (Polyvinyl Pyrrolidone) sont

ajoutés au tampon d’extraction (Zivy et al., 1983 ; Mayer et al.,1987 ; Chory, 1987), pour

prévenir cette oxydation. Dans ce contexte, les résultats obtenus sur les bourgeons apicaux et

les jeunes plantules de la moutarde blanche (Sinapis alba) ont montré l’efficacité de ces

inhibiteurs (Cremer. 1985). Alternativement ou quelquefois en combinaison avec le PVP, des

agents réducteur tel que l’Ascorbate, β-mercaptoethanol (Cashmore. 1976 ; Meza-Basso.

1986 ; Baszczynski. 1982 ; Ginzburg. 1986 ; De Vries. 1982 ; Lin. 1984), le Potassium

Metabisulfite (Uemura. 1984), et le DTT (Zivy. 1983 ; Mayer. 1987) sont ajoutés pour éviter

l’activité phénoloxydase (Rabilloud. 1996).


9

2. 2. Extraction dénaturante

Cette méthode d'extraction est réalisée dans le cas des analyses en protéomique

analytique. Dans laquelle la structure tridimensionnelle des protéines est modifiée, et souvent

réduites en polypeptide pour faciliter leur solubilisation. Quelques méthodes et agents

chimiques sont décrits ci-dessous.

2. 2. 1. La méthode SDS

La méthode d’extraction par l’SDS à 60 C° suivis d’une précipitation à l’acétone a été

développée par Harrison et Black (Harrison et al., 1982) pour extraire les protéines foliaires et

des cellules du mésophile de digitaria sangunalis. En effet, la dénaturation thermique

fonctionne en synergie avec la dénaturation par l’SDS et offre une inactivation rapide des

protéases. Cependant cette procédure conduit à la précipitation des polypeptides de faible

poids moléculairen (Gallagher et Leonard. 1986). L’optimisation de cette technique (SDS 3

min à 100 C°) par Ames et Nikaido (Ames et al. 1976) a permis d'obtenir une meilleure

solubilisation des protéines membranaires de salmonella typhimurium, comparée au tampon

de lyse d’O Farrell, qui n’est pas efficace pour ce type de protéines. Une autre technique

combinant l’urée et le Nonidet P-40 (NP-40) avec le carbonate de potassium à un pH de 10.3

a permis une solubilisation efficace des protéines membranaires des graines végétale, sans

l’utilisation de l’SDS (Horst et al., 1980).

2. 2. 2. Précipitation directe

Cette procédure consiste en une précipitation des proteines par le TCA à 10% w/v,

suivis d’un rinçage à l’acétone des culots protéiques pour les solubiliser ensuite dans un

tampon UKS ( Urée, Potassium, SDS ) à fin de les analyser par électrophorèse 2-D (Granier.

1988). D'ailleurs, la précipitation à l’acétone a été utilisé par Vierling et Key (Vierling et al.

1985). Cependant, la combinaison de ces deux agents de précipitation et dénaturation (TCA,

Acétone) a été utilisé par Zivy (Zivy. 1986), et a donné des gels de bonnes qualités.

En outre, cette technique a été testé sur différent matériel végétal tels que la tomate,

pétunia, latex, noix de coco, pollen du blé, maïs, tournesol, levure, et même dans les tissus

animal (les nématodes), les résultats obtenus ainsi ont permis non seulement d'améliorer la


10

résolution des gels, mais aussi la disparition des stries. D'autre travaux ont montré que cette

technique s'est révélé plus rapide comparé à l’extraction au phénol permettant donc de

préparer plusieurs échantillons nécessaire dans les études de polymorphisme (Granier. 1988).

2. 2. 3. Extraction au phénol

Cette méthode était développée par Schuster et Davis (Schuster et Davis. 1983).

L'extraction au phénol consiste à extraire les protéines, aussi bien que les acides nucléiques

présents dans l’espace aqueux (Du Pont. 1988). Pour cela, on ajoute un tampon tris mélangé à

un volume égal de phénol hydro-saturé, puis on procède à une séparation des deux phases par

centrifugation (Hurkman et al., 1986).

Non seulement, cette technique inactive les enzymes sans recours à la chaleur, et

donne une résolution des gels et des spots comparable à la méthode SDS, mais aussi, elle

élimine les polysaccharides, et les détriments potentiels des extraits des plantes, ainsi que les

grosses molecules de glycoprotéines. (Rabilloud. 1996). De plus les culots préparés par cette

procédure semblent être les plus pure et les plus soluble (Cilia. 2009 ; Sheoran. 2009).

Cette méthode est utilisée par plusieurs auteurs, sur differents organes végetals tels

que les feuilles et les graines d’épinard (Guy. 1987), les racines et les bourgeons de l’orge

(Ramagopal. 1987) ou elle s'est avérée efficace pour la solubilisation des protéines

membranaires.

2. 2. 4. Solubilisation différentielle

Cette technique a été introduite par Moloy (Moloy et al., 1998) pour extraire les

protéines totales d’E. Coli. Elle est réalisée par la succession de trois étapes d’extraction dont

la dernière est la plus performante : la première étape est initiée par la lyse cellulaire en

utilisant le tris ; la deuxième étape, l’échantillon résultant est soumis à une extraction, cette

fois ci le tampon IEF conventionnel (Urée, CHAPS, DTT) ; la troisième étape, consiste à

traiter les culots (riches en protéines membranaires et représente 11% (w/w) du matériel de

départ ), par un tampon à base d’urée, thio-urée, CHAPS, TBP.

C'est ainsi qu'onze protéines de la surface membranaires d’ E. coli., ont été identifiées

dans un gel 2-D à partir de la dernière étape d’extraction (Herbert. 1999).


11

2. 2. 5. Cas des ponts disulfures

La rupture des ponts disulfures est réalisée par des agents thiols libres, de faible

volatilité et de petite concentration, tels que le β-mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT) ou

Dithioerythritol (DTE), Cysteamine (Rabilloud. 1996). Il faut signaler que le DDT ou DTE

présentent des inconvénients malgré leur utilisation à des concentrations assez faibles par

rapport au thiol protéiques, par exemple l’oxygène dissous est capable de ré-oxydé les thiols

en bisulfures de sorte que le thiol libre soit consommé, cela conduit à la ré-oxydation des

thiols protéiques en disulfures, et dans quelques cas a la suroxydation des protéines libres en

faux disulfures (Rabilloud. 1996).

2. 2. 6. Rôle des Chaotropes et des surfactant dans l’extraction dénaturante

Un agent chaotropique comme l’urée est une molécule qui détruit les faibles

interactions intramoléculaires (non-covalente), telles que les liaisons hydrogène, les forces de

van der Waals et les liaisons hydrophobe et dénature, ainsi les macromolécules biologiques

(protéine, l'ADN et l'ARN). L’introduction par Rabilloud (Rabilloud et al., 1997) de la thio-

urée et de l’urée s'est avéré très efficace dans la solubilisation des protéines membranaire et

des fractions cellulaires (chloroplaste, mitochondrie).

Un surfactant ou tensioactif est un composé qui modifie la tension superficielle entre

deux surfaces, Il permet ainsi de solubiliser deux phases non miscibles. Il existe plusieurs

substances ioniques non compatibles avec l’IEF, donc l’utilisation de l’SDS n’est pas

recommandée et on est limité aux surfactant non ionique ou zwitterionique, raison pour

laquelle le Triton X-100 et le Nonidet P-40 sont traditionnellement utilisés ainsi, que les

surfactants à base de sucre tel que l’octyl glucoside. Cependant dans les dernières années le

sulfobetaine CHAPS est devenus le surfactant de choix en association avec l’urée (Granier.

1988).

La combinaison de ces Chaotropes avec les surfactants tel que le monosulfobetaine

permet l’analyse d’une gamme d’échantillons variés, surtout en IEF où les surfactants sont

indispensable pour solubiliser les résidus hydrophobes en exposition après leur traitement par

les chaotropes (Granier. 1988).


12

2. 3. Contaminants des préparations protéiques

2. 3. 1. Sels

En général, une haute quantité de sel est présente dans les organismes halophiles ou

dans certains fluides biologiques (urine, sueur, plasma…etc.), des méthodes de concentration

des protéines et de dialyses (dialyseurs sous vide, centrifugation, etc.) sont souvent utilisées

(Manabe. 1982). Cependant, une perte de protéines par adsorption et par diffusion à travers

les membranes de dialyse des molécules de faible poids moléculaire est observée (Rabilloud.

1996). Des techniques prometteuses basées sur la précipitation des protéines avec des

colorants ont été mises au point, ces méthodes sont des substituts efficaces de la précipitation

par la TCA pour l’élimination des sels et sur d’autre techniques modernes (Kole. 2010 ;

Marshall. 1995 ; Bollag. 1991).

2. 3. 2. Lipides

Les lipides se lient aux protéines par des interactions hydrophobes affectant leur

charge et leur Mr (masse moléculaire), ce complexe protéine-lipide est insoluble dans les

solutions aqueuses, conduisant généralement à l‘échec de la pénétration des protéines dans le

gel IEF (Shaw et al., 2003), cette interaction peut être concurrencé par l’addition de quantité

importante de détergents et par la précipitation à base de TCA/acétone (Nagaraj. 2007 ;

Hopkinson. 2005).

L’élimination finale du solvant est très importante pour éviter les problèmes

d’émulsion ou de précipitation. Aussi, si les culots obtenus sont séchés excessivement pour

l’élimination complète du solvant, il serait impossible de ré-solubilisé les protéines même

dans les tampons fortement dénaturant. Ainsi l’achèvement d’un cycle propre et reproductible

de délipidation/ré-solubilisation est difficile du moment qu’une délipidation par des solvants

organique est requise (Rabilloud. 1996).

2. 3. 3. Acides nucléiques

Les acides nucléiques sont de grosses molécules, qui augmentent considérablement la

viscosité de la solution et obstruent les pores du gel (Shaw et al., 2003). Ils se comportent

comme des poly-anions, et se lient aux protéines par des interactions électrostatiques. Le

complexe formé se lie aux carriers ampholytes du tampon IEF (Galante. 1976). Cet ensemble


13

se lie à son tour aux protéines et donne une fausse focalisation, de plus, il augmente le nombre

de stries et de traînées dans le gel 2-D (Heizmann. 1980).

La digestion enzymatique RNase, DNase est utilisée pour éliminer ces acides

nucléiques (O’Farrell. 1975). Elle est accompagnée de l’addition d’ampholytes au tampon

d’extraction, et suivie d’une précipitation/centrifugation des produits de la digestion par la

TCA (Shirey. 1969 ; Chaudhury. 1973 ; Rabilloud. 1986 ; Shaw et al., 2003). Cependant,

certains acides nucléiques se lient fortement aux protéines même en présence d’une grande

quantité d’urée (qui dénature les protéines) (Sanders. 1980). Ces protéines peuvent être

solubilisées par des compétiteurs de cations tel que la prolamine (Sanders. 1980) ou la

lécithine (Willard. 1979) à pH acide, ou bien le pH d’extraction peut être augmenté de sorte

que les protéines se comportant comme des anions et sont répulsées par les acides nucléiques

(Rabilloud. 1996).

2. 3. 4. Polysaccharides

Tout comme les acides nucléiques mais à moindre titre, les polysaccharides (amidon,

glycogène, etc.) augmentent la viscosité de la solution et obstruent les pores du gel vu leur

charge et leur Mr. Les méthodes d’ultracentrifugation utilisées pour éliminer les acides

nucléiques, le sont pour les polysaccharides. Aussi, la précipitation sélective des protéines par

la TCA, sulfate d’ammonium, phénol/ammonium, acétate (Hurkman. 1986) ou par des

colorant (Marshall. 1992 ; Marshall. 1995) suivie d’une ré-solubilisation, peut être envisagé

comme solution pour leur l’élimination (Rabilloud. 1996).


14

3. Électrophorèse

3.1. Historique

Le début du XVIIIème siècle, marqué par les travaux de Charles de Coulomb (1736-

1806), Alessandro Volta (1745-1827) et André-Marie Ampère (1775-1836) ont permit

l’émergence des premières lois de l’électro-statistique et de l’électricité. En 1859, l’Allemand

Georg Hermann Quincke (1834-1924) découvre qu’il est possible de déplacer des particules

colloïdales (sous forme de colle gélatineuse) sous l’action d’un champ électrique : c’est la

cataphorèse. Par la suite, Hermann Von Helmholtz (1821-1894) développe l’électro-osmose :

sous un champ électrique, il observe que des particules chargées se déplacent vers le pôle de

signe opposé à leur charge. En 1892, S.E. Linder et H. Picton, imaginent d’exploiter cette

observation pour la séparation de particules chargées. En 1937, c’est le Suédois Arne

Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-1971) qui met en œuvre cette technique de séparation pour les

protéines du sérum sanguin et du lait, ce qui lui vaudra le prix Nobel en 1948. Sa méthode de

fractionnement en phase liquide est alors trop onéreuse en matériel et en personnel pour la

pratique courante, mais il la perfectionne et en 1950 il met au point l’électrophorèse sur

papier, plus simple et permettant une utilisation plus large (Groulade. 1978 b). Depuis 1957,

l’électrophorèse sur acétate de cellulose autorise une meilleure individualisation des fractions

et ainsi l’établissement de tracés plus expressifs.

Les années suivantes, l’utilisation de gel de polyacrylamide permet l’obtention d’un

fractionnement plus important, de plus l'introduction de l'électrophorèse bidimensionnelle par

O' Farrell (O'Farrell. 1975) et le développement d’autre variante de cette technique (Schägger

et von Jagow, 1991; Schägger et al., 1994) comme la BN-PAGE et CN-PAGE a amélioré le

pouvoir résolutif de l'électrophorèse et a permit la détection des modifications post

traductionnelle jusque là impossible à mettre en évidence par les méthodes

monodimensionnelle.

Aujourd’hui cette technique, qui ne cesse de s’améliorer par la diversité des supports

et des techniques de réalisation, est devenue un outil indispensable dans de nombreux

laboratoires, au niveau de la recherche en génomique et en protéomique au sens large. En

amélioration des plantes, cette technique est utilisée dans l'identification variétale et la mise

en évidence des protéines de stress biotique et abiotique.


15

3. 2. Principe

Les méthodes connues sous le nom d’électrophorèse, sont basées sur le déplacement

de molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique. Quand les molécules sont de charge

négative (anions) se dirige vers l’électrode positive ou anode. Quand les molécules sont de

charge positive (cation), ils se dirigent vers l’électrode négative (cathode). Le champ

électrique est obtenu par un générateur de courant continu, dont les bornes sont reliées à la

cathode et à l’anode. Le support du champ électrique est constitué par un tampon d’un pH et

d’une concentration convenables, dont les ions conduisent le courant. Les phénomènes de

séparation se produisent dans un support poreux approprié, il peut s’agir de papier filtre

(électrophorèse sur papier), d’un dérivé de la cellulose (acétate de cellulose), d’un gel extrait

d’algue (agarose) ou d’un gel de polymère organique (polyacrylamide) où le calibre des

micro-canalicules internes des mailles du réseau de polymère, gouverne la vitesse de

migration des molécules à travers ce réseau.

3. 3. Migration électrophorètique

En électrophorèse, la séparation est permise par les différences de vitesses de

migrations existant entre les différents analytes. La vitesse de migration électrophorétique

d’un analyte (vep) mesurée en mètre par seconde (m.s-1). Elle s’exprime en fonction de sa

mobilité effective (mep) mesurée en mètre carré par seconde par volte (m2.s-1.V-1) multipliée

de son champ électrique appliqué (E) mesurée volte en par mètre (v.m-1) : vep = mep E

En réalité, la mobilité électrophorètique d’un composé dépend de plusieurs paramètres

: la mobilité absolue du composé ; le pH et la force ionique de l’électrolyte ; et de l’interaction

avec des molécules présentes dans le milieu de séparation. Si l’analyte présente des propriétés

acido-basiques, le pH du tampon est important, car dans ce cas, son degré d’ionisation et par

conséquent sa mobilité électrophorètique sera influencée par le pH. En outre, quelles que

soient les propriétés acido-basiques de l’analyte considéré, si ce dernier est chargé, sa

mobilité électrophorétique dépendra de la force ionique de l’électrolyte support. Enfin, la

mobilité relative des molécules peut être spécifiée, en la calculant relativement à la distance

de migration de substances standard, généralement des colorants tel que le bleu de

bromophénol (Chrambach. 1985).


16

3. 4. Quelques méthodes classiques d’électrophorèse

3. 4. 1. Électrophorèses en zone

L’électrophorèse en zone regroupe toutes les techniques dont le principe de séparation

est basé sur la différence de mobilité électrophorétique. Deux particules de vitesses de

migration données parcourent des distances distinctes en un intervalle de temps similaire,

elles vont ainsi être localisées dans des zones différentes. L'échantillon (un mélange d'espèces

anioniques et cationiques) est introduit dans le système qui contient une solution d’électrolyte

support. En général, la concentration de l'électrolyte support est élevée par rapport à celle des

espèces ioniques de l'échantillon et permet de maintenir un pH relativement constant, et un

gradient de potentiel uniforme dans le système entier. Les espèces ioniques de l'électrolyte et

de l'échantillon ont une certaine mobilité effective, et quand un courant électrique passe à

travers le système, ces espèces ioniques migrent avec des vitesses spécifiques : les cations

migrent vers la cathode et les anions vers l'anode. Il en résulte un flux d'ions de l'électrolyte

support suivi par un flux d'ions de l'échantillon sous forme de bandes (Viera-Nunes. 2006).

3. 4. 2. Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Cette technique a été introduite par Shapiro (Shapiro et al., 1967). Dans cette méthode

les protéines sont exclusivement séparées selon leur poids moléculaire, car l’ajout du SDS

(détergent anionique) masque la charge des protéines, pour donner une charge nette constante

par unité de mass qui est de 1.4 gramme SDS par gramme de protéine, et rompt les liaisons

hydrogène, donc, déplie la structure tertiaire et quaternaire des protéines. Il existe une relation

linéaire entre le logarithme du poids moléculaire et la distance de migration relative de la

micelle SDS-polypeptide. Par rapport aux gels homogènes, les gels gradués permettent la

séparation d'une large gamme de protéines, et une meilleure linéarité, et les bandes sont mieux

définit grâce à la diminution des phénomènes de diffusion (Westermeier. 2004).

3. 4. 3. Electrophorese native (CN-) et (BN-) PAGE

L’électrophorèse native en gel de polyacrylamide est un outil performant pour

l’analyse des complexes de protéines membranaire, la plus grande révolution dans cette

technique a été l’introduction de la BN-PAGE. Quoique ces techniques soient très

performantes, ils ne peuvent être appliqués à tous les systèmes d’analyse avec la même

résolution. Dans la CN-PAGE les protéines migrent selon leur poids moléculaire et leur


17

charge native puisque les protéines ne sont pas dénaturées, dans ce cas seul les protéines

acides pI <5.7 sont séparées, pour la BN, le colorant bleu de Coomassie présent dans le

tampon cuve (cathode) se lie aux protéines leur conférant une charge négative comme pour le

cas de l’SDS, cependant le bleu de Coomassie n’altère pas la structure tridimensionnelle,

c’est une methode à decalage de charge qui permet la séparation des protéines basiques.

(Schägger et von Jagow. 1991; Schägger et al., 1994).

3. 4. 4. Électrophorèse discontinue

Elle a été introduite par Ornstein et Davis (Ornstein et Davis. 1964). La discontinuité

est basée sur quatre paramètres : la structure du gel (diamètre des pores) ; le pH du tampon ;

la force ionique du tampon ; la nature des ions dans le gel et dans les tampons électrodes.

Dans cette technique, deux gels sont superposés, le gel de concentration (stacking gel), aux

larges pores, et le gel de résolution aux mailles plus fines. L’SDS peut être ajouté lors de la

préparation des solutions du gel et aux tampons d’électrodes pour donner une charge négative

globale aux protéines (Ornstein. 1964).

3. 4. 5. Électrophorèse en gel gradient

Il ne s’agit pas à proprement parler d’une nouvelle méthode d’électrophorèse mais

plutôt d’un autre mode de fonctionnement des différentes méthodes décrites précédemment

(électrophorèse de zone, électrophorèse en disque…etc.). Pour obtenir une concentration

graduelle (figure 03), on mélange continuellement à l’aide d’un agitateur, deux solutions

monomérique d’acrylamide de différentes concentrations. La densité de la solution la plus

concentrée peut être augmentée par le glycérol ou le sucrose de sorte que les deux couches ne

se mélangent pas dans les plaques. Ainsi, on obtient un gradient linéaire (Westermeier. 2004).

Le gel gradient a un effet d’affûtage sur les bandes « sharpening effect », il peut être utilisé

pour déterminer le diamètre moléculaire des protéines dans leurs états natifs (Rothe et al.,

1982).


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Figure 03 : Réalisation du gradient du gel (Rothe et al., 1982).

3. 5. Isoéléctrofocalisation en carriers ampholytes libres (CA-IEF)

3. 5. 1. Principe théorique

L’IEF est basée sur la séparation des molécules amphotères, tel que les peptides et les

protéines dans un gel à gradient de pH et sous l’action d’un champ électrique. En effet, dans

ce champ, les molécules migrent vers l’anode ou la cathode jusqu’à ce qu’elles atteignent une

position dans le gradient du pH, où leurs charges nettes sont nulles. La vitesse de migration

est proportionnelle à cette charge qui est elle-même proportionnelle à la différence entre le pH

du milieu et le pI (point isoélectrique) de la protéine.

Quoique, la base théorique de la réalisation d’un gradient de pH naturel (formé

naturellement par un champ électrique) a été décrite par Svensson en 1961 (Svensson. 1961),

la réalisation pratique, est l’œuvre de Vesterberg (Vesterberg, 1969) qui avait synthétisé un

mélange d’isomères aliphatiques d’acides oligoamino-oligocarboxylique. Ces tampons

forment un spectre d’ampholytes de faible poids moléculaire avec des points isoélectriques

qui se rapproche d’une façon continue. Leur formule chimique générale est la suivante :


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Le nombre de racines (x) de la formule (CH2) x–COOH, peut prendre la valeur de 2

ou 3.

Ces carriers ampholytes présentent un avantage majeur au niveau de leur point

isoélectrique : une haute capacité tampon ; une parfaite solubilité ; une conductivité régulière

du courant électrique ; et l’absence d’effets biologique. Presque tous les carriers ampholytes

sont chargés soit positivement (pI élevé) soit négativement (pI faible). La plupart des

solutions commerciales disponibles contiennent 40% (w/v) d'ampholytes. Donc, la

concentration peut ne pas être spécifiée. Usuellement, une concentration de 2 à 2.5% (w/v) de

carriers ampholytes est utilisée pour un gradient moyennement uniforme de pH 3 à 10

(Westermeier. 2004).

Pour la réalisation de l’IEF carriers ampholytes, les gels sont coulés dans des tubes de

1 mm de diamètre et d’une langueur de 24 cm en moyenne, après polymérisation et séparation

des protéines, les gels ont une forme cylindrique après leur démoulage (Westermeier. 2004).

3. 5. 2. Facteurs influençant la formation du pH

La formation du pH peut être influencée par plusieurs facteurs tel que la température et

le voltage. Cependant, il existe deux phénomènes importants qui rendent très difficile

l’établissement de ce pH et limitent l’utilisation de l’IEF en carrier ampholyte, ces deux

facteurs sont le phénomène de plateau et l’éléctrœndosmose.

A) Le phénomène de plateau « plateau phenomenon » : expliqué en détail en 1986 par

Mosher (Mosher et al., 1986), il consiste en une déformation progressive du gradient de pH,

qui tend à être aplati au niveau des pH neutres, et donne des pentes élevées aux pH extrêmes

du gradient. Ce phénomène est dû à la compression des ampholytes les plus acides vers

l’anode et les plus basiques vers la cathode, ce qui conduit à un aplatissement des zones

d’ampholytes dans la région neutre du gradient, et donc à la formation d’un plateau (Poitevin.

2008).

B) L’électrœndosmose : Les supports ou milieux de séparation (gel ou surface), et les

équipements (les plaques de verres, les tubes ou capillaires), peuvent comporter des groupes

chargés (oxyde de silicium dans les surfaces en verres) (Westermeier. 2004).


20

Quand les groupes fixés sont négativement chargés en l’occurrence dans les tampons

basiques et neutres. Dans un champ électrique, ils sont attirés par l’anode, mais comme ils

sont fixés ils ne peuvent pas migrés, cela mène à une compensation par un contre flux d’ions

H3O+ en direction de la cathode, c’est le phénomène de l’électrœndoosmose. Dans le gel, cet

effet est observé comme un flux d’eau en direction de la cathode durant la migration

électrophorétique qui emporte les substances solubilisées. L’électrophorèse et

l’électrœndosmose sont ainsi additives, cela donne une mauvaise résolution et provoque la

déshydratation du gel du coté de l’anode (Westermeier. 2004).

Quand les groupes fixés sont positivement chargés, le flux électroendosmotique est en

direction de l’anode (Westermeier. 2004).

Dans ce cas, le gradient de pH ne peut être supérieur à 7,5 – 8, ce qui représente une

limite pour la séparation des protéines basiques. Une méthode spéciale a été développé pour

la séparation de ces protéines (O’Farrell. 1977), il s’agit de la NEPHG-IEF (Non Equilibrum

PH Gradient IsoElectroFocalisation). Cependant, cette technique est faiblement reproductible

(Kuhn. 1980).

3. 5. 3. Autre types de gradient de pH

L’utilisation de gradients de pH immobilisés (IPG pour Immobilized PH Gradient)

permet de s’affranchir des déformations observées avec l’utilisation d’ampholytes porteurs en

solution (Righetti. 2007). Cette technique est principalement utilisée en gel de

polyacrylamide, et les ampholytes porteurs de différents pI, sont liés de manière covalente à

des monomères d’acrylamide (Görg et al., 2000).

3. 6. Électrophorèse bidimensionnelle

Cette technique a été introduite pour la premier fois par O’ Farrell en 1975 (O’ Farrell.

1975), afin de séparer les protéines bactériennes d’e coli, il existe plusieurs variante pour cette

technique selon les paramètres physiquo-chimiques utilisés pour la séparation des protéines

c’est ainsi que pour L’IEF/PAGE ou SDS-PAGE, les polypeptides sont séparés selon leurs

charges native en premier dimension et selon leur poids moléculaire, le même principe est

utilisé dans l’électrophorèse bidimensionnelle CN/PAGE ou SDS-PAGE. Pour la BN/ PAGE

ou SDS-PAGE les protéines sont séparées selon leur poids moléculaire dans les deux


21

dimensions sauf que dans la première séparation ils ne sont pas dénaturée, d’autre méthodes

utilisent la dénaturation dans les deux séparations comme dSDS/PAGE (Rais 2004).

Schägger, 1991 Schägger, 1994

. Le principe de séparation est simple, les protéines sont d’abord analyser par une

premier électrophorèse puis les boudins ou les slabes sont découpé est déposé

horizontalement dans le deuxième gel. Quand la deuxième dimension est achevée, les

polypeptides ou protéines apparaissent sous forme de taches (spots) de tailles différentes

quantifiables par différentes méthodes de colorations et de détections ( Sheehan et Tyther

2009).

Figure 04 : Le principe d’électrophorèse à haute résolution (O’Farrell. 1975).

3. 6. 1. Visualisation des protéines

Il existe plusieurs méthodes de visualisation des protéines, le choix se porte sur la

sensibilité de la méthode et la compatibilité de la coloration avec les analyses ultérieurs,

parmi ces techniques de visualisations, les plus citées sont ; le bleu de Coomassie (Coomassie


22

Brillant Blue G-250 et R-250) qui est un triphenylméthane anionique, attiré

électrostatiquement par les acides aminés basiques. Cette technique colore la plupart des

protéines et peptides, avec une bonne linéarité quantitative, elle est compatible avec la

spectrométrie de masse, mais elle n’est pas très sensible, car elle requière au moins 1 µg de

protéines par spot. Elle est basée sur les propriétés colloïdales des colorants CBB (Coomassie

Brillant Blue) G-250 et R-250, la sensibilité de cette technique est de l’ordre du ng (Neuhoff.

1988) (Figure 05).

Figure 05 : Gel 2-D de graines matures de M. Truncatula coloré par le Coomassie BrilliantBlue G-250 (Zhentian, et al. 2005).

3. 6. 1. 2. Méthodes de coloration par fluorescence

La méthode la plus récente de coloration est l’utilisation de la fluorescence par

couplage covalent de molécules fluorescentes (Ünlü et al., 1997) ou l’utilisation des

complexes organométalliques fluorescents du type Sypro-Ruby (Berggren et al., 2000 ;

Rabilloud et al., 2001). Ces colorations fluorescentes sont moins sensibles que les techniques

utilisant les ions d’argent. Cependant, elles présentent une très grande gamme de linéarité et

sont parfaitement compatibles avec la spectrométrie de masse (Westermeier. 2004). Deep

PurpleTM est le colorant le plus sensible (Mackintosh et al., 2003), Suivi du Sypro-Ruby

(Berggren et al., 2002). D’autre sont de sensibilité similaire au Bleu de Coomassie, comme le

Nile-Red (Alba et al., 1996), le Sypro-Red et le Sypro-Orange (Steinberg et al., 1996). Ces

colorant sont relativement coûteuses et des scanners à fluorescence et camera CCD sont

nécessaire pour la réalisation de ces techniques (Sheehan et Tyther 2009).


23

3. 6. 1. 3. Coloration négative par le zinc d’imidazole

La sensibilité de cette méthode atteint plus de 15 ng (Hardy et al., 1996), elle est

appelée coloration négative, car elle colore uniquement le fond du gel sans les protéines, la

visualisation des spots est plus adaptée pour l’analyse par spectrométrie (Matsui et al., 1997).

Cependant elle ne peut être utilisée pour la quantification.

3. 6. 1. 4. Coloration à l’argent

Introduite pour les gels polyaccrylamide 2-D par Merril (Merril et al., 1979), sa

sensibilité atteint 0.2 ng. Il existe deux principale variantes de cette technique, la coloration au

nitrate d’argent, ou la coloration diamine d’argent. Cette dernière montre une très bonne

sensibilité pour les protéines basiques, mais elle contient quelques solutions caustiques, et

n’est pas compatible avec le tampon tricine (Westermeier. 2004). La coloration à l’argent,

présente une bonne sensibilité, une faible linéarité, et est moyennement compatible avec

l’analyse par spectrométrie de mass (Gharahdaghi et al., 1999 ; Shevchenko et al., 1996).

3. 6. 1. 5. Détection par radioactivité

Comme la coloration les méthodes de détection des protéines par radioactivité (radio-

labelling) varient aussi en termes de sensibilité, l’autoradiographie est presque la méthode la

plus commune de détection, car elle permet l’utilisation d’un nombre variés d’isotopes (P32,

I125, C14, et S35) (Dunn. 1993). Cependant, la détection peut prendre des jours, voir des

semaines, si un grand degré de sensibilité est requis (Dunn. 1993 ; Link. 1999).

3. 6. 2. Analyse de l’image

Avant l’analyse, l’électrophoregram doit être connecté à un ordinateur, lié à une

camera, ou un scanneur ou bien à un densitomètre. Parmi les méthodes d’imagerie disponible

la cameras CCD (Charged Coupled Device) est la plus polyvalente (Stochaj et al., 2003 ).

Cependant, des scanners sont préférés à ces derniers pour l’acquisition d’images de haute

résolution et pour obtenir un fond homogène allant du centre du gel jusqu’aux deux bords.

L’image est enregistrée par un autre scanneur munie de fonctions de modifications du mode

de transmission de lumière, la fluorescence ou la radioactivité sont détectées par des lasers

spéciaux. Pour l’automatisation, des spots protéiques de référence (marqueurs interne) sont

scanner ensemble avec les protéines à analyser, les coordonnée x et y sont envoyés à une liste

« picking liste » pour les stocker (Westermeier. 2004). Du moment que les techniques de


24

coloration sont compatibles avec la spectrométrie de mass, n’importe qu’elle changement

dans l’expression des protéines peut être identifié par la technique de Western Blot (Celis.

1999), et/ou, par l’analyse des peptides des spots excisées (Pandey. 2000), qui sont ensuite

comparés avec des bases de données de séquences protéiques de référence (Sanchez. 2001).

3. 6. 3. Évaluation des gels 2-D

L’évaluation des gels complexes requiert des logiciels qui corrigent l’arrière plan du

gel et quantifient les spots. Cependant, l’objectif principal des logiciels 2-D est la détection

automatique des spots, leur comparaison avec d’autres gels 2-D du même échantillon, et

l’identification des différences dans l’expression des protéines d’échantillons variés.

Les outils d’analyses statistiques sont aussi introduits dans les logiciels pour évaluer

par exemple la signification de la variabilité de l’expression protéique, les données générées

par les gels 2-D peuvent être analysés par les méthodes d’analyse uni/multi variées. La

résolution dépend de la finesse et de la clarté de l’image, elle est communément quantifiée par

le dpi «dots per inch» qui représentent le nombre de pixel par surface de gel. Cependant, les

scanners actuelle définissent les taille de pixels en μg 50, 100, ou 200, le pixel est un point

unique dans l’image (pix : picture, el : élément). En théorie, on peut avoir plus de 15 000

spots dans un seul gel, mais en pratique, il existe 5 000 spots seulement moyennant une bonne

séparation (Sheehan. 2009).

Il est impossible de détecter l’apparition ou la disparition de nouveaux spots, par

simple comparaison de deux gels contenant plusieurs milliers de spots, c’est pour cela que

l’utilisation de logiciel d’évaluation d’image est très utile (Berkelman et Stenstedt. 1998).

3. 6. 4. Application de l’électrophorèse bidimensionnelle chez les plantes

Le premier point d’étude de la protéomique est l’identification exhaustive des

protéines exprimées par un organisme (Malmstrom et al., 2004 ; McGregor et Dunn 2006).

Ceci a été possible grâce au développement simultané des techniques séparatives, ainsi que

des différents appareillages de spectrométrie de masse. De plus, cette approche a

considérablement été dopée par tous les programmes de séquençage de génomes, ainsi que

des outils et moteurs de recherche bioinformatique (Wheelock et Wheelock. 2008).

L’application d’une telle technologie de séparation des protéines, couplée à la spectrométrie

de masse a permis à un grand nombre de groupes de se lancer dans l’analyse systématique,


25

afin de réaliser des cartes protéiques de gel 2-D, et donc la mise en place de bases de donnés

construites autour des gels 2-D (Toda et al., 1998 ; Mollenkopf et al., 1999).

Le deuxième aspect important de l’analyse protéomique est l’analyse différentielle qui

consiste par exemple à comparer les protéomes de deux états distincts (stressé/témoin ;

traitement/ pas de traitement ; ...etc.) en observant l’apparition, la disparition ou les variations

des quantités des protéines (Komatsu. 2007).

L’approche de quantification la plus classique consiste à séparer les mélanges

protéiques sur des gels d’électrophorèse bidimensionnelle, et après coloration à comparer les

différences entre les gels. Les spots contenants les protéines exprimées de façon différentielle

seront analysés par spectrométrie de masse (Larrainza. 2007).

Un troisième point très important pour l’étude protéomique par spectrométrie de

masse est la recherche des modifications post-traductionnelles portées par les protéines

d’intérêts (Mateos. 2008). En effet, le faible nombre de gènes eucaryotes laisse à penser que

la complexité des organismes va résulter entre autre de la maturation et des modifications

post-traductionnelles des protéines. Ces modifications post-traductionnelles regroupent les

modifications chimiques covalentes, ainsi que la perte d’acides aminés sous l’action

d’exopeptidases (Biemann. 1990). La spectrométrie de masse est aujourd’hui l’outil de choix

pour répondre aux questions des modifications post- traductionnelles portées par les protéines.

Elle peut en effet identifier le type de modification (phosphorylation, glycosylation,

oxydation...), déterminer son emplacement sur la séquence des protéines, voir sa structure

(Mann et Jensen 2003 ; Heintz.2004).

3

Partie IIMatériels et méthodes

Partie II : Matériels et méthodes

26

1. Échantillonnage et extraction des protéines totales

Pour mettre au point la technique d’électrophorèse bidimensionnelle, 0.5 g de matériel végétal

(graines d’écotypes annuels sauvages, du genre Medicago) sont récupérées sur le site du

campus Mourad Taleb Salim ex l’Institut du Génie Maritime d’Oran (IGMO) en début

Septembre, pour intervenir avant la germination des graines. Les étapes (Zivy. 1986) de

l’extraction des protéines totales (tableau 02) sont valables pour la première dimension

electrophoretique IEF-Carrier ampholytes 4%, et CN-PAGE et se font comme suivant :

1- Des tubes eppendorfs de 1.5 ml vides sont pesés ;

2- Les graines sont finement broyer à l’aide d’un mortier dans de l’azote liquide,

jusqu'à obtention d’une poudre ;

3- On ajoute 10 ml (8+2 ml) de solution de précipitation par 0.5 g de poudre dans les

tubes eppendorfs, on place l’extrait dans un congélateur à -20 °C.

4- Les extraits sont centrifugés à 14 000 t/min pendant 15 min, pour séparer le culot

protéique du surnageant ;

5- Le surnageant est éliminé, le culot est couvert part 200 µl de solution de rinçage

éliminant les résidus de TCA, contenue dans la solution de précipitation. Les tubes

sont placés 1 heure à -20 °C.

6- Le rinçage est refait jusqu’à obtention d’un culot blanc.

7- Les culots sont séchés sous cloche à vide (1 heure).

8- Les tubes sont pesés pour déterminer le poids de chacun des culots secs.

Tableau 02 : Solution d’extraction des protéines (Zivy. 1986).

Solution Produit Quantité

Précipitation des protéinesTCA 10 g

β-Mercaptoéthanol 70 µlAcétone Qsp 100 ml


27

Rinçage de TCA β-Mercaptoéthanol 70 µlAcétone Qsp 100 ml


28

2. Électrophorèse bidimensionnelle : IEF/SDS-PAGE

2. 1. Premier dimension : IEF-Carrier ampholytes 4%

2. 1. 1. Solubilisation des protéines en IEF

La solubilisation des protéines extraites se réalise juste avant la séparation. On a utilisé

le tampon UKS conventionnel, qui est préparer dans l’ordre définit dans le tableau 03.

Tableau 03 : Tampon de solubilisation UKS (Granier. 1988).

Produit QuantitéUrée 2.85 g

K2CO3 0.125 µlSDS 0.625 µl

Triton X-100 1.5 mlDTT 125 µl

Ampholyte 3-10 250 µlEau bi-distillée Qsp 5 ml

2. 1. 2. Préparation des tubes IEF

Une journée avant utilisation, les tubes sont lavés par une solution de HCL 1 fois

normale, rincés en abondance par de l’alcool et par l’eau bi-distillée, puis séchés dans l’étuve

à 26 °C. Juste avant le coulage des gels, l’une des extrémités des tubes IEF est obstruée par la

paraffine.

2. 1. 3. Préparation du gel IEF- Carriers ampholytes

Le gel IEF à base d’urée est préparé dans un bécher de 25 ml. La solution (tableau 04)

est doucement agitée pendant cinq minutes, et mise dans un sonicateur (3 fois une minute, à

moins de 28°C), afin de solubiliser l’urée, puis le persulfate est ajouté. On introduite jusqu’au

fond du tube IEF une seringue munie d’un tube capillaire, pour couler le gel, en laissant un

espace afin de déposer les protéines.


29

Tableau 04 : Solution du gel IEF-Carrier ampholytes (O’ Farrell. 2007).

Produit QuantitéUrée 3.75 g

Solution A+B (30%) 0.93 mlNP-40 1.38 ml

Ampholytes (2%) :

pH 3-10

- pH 3-10

pH 5-7 400 µlpH 3-10 100 µl

Persulfate (10%) 20 µlEau bi-distillée 1,37 ml

2. 1. 4. Tampon d’électrodes de l’IEF-Carriers ampholytes

Deux tampons d’électrode (tableau 05) sont utilisés pour la séparation en IEF : le

tampon cathodique (0.1 M NaOH), est versé dans la chambre supérieure où est plongée la

cathode ; et le tampon anodique (0.08 M H3PO4) remplit la chambre inferieur (anode).

Tableau 05 : Solutions des tampons d’électrodes (O’ Farrell. 2007).

Tampon cathodique Tampon anodiqueNaOH 4 g Acide phosphorique 85% 5.5 ml

Eau bi-distillée 1 l Eau bi-distillée 1 l

2. 1. 5. Focalisation

L’isoélectrofocalisation utilise un dispositif de 24 tubes Hoefer.USA-SE600-151.5

connecté à un générateur Consort E700 programmable (tableau 06) pour le voltage, l’intensité

du courant et la durée de migration. L’expérience qui porte sur huit gels nécessite huit tubes

IEF.

Les protéines quantifiés par la méthode de Bradford (1976) indiquent une

concentration de 0.56 µg/ µl, les volumes de protéines déposées sont de l’ordre de 20, 30 et

40 μl, par gel, dont la quantité est respectivement de 11,2 μg, 16,8 μg et 22,4 μg. Ceci afin de

mettre en évidence les protéines présentes en quantités différentes chez le même écotype.


30

Tableau 06 : Programme de voltage (Nagaraj. 2007).

Programme de voltage de la pré-focalisation Programme de voltage de la focalisationVoltage Temps Voltage Temps

500 v 30 min 500 v 30 min1000 v 60 min 1000 v 60 min

16 000 v 21 h

La pré-focalisation permet d’établir un gradient de pH dans le gel. Les huit tubes sont

placés dans la cuve remplie par les tampons IEF, les protéines sont déposées et le dispositif

est fermer, avant sa connexion au générateur pour initier la séparation (tableau 06).

2. 1. 6. Démoulage des boudins

Les gels sont démoulés par jet d’une seringue remplie d’eau. Ils sont conservé à

- 20 °C dans de la paraffine couverte d’aluminium.

2. 2. Deuxième dimension : SDS-PAGE continu 10%

2. 2. 1. Préparation du gel et du tampon de la deuxième dimension

Le gel de la deuxième dimension est continu avec 10 % d’acrylamide avec une

épaisseur de 1,5 mm, le tampon utilisé est un tampon tris glycine homogène (pH = 8,6) pour

les deux cuves, quand au gel on a utilisé un tampon tris-Hcl (pH = 8,8) (tableau 07). Le gel est

préparé une heure avant la fin de l’IEF, pour lancer la deuxième dimension.


31

Tableau 07 : Solutions utilisées pour la deuxième dimension Selon (Laemmli. 1970.

modifié).

Solution du tampon d’électrodes

(Laemmli. 1970. modifié).

Solution du gel de séparation (10 %) (Laemmli.

1970. modifié).

Tris 3,28 g Produit QuantitéGlycine 14,43 g Tris-Hcl ph 8.8 17.5 ml

SDS 0,1 g Solution A+B (30%) 11.65 mlEau bi-distillée Qsp 100 ml APS (10%) 420 µl

Temed 28 µlEau bi-distillée Qsp 35 ml

2. 2. 2. Séparation des protéines

Elle débute avec un voltage de 150 v, pendent une heure pour passe à 200 v, pendent 7

à 8 heure, jusqu'à la fin de la migration marquée par l’arrivée du bleu de Bromophenol (front

de migration) à la limite inferieur du gel.

Figure 06 : dispositif de séparation en éléctrophorèse bidimentionnelle.


32

2. 2. 3. Coloration, décoloration et fixation du gel 2-D IEF/SDS-PAGE

La solution à base de Coomassie G 250 et de sulfate d’ammonium (tableau 08) colore

les gels, qu’on laisse reposer (48 heures) sous une douce agitation et à l’abri de la lumière. Le

G-250 est saupoudré de façon homogène sur les gels préalablement trempés dans la solution

de coloration. La solution de décoloration baigne les gels pendant une heure.

Tableau 08 : Solution de coloration et de décoloration au Coomassie G-250 (Blakesley et

Boezi. 1977).

Solution de coloration Solution de décolorationProduit Quantité QuantitéG-250 0.1 g -

Méthanol 20 ml 20 mlSulfate d’ammonium 10 g 10 g

Acide Octophosphorique (85%) 2 ml 2 mlEau Qsp 100 ml Qsp 100 ml

Les protéines sont fixées par une solution d’acide acétique à 7%. Pour visualiser les

spots, les gels sont mis dans du papier cellophane et scannés.

3. Électrophorèse bidimensionnelle : CN/SDS-PAGE

Pour optimiser l’electrophorèse 2-D, nous avons utilisé en premier dimension un gel

gradient non-dénaturant (4-10 %), et deux gels discontinus 8 % et 10 % ont été préparé, le

premier est utiliser pour la visualisation des protéines dans la premier dimension et le

deuxième est coupé en slabes est mit dans un tampon tris pour être conservé.


33

3.1 Premier dimension CN-PAGE

3. 1. 1 Solubilisation des protéines en CN-PAGE

La solubilisation des protéines extraites se réalise juste avant la séparation. On a utilisé

le tampon (Laemmli. 1970. modifié) qui est préparé dans l’ordre définit dans le tableau 09.

Apres l’ajout du tampon (15µl/ µg) les proteines sont passée au bain marie pendant 3 min à

60°C.

Tableau 09 : Tampon de solubilisation (Laemmli. 1970. modifié).

3. 1. 2 Préparations

des gels CN-PAGE

Pour la réalisation de

la première dimension

electrophoretique (CN-

PAGE), nous avons réalisé

trois types de gels, un gel gradient de 10% (tableau 10), un gel discontinue de 10% et un gel

discontinue de 8% (tableau 11).

Tableau 10: gel gradient 10%.(Laemmli. 1970. modifié).

Produit Solution du gel4% 10%

Solution A+B 1,32 ml 3,33 mlLower gel 5 ml 2,5 ml

APS 100 µl 100 µlTemed 12,5 µl 12,5 µl

Eau bi-distillée Qsp 10 ml Qsp 10 ml

Produit QuantitéTris-HCl pH 7.2 500 µl

MgCl2 30 µlGlycerol 2 ml

Triton X-100 1 mlPMSF 200 µlNaCl 600 µlSDS 1%

β-Mercaptoethanol 5%H2O-bidistillée 10 ml


34

Tableau 11 : gel discontinue à 8% et à 10%. (Laemmli. 1970. modifié).

Solutions des gelsProduits Concentration à 4% Séparation à 8% Séparation à 10%

Solution A+B 0,66 ml 2,66 ml 3,33 mlLower gel - 2,5 ml 2,5 mlUpper gel 2,5 ml - -

APS 100 µl 100 µl 100 µlTemed 12,5 µl 12,5 µl 12,5 µl

Eau bi-distillée Qsp 5 ml Qsp 10 ml Qsp 10 ml

3. 1. 3. Tampon cuve de la CN-PAGE

Le même tampon cuve a été utilisé pour toute les techniques de séparations

monodimensionnelles de la CN/PAGE et ceci pour : le gel gradient à 10 % ; le gel discontinu

10% ; et le gel discontinu 8%.

Tableau 12 : Solutions du tampon cuve pour la première dimension (Laemmli.1970).

Produit QuantitéTris HCL (pH = 8.6) 3,28 g

Glycine 14,43 gEau bi-distillée Qsp 100 ml

2. 2. 4. Séparation des protéines en CN-PAGE

Pour facilite la pénétration des protéines dans le gel on commence par un ampérage de

25 mA pendant une demi heure et on passe à 35 mA jusqu’à la fin de la séparation. Un

voltage constant de 150 v est appliqué pendant toute la séparation.


35

2. 2. 3. Coloration, décoloration et fixation du gel CN-PAGE

La solution à base de Coomassie R 250 (tableau 13) colore les gels, qu’on laisse

reposer (48 heures) sous une douce agitation et à l’abri de la lumière. Le R-250 est saupoudré

de façon homogène sur les gels préalablement trempés dans la solution de coloration. La

solution de décoloration baigne les gels pendant une heure.

Tableau 13 : Solution de coloration au Coomassie R-250 (Schägger. 2006).

Solution de coloration Solution de décolorationProduit Quantité QuantitéR-250 0.1 g -

Méthanol 50 ml 50 mlAcide acétique 40 ml 40 mlEau bi-distillée Qsp 100 ml Qsp 100 ml

3. 2 Deuxièmes dimensions SDS-PAGE

Les gels conservés dans du tampon tris-SDS (voir. Composition du lower gel) sont

découpés par une lame très fine et d’une façon franche pour obtenir une surface linéaire afin

d’assurer un contact optimal entre les interfaces des gels de la première et de la deuxième

dimension. La préparation du gel est de la même composition que celle utilisée en deuxième

dimension de l’IEF (cf. supra). Le voltage est lui aussi semblable à celui de la CN-PAGE. La

coloration décoloration et fixation des protéines se fait de la même façon que pour la première

dimension CN-PAGE (cf. supra).

Partie IIIRésultats et discussion

Partie III Résultats et discussions

36

Électrophorèse bidimensionnelle IEF-CA/SDS-PAGE

Le gel de résolution à 10% d’acrylamide sépare les protéines dans une gamme de poids allant

de 14-205 kDa.

L’ammonium sulfate permet d’avoir un fond plus claire et homogène, car il aide à la

précipitation des fragments de protéines membranaires, lors de la centrifugation.

Dans cette étude nous avons réalisés plusieurs essais pour la mise au point de la

technique d'électrophorèse bidimensionnelle (IEF/SDS-PAGE et CN/SDS-PAGE) des

protéines totales, afin de mettre en évidence la variabilité génétique existante entre les

espèces annuelles de genre Medicago. Mais pour maitriser la technique nous avons utilisé des

espèces sauvages non répertoriées.

La préparation des gels IEF selon le protocole Monribot et Boucherie (Monribot et

Boucherie. 1999 modifié), c'est avérée difficile, car ce dernier utilise un volume important de

solution (25 ml) pour réaliser 24 gels IEF.

Dans notre étude on a utilisé 8 tubes pour la mise au point de la technique

d'isoelectrophocalisation de la première dimension. 7 ml de solution de gel IEF sont suffisant

pour couler les gels des 8 tubes (il faut 800μl de solution du gel pour remplir un tube IEF de

24 cm).

La concentration de l'urée (9.5 M) ne peut être réduite si on veut obtenir une

solubilisation optimale des protéines surtout les molécules hydrophobes dans une solution

aqueuse.

Dans notre cas et pour améliorer la solubilisation de l'urée on a mit d'avantage d'eau,

en déduisant la proportion de l’eau bi-distillée nécessaire pour une quantité suffisante pour 7

ml. Les résultats obtenus, montrent que l'urée peut se solubilisée en présence de quantité

suffisante d'eau, avec disparition des deux phases rencontré précédemment de plus on a utilisé

du NP-10 au lieu de NP-40 pour diluer la solution du gel.

Malgré les modifications introduite, cette solution n'est pas pure et on remarque

l'existence de petits granules insolubles suspendus dans la solution, ce qui peut obstruée les


37

mailles des gels et empêchent les protéines de se séparées correctement, de plus on a observé

que l'urée cristallise rapidement à une température inférieur à 20°C.

Pour résoudre ce problème on a préparé les gels IEF dans une chambre à température

contrôlée (26°C), ensuite, la solution est passée au sonicateur 3 fois 1 minute, pour le

dégazage et une bonne solubilisation de l'urée, mais vu que la température du sonicateur

augmente avec les ultrasons et dépasse le seuil critique de 28°C, on a remarqué un début de

polymérisation.

La réduction du temps de sonication (3×10 seconde) et l'ajout du persulfate à la

solution après l'étape de sonication nous a permis d'obtenir une solution IEF homogène, et

évité l'initiation de la polymérisation dans le récipient.

Les gels sont coulés horizontalement et mit dans l'étuve à 26°C, pour la

polymérisation qui dure 24 heures, les résultats obtenus indique une polymérisation partielle

et dans la plupart des cas les gels sont complètement à l'état liquide.

La modification de la proportion des ampholytes de la gamme de Ph 3-10 dans la

solution par rapport aux autres gammes (5-7; 5-8), nous a permit d'obtenir une polymérisation

efficace des gels.

Après plusieurs essais effectuer pour l'amélioration de la polymérisation et

l'élimination des bulle d'airs on obtenait seulement 2 gels correct, sur 8, et qui sont de

consistance assez rigide et flexible, permettant leurs manipulation avec aisance surtout pour

leur transfert en deuxième dimension.

On changeant le mode de coulage des gels en horizontale par le coulage en verticale,

on a observé que les bulles d'aire remontées rapidement en surface, et les gels obtenus étaient

complètement dépourvues de ces derniers.

Les résultants indiquent que l'étape de pré-focalisation est très utile car, malgré le

nombre insuffisant et très peu représentatif de spots obtenus, ces dernier ne sont révélés que

par une IEF avec une pré-focalisation.


38

Figure 07 : Partie du gel 2-d coloré au bleu de Coomassie représentant trois spots

Après transfère du gel IEF en deuxième dimension on remarque qu'une partie du gel

flotte dans la solution cathodique en dessus du gel SDS-PAGE et qu'il n’adhère pas à celui-ci,

il se détache progressivement au fur et à mesure de la deuxième séparation. Pour cette raison

on a utilisé une solution de 0.5 d'agar pour sceller les deux gels ensemble et permettre leur

contact pour assurer le transfère des protéines.

Les gels de la deuxième dimension obtenus sont plus rigides, avec une épaisseur de

1.5 mm, les résultats obtenus par la coloration au bleu de Coomassie G-250 montrent des gels

de couleur homogène, cette coloration dure 48 heures et elle est simple à réaliser par rapport à

la coloration au nitrate d'argent qui est plus compliqué.

Pour extraire les protéines totales, nous avons utilisé des solutions compatible

avec l'IEF c'est à dire qu'ils ne confèrent pas de charges supplémentaires aux molécules

analysées car cela pourraient faussées leurs points isoelectriques.

La solution à base de TCA/Acétone est fréquemment utilisé dans l'extraction

dénaturante, car elle offre un double avantage celui de la précipitation des protéines et de

l'inhibition de la protéolyse.

Au début de notre expérience, l'absence de polymérisation nous a laissé supposée

qu'elle est due à la présence du β- mercapthoetanol qui est un agent réducteur puissant (enlève

les ponts disulfure).

D’autres agents réducteurs tels que le DTT et le DTE qui sont des agents thiols de

faible puissance par rapport au β- mercapthoetanol ont été utilisés dans certains protocoles en

association avec des détergents zwitterionique plus performant comme le CHAPS et les

sulfobetaines SB-13.


39

Cependant la non disponibilité de ces détergents pour notre étude ne nous permet pas

d’utiliser le DTT au risque de ne pas avoir une meilleurs solubilisation des protéines totales,

surtout pour les grosses molécules et les protéines hydrophobes.

Pour ne pas remplacer le β- mercapthoetanol très utile pour notre étude nous avons

réalisé des essais pour savoir s’il est le seul responsable de l’inhibition de la polymérisation

des gels IEF. Nous avons cherché dans la littérature, s’il n’existe pas d’autres agents

responsables de cette inhibition (Brewer. 1967).

Les essais effectuer par la suite pour la préparation des gels IEF, nous ont permit de

confirmer que deux facteur peuvent jouer un rôle crucial dans la polymérisation de

l'acrymlamide avec le bis-acrylamide qui sont respectivement; les ampholytes de la gamme de

Ph 3-10 et l’oxygène (Westermeier. 2004).

Les ampholytes de la gamme de pH 3-10, une concentration élevée entraine

l’augmentation de la concentration des Ph très acide et des pH très basiques constitutif (très

basique 8.5-10 et très acide 3- 4.5) de ce spectre, ces pH extrêmes inhibent la polymérisation

car le phénomène de pontage entre l’acrylamide et le bis-acrylamide initier par l’ammonium

persulfate (APS) nécessite un environnement neutre (Westermeier. 2004). De ce fait,

l’ajustement de la concentration de pH 3-10 en diminuant sa proportion a permis d'améliorer

la polymérisation.

En ce qui concerne l’oxygène, le mode horizontale de polymérisation conduit à

l'emprisonnement de l’air dans la solution, l’oxygène étant dissous dans le gel, il se

transforme en bulles plus au moins abondantes qui une fois piégées dans le gel polymérisé,

créent des lacunes entravant le passage du courant électrique (electric gap) empêchant ainsi la

séparation des protéines, ce phénomène est constaté lors du passage du bleu de méthylène

(étalon de migration).

Si ces bulles sont de grosses tailles, elles déstabilisent la structure des gels provoquant

des cassures à plusieurs endroits. Le mode de polymérisation en verticale semble plus efficace

car l’absorption d’oxygène est moins importante.

D'autre part, la sonication, procédé permettant à la fois le dégazage de la solution et la

dissolution de l'urée, se traduit par une meilleure homogénéisation du mélange et l’obtention

de meilleurs gels.


40

Dans notre étude nous avons utilisé l’urée, qui est nécessaire à l'amélioration de la

solubilisation des protéines hydrophobes et les protéines de grand poids moléculaire, en

association avec des tensioactifs non ioniques classiques tels que NP-40 et le Triton X-100,

cependant, ces tensioactifs même s'ils sont compatible avec l’IEF (car ils ne confèrent

aucunes charges aux protéines) ils ne sont pas très performant (Granier. 1988) et on a pas pu

séparer les protéines par ces tensioactifs sont largement remplacés dans les protocoles récent

par des surfactants zwitterioniques tels que le CHAPS, et les sulfobetaines SB-14.

D’un autre coté, les concentrations élevées d’urée (9M) permettant une meilleur

solubilisation des extraits protéiques tout en augmentant la viscosité du gel va paradoxalement

diminuer la mobilité des protéines ceci a été constaté lors de nos essais ou l'on a constaté que

les séparations prennent beaucoup plus de temps comparées aux gels SDS-PAGE de la

deuxième dimension, et dépassent même les 12 heures, période au delà de laquelle le Ph

commence à se dégrader. Ces phénomènes conjugués à l'établissement hasardeux du pH lors

de la préfocalisation peuvent expliquer les résultats négatifs obtenus.

La perte des protéines extraite par précipitation peut se produire à différents niveaux

du processus electrophoretique:

lors de l'extraction et de la solubilisation des protéines.

Lors du dépôt de protéines, ou la pénétration dans le gel.

À l'intérieur du gel lui même au point isoélectrique

Pendant le transfert du gel de la première a la deuxième dimension (Rabilloud. 1996).

Une perte très importante est en effet signalée due aux détergents et tensioactif

utilisés pour éliminer les contaminants des échantillons comme les lipides et les acides

nucléiques. Mais cette perte n'explique pas à elle seule les résultats insatisfaisants obtenu car

même s'il y'a une perte de protéines une partie devrait être présente dans le gel (Rabilloud.

1996).

Il est a indiqué que plusieurs phénomènes expliquent la dégradation et l'instabilité du

ph tel que l’eletroendosmose ou le phénomène de plateau, mais aussi la qualité de séparation

qui varie beaucoup d’une solution d’ampholyte à une autre confirmant la différence de qualité

qui existe entre les différentes marques commercialisées, cela a été signalé par le groupe


41

Righetti (Righetti. 2007) qui ont fractionné des ampholytes en étudiant leurs propriétés de

focalisation par la CZE-MS( capilarity zone electrophoresis- mass spectrometry). Ils ont

conclus qu’une part non négligeable de ces ampholytes, s'étendant sur tout l'intervalle que

couvrent les différentes gammes, est de mauvaise qualité.

Dans notre études les ampholines 3-10, nous ont permis d’avoir les seuls et uniques

spots présent dans le gel et de toutes les expériences réalisées. Les pharmalytes et les

servalytes n’étaient pas efficace car aucune séparation n’a pu être réussie par ces solutions, ce

qui est en accord avec les travaux de Poitevin (2008). Par contre le groupe Righetti signale

que les meilleurs résultats sont obtenus par les pharmalytes, cela peut s'explique par le fait

qu'il a utilisé des Ph étroit pour son étude alors que nous avons utilise des pH étendu.

Les différents points discutés précédemment nous fons prendre conscience que cette

technique est très difficile à mettre au point et le fait que les résultant ne soient pas

reproductibles entre laboratoires et même au sein du même laboratoire (Zilberstein. 2010) fait

qu'elle est largement abandonner en faveur d'une nouvelle technique qui utilise un gradient

de Ph immobiliser c'est à dire qui est fixe car il se polymérise avec les molécules

d’acrylamide, ce principe a permis de révolutionner la technique d'électrophorèse

bidimensionnelle, de plus les progrès réaliser en matière de solubilisation des protéines

hydrophobe et de gros poids moléculaire ces réalisation en protéomique ont fortement

contribuer aux remplacement de l’IEF en carrier ampholytes par l'IPG.

A-Électrophorèse 2-D CN- gradient (4-10%) / SDS-PAGE continu (10%)

La technique d’électrophores native permet la séparation des protéines sans l’altération

de la structure tridimensionnelle. L’utilisation du protocole de précipitation à base de TCA et

la solubilisation des protéines par le tampon Laemmli (1970) a permis d’obtenir les résultats

présentes par les gels : gel 1-g gradient 4-10% ; gel bidimensionnel gradient 4-10%/SDS-

PAGE ; gel discontinu 4-10%/SDS-PAGE, gel discontinu 4-8 %/SDS-PAGE.

Pour le gel 1-D (figure 08), nous pouvons distinguer cinq zones de migration

Zone de migration lente : 0.56

Zone de migration moyenne : 0.71

Zone de migration rapide : 0.81 et 0.84


42

Figure 08: électrophorèse non dénaturante des protéines totales de graines sauvages deMedicago

Le gel bidimensionnelle gradient 4-10 %/SDS-PAGE illustré dans la figure 09, nouspermet de formuler plusieurs observations:

Horizontalement, nous observons la formation de bandes opaques et très peunombreuses qui sont séparées des bandes protéiques de faibles intensité et de moindreépaisseur et longueur, biens réparties sur la surface du profil protéique, qui s’étal sur plus dela moitié de la migration en deuxième dimension électrophorètique.

Ces bandes de longueurs importantes sont continues, indiquant la quantité de dépôt etl’effet de diffusion importants. Ceci montre que la quantité des protéines déposées pour lapremière dimension (CN-PAGE gradient discontinu 4-10 %) reste très importante.

Verticalement, les bandes protéiques parcourent le gel de façon distincte du premierquart à la fin du gel de la deuxième dimension. Ceci indique que ce maillage correspond à larésolution de cette gamme de protéines pour la première dimension (SDS-PAGE continu 10%).


43

En absence de marqueur de poids moléculaire, nous avons calculé les fronts demigrations de chaque bande, pour obtenir une représentation de la taille des molécules. Lesrésultats sont présentés dans la figure 10.

Ce profil schematise les bandes les plus représentatifs de notre gel dont le nombre estde neufs classé de a à h, dont les fronts de migration sont : a, b : 0.39, c : 0.54 ; d : 0.62 e :0.78, f, h 0.8, i : 0.81 g : 0.84.

Il montre l’existence de bandes protéiques dont le front de migration est similaire (a,b) et (f, h) et des bandes qui n’ont pas le même front de migration mais qui sont dans la mêmerangée verticale (e, f, g) et (h, i).

Figure 09-a: Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D gradient 4-10%/SDS-PAGEcontinu 10% des proteines tatale de graines de Medicago.


44

L’étude des fronts de migration Rf remplace les marqueurs de poids moléculaire

(Bossis. 1999). Trois complexes protéiques ont été résolu dans le gel, dont deux sont dimères

(b, d) et (h, i) et un est trimère (e, f, g). Ces oligomères en gel SDS-continue à 10% semblent

être des complexes protéiques qui selon Zhentian (Zhentian. 2005) ont un poids moléculaire

allant de 22 à 97 kDa. Il est à signaler que le nombre de ces sous-unités constitutives est

réduit. Etant donné que cette technique mette en évidence plusieurs complexes protéiques, nos

résultats n’en concordent pas (Wittig. 2008). Ceci peut être du à la précipitation importante

des protéines qui se traduisent par des trainées excessives observées dans le premier gel

(Gallagher .2006).

Notre profil protéique montre également une absence de trainées verticales et une

présence abondante de trainées horizontales, ces derniers représentent une variation au point

de vue longueur de bandes, ces bandes de différentes longueurs sont probablement dues à la

différence de la quantité de protéine contenue dans notre échantillon. Il est à supposable que

les bandes à grande longueur, soient des produits de deux ou trois fractions de même poids

moléculaire qui s’aligne et se fusionnent sur la même ligne horizontale.

Ce même phénomène a été souvent observé dans les profils protéiques bidimensionnelles

de différentes plantes (Imin. 2004 ; Gundacker1.2006; Wang. 2007 ; Wittig et Schagger.

Figure 09-b : Profil protéique et Rfs des protéines totale des graines sauvages deMedicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE


45

2009; Castillejo. 2010). Cette variabilité quantitative (longueur des protéines) que possède

les graines de Medicago reflète sa richesse protéique notamment en celles de réserve qui sont

stockés pendant le développement de la graine d’où l’intérêt de leur utilisation dans cette

étude. Ces résultats se conforment avec ceux trouvés par Mahnane (Mahnane. 2010) : Les

graines de Medicago renferment un très grand nombre de protéines différentes (protéines de

structure, protéines biologiquement actives et protéines de réserve. D’ailleurs, ce même auteur

rapporte en travaillant sur les graine de Medicago plante modèle des légumineuse qu’elle est

constituée des protéines essentiellement d’albumines et de globulines.

Donc, les bandes révélées dans le gel ayant une intensité plus importante pourrait bien

s’agir de globulines qui représentent 60 à 90 % de l’azote totale des légumineuses, elles ont

une structure spatiale complexe et peuvent se lier ou se dissocier selon les conditions du

milieu. Par ailleurs les bandes ayant une intensité moins importante pourrait probablement

être des albumines car, ces derniers représentent 10 à 20% des fractions protéiques des

légumineuse, ce sont des molécules ayant un rôle fonctionnel dans la cellule.

Il est fort probable de détecter des bandes non visibles dans le gel correspondant à des

protéines minoritaires. Cette non apparition des bandes semble être du à la concentration des

protéines majoritaires qui en atteignant certains seuil de concentration vont masquer les

protéines minoritaires présentes à ces endroits. Ce phénomène est d’autant plus important

dans les gels gradient ou les bandes sont très proches, car ce dernier sépare une large gamme

de poids moléculaire des protéines de poids moléculaire très proches ainsi que celles ayant

des masses très proches qui se dilatent empêchant ainsi leurs distinctions (Westermeir. 2004).

Notre recours à utiliser la TCA réside non seulement dans le fait qu’il constitue la

meilleure procédure de précipitation, mais aussi il donne le meilleur rendement en matière de

précipitation des protéines récalcitrantes. De plus, il élimine les sels, les lipides, les poly

phénols, les polysaccharides et les protéases, ce qui fait de lui un produit à large utilisation

dans la préparation des échantillons végétaux destinés aux analyses protéomiques. Des

recherches (Zhentian. 2005 ; Jorrín. 2007 ; Méchin, 2007) à ces fins protéomiques ont été

menés en utilisant la TCA et non pas l’éthanol, le méthanol/ammonium acétate, phénol–

chloroform– isoamyl alcool qui sont des produit alternative de la précipitation.


46

Le profil protéique révèle des sous-unités ou fractions protéiques en disposition

verticale sous forme de piles. Ceci indique la présence d’états oligomeriques qui ne se sont

pas dénaturés dans le tampon de préparation des protéines à base d’SDS ou réduit par le β-

mercapthoethanol. Ces oligomères se sont séparées sous forme de complexes protéiques dans

la deuxième dimension. Cette dernière a permis d’avantage la dénaturation de ces complexes

par l’SDS présent à la fois dans les tampons cuve et dans les tampons du gel, ce qui a conduis

à leurs séparation sous forme de sous-unité en deuxième dimension, d’où leurs apparences

sous forme de piles verticales de fractions protéiques.

Pour ce qui est des fractions sur la même rangée horizontale, il pourrait bien s’agir des

sous-unités protéiques de même poids moléculaire qui se trouvent dans des complexes

protéiques différents (a, b) et (f, h), cela a été rapporté par (Reisinger et Eichacker. 2007). En

effet ces bandes peuvent être soit des protéines iso-formes ou des protéines similaires. On

suppose qu’ils sont des allèles produits du même locus (Bossis. 1996).

Dans notre études nous avons l’atout d’utiliser le SDS comme détergeant car il a non

seulement l’avantage de sa simplicité (Bianchi-Bosisio. 1991 ; Le Bricon. 1998 ; Pesce.

1972) mais aussi, il permet la séparation des protéines basiques qui est moins évidente par

d’autres détergents (). De plus, ce détergeant fortement anionique s’associe avec les protéines

dans un rapport de 1,4 g de SDS/g de protéines, quantité suffisante pour masquer leur charge

intrinsèque (Trivin.2002).

Ce détergent SDS a fait l’objet de pas mal d’étude d’électrophorèse bidimensionnelle

(Eubel et al. 2005 ; Williams et al. 2006 ; Swamy et al. 2006 ; Reisinger et al. 2007. Wittig

et al. 2008) Sur différents matériels végétales comme le blé (Zhao .1996) le riz (Agrawal et

al. 2005) et le Medicago (Daher et al. 2010) l’orge (Hynek.2006).

Des études pareils ont été menés par des chercheurs (Ossenbühl et al., 2004; Schwenkert

et al., 2006; Danielsson et al., 2006) travaillant sur des complexes protéiques de chloroplaste

et thylacoïde des algues et des plantes. Dans le même contexte d’autres auteurs ont signalé

pour la Medicago sativa et la Pisum sativum, une différence significative entre la résolution

des protéines selon les détergeant utilisés dans la solubilisation des protéines (Ladig. 2010).

En effet, des détergents tels que le DDM et le digitonin (mild detergent) n’altérant pas la

structure native des protéines permettent à la fois leur migration selon leurs charges charge


47

nette et leurs poids moléculaire. L’utilisation de ces derniers a permis une meilleur

performance en matière de résolution (Eubel. 2005 ; Ladig.2010).

A titre de comparaison le nombre de fractions résolu dans une 2-D BN/SDS PAGE est

normalement moins important que dans les gels 2-D IEF/SDS-PAGE, Ceci est principalement

due au fait que les protéines ne sont pas séparées sur la surface total des gels mais plutôt

arrangées sous forme de piles verticales, ce qui est en accord avec les résultats observés dans

notre gel. Cela indique la complexité de la résolution dans la séparation native.

B-Électrophorèse 2-D CN- Discontinu (4-10%)/SDS-PAGE continu (10%)

Le gel présente des bande encore plus épaisse que le gel gradient et au lieu d’avoir des

spots on a obtenus des bandes très diffus, cependant ils sont bien distinct par rapport au gel

gradient. Par ailleurs on observe que les bande n’occupent que la moitié du gel et ne sont pas

séparé dans la totalité du gel.

Le profil des Rfs présente les bandes sous une formes schématique dans le gel, les

bandes avec une coloration noire représente les fractions qui apparaissent très dense et les

bande grise celles qui sont mois claire, il y’a sept bande de a à g dont le Rfs sont

respectivement : 0.28, 0.31 0.43 0.5 0.53 0.64 0. 91. Six de ces bande se disposent en ligne

verticale (b à g), la bande a, c et d sont très épaisses et laissent pensé que c’est une fusion de

deux bandes sous-jacente par diffusion, les bondes c présente un centre bien définit qui

correspond à un spot mais la diffusion est très importante autours.


48

Figure 11-a : Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu 4-10%/SDS-PAGE

continu 10% des proteines tatale de graines de Medicago

Figure 11-b : Profil des protéique et Rfs des protéines totale des graines sauvage de

Medicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE


49

B-Électrophorèse 2-D Cn- Discontinu (4-8%)/SDS-PAGE Continu (10%)

Pour améliorer la résolution et d’obtenir des spots avec un centre bien définis nous

avons réalisé un gel discontinue de 4-10%. Les résultats obtenus révèlent des bandes de plus

large épaisseur par rapport au gel gradient. De plus, ces bandes ne sont pas reparties sur toute

la surface du gel bidimensionnelle. Ceci pourrait se traduire par le fait que ces protéines n’ont

pas migré jusqu’au bout de la première dimension et sont restées bloquer dans la partie

supérieure du gel de résolution qui semble exercer un effet de restriction sur les protéines à

analyser.

Malgré que, les protéines sont disposées en ligne verticale, nous ne pouvons pas

confirmer ni infirmer le fait qu’ils appartiennent ou non au même complexe, car il est supposé

que l’obstruction des gels par les protéines de plus haut poids moléculaire (à cause du

maillage resserré de 10% de la première dimension) conduit au piégeage des molécules dans

la zone supérieur du gel discontinue, ce qui indique la répartition des bandes sur une partie du

gel 2-D et non pas sur toute la surface du gel.

Il est important de noter que la concentration dans le stacking gel peut causer

l’agrégation des protéines (Walker. 2000). D’un autre coté, quand la quantité des protéines

sont importante, des trainées verticales et horizontales sont observées dans le gel 2-D (), ce

qui explique la taille importantes des bandes et leur apparition sous formes de fractions

étalées horizontalement.

Des études comparatives entre le maillage des gels de résolution à concentration de

7.5% et de 9% sur deux complexes mitochondriales I et V montrent qu’ils sont bien séparés

l’un de l’autre. Une concentration de gel supérieure ou égal à 10% conduit à une faible

résolution du complexe I ou du complexe V qu’ils soient séparés ou réunis. Cet effet est aussi

observé dans un gel de 12% de concentration d’acrylamide (Yan .2009). Cependant, ces

complexes ont été très bien résolus par une concentration entre 7.5% et 9%. En générale dans

un gel de 7,5% les protéines ayant un poids moléculaire moins de 140 kDa devraient être

séparées, alors qu’un gel de 12% sépare les protéines ayant poids moléculaire inferieure à 60

kDa.


50

L’absence du SDS dans la première dimension n’a pas facilité la solubilisation des

protéines de haut poids moléculaire, ce qui pourrait expliquer l’obstruction des mailles

d’acrylamide.

Ces résultats montrent que le maillage de 10% du gel de résolution de la première

dimension ne convient pas à la séparation de toute la gamme de taille des protéines de notre

échantillon, à ce moment là, il pourrait être mieux adapté pour analyser les protéines de faible

poids moléculaire. Par ailleurs la quantité des protéines déposées semble être en excès par

rapport au seuil de résolution.

C-Electrophorèse 2-D CN- Discontinu (4-8%)/SDS-PAGE

Pour améliorer la séparation et obtenir plus de bandes dans le gel et un profil protéique

étendu sur toute la surface du gel, nous avons réalisé une électrophorèse bidimensionnelle CN

à gel discontinu 4-8%, dont le gel de concentration est de 4% et le gel de séparation est de

8%. On a obtenu deux gels bidimensionnels.

Figure 12-a : Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu 4-8%/SDS-PAGE continu 10% des proteines tatale de graines de Medicago

continu à 10% de graines savage de Medicago.


51

Figure 13-a : Gel d’electropphorese bidimensionnelle 1-D discontinu 4-8%/SDS-PAGEcontinu 10% des proteines tatale de graines de Medicago

Figure 12-b : Profil des protéique et Rfs des protéines totale

des graines sauvage de Medicago pour le gel bidimensionnelle CN-

Gradient/SDS-PAGE


52

Figure 13-b : Profil des protéique et Rfs des protéines totale des graines sauvage de

Medicago pour le gel bidimensionnelle CN-Gradient/SDS-PAGE

Les résultats obtenus des deux gels (figure 13-a et 13-b) ont permis d’avoir la

meilleure résolution que tous les gels réalisés précédemment (gel graduant et gel discontinu à

10%). cette résolution se manifeste par 16 fractions dans le gel 12-a (figure 12-b) et 15

fractions dans le gel 13-a (figure 13- b).

Dans le gel a, le phénomène de fusion des bandes (g et i) paru dans le gel

bidimensionnelle à gradient de concentration (b, c, d) persiste avec des spots à un centre plus

dance disposée cote à cote qui forme une seule ligne horizontale. Au point de vue résolution,

ce gel se révèle plus performant par rapport aux gels précédents. Dans le gel 13-a, le

phénomène de fusion des bandes est absent, les spots se révèlent sous forme ronde avec un

centre bien défini. Au point de vue résolution, ce gel se révèle plus performant aussi bien par

rapport aux gels précédents que par rapport à celui du gel 12-a.

Ce contraste en matière de résolution entre les gels précédents (gradient, discontinue à

10%) et ceux discontinus à 8% semble être est du au maillage moins restrictif que celui de

10%, ce qui permet de conclure que ce maillage est plus adapté pour la séparation de nos

échantillons. En effet la littérature rapporte qu’un maillage de 7.5 % pourrait servir de

concentration optimale de départ pour la séparation des protéines dont la taille est inconnue

(Walker. 1994). Dans notre étude les gels réalisés à 8% se sont traduits par des résultats

satisfaisants.


53

Des résultats similaires ont été rapporté (Krause. 2006 ; Aivaliotis et al., 2007) qui

montre l’efficacité de cette technique en gel discontinue pour la séparation de type particulier

de protéines (protéine membranaire, protéines des mitochondriale et chloroplastique).

Pour le contraste en matière de résolution entre le gel 12-a et le gel 13-a, nous

soupçonnons un manque de reproductibilité qui a fait que le gel 13-a soit plus résolu que le

12-a. D’autres expériences restent à faire pour améliorer cette résolution.

Bibliographie

Partie V Bibliographie

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Mise au point de la technique d’électrophorèse ... · Tableau. 06: Programme de voltage (Nagaraj. 2007). 28 Tableau. 07: Solutions utilisées pour la deuxième dimension Selon